Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительная характеристика иммунопротективных эффектов бактериальных рибосом, полученных различными способами

На правах рукописи

Скобликов Николай Эдуардович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОПРОТЕКТИВНЫХ ЭФФЕКТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОСОМ, ПОЛУЧЕННЫХ РАЗЛИЧНЫМИ СПОСОБАМИ

03.00.07 — микробиология 14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва 2004

Работа выполнена в Кубанской государственной медицинской академии и Российском центре функциональной хирургической гастроэнтерологии Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Краснодар)

Научные руководители:

доктор биологических наук профессор Орлов Вячеслав Георгиевич кандидат медицинских наук Крылов Виталий Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Калуцкий Павел Вячеславович доктор биологических наук профессор Савицкая Карина Илларионовна

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского

Зашита состоится « \$ » МОЛ 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.040.08 в Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова (119992 г. Москва, ул. Большая Пироговская, д. 2, стр. 3). . С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова (117998 г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан « УЗ » еилаСлЛ 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

профессор

Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наиболее эффективным и экономичным способом

иммунобиологических препаратов (Воробьёв А. А., 1999; Покровский В. И., Семёнов Б. Ф., 1999), прежде всего — вакцины. Совершенствование вакцинных препаратов связано с поиском новых эффективных иммуногенов, обладающих протективной активностью. Среди протективных антигенов, используемых для производства современных химических вакцин особое место занимают бактериальные рибосомы (Медуницын Н. В., 1999). Среди свойств рибосом особое место занимает феномен рибосомной протекции, который заключается в способности рибосом, выделенных из патогенных микроорганизмов и введённых в восприимчивый макроорганизм, защищать его от соответствующей гомологичной, а в некоторых случаях и гетерологнчиой инфекции. Начиная с первого сообщения (YoumansA. S. и YoumansG. P., 1965), изучение иммупопротективных свойств рибосом оформилось в самостоятельное направление современной вакцинологии (Левенсон В. И., Хазанова В. В., 1991; Eisenstein Т. К. et al., 1976; Liebennan M. M. et al., 1979; Dussourd d'Hinterland L., 1980; Gregory R. L., 1986; Segal E., 1989; Nicolaeva L.V., Savel'ev E.P., 1991; Normier G.etal., 1992 и др.). К бесспорным достоинствам рибосомных препаратов можно отнести их низкую токсичность и реактогашость, высокую иммуногенность и способность создавать перекрё'сгный иммунитег к различным серотииам возбудителей в пределах вида (Левенсон В. И. и др., 1988; Бакулин И. Н., Сергеева Т. И., 1990; Оветчин П. В., Цыганеико А. Я., 1984). Препараты на основе бактериальных рибосом в настоящее время вышли за рамки классических вакцин, широко применяются в качестве иммуномодуляторив (Хаитов P.M. и др., 1994; Гордиенко СМ., Ласица О. И., Федорчук А. Г., 1995), что позволяет рассматривать их в качестве основы для конструирования вакцинных препаратов нового поколения. Перспективность разработки рибосомных иммунобиологических препаратов обусловлена также необходимостью использования для коррекции различных иммунопатологических

снижения инфекционной заболеваемости является использование

состояний средств, нормализующих

расстройства связаны с нарушениями метаболизма, прежде всего — нуклеинового обмена (Караулов А. В., 1999). Одной из главных проблем развития данною направления является сложность получения рибосомного материала и, как следствие, высокая себестоимость соответствующего целевого продукта. Получивший наибольшее распространение метод дифферент laibnoro ультрацентрифугирования клеточного лизата бактерий позволяет получать препараты высокого качества, однако является весьма громоздким и требующим дорогостоящего оборудования, сложного в эксплуатации. Исходя из этого, исследователями велись поиски альтернативных методов выделения рибосомных фракций для нммунобиотехнологнческих целен. Предложенные варианты химического фракционирования отличаются низким выходом продукта (Орлов В. Г., 1991) и, кроме того, не позволяют получить ннтактную фракцию рибосом (Крылов В. П., 1996), что затрудняет его внедрение в промышленное производство рибосомных иммунобиологических препаратов. В то же время известно, что при исследовании структурно-функциональной организации прокариотических рибосом успешно применялся метод эксклюзпонноп хроматографии на колонке (гель-фильтрации) для получения препаративных количеств рибосомного материала (JelencP. С, 1980). Поэтому целесообразно разработать методику получения экспериментальных рнбосомных препаратов с помощью гель-фильтрации и исследовать протективные свойства целевого продукта.

Несмотря на множество публикаций, посвященных изучению разных аспектов феномена рибосомиой протекции, вопрос о природе протективной активности рибосом, а также о механизмах её реализации остаётся до настоящего времени неразрешённым. Исследования, проводимые на различных моделях, дачи обширный материал для построения гипотез о возможных механизмах рнбосомной протекции (Youmans A. S., Youmans G. Р., 1965; Gonggrijp R. etal., 1980, 1981: AngermanQEisenstemr., 1980; VennemanM.R.,BigleyN. J., 1969;SmithR. Letal.. 1974; ЛевенсонВ.И.идр., 1988, 1991; Крылов В. П., 1996). Однако абсолютное большинство исследований проводилось на инфекционных моделях с

использованием вирулентных микроорганизмов, обладающих широким набором факторов патогенности. Это обстоятельство не позволяет вскрыть механизмы рибосомной протекции на молекулярном уровне. Представляется очевидным, что исследования на моделях, связанных с действием только одного фактора патогенности, более перспективны в плане расшифровки молекулярных механизмов протективного действия бактериальных рибосом. К таким моделям можно отнести проявление биологической активности бактериальных токсинов in vivo и in vitro. В качестве основы для модели изучения антитоксической рибосомной протекции нами использовался а-гемолизин Escherichia coli. Этот токсин играет важную роль в инфекционной патологии, являясь одним из главных факторов вирулентности уропатогенных штаммов кишечных палочек (Бондаренко В. М, ГолубевА. В., 1988). Исследование антитоксической протективной активности 70S рибосом на модели токсического действия а-гемолизина кишечных палочек позволит углубить представления о механизмах реализации протективного феномена бактериальных рибосом.

Цель работы — сравнение иммунопротективных эффектов препаратов 70S рибосом, выделенных из кишечной палочки (Escherichia coli) методами дифференциального ультрацентрифугирования и колоночной хроматографии (гель-фильтрации), на модели интоксикации лабораторных животных Е. coli для совершенствования качества и технологии получения медицинских иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом. Задачи:

1. Разработать схему получения 70S рибосом методом гель-фильтрации для изучения их иммунопротективных свойств.

2. Провести сравнительный анализ физико-химических параметров препаратов 70S рибосом Е. coli, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.

3. Подобрать схемы иммунизации лабораторных животных и экспериментальные модели действия на организм лабораторного гемолизина штамма Е. coli, используемого для выделения 70S рибосом.

4. Выявить различия способности обеспечивать защиту от действия а-гемолизина Е. coli препаратов 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод гель-фильтрации позволяет получать 70S рибосомы для иммунобиотехнологических целей.

2. 70S рибосомы гемолитического штамма кишечной палочки, независимо от способа получения рибосомного. материала, способны индуцировать тахифилаксию мышей к действию a-гемолизина и нейтрапизовать in vitro гемолитическую активность

3. Протективная активность рибосомных препаратов зависит от способа фракционирования клеточного лизата и наличия факторов вирулентности у штамма-источника рибосомного материала.

Новизна и теоретическое значение работы. В данной работе впервые:

• проведён сравнительный анализ иммунопротективных свойств 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации:

• обнаружено снижение антитоксической протекции препаратов 70S рибосом, полученных методом гель-фильтрации, по сравнению с препаратами, полученными методом дифференциального ультрацентрифугирования, на модели острой интоксикации белых мышей а-геМ0ЛИЗИН0М Е. coli;

• установлена способность препаратов 70S рибосом, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность гомологичного штамма кишечной палочки in vivo и in vitro;

• установлена способность антирибосомных антител, полученных иммунизацией кролика препаратами 70S рибосом, полученными методами дифференциального

ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки in vivo.

Практическое значение работой Метод гель-фильтрации клеточного лизата обладает по сравнению с методом дифференциального ультрацентрифугирования рядом технологических преимуществ, позволяющих упростить процесс получения препаратов бактериальных рибосом для иммунобиотехнологических: целей. Способность, 70S рибосом из гемолитических штаммов кишечной палочки вызывать в эксперименте на мышах тахифилаксию к а-гемолизину Е. coli и нейтрализовать in vitro гемолитическую активность данного бактериального экзотоксина открывает перспективы разработки новых антитоксических препаратов на основе бактериальных рибосом.

Апробация работы. Результаты исследовании опубликованы в открытой печати (10 работ). Основные положения диссертации докладывались на научно-практических конференциях молодых учёных и студентов. Кубанской государственной медицинской академии (Краснодар, 1999); научно-практической конференции молодых учёных «Развитие социально-культурной сферы СевероКавказского региона» (Краснодар, 2001); IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001); МП международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, Иммунология и Глобальная Сеть» (Cannes, France, 2002); V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); XVI зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004). Результаты исследований внедрены в научную работу ЦНИЛ Кубанской государственной медицинской академии (отдел экспериментальной и клинической иммунологии, отдел молекулярной биологии бактерий), Российского центра функциональной хирургической гастроэнтерологии МЗ РФ (отдел клинической микробиологии, отдел клинической и экспериментальной иммунологии), отдела микробиологического синтеза СевероКавказского НИИ биотехнологии и химии. Новые данные о механизмах реализации антитоксического протективного эффекта, индуцированного препаратами бактериальных рибосом, используются в учебном процессе на кафедре

микробиологии - Кубанской государственной медицинской академии и кафедре генетики и микробиологии Кубанского государственного университета.

Структура работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками. Работа состоит из введения, аналитического обзора, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 169 источников, из которых 90 — отечественных и 79 — зарубежных.

Материалы и методы исследования Источником рибосомного материала служили штаммы Е. coli MRE600; Е. coli DH1 с Иу-плазмидой pRDl; Staphylococcus aureus 209P = АТСС 6538 - Р = NCTC 7447 = FDA 209P = ССМ 2022 = ВНИИА 209Р. Биомассу бактерии выращивали при +37°С на жидкой синтетической питательной среде в ходе периодического динамического культивирования до начала поздней логарифмической фазы роста культуры. Рост клеток останавливали внесением хлорамфеникола (100мкг/мл). Биомассу осаждали на центрифуге К-70 при 3500 об/мин, +4°С в течение 20 минут, дважды промывали буферными растворами, ресуспендировали в лизирующем буфере и подвергали батлистнческоП дезинтеграции клеток на гомогенизаторе Л-17, установленном в рефрижераторной центрифуге ЦЛР-1. Режим дезинтеграции: троекратное центрифугирование с абразивом по 3 минуты при 1500 об/мин, +10°С с интервалом в 15 минут для охлаждения разрушаемых клеток при -10°С. Абразив и не разрушенные клетей осаждали при 3500 об/мин, +4°С в течение 20 минут, осадок отбрасывали, а супернатант использовали. для выделения рибосомных фракций дифференциальным ультрацентрифугированием, либо гель-фильтрацией. Седиментационное выделение 70S рибосом осуществляли в роторе Ti-70 ультрацентрифуги L8-70 («Becman»): фракции S30 — при 30 000 об/мин, +4°С в течение 30 минут, рибосомной фракции — при 42 000 об/мин, +4°С в течение 2 часов. Осадки — 70S рибосомы — замораживали при -20°С. Хроматографическое выделение рибосомной фракции проводили, используя комплект

хрома!ографнческого оборудования на колонке размером 28*350 мм, заполненной сефадексом G-200 («Pharmacia», Швеция) при +10°С. Полученные фракции подвергали сиеюрофотометрии в диапазоне 312,5 — 213 нм на спектрофотометре «Specord UV-Vis». Сохраняли только фракции с характерными для очищенных рибосом соотношением OD^a/ODys и ООгя/СЮгбо, равным 1,8 — 2. Полученные образцы 70S рибосом тестировались на качество по следующим показателям: 1) спектрофотометрия в диапазоне 312,5 — 213 нм; 2) аналитическое' ультрацентрифугированне образцов в присутствии 1,0 мМ ацетата магния; 3) электрофорез рибосомных белков в линейном 7-!5%nAAT-SDS; 4) электрофорез рпбосомной РНК в 3% ПААГ (Крылов В. П., 1996).

Протективные свойства 70S рибосом гемолитического штамма Е. eoliDHI исследовали in vivo на модели острой интоксикации Е. coli белых

беспородных мышей и in vitro на подели гемолиза эритроцитов. Для получения а-гемолнзина проводили концентрирование культуральной жидкости в диализных мешках против ПЭГ-17 000. DLjo a-гемолизина рассчитывали по Керберу (1931, цит.по Ашмарин И. П., Воробьёв А. А., 1962), разрешающую дозу (2 DL») вводили внутрибрюшинно. Гибель животных учитывали на протяжении 3 суток. Иммунизацию мышей осуществляли внутрибрюшинным введением препаратов рибосом в дозах 100 мкг, 1 мкг и 0,001 мкг по различным схемам. Протективный эффект выражали в процентах животных, выживших после введения в течение 3 суток.

Гемолитическую активность a-гемолизина определяли по Kanclersky К., MollbyR. (1984) в собственной модификации и выражали в гемолитических единицах (hemolytic units. HU). Нативную свежевзятую кровь человека в буфере вносили в равных количествах в серийные последовательные разведения токсина. После инкубации эритроцитов с разведениями токсина в течение 1 часа при+37°С, определяли экстинцию оставшихся нелизированными эритроцитов. Дтя выявления токсиннейтрализующей активности 70S рибосом эритроциты перед внесением в разведения токсина предварительно инкубировали с препаратом рибосом при +37°С в течение I часа.

Изучение иммунологической специфичности препаратов 70S рибосом проводили с помощью антирибосомных кроличьих сывороток, полученных по методике Ю. Л. Субботиной с соавт. (1979), для чего 0,2 мг 70S рибосом с полным адъювантом Фрейнда вводили в подколенный лимфоузел кролика массой 1,8 — 2 кг, а через месяц с недельными интервалами делали 3 внутривенные инъекции по 1 мг препарата. Гипериммунные сыворотки получали на 7-й день после последней иммунизации и хранили при -30°С. Титр антител к рибосомному материалу и преципитацию антирибосомных антител с а-гемолизином определяли в реакции - двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони (1950, цит. по Остерман Л. А., 1983),. Для выявления нейтрализации токсина антирибосомными антителами а-гемолизин Е. coli в дозе 2 DL50 инкубировали при +37°С в течение 1 часа с разведениями антисыворотки, после чего вводили внутрибрюшинно мышам.

Полученные результаты обрабатывались статистически (МерковА. М., 1970; Урбах В.Ю., 1975) с расчётом средней величины (М), ошибок средних величин (т), средних квадратичных отклонений (а). Достоверность различий между средними величинами оценивали при помощи критерия Стьюдента. Микробиологические и иммунологические исследования проводились при технической и методической поддержке О. А. Качановой, С. В. Кошелевой, С. В. Егоровой и Ф. Ш. Сиюховой.

Результаты исследования и их обсуждение

Выход рибосомных фракций, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтращи. Технология выделения препаратов 70S рибосом была основана на принципе интактности рибосом (Крылов В. П., 1996), который обеспечивался в результате: 1) стерильности на всех этапах для защиты целевого продукта от экзогенных РНКаз и посторонних антигенов; 2) непрерывной холодовой цепи для подавления активности эндогенных РНКаз; 3) подавления активности РНКаз с помощью применения ингибиторов (ПВС и меркаптозтанол). Выход микроорганизмов выражали через «экономический коэффициент по биомассе» — отношение массы образованных клеток к весу

потреблённого питательного субстрата, а выход рибосом — через «экономический коэффициент по продукту» — отношение массы образованного продукта к массе потреблённого субстрата, а также через «удельный коэффициент выхода продукта» — отношение массы образованного продукта к массе образованных клеток. «Экономический коэффициент по продукту» при использовании метода дифференциального ультрацентрифугирования составил а при

использовании метода гель- фильтрации —

«удельный, коэффициент выхода продукта» — и

9,575±0,180x10"3 (р>0,25; 1=1,473)

соответственно. Недостоверность различия данных показателей позволяет утверждать, что потери целевого продукта при гель-фильтрации минимальны.

• : ■ 1 1 1 ! i 1 1

, 1 -у ♦ i i 1 1

: 1 1 t 1 • ;

1 . ,/ ' "\1 1 * •

1 . i: ! Н ч • : i

• < l 1 N ч, г • 1

\ } Г • • 1 » t ; — • •

! ! Л * " • 1 • • • • ♦ • t _ i -

! 1 1 i 1 t 1 I -

1 _и» 1 1 ' 1 I » ■ -

60' 90' 120" 150" Врем« фракционирований

от нанесены образца на колонку, ына

Рис.1. Профиль элюции бактериального лизата штамма Е. coliDHl, полученного без применения ультрацентрифугирования. Гель — сефадекс G-200. Геометрия колонки 28х350 мм. Объём образца 3 мл. Скорость элюции — 20 мл/час.

Это позволяет утверждать, что потери целевого продукта при гель-фильтрации минимальны, причём важно отметить, что фракционировался именно исходный клеточный лизат (рис.1), а не промежуточные фракции, полученные при ультрацентрифугировании, например, фракция S30. Спектрофотометрический, седиментационный и электрофоретический анализ рибосомных фракций не обнаружил различий физико-химических параметров исследуемых образцов.

Исследование антитоксических протективных свойств препаратов бактериальных рибосом на модели острой интоксикации белых мышей а-гемолизином Е. coli. Использование принципиально новой модели для изучения протекгивных свойств рибосом позволило установить, что оптимальные дозы и режимы иммунизации, формирующие протекцию в условиях экспериментальных генерализованных и локализованных инфекций по данным литературы, в условиях острой интоксикации а-гемолизином Е. coli протекцию не индуцируют (таблица 1). Вместе с тем, оптимальные дозы (для мышей — 1 нг), введённые за 1 час до интоксикации оказывали протективный эффект, защищая до 56,7±4.2% животных от развития ДВС-синдрома. Столь быстрое развитие протективного эффекта и непродолжительное его сохранение свидетельствует о том, что в формировании антитоксической защиты на данной модели играют роль механизмы неспецифической резистентности. То есть, развивался феномен тахифилаксии к гемолизину. Такой способностью обладали только рибосомы гемолитического штамма Е. coliDHl, но не штамма Е. coli MRE600, который а-гемолизин не продуцирует. Также была установлена более низкая антитоксическая протективная активность рибосом, выделенных из штамма Е. coli DH1 методом гель-фильтрации. Показатель протекции при однократном введении I нг рибосом за I час до интоксикации составил 56,7±4,2% для 70S рибосом штамма Е.coliDHl. полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования, и 36,7±42% для 70S рибосом штамма Е.тоЦ DH1, полученных методом гель-фильтрации. Различия показателей протекции были достоверны (р<0,05; t = 3367). Это позволяет предполагать, что в процессе хроматографического фракционирования рибосомный материал частично утрачивает некий компонент, играющий определённую роль в защите от a-гемолизина in vivo. Принципиально важным является факт угнетения тахифилаксии при использовании высоких доз рибосом, что также соответствует известным данным литературы, полученным на моделях локализованных и генерализованных инфекций. Такая своеобразная зависимость протективного эффекта от дозы, когда малые концентрации рибосом вызывают максимальный эффект, а высокие дозы, напротив, тормозят его, позволяет утверждать, что

Таблица 1

Зависимость протектнвного антитоксического эффекта

полученных различными методами препаратов 70S рибосом различных штаммов Е. coli от дозы препарата, кратности его введения и периода от его введения до введения а-гемолнзииа

№ схемы Доза 70S рибосом (мкг на 1 мышь) Кратность введения 70S рибосом Доза а-гемолизина, DLso Период от введения 70S рибосом до введения a-гемолизина, час Показатель протекции (% выживших животных)

DH1 * DH1** MRE600**

1. 100 1 2 1 10,0 ±0,0 0,0 0,0

2. 100 1 2 24 6,7 ± 4,2 0,0 0,0

3. 1 1 2 1 22,4 ±2,1 20,0 ± 0,0 0,0

4. 1 1 ■ 2 24 13,3 ±4,2 10,0 ±0,0 0,0

5. 0,001 2 1 56,7 ± 4,2 36,7 ±4,2 0,0

6. 0,001 1 2 24 43,3 ± 4,2 30,0 ± 0,0 0,0

7. 0,001 1 2 120 22,4 ±2,1 16,7 ±4,2 0,0

8. 0,001 2 2 120, 240 13,3 ±4,2 3,3 ± 4,2 0,0

9. 0,001 3 2 120, 240,360 0,0 0,0 0,0

10. 0 0 2 0 0,0 0,0 0,0

— Рибосомы указанного штамма Е. coli получены методом дифференциального ультрацентрифугирования;

— Рибосомы указанного штамма Е. coli получены методом гель-фильтрации.

обнаруженная тахифилаксия — результат опосредованной рибосомами активации механизмов экстренной защиты макроорганизма.

Исследование антитоксических протективных свойств препаратов бактериальных рибосом на модели гемолиза in vitro. Быстрота развития протективного эффекта и непродолжительность его сохранения дали основание предположить, что в процессе развития протекции существенную роль играют механизмы специфического связывания и инактивации токсина непосредственно компонентами рибосомного материала. Для подтверждения этого исследовали гемолитическую активность а-гемолизина in vitro как в отношении нативных эритроцитов, так и в отношении эритроцитов крови, предварительно инкубированной с рибосомами штаммов Е. coli DH1 и MRE600 (таблица 2).

Таблица 2

Антитоксическая протективная активность 70S рибосом Е. coli in vitro

Состояние эритроцитов, подвергнутых гемолизу а-гемолизином: Гемолитическая активность а-гемолизина, HU

преинкубированные с 1 нг рибосом штамма Е. coli DH1 (УЦФ) 24,945±3,763

Е. coli DH1 (ГФ) 42,339± 1,834

Е. coli MRE600 (ГФ) 96,098± 14,898

преинкубированные с 100 нг рибосом штамма Е. coli DH1 (УЦФ) 108,342±8,655

Е. coli DH1 (ГФ) 105,651±10,119

Е. coli MRE600 (ГФ) 107,449±6,620 iÖ7,596±12,213.....

нативные

Примечание: (УЦФ) — рибосомы получены ультрацентрнфугированием. (ГФ) — гель-фильтрацией.

Полученные данные свидетельствали о том, что малые дозы рибосом гемолитического штамма кишечной палочки БЫ1 проявляли антитоксический эффект, достоверно снижая гемолитическую активность а-гемолизина: в 4313 раз (р<0,02; 1 = 5,379) при использовании дифференциального ультрацентрифугирования и в 2,541 раза (р<0,05; I = 4,347) при использовании гель-фильтрации в качестве способа вьшеления рибосомного материала. Увеличение дозы рибосом

в 100 раз отменяло указанный эффект. Антитоксической активностью обладали только рибосомы гемолитического штамма, независимо от способа получения рибосомного материала, но не препараты, выделенные из штамма Е. coli MRE600 (р<0,5; t = 1,358). Вероятно, механизмы протекции опосредованы активацией клеток. крови или компонентов плазмы, а обнаруженный нами эффект снижения гемолитической активности токсина при использовании доз рибосом связан с тем, что нами использовалась именно нативная кровь, а не отмытые эритроциты.

Иммунологическая специфичность антирибосомныхсывороток. В сыворотке кроликов, иммунизированных рибосомами штамма Е. col iDH1, полученными методами- дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, обнаруживались антитела к рибосомам гомологичного штамма в титре 1:16 — 1:32. Указанные сыворотки не реагировали с рибосомами негемолитического штамма Е. coli MRE600, которые, видимо, не имеют в своей структуре антигенных детерминант, специфически взаимодействующих с антирибосомными антителами, полученными к 70S рибосомам штамма Е. coli DH1. Предполагая наличие в составе 70S рибосом антигенных детерминант самого а-гемолизина, мы провели эксперименты по взаимодействию антирибосомных антител с а-гемолизином Е. coli в реакции двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони. Через 18 часов обнаруживались полосы преципитации - между сывороткой кроликов, иммунизированных препаратами 70S рибосом штамма Е. coli DH1 и а-гемолизином (рис.2). Способность полученных антирибосомных антител защищать мышей от разрешающей дозы выясняли в реакции

нейтрализации токсина (таблица 3). Оказалось, что 100% зашиты мышей от действия 2DL50 a-гемолизина после его преинкубации' с антирибосомными антителами добиться не удалось. Максимальная выживаемость обеспечивалась кроличьими гипериммунными сыворотками до разведения 1:4 и составляла 56,67±4,184% и 53,33±4,18% для препаратов, полученных ультрацентрифугированием и гель-фильтрацией соответственно.- Разница между полученными показателями недостоверна (р>0,5; t = 0,563). Это позволяет говорить о том, что метод выделения рибосом не влияет на их иммуногенный потенциал.

1:2

1:2

1:64 i:4

1:64

1:4

1:32

1:8

1:16

1:16

а)

б)

Рис. 2. Реакция двойной радиальной нммунодиффузии по Ухтерлонп гемолизина штамма Е. coliDHl с сывороткой кролика, иммунизированного препаратом 70S рибосом штамма Е. coliDHl, полученного методами дифференциального ультрацентрифугирования (а) и гель-фильтрации (б). Гемолизин внесён;в центральные лунки, антисыворотка — в периферические лунки. Двукратные разведения сыворотки (от 12 до 1:64) обозначены на рисунке.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРЕПАРАТИВНОМУ ПОЛУЧЕНИЮ 70S РИБОСОМ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕДИЩШСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Для получения препаратов тотальных 70S рибосом, обладающих высокой протективной активностью, следует использовать вирулентные штаммы возбудителя. Перспективно создавать генетически модифицированные микроорганизмы с заданным набором факторов вирулентности на основе иламмов Е. coli MRE600 ИЛИ Е. coli A19, которые отличаются крайне низкой активностью эндогенных РНКаз, что принципиально важно для сохранения структурной целостности рибосомных частиц. Собирать биомассу для выделения рибосомного материала "следует до начала поздней логарифмической фазы роста культуры. Все этапы процесса выделения рибосом следует вести строго на холоде в асептических условиях. Разрушение бактериальных клеток следует проводить методом баллистической дезинтеграции или раздавливанием с использованием Х-пресса. Тщательности дезинтеграции биомассы следует уделять особое внимание. Для выделения рибосом из клеточного лизата целесообразно использовать метод гель-

Таблица 3

Сравнительная характеристика токсиннейтрализующего эффекта аитирибосомных антнсывороток, полученных иммунизацией кролика фракциями 70S рибосом штамма Е. coli DH1, выделенных методами дифференциального ультрацеитрнфугкрования и гель-фильтрацкн в опыте нейтрализации токсина на мышах in vivo

№ схемы Доза a-гемолизина, DL5o Титр антисыворотки Показатель протекции (% выживших животных)

DH1 * DH1**

1. 2 1:1 ? 6,7 ± 4,2 0,0

2. 2 1:2 22,4 ± 2,1 16,7 ±4,2

3. 2 1:4 56,7 ± 4,2 53,3 ± 4,2

4. 2 1:8 36,7 ± 4,2 30,0 ± 0,0

5. 2 1:16 10,0 ±0,0 3,3 ± 4,2

6. 2 0 0,0 0,0

* — Антисыворотки получены иммунизацией кролика фракциями 70S рибосом штамма Е. coliDHl, выделенных методом дифференциального ультрацентрифугирования;

** — Антисыворотки получены иммунизацией кролика фракциями 70S рибосом штамма Е. coliDHl, выделенных методом гель-фильтрации.

фильтрации на колонке с параметрами 28*350 мм, заполненной сефадексом G-200. используя в качестве элюента буферный водный раствор следующего состава: трис HCl — 10 мМ, рН=7,4; СаС12 — 100 мМ; магния ацетат — 10 мМ: поливинилсулъфат — 100 мкг/мл. Оптимальный объём однократно наносимого на колонку лизата должен составлять 3 — 3,5 мл. Увеличение наносимого на колонку количества лизата может привести к недостаточно чёткому разделению хроматографических пиков и снижению качества препарата, а уменьшение — к снижению мощности процесса. При таких параметрах хроматографического процесса скорость элюции должна составлять 15 — 20 мл/ч. Все собранные фракции следует подвергать спектрометрическому исследованию в ультрафиолетовой части спектра, снимая кривую поглощения в диапазоне 312 — 213 нм, сохраняя только фракции, спектрограммы которых имеют классический внешний вид, с отношением ОСЬк/СЮц} и ODja/'ODjto, равным 1,8 — 2. В зависимости от условий эксперимента, полученные препараты 70S рибосом следует либо сохранять замораживанием при -20°С, либо асептически расфасовывать по ампулам и подвергать лиофилизации, после чего запаивать ампулы под вакуумом.

ВЫВОДЫ

1. Метод гель-фильтрации позволяет получать из клеточного лизата различных штаммов кишечной палочки препараты 70S рибосом с типичными физико-химическими параметрами рибосомного материала и использовать указанные препараты для иммунобиотехнологическнх целей.

2. Острая внутрибрюшинная интоксикация мышей а-гемолизнном Е. coli и гемолиз эритроцитов in vitro являются адекватными элементарными моделями для изучения антитоксической протективной активности 70S рибосом гемолизирующих Е. coli.

3. Препараты 70S рибосом, полученные из гемолитического штамма Е. coli методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, способны блокировать токсическое действие Е. coli, как в экспериментах in vivo, так и in vitro.

4. Индукция тахифилаксии мышей к действию d-Гемо.ВПИНа coli

опосредована только малыми дозами 70S рибосом гомологичного штамма.

5. Между способом выделения фракции 70S рибосом из клеточного лизата и протективной активностью полученных рибосомных препаратов существует взаимосвязь: 70S рибосомы Е. coli, полученные из гемолитического штамма методом гель-фильтрации проявляют менее выраженную протективную активность по сравнению с аналогичными препаратами, полученными с помощью дифференциального ультрацентрифугирования в экспериментах по защите от а-гемолизина гомологичного штамма на элементарной модели in vivo и in vitro.

6. Гипериммунные кроличьи антисыворотки к 70S рибосомам гемолитического штамма кишечных палочек (независимо от способа выделения рибосом) проявляют иммунологическую специфичность к гомологичного штамма Е. coli.

7. Гипериммунные кроличьи антисыворотки к препаратам 70S рибосом, полученных из гемолитического штамма Е. coli, как методом дифференциального ультрацентрифугирования, так и методом гель-фильтрации, обеспечивают защиту от гомологичного штамма (обладают токсиннейтрализующей активностью) в опыте нейтрализации токсина in vivo на белых мышах.

Список публикации по теме диссертации

1. Скобликов Н. Э. Активность гемолизинов из рекомбинантных штаммов Escherichia coli // Материалы 60-й юбилейной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Актуальные вопросы медицинской науки и здравоохранения». — Краснодар. — 1999. — С. 99.

2. Крылов В.П., Скобликов Н.Э., Егорова СВ. Антитоксический протективный эффект бактериальных рибосом // Материалы научно-практической конференции молодых учёных «Развитие социально-культурной сферы Северо-Кавказского региона». — Краснодар. — 2001. — С. 193-195.

3. Крылов В. П., Скобликов Н. Э., Кошелева С. В. Методика расчёта LDjo бактериальных гемолитических токсинов для лабораторных животных // Материалы научно-практической конференции молодых учёных «Развитие социально-культурной сферы Северо-Кавказского региона». — Краснодар. — 2001. — С. 202-204.

4. Орлов В. Г., Крылов В. П., Скобликов Н. Э. Перспективы использования препаратов бактериальных рибосом в современной вакцинологии // Кубанский научный медицинский вестник. — 2001. — № 4 (58). — С. 39-41.

5. Крылов В.П., Орлов В.Г., Скобликов Н.Э. Защитный эффект бактериальных рибосом от действия альфа-гемолизина кишечной палочки in vitro и in vivo // Аллергология и иммунология. — 2001. — Т.2. — №2. — С. 143.

6. Орлов В. Г., Крылов В. П., Сиюхова Ф. Ш., Качанова О. А., Скобликов Н. Э. Иммуногенные и иммунотропные эффекты бактериальных. рибосом // International Journal on Immunorehabilitation — 2002. — V.4. — № 1. — P. 45.

7. Orlov V. G., Krylov V. P., Siyuhova F. Sh., Kachanova O. A., Skoblikov N. E. Immunogenic and immunotropic effects of bacterial Ribosomes // Abstracts of the VIII International Congress on Immunorehabilitation «Allergy, Immunology and Global Network», April 21-24,2002, Cannes, France.

8. Крылов В. П., Орлов В. Г., Качанова О. А., Сиюхова Ф. Ш.. Скобликов Н. Э. Бактериальные рибосомы как основа иммунобиологических препаратов нового класса // Аллергология и иммунология. — 2003. — Т.4. — №2. — С. 101.

9. Крылов В. П., Орлов В. Г., Качанова О. А., Сиюхова Ф. Ш., Скобликов Н. Э. Перспективы разработки иммунобиологических препаратов нового класса на основе бактериальных рибосом // Материалы научно-практической конференции «Современное состояние российской биотехнологии». — Москва. — 2003. — С. 21.

10. Скобликов Н. Э., Крылов В. П., Кошелева С. В. Протективная активность бактерильных рибосом и биотехнологические основы разработки рибосомных иммунобиологических препаратов // Тезисы докладов и стендовых сообщений XVI зимней молодёжной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». — Москва. — 2004. — С. 92-93.

ММА им. И. М. Сеченова Подписано в печать 2004 г.

Тираж 100 экземпляров

*-?1б9

Актуальность темы

Наиболее эффективным и экономичным способом снижения инфекционной заболеваемости является использование иммунобиологических препаратов (Воробьёв А. А., 1999;

Покровский В. И., Семёнов Б. Ф., 1999), прежде всего — вакцины. Совершенствование вакцинных препаратов связано с поиском новых эффективных иммуногенов, обладающих протективной активностью. Среди протективных антигенов, используемых для производства современных химических вакцин особое место занимают бактериальные рибосомы (Медуницын Н. В., 1999).

К середине XX века была окончательно выяснена роль рибосом, как главного и наиболее сложного компонента трансляционной системы (Шапвиль Ф., Энни Э.-Л., 1977; СпиринА. С., 1986). Среди свойств рибосом особое место занимает феномен рибосомной протекции, который заключается в способности рибосом, выделенных из патогенных микроорганизмов и введённых в восприимчивый макроорганизм, защищать его от соответствующей гомологичной, а в некоторых случаях и гетерологичной инфекции.

Начиная с первого сообщения (Youmans A. S. и Youmans G. Р., 1965), изучение иммунопротективных свойств рибосом оформилось в самостоятельное направление современной вакцинологии (Левенсон В. И., Хазанова В. В., 1991; Eisenstein Т. К. et al., 1976; Lieberman М. М. et al., 1979; Dussourd d'Hinterland L., 1980; Gregory R. L., 1986; Segal E., 1989; Nicolaeva L. V., Savel'ev E. P., 1991; Normier G. et al., 1992 и др.).

К бесспорным достоинствам рибосомных препаратов можно отнести их низкую токсичность и реактогенность, высокую иммуногенность и способность создавать перекрёстный иммунитет к различным серотипам возбудителей в пределах вида (Левенсон В. И. и др., 1988; Бакулин И. Н.,

Сергеева Т. И., 1990; Оветчин П. В., Цыганенко А. Я., 1984). Препараты на основе бактериальных рибосом в настоящее время вышли за рамки классических вакцин, широко применяются в качестве иммуномодуляторов и демонстрируют свою эффективность (Хаитов Р. М. и др., 1994; Гордиенко С. М., Ласица О. И., Федорчук А. Г., 1995). Перспективность разработки рибосомных иммунобиологических препаратов обусловлена также необходимостью использования для коррекции различных иммунопатологических состояний средств, нормализующих нуклеиновый обмен, поскольку иммунные расстройства связаны с нарушениями метаболизма, прежде всего — нуклеинового обмена (Караулов А. В., 1999). Высокая протективная и иммуномодулирующая активность бактериальных рибосом позволяет рассматривать их в качестве основы для конструирования вакцинных препаратов нового поколения.

Одной из главных проблем развития данного направления является сложность получения рибосомного материала и, как следствие, высокая себестоимость соответствующего целевого продукта. Получивший наибольшее распространение метод дифференциального ультрацентрифугирования клеточного лизата бактерий позволяет получать препараты высокого качества, однако является весьма громоздким и требующим дорогостоящего оборудования, сложного в эксплуатации. Исходя из того, что технология дифференциального ультрацентрифугирования не может быть основой для вакцинного производства, так как производительность этого способа резко ограничена небольшой ёмкостью высокоскоростных роторов, исследователями велись поиски альтернативных методов выделения рибосомных фракций для иммунобиотехнологических целей. Прежде всего, стали рассматриваться варианты химического фракционирования (Лиходед В. Г. и др., 1973; Левенсон В. И. и др., 1984), которые, несмотря на преимущества, обладают рядом недостатков. Химическое фракционирование отличается низким выходом продукта (Орлов В. Г., 1991) и, кроме того, не позволяет получить интактную фракцию рибосом (Крылов В. П., 1996), что затрудняет его внедрение в промышленное производство рибосомных иммунобиологических препаратов. В то же время известно, что при исследовании структурно-функциональной организации прокариотических рибосом успешно применялся метод эксклюзионной хроматографии на колонке (гель-фильтрации) для получения препаративных количеств рибосомного материала (Jelenc Р. С., 1980). Поэтому целесообразно разработать методику получения экспериментальных рибосомных препаратов с помощью гель-фильтрации и исследовать протективные свойства целевого продукта.

Несмотря на множество публикаций, посвященных изучению разных аспектов феномена рибосомной протекции, вопрос о природе протективной активности рибосом, а также о механизмах её реализации остаётся до настоящего времени неразрешённым. Исследования, проводимые на различных моделях, дали обширный материал для построения гипотез о возможных механизмах рибосомной протекции (Youmans A. S., Youmans G. Р., 1965; Gonggrijp R. et al., 1980, 1981; AngermanC., Eisenstein Т., 1980; Robert D. et al., 1981; Venneman M. R., Bigley N. J., 1969; Smith R. L. et al., 1974; Левенсон В. И. и др., 1988, 1991; Крылов В. П., 1996). Однако абсолютное большинство исследований проводилось с рибосомами, выделенными из вирулентных микроорганизмов, обладающих широким набором факторов патогенности. Это обстоятельство не позволяет вскрыть механизмы рибосомной протекции на молекулярном уровне, принимая во внимание, что протективный иммунитет обусловлен способностью иммунной системы блокировать реализацию патогенного потенциала возбудителя в макроорганизме (Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А., Сидорович И. Г., 2000). Представляется очевидным, что исследования на моделях, связанных с действием только одного фактора патогенности, более перспективны в плане расшифровки молекулярных механизмов протективного действия бактериальных рибосом. К таким моделям можно отнести проявление биологической активности бактериальных токсинов in vivo и in vitro.

К настоящему времени крайне ограничено количество исследований протективной активности 70S рибосом на моделях токсического действия бактериальных экзотоксинов: известны эксперименты с энтеротоксином штамма Е. coli 015 (Лиходед В. Г., Табачник А. Л., Темпер Р. М., 1974) и токсином Clostridium perfringens типа «А» (Ефимова М. Г., 1998).

В качестве основы для модели изучения антитоксической рибосомной протекции нам представляется весьма привлекательным использование а-гемолизина Е. coli. Этот токсин играет важную роль в инфекционной патологии, являясь одним из главных факторов вирулентности уропатогенных штаммов кишечной палочки, ответственных за развитие сепсиса, токсического отёка лёгких, поражении почек и нижних отделов мочевыводящего тракта эшерихиозной этиологии (Бондаренко В. М., Голубев А. В., 1988).

Имеется значительное количество публикаций, посвящённых расшифровке структуры биомолекулы а-гемолизина Е. coli, изучению генетического контроля её синтеза и механизма действия (Палкина Н. А., Кушнарёв В. М., Мельников С. Я., 1975; Палкина Н. А., 1976; Ратинер Ю. А., Канарейкина С. К., Бондаренко В. М., Голубева И. В., 1976; Фаворов В. В. и др., 1984; Шмитт К. К., Мейсик К. С., О'Браэн А. Д., 2000). Исследование антитоксической протективной активности 70S рибосом на модели токсического действия а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки позволит углубить представления о механизмах реализации протективного феномена бактериальных рибосом.

Цель и задачи исследования, основные экспериментальные подходы

Целью данной работы являлось сравнение иммунопротективных эффектов препаратов 70S рибосом, выделенных из кишечной палочки (Escherichia coli) методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации), на модели интоксикации лабораторных животных а-гемолизином Е. coli для совершенствования качества и технологии получения медицинских иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработать схему получения 70S рибосом методом гель-фильтрации для изучения их иммунопротективных свойств.

2. Провести сравнительный анализ физико-химических параметров препаратов 70S рибосом Е. coli, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.

3. Подобрать схемы иммунизации лабораторных животных и экспериментальные модели действия а-гемолизина штамма Е. coli, используемого для выделения 70S рибосом.

4. Выявить различия способности обеспечивать защиту от действия а-гемолизина Е. coli препаратов 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.

Основные экспериментальные подходы, применяемые для решения поставленных задач, заключались в:

• выделении рибосомных фракций иследуемых штаммов бактерий методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации;

• спектрофотометрическом, седиментационном и электрофоре-тическом анализе качества препаратов 70S рибосом, полученных различными методами;

• получении препаративных количеств а-гемолизина штамма Е. coli DH1, несущего плазмиду гемолиза pRDl;

• оценке антитоксической защиты от летального действия а-гемолизина Е. coli, вызываемой введением лабораторным животным препаратов 70S рибосом, полученных различными методами, на экспериментальной модели;

• оценке способности препаратов 70S рибосом, полученных различными методами, обеспечивать защиту эритроцитов от действия а-гемолизина Е. coli in vitro;

• получении кроличьих сывороток, содержащих антитела против 70S рибосом, полученных различными методами.

Новизна результатов

Впервые проведён сравнительный анализ иммунопротективных свойств 70S рибосом различных штаммов кишечной палочки, полученных методом дифференциального ультрацентрифугирования и методом гель-фильтрации.

Впервые обнаружено снижение антитоксической протекции препаратов 70S рибосом, полученных методом гель-фильтрации, по сравнению с препаратами, полученными методом дифференциального ультрацентрифугирования, на модели острой интоксикации белых мышей а-гемолизином Е. coli.

Впервые установлена способность препаратов 70S рибосом, полученных методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки in vivo и in vitro.

Впервые установлена способность антирибосомных антител, полученных иммунизацией кролика препаратами 70S рибосом, полученными методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, нейтрализовать гемолитическую активность а-гемолизина гомологичного штамма кишечной палочки in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту

- Метод гель-фильтрации позволяет получать 70S рибосомы для иммунобиотехнологических целей.

- 70S рибосомы гемолитического штамма кишечной палочки независимо от способа получения рибосомного материала, способны индуцировать тахифилаксию мышей к действию а-гемолизина и нейтрализовать in vitro гемолитическую активность а-гемолизина.

- Протективная активность рибосомных препаратов зависит от способа фракционирования клеточного лизата и наличия факторов вирулентности у штамма-источника рибосомного материала.

Научно-практическое значение работы

Метод гель-фильтрации клеточного лизата обладает по сравнению с методом, дифференциального ультрацентрифугирования рядом, технологических преимуществ, позволяющих упростить процесс получения препаратов бактериальных рибосом для иммунобиотехнологических целей.

Способность 70S рибосом из гемолитических штаммов кишечной палочки вызывать в эксперименте на мышах тахифилаксию к а-гемолизину Е. coli и нейтрализовать in vitro гемолитическую активность данного бактериального экзотоксина открывает перспективы разработки новых антитоксических препаратов на основе бактериальных рибосом.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследований опубликованы в открытой печати (10 работ). Основные положения диссертации докладывались на научно-практических конференциях молодых ученых и студентов Кубанской государственной медицинской академии (г. Краснодар, 1999); Научно-практической конференции молодых учёных "Развитие социально-культурной сферы Северо-Кавказского региона" (Краснодар, 2001); IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001); VIII международном конгрессе по иммунореабилитации «Аллергия, Иммунология и Глобальная Сеть» (Cannes, France, 2002); V Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003); XVI зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004).

Результаты исследований внедрены в научную работу ЦНИЛ Кубанской государственной медицинской академии (отдел экспериментальной и клинической иммунологии, отдел молекулярной биологии бактерий), Российского центра функциональной хирургической гастроэнтерологии МЗ РФ (отдел клинической микробиологии, отдел клинической и экспериментальной иммунологии), отдела микробиологического синтеза Северо-Кавказского НИИ биотехнологии и химии.

Новые данные о механизмах реализации антитоксического протективного эффекта, индуцированного препаратами бактериальных рибосом, используются учебном процессе на кафедре микробиологии Кубанской государственной медицинской академии и кафедре генетики и микробиологии Кубанского государственного университета.

выводы

1. Метод гель-фильтрации позволяет получать из клеточного лизата различных штаммов кишечной палочки препараты 70S рибосом с типичными физико-химическими параметрами рибосомного материала и использовать указанные препараты для иммунобиотехнологических целей.

2. Острая внутрибрюшинная интоксикация мышей а-гемолизином Е. coli и гемолиз эритроцитов in vitro являются адекватными элементарными моделями для изучения антитоксической протективной активности 70S рибосом гемолизирующих Е. coli.

3. Препараты 70S рибосом, полученные из гемолитического штамма Е. coli методами дифференциального ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, способны блокировать токсическое действие а-гемолизина Е. coli, как в экспериментах in vivo, так и in vitro.

4. Индукция тахифилаксии мышей к действию а-гемолизина Е. coli опосредована только малыми дозами 70S рибосом гомологичного штамма.

5. Между способом выделения фракции 70S рибосом из клеточного лизата и протективной активностью полученных рибосомных препаратов существует взаимосвязь: 70S рибосомы Е. coli, полученные из гемолитического штамма методом гель-фильтрации проявляют менее выраженную протективную активность по сравнению с аналогичными препаратами, полученными с помощью дифференциального ультрацентрифугирования в экспериментах по защите от а-гемолизина гомологичного штамма на элементарной модели in vivo и in vitro.

6. Гипериммунные кроличьи антисыворотки к 70S рибосомам гемолитического штамма кишечных палочек (независимо от способа выделения рибосом) проявляют иммунологическую специфичность к а-гемолизину гомологичного штамма Е. coli.

7. Гипериммунные кроличьи антисыворотки к препаратам 70S рибосом, полученных из гемолитического штамма Е. coli, как методом дифференциального ультрацентрифугирования, так и методом гель-фильтрации, обеспечивают защиту от а-гемолизина гомологичного штамма (обладают токсиннейтрализующей активностью) в опыте нейтрализации токсина in vivo на белых мышах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРЕПАРАТИВНОМУ ПОЛУЧЕНИЮ 70S РИБОСОМ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕДИЦИНСКИХ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Для получения препаратов тотальных 70S рибосом, обладающих протективными свойствами в отношении определённых антигенов, мы ремокомендуем использовать высоковирулентные штаммы микроорганизмов.

Желательно, чтобы подобранные штаммы были РНКазонегативными, чтобы свести к минимуму риск деструкции рибосомных частиц эндогенными рибонуклеазами. Культивирование биомассы подобранных штаммов следует вести до до начала поздней логарифмической фазы роста культуры на жидкой питательной среде. Все этапы процесса выделения рибосом из бактериальной биомассы следует вести строго на холоде. Разрушение бактериальных клеток следует проводить методом баллистической дезинтеграции или раздавливанием с использованием Х-пресса. Тщательности дезинтеграции биомассы следует уделять особое внимание.

Для выделения рибосом из клеточного лизата рекомендуем использовать метод гель-фильтрации с параметрами колонки 28x350 мм, заполненной сефадексом G-200, используя в качестве элюента буферный раствор следующего состава: трис НС1 —10 мМ, рН = 7,4; калия хлорид — 100 мМ; магния ацетат — 10 мМ; поливинилсульфат— 100 мкг/мл.

Оптимальный объём однократно наносимого на колонку лизата должен составлять 3—3,5 мл. Увеличение наносимого на колонку количества лизата может привести к недостаточно чёткому разделению хроматографических пиков и снижению качества препарата, а уменьшение — к снижению мощности процесса. При таких параметрах хроматографического процесса скорость элюции должна составлять 15 — 20 мл/ч.

Все собранные фракции следует подвергать спектрометрическому исследованию в ультрафиолетовой части спектра, снимая кривую поглощения в диапазоне 312,5—213 нм, сохраняя только фракции, спектрограммы которых имеют классический внешний вид, с отношением OD26o/OD235 и OD28o/OD26o, равным 1,8 — 2.

В зависимости от условий эксперимента, полученные препараты 70S рибосом следует либо сохранять замораживанием при -20°С, либо асептически расфасовывать по ампулам и подвергать лиофилизации, после чего запаивать ампулы под вакуумом.