Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Сравнительная гигиеническая оценка фотосенсибилизаторов и продуктов их фототрансформации на примере метиленового голубого и холиниометилзамещенного фталоцианина цинка

На правах рукописи

ГОЛОВАЧ ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ФОТОТРАНСФОРМАЦИИ НА ПРИМЕРЕ МЕТИЛЕНОВОГО ГОЛУБОГО И ХОЛИНИОМЕТИЛЗАМЕЩЕННОГО ФТАЛОЦИАНИНА ЦИНКА

14.00.07-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 Л ' " ' "

' ■ ■ • .., , .. V

Москва - 2009

003468990

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Синицына Оксана Олеговна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ревазова Юлия Анатольевна НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН

доктор медицинских наук Хамидулина Халидя Хизбулаевна ФГУЗ «Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ» Роспотребнадзора

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова РОСЗДРАВА

Защита диссертации состоится «28» мая 2009 г. в Д часов на заседании диссертационного совета Д 001.009.01 в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан «_»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор 'Х&Г)^С^СЛ Беляева Наталья Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обеспечение населения питьевой водой, безопасной в эпидемическом отношении, определяет необходимость совершенствования методов обеззараживания (Г.Г.Онищенко, 2003; WHO, 2003; Рахманин Ю.А. и соает., 2004). Применяемые в настоящее время физические и химические методы обеззараживания воды сопряжены с рядом общеизвестных недостатков. В частности, наиболее распространённые во всём мире реагенты на основе активного хлора не только высокотоксичны, вызывают аллергические реакции при перехлорировании, раздражают слизистые оболочки, но и приводят к образованию в воде хлорорганических соединений, многие из которых обладают мутагенной и/или канцерогенной активностью (Красовский Г.Н. и соавт., 1987; Жолдакова З.И. и соавт., ¡999).

Альтернативные способы обеззараживания - озонирование и ультрафиолетовое облучение, также не универсальны. Несмотря на то, что ультрафиолетовое облучение оказывает на большинство химических веществ гораздо более слабое трансформирующее действие, чем активный хлор (Жолдакова З.И., Полякова Е.Е. и соавт., 2000), в дальнейшем возможна реактивация микроорганизмов. При озонировании также отсутствует остаточное действие обеззараживания и существует опасность образования канцерогенных броматов. В связи с этим, продолжается поиск новых эффективных и безопасных методов обеззараживания воды.

В последние годы предложена новая физико-химическая технология обеззараживания воды фотодннамическим методом. Принцип метода (патент №2235688 от 10.09.2004 г.) основан на тропности к клеткам фотодинамически активных красителей (химических сенсибилизаторов), которые под действием света в присутствии кислорода генерируют синглетный кислород и другие его активные формы, окисляющие биомолекулы и вызывающие гибель микроорганизмов по месту локализации (Atherton S. et al, 1993; Lee Y.el al, 1995; Buchko G.M. et al, 1995; Wainwright M. Et al, 1997; Кузнецова H.A., Катя О.Л., 1998). Обеззараживание является результатом физико-химических реакций, протекающих в растворе.

Одними из наиболее эффективных дезинфектантов для фотодинамического обеззараживания воды являются красители из тиазинового и тетраазопорфиринового рядов - метиленовый голубой (МГ) и холиниометилзамещенный фталоцианин цинка (ХМ-ФЦ) (Kuznetsova N„ Artemova Т. et. al 2003; Артемова Т.З. и др. 2004).

Согласно международной директиве REACH (регистрация, оценка и авторизация химических веществ) все химические вещества, применяемые в промышленности, должны проходить процедуру оценки их опасности (Хамидулина Х.Х., 2008), включая способность вызывать отдаленные эффекты (Ревазова Ю.А. и соавт., 2008).

Вместе с тем, несмотря на широкое применение красителей в фармакологии, их опасность при длительном поступлении в организм не изучена. Кроме того, в процессе фотохимических реакций происходит трансформация красителей, степень фотолиза которых и спектр образующихся продуктов может зависеть от длительности облучения. При этом наиболее важный с гигиенических позиций аспект этих процессов - сравнительная опасность исходных веществ и продуктов их трансформации (Жолдакова З.И., Синицына О.О. и соавт., 2002), также является не изученным.

Важным критерием допустимости применения средств обеззараживания воды, является соотношение «эффективная/безопасная концентрация» (Синицына О.О. и соавт., 2006).

В связи с вышеизложенным, целью данной работы является сравнительная гигиеническая оценка фотосенсибилизаторов и продуктов их трансформации, образующихся под действием видимого света, на примере метиленового голубого и холиниометилзамещенного фталоцианина цинка.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. На примере МГ установить зависимость изменения пороговых концентраций по органолептическому и общесанитарному показателям вредности от времени облучения видимым светом.

2. Изучить токсичность и способность к кумуляции МГ и ХМ-ФЦ при однократном действии.

3. Дать сравнительную оценку токсичности сенсибилизаторов и продуктов их фототрансформации при длительном энтеральном поступлении в организм.

4. На основании сопоставления эффективных в отношении микроорганизмов и безопасных концентраций обосновать рекомендации о возможности применения МГ и ХМ-ФЦ для обеззараживания воды.

Научная повита работы. Впервые показано, что при облучении видимым светом веществ из тиазинового и тетраазопорфиринового ряда образуются более опасные продукты их трансформации.

Установлены закономерности изменения их опасности в зависимости от времени воздействия видимого света.

Впервые показано, что одним из механизмов токсического действия МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фототрансформации на лабораторных животных является увеличение генерации активных форм кислорода.

Впервые выявлены мутагенные эффекты продуктов 25% фототрансформации МГ в опытах in

vivo.

Впервые выявлено эритроцитотоксическое действие продуктов фототрансформации ХМ-ФЦ.

Впервые показано, что ХМ-ФЦ и продукты его частичной фототрансформации обладают иммунотоксическим действием.

Обосновано, что при установлении ПДК и определении допустимости использования в практике хозяйственно-питьевого водоснабжения реагентов, способных к фототрансформации, следует учитывать время появления наиболее опасных компонентов в реальных условиях применения.

Практическая значимость. Доказана недопустимость обоснования ПДК МГ и ХМ-ФЦ в воде водных объектов.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проектов Методических указаний «Санитарно-эпидемиологические испытания (исследования) продукции, используемой в системах водоснабжения» и «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды».

Работа выполнена в лаборатории эколого-гигиенической оценки и прогнозирования токсичности веществ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина РАМН в рамках плановой научной темы № г/р 02200900946, а также при финансовой под держке Правительства Москвы.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на Форуме по гигиене и санитарии «ДЦД-2006» (Москва, 2006), Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Современные проблемы гигиены города, методология и пути решения» (Москва, 2006), II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007), V Специализированной конференции по оценке и контролю микрозагрязнений/опасных веществ в воде Международной водной ассоциации «MICROPOL & ECOHAZARD 2007» (Франкфурт-на-Майне, 2007), Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «ЭкоФорум-2008» (Санкт-Петербург, 2008).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение опасности МГ при частичной фототрансформации и снижение - при полном фотолизе.

2. Усиление токсичности ХМ-ФЦ с увеличением степени фототрансформации.

3. Механизм интоксикации МГ и ХМ-ФЦ, заключающийся в прооксидантном действии и влиянии на антиоксидантную систему, и сопровождающийся появлением специфических эффектов (МГ - мутагенный, ХМ-ФЦ - эритроцитотоксический и иммунотоксический).

4. Недопустимость применения МГ и ХМ-ФЦ для обеззараживания воды.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в центральной

печати, 3 тезисов и 1 за рубежом.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, приложений.

Текст изложен на 196 страницах, содержит 39 рисунков, 59 таблиц, 33 приложения. Библиография включает 203 источника, в том числе 99 иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами изучения служили красители тиазинового и тетраазопорфиринового рядов: метиленовый голубой (МГ) и холиниометилзамещенный фталоцианин цинка (ХМ-ФЦ), а также продукты их 25% и 100% фототрансформации (ПФТ25 и ПФТюо).

Для решения поставленных задач было проведено 3 серии острых опытов и 3 серии хронических экспериментов по изучению влияния красителей на организм теплокровных животных, а также 14 серий экспериментов по изучению влияния МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фототрансформации на органолептические свойства воды и процессы самоочищения водных объектов.

Количественная характеристика объектов, материалов и объема исследований представлены в таблице 1.

О процессах фототрансформации красителей судили по изменению электронных спектров поглощения их растворов в процессе облучения. Исследования проводили на спектрофотометре «5ресог6> на базе МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с к.б.н. Е.Е.Поляковой.

Эксперименты по изучению влияния МГ и продуктов его фототрансформации на органолептические свойства воды и процессы самоочищения водных объектов проводили в соответствии с МУ2.1.5.720-98.

Объектами токсикологических исследований являлись три вида лабораторных животных (свыше 1020 животных): белые нелинейные крысы, белые нелинейные мыши, морские свинки. Всего было использовано 580 белых крыс с массой тела 200+20 г., 400 мышей с массой тела 20-25 г., 60 морских свинок с массой тела 320-350 г.

Токсичность МГ и ХМ-ФЦ при энтеральном поступлении изучалась в острых и хронических экспериментах, ПФТ25 и ПФТюо - в хронических экспериментах. В острых опытах оценивалось, также кожно-резорбтивное действие МГ по смертельным эффектам и накоплению в организме.

Дозы веществ и продуктов их фототрансформации, исследованные в хронических экспериментах, выбирались с учетом эффективных бактерицидных концентраций (ХМ-ФЦ - 3 мг/л (Ки:пе1зоуа N. е/. а1„ 2003; Артемова Т.З. и др., 2004), МГ - 5 мг/л (патент №2235688 от 10.09.2004 г.)) и составили: МГ - 0,25; 0,05; 0,01 мг/кг, ПФТ25 МГ - 0,05; 0,01 мг/кг (1 серия); ПФТ25 МГ - 0,05; 0,01; 0,002 мг/кг, ПФТюо МГ - 0,05 мг/кг (2 серия); ХМ-ФЦ - 0,05; 0,01; 0,002 мг/кг, его ПФТ25 - 0,05; 0,01; 0,002 мг/кг, его ПФТюо - 0,05; 0,01 мг/кг (3 серия). Дозы продуктов фототрансформации сенсибилизаторов приведены в расчете на исходный краситель.

При выборе показателей, позволяющих оценить действие красителей и продуктов их трансформации на организм животных, руководствовались стремлением отразить, по возможности, состояние целостного организма, функций отдельных органов и систем, процессы интоксикации и детоксикации. Учитывая, что в результате сенсибилизации МГ и ХМ-ФЦ квантами видимого света происходит образование активных форм кислорода (АФК), особое внимание уделялось изучению возможных последствий их действия, а также состоянию антиоксидантной системы защиты организма.

Оценка функционального состояния организма животных осуществлялась по ключевым системам гомеостаза с использованием физиологических (вес, СПП, вертикальная активность), биохимических (интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции, уровень ЭН-групп, активность каталазы, холинэстеразы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, глутатионредуктазы, ацетилэстеразы, Ы-ацетил-р-О-глюкозаминидазы), гематологических (концентрация гемоглобина в крови, количество эритроцитов, лейкоцитов) и морфологических (печень, почки, тонкий кишечник (12-перстная и подвздошная кишка), толстая (ободочная) кишка, легкие, семенники) показателей. Гонадотоксическое действие сенсибилизаторов оценивалось по таким показателям, как относительная масса семенников, осмотическая резистентность и время подвижности сперматозоидов. В полиорганном микроядерном тесте (костный мозг, толстая кишка, мочевой пузырь), проведенном по окончании хронических экспериментов, изучали

Таблица I. Методы, объекты и объем исследований.

3N

Методы исследования .Объекты исследования Показатели Объем исследований

Спектрофотометрические МГ и ХМ-ФЦ Оптическая плотность, % трансформации 2 серии

Органолептические Опытные одораторы, дегустаторы; МГ и продукты фототрансформации Цветность, привкус, запах, прозрачность, образование пены на поверхности воды; пороговые концентрации 4 серии

Санитары о-химические Модельные водоемы, МГ и продукты фототрансформации БПК, концентрация ионов аммиака, нитритов, нитратов; пороговые концентрации 10 серий

Острый опыт Белые крысы-самцы, МГ (энтеральное и перкутанное поступление) и ХМ-ФЦ (энтеральное поступление) Смертельные эффекты, клиническая картина отравления, накопления в органах; ЛД50, I«« 60 крыс

Длительный токсикологический опыт (150 и 180 суток) Белые крысы-самцы, МГ, ХМ-ФЦ и продукты 25% и 100% фототрансформации Физиологические, гематологические, биохимические, морфологические, гонадотоксическое действие 580 крыс, 15 показателей

Морфологические Печень, почки, тонкий кишечник (12-перстная и подвздошная кишка), толстая (ободочная) кишка, семенники, легкие 114 крыс, 49 показателей

Цитотоксические (полиорганный микроядерный тест) В костном мозге - доля ПХЭ от всех эритроцитов, ПХЭ патологической формы; в толстом кишечнике - доля клеток с кариопикнозом, двуядерных клеток; в мочевом пузыре - доля двуядерных клеток, клеток с атипичной формой ядра и с перетяжкой ядра 80 крыс, 6 показателей

Цитогенентические (полиорганный микроядерный тест) Частота клеток с микроядрами и протрузиями в костном мозге, мочевом пузыре, толстой кишке 80 крыс, 2 показателя

Аллергенное, иммунотоксическое и раздражающее действие Морские свинки, белые мыши, МГ, ХМ-ФЦ и продукты 25% и 100% трансформ ации Наличие эффекта; показатель иммунотоксического действия (уровни содержания специфических - антител в сыворотке крови) 60 морских свинок, 400 мышей, 3 показателя

мутагенное и цитотокеическое действие веществ. В отдельной серии экспериментов оценивалось иммунотоксическое действие продуктов фототрансформации МГ, ХМ-ФЦ и продуктов его фотолиза по влиянию на гуморальное звено иммунитета (изменению способности к синтезу специфических IgO-антител), а также их аллергенное действие.

Результаты, полученные в токсикологических экспериментах, обрабатывались с помощью компьютерных программ "Statistica for Windows". Достоверность различий определяли по t критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Манна-Уитни. Количественный критерий значимости отклонений от контроля определялся с учетом степени пластичности (коэффициента вариации, С») показателей (И.М.Трахтенберг и др., 1991).

В ходе обработки полученных данных построены графические изображения с использованием различных видов диаграмм с применением стандартной программы Microsoft Excel-XP.

Личный вклад автора составляет более 80%. Часть исследований проводили совместно с сотрудниками лабораторий НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН под руководством д.б.н., проф. Н.Н.Беляевой, д.б.н. Л.П.Сычевой, д.б.н. Л.В.Хрипач, а также к.б.н. Е.Е.Поляковой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время доказано, что в процессе трансформации веществ в окружающей среде под влиянием естественных факторов (солнечная радиация, окисление молекулярным кислородом, микрофлора и т.п.), что в классической гигиене принято называть естественным самоочищением, могут образовываться не только менее (Towill L.E. et al, 1978; Красовский Г.Н. и др., 1985; Бочаров В.В. и др., 1988; Бочаров В.В., 1991), но и более опасные соединения (Костовецкий Я.И. и др., 1985; Синицына О.О., 1994; Жолдакова З.И. и др., 1998; Малышева А.Г., 1998).

Основываясь на этих данных, была высказана гипотеза, что в процессе фотохимических реакций, лежащих в основе фотодинамического метода обеззараживания воды, происходит изменение структуры не только биомолекул микробных клеток, но и трансформация самих красителей, степень фотолиза которых и спектр образующихся продуктов может определять опасность фотосенсибилизаторов. Поэтому исследования были направлены на изучение сравнительной опасности МГ и ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации.

О процессах фототрансформации красителей свидетельствовали изменения электронных спектров поглощения их растворов в процессе облучения. Необлученные растворы красителей имеют по 2 основных максимума поглощения: МГ - при 293 и 664 нм, ХМ-ФЦ - при 342 и 683 нм. С увеличением длительности освечивания уменьшалась интенсивность поглощения на этих длинах волн, что свидетельствует о трансформации молекул сенсибилизаторов. Таким образом, в процессе облучения видимым светом происходит не только сенсибилизация, но и трансформация красителей.

Анализ кривых электронных спектров поглощения позволил установить скорость трансформации МГ и ХМ-ФЦ. Длительность облучения растворов МГ и ХМ-ФЦ, необходимая для близкой к 100% трансформации красителей, составляла 10 часов. Учитывая, что в реальных условиях длительность освечивания воды для ее дезинфекции может варьироваться, представляло интерес сравнить токсичность не только красителей и продуктов их полной трансформации, но и оценить опасность смеси сенсибилизатора и продуктов его частичной (25%) трансформации. Время, необходимое для такого превращения красителей, оказалось равным 3 часам для МГ и 30 минутам для ХМ-ФЦ. Эти данные послужили основанием для определения оптимального времени облучения растворов сенсибилизаторов при исследовании их опасности.

Изучение токсичности и опасности метиленового голубого и продуктов его фототрансформации.

Лимитирующим показателем влияния МГ на органолептические свойства воды являлось изменение окраски. Пороговая концентрация МГ составляет 0,012 мг/л. По мере увеличения длительности освечивания интенсивность окрашивания растворов снижалась. При этом 25%

фототрансформация МГ способствовала 2-кратному снижению опасности - пороговая концентрация продуктов фотолиза МГ составляет 0,025 мг/л.

Иная зависимость изменения пороговых концентраций МГ от времени облучения видимым светом наблюдалась по влиянию на процессы самоочищения водных объектов. Продукты фототрансформации МГ вызывали в 5 раз более выраженное торможение процессов биохимического потребления кислорода: пороговая концентрация МГ составила 0,05 мг/л, продуктов его фотолиза - 0,01 мг/л. На этих и более низких уровнях ни МГ, ни продукты его фототрансформации не оказывали влияния на процессы минерализации азотсодержащих соединений.

При однократном внутрижелудочном поступлении в высоких дозах (1500-6000 мг/кг) МГ обладал высокой скоростью и степенью всасывания в желудке, быстрой диссиминацией в организме животных. Окрашивание кожных покровов наблюдалось через 30 минут после введения максимальной дозы. Вскрытие павшей через 6 часов крысы показало, что органы брюшной полости, а также мышечная и подкожно-соединительная ткани окрашены в синий цвет. Окрашивание внутренних органов сохранялось в течение 14 суток, что свидетельствует о проявлении материальной кумуляции МГ. В течение первых четырех суток происходило постепенное выведение красителя. ЛД50 сенсибилизатора составила 2500 (986,5 + 4013,5) мг/кг. Индекс кумуляции (1кум) равен 0,49 (сильная кумуляция).

Таким образом, по смертельным эффектам МГ относится к 3 классу токсичности (умеренно опасное вещество), а по способности к кумуляции - ко 2 классу (сильная кумуляция) (МУ 2.1.5.720-98).

При однократном перкутанном воздействии в дозах 4500 и 6000 мг/кг смертельных эффектов и накопления красителя во внутренних органах и подкожно-соеденительной ткани не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии кожно-резорбтивного действия МГ. Местного раздражающего действия также не выявлено. ЛД50 МГ при нанесении на кожу » 6000 мг/кг.

У животных при длительном поступлении МГ в неизмененном виде в дозах 0,25, 0,05 и 0,01 мг/кг снижалась способность ЦНС суммировать подпороговые импульсы, нарушалась долговременная память, о которой судили по изменению вертикальной активности. Кроме того, МГ и его ПФТ25 в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг вызывали достоверное увеличение активности антиоксидантного фермента каталазы в крови животных, что свидетельствует об усилении скорости генерации АФК в тканях организма и позволяет сохранить положение оксидантного равновесия (рис. 1 А, Б).

0,05 мг/кг. каталаза '" 0,01 мг/кг, каталаза

Рис. 1. Изменения активности каталазы в крови и интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции в сыворотке крови при пероралыюм поступлении МГ (А) и продуктов его 25% трансформации (Б) в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг в условиях хронического эксперимента (в % отклонений от контроля).

Изменения активности каталазы крови и интенсивности JI3XJ1 сыворотки крови животных, получавших ПФТ25, были более выраженными (рис. 1 Б). Способность МГ усиливать перекисное окисление липидов за счет генерации АФК выявлено также в ряде исследований, проведенных in vitro (Gupta Р.К. et. al., ¡996; Zhang G.J. et. al., 1997; Brunk U.T. et. al., J997; Ball D.J. et. al„ 1998). ПФТюо в дозе 0,05 мг/кг оказывали сходное по характеру, но менее выраженное токсическое действие по сравнению с продуктами неполного фотолиза красителя.

В таблице 2 представлена результирующая оценка степени выраженности токсического действия МГ и продуктов его фототрансформации по морфологическим критериям. Судя по структурно-функциональным показателям, исходный краситель в дозах 0,25 и 0,05 мг/кг вызывал повышение индекса альтерации гепатоцитов, балочной дискомплексации, увеличение доли клеточных инфильтратов, гемодинамических сдвигов, числа некрозов, снижение доли паренхимы, усиление полиплоидизации гепатоцитов, что свидетельствует о выраженном токсическом действии на печень. Обнаруженные в 12-перстной кишке изменения (увеличение нарушения целостности каймы ворсин кишки, их деструктурированности, усиление гемодинамических сдвигов) характеризуют эти дозы МГ как действующие.

Таблица 2. Оценка степени выраженности токсического действия метилеиового голубого и

Орган МГ, мг/кг ПФТ25, мг/кг ПФТюо, мг/кг

0,25 0,05 0,01 0,05 0,01 0,05

Печень +++ +++ - ++ + +

12-перстная кишка +++ +++ - ++ + -

Почки ++ ++ - - - -

Толстая кишка - - - - - -

Примечание: «-t-н-, -и-, +.» - выраженность токсического действия, «-» - отсутствие действия.

В почке при воздействии МГ в дозе 0,25 мг/кг отмечено увеличение доли атрофичных клубочков, увеличение индекса альтерации эпителия почечных канальцев, увеличение клеточной инфильтрации в строме. Доза 0,05 мг/кг вызывала изменения тех же показателей, за исключением последнего. Изменения в толстой кишке не выявлены. Хроническое воздействие МГ в дозе 0,01 мг/кг не приводило к повреждению внутренних органов.

Дозы 0,05 и 0,01 мг/кг ПФТ25, по сравнению с исходным красителем, вызывали менее выраженный токсический эффект, который может быть оценен как минимальный в печени и 12-перстной кишке, не оказывая неблагоприятного влияния на почки и толстую кишку. Воздействие ПФТюо в дозе 0,05 мг/кг приводило к изменениям только в печени.

Сравнение выраженности токсических эффектов МГ с разной степенью трансформации в дозе 0,05 мг/кг по структурно-функциональным показателям печени, 12-перстной кишки, почек и толстой кишки показало (таблица 2), что она изменяется от отсутствия действия (МНД) до порогового (ПД) и токсического (Токе.). Наиболее выраженное повреждающее действие на изученные органы оказывал МГ. С увеличением степени трансформации красителя выраженность изменений морфологических показателей снижалась.

В полиорганном микроядерном тесте выявлено мутагенное действие ПФТ25 МГ в дозе 0,05 мг/кг (увеличение доли эпителиальных клеток с протрузиями в толстой кишке), чего не наблюдалось при действии необлученного красителя в дозах 0,25, 0,05 и 0,01 мг/кг и ПФТюо в дозе 0,05 мг/кг (таблица 3).

Полученные данные согласуются с установленной рядом авторов в опытах in vivo интеркалирующей способностью МГ (Chung К.-Т. et. al., 1981; Webb R.B. et. al., 1984; Kier L.D. et. al., 1986; Ishidate Jr M. et. Al., 1988; Ере B. et. al., 1990; Tucker J.D. et. al., 1993; Wagner S.J. et. al., 1995; Smijs T.G. et. al., 2004). Однако мутагенные эффекты продуктов 25% фототрансформации МГ в эксперименте на животных выявлены впервые.

Кроме того, обнаружено цитотоксическое действие ПФТ25 в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг (увеличение доли клеток с кариопикнозом в толстой кишке). Согласно мнению McLearie J. et al (1992) и Pecc L. et al (2000), цитотоксичность МГ обусловлена фотогенерацией радикалов ОН'.

Цитотоксическое действие ПФТюо МГ в дозе 0,05 мг/кг не выявлено.

В иммунологических экспериментах установлено, что независимо от степени трансформации МГ в концентрациях 1 и 0,2 мг/л не обладает иммунотоксическим, сенсибилизирующим и местным раздражающим действием.

Таблица 3. Мутагенный и цитотоксический эффект метиленового голубого и продуктов его _ фототрансформации_

Показатели % к контролю

МГ, мг/кг ПФТ25, мг/кг ПФТШ, мг/кг

0,25 | 0,05 | 0,01 0,05 | 0,01 0,05

Полихроматофильные эритроциты в костном мозге

Микроядра 177,3 131 31 77,3 61,6 38,2

ПХЭ/все эритроциты 108,6 100 94,3 102,9 105,7 105,4

Эпителиальные клетки в толстой кишке

Микроядра 100 100 194,1 294,1 0 34

Протрузии 94,6 100 82,3 315,5 \ 105 23,6

Кариопикноз 126,1 45,8 104,2 187,5 Т 195,8 Т 106,4

Эпителиальные клетки в мочевом пузыре

Микроядра 138,2 161,3 123 69,1 100 71,6

Протрузии 139,1 154,2 100,8 128,2 100 118,6

Двуядерные клетки 44,3 39,3 78,4 48 51,9 100,3

Клетки с перетяжкой ядра 94,6 87,5 100,3 71,2 76,6 100

Клетки с атипичной формой ядра 99,6 104,8 94,3 137,7 89 100

«t |» - направленность отклонений от контроля, р<0,05 по критерию Манн-Уитни.

Пороговые дозы, установленные по комплексу физиологических, биохимических, структурно-функциональных, цитотоксических и цитогенетических показателей, представлены в таблице 4. Сравнительная гигиеническая оценка опасности исходного сенсибилизатора и продуктов его фототрансформации показала, что под влиянием видимого света частичная трансформация красителя сопровождается усилением токсичности, о чем свидетельствует снижение пороговой дозы в 5 раз.

Таблица 4. Пороговые дозы метиленового голубого при разной степени фототрансфомации

Критерии Пороговые дозы, мг/кг

МГ ПФТ25 ПФТюо

Биохимические, физиологические 0,01 0,002 0,05

Морфологические (печень, почки, 12-перстн. кишка, толстая кишка) 0,01<ПД< 0,05 0,01 0,05

Цитотоксические (мочевой пузырь, толстый кишечник) 0,05 0,01 Эффект не выявлен

Цитогенетические (костный мозг, мочевой пузырь, толстый кишечник) Эффект не выявлен 0,05

Кроме того, у продуктов частичной трансформации МГ появились новые эффекты токсического действия - мутагенные. Дальнейшее облучение светом до 100% трансформации приводит к снижению токсичности в 25 раз. По-видимому, это связано с трансформацией не только самого сенсибилизатора, но и опасных продуктов его фотолиза.

Аналогичное снижение токсичности в процессе фотолиза за счет превращения промежуточных продуктов фототрансформации, подтвержденное результатами химического анализа, установлено и для другого красителя - профлавина ацетата (Синщына О.О., Лебедев Т.А. и др., 2008).

Учитывая высокую критериальную значимость мутагенного действия в оценке опасности веществ (Журков B.C., 1981; Сычева Л.П., 1983; Г.Н.Красовский и др., 1992), низкую скорость полного фотолиза МГ (>10 часов), а также реальную длительность освечивания воды при ее

обеззараживании фотодинамическим методом (3 часа), обоснование его допустимых доз проводилось по результатам изучения цитогенетической активности ПФТ25. С использованием рекомендаций, изложенных в МУ№ 4110-86, была рассчитана допустимая доза мутагена - 0,00025 мг/кг, которая в пересчете на концентрацию составляет 0,005 мг/л, что в 1000 раз ниже эффективной обеззараживающей концентрации МГ.

Сопоставление пороговых концентраций МГ по органолептическому и общесанитарному показателям вредности с максимальной недействующей концентрацией (таблица 5), позволяет отнести этот сенсибилизатор к 1 классу опасности, что в совокупности не позволяет рекомендовать его в качестве дезинфицирующего средства всех видов вод (питьевые, сточные, вода плавательных бассейнов и т.д.) и делает нецелесообразным утверждение его ПДК в воде.

Таблица 5. Сопоставление пороговых и максимальной недействующей концентраций _метиленового голубого с различной степенью фототрансформацнн_

Показатель МГ ПФТ

ПК по органолептическому показателю вредности, мг/л 0,01 0,025

ПК по общесанитарному показателю вредности, мг/л 0,05 0,01

МНК (на основе ДЦму,), мг/л 0,005

Класс опасности 1

Изучение токсичности и опасности холиниометилзамещенного фталоциапина цинка и продуктов его фототрансформации.

В остром опыте установлено, что ХМ-ФЦ обладает высокой скоростью и степенью всасывания в желудке, быстрой диссиминацией в организме животных, большей чем МГ. Через 10-15 минут после введения отмечалось окрашивание кожных покровов. Несколько часов спустя на вскрытии наблюдалось окрашивание не только желудка, кишечника, почек, но и брыжейки, мышечной и подкожно-соединительной ткани. Подобная тропность к рыхлой волокнистой ткани отмечена для производных фталоцианина меди (Ротенберг Ю.С. и др., 1977). В течение первых четырех суток происходило постепенное выведение красителя, но некоторая его часть достаточно прочно связалась с тканями и сохранялась до конца эксперимента. Через 14 суток окрашенными оставались не только внутренние органы, но и костная ткань, что свидетельствует о выраженной материальной кумуляции ХМ-ФЦ. ЛД50 сенсибилизатора составила 3977 (3185 +■ 4770) мг/кг. Индекс кумуляции (1кум) равен 0,17 (сильная кумуляция).

Таким образом, по смертельным эффектам ХМ-ФЦ относится к 3 классу токсичности (умеренно опасное вещество), обладает выраженной материальной кумуляцией при поступлении в субсмертельных дозах.

Как показано на рисунке 2, ХМ-ФЦ и продукты его частичной фототрансформации при однократном и повторном воздействии в дозе 400 мг/кг и при повторном поступлении в дозах 0,05 и 0, 01 мг/кг обладают выраженным иммунотоксическим действием, о чем свидетельствует достоверное снижение содержания специфических иммуноглобулинов 1§Сг в сыворотке крови соответствующих групп мышей по сравнению с контрольной группой, которой был введен только БСА. Отсутствие достоверных отклонений от иммунизированного контроля при однократном и повторном воздействии ХМ-ФЦ в дозе 40 мг/кг позволяет также предположить, что ХМ-ФЦ обладает не только иммунотоксическим, но и адъювактным действием. Наложением этих двух противоположных эффектов можно объяснить сложную куполообразную зависимость "доза-эффект" при повторном введении ХМ-ФЦ, с наличием участка обратно-пропорциональной связи в диапазоне доз 40 - 0,05 - 0,01 мг/кг.

8 день

В Контрольная(интактная) группа

□ ХМ-ФЦ, 40 мг/кг, однократно S ХМ-ФЦ 0,05 мг/кг

□ ПФТ25, 0,01 мг/кг

□ Контрольная группа БСА 0 ХМ-ФЦ, 400 мг/кг

□ ХМ-ФЦ, 0,0] мг/кг

□ ПФТ100, 0,05 мг/кг

21 день

Ш ХМ-ФЦ, 400 мг/кг, однократно □ ХМ-ФЦ, 40 мг/кг ■ ПФТ25, 0,05 мг/кг ИПФТ100,0,01 мг/кг

(*р<0,01 **р<0,001 ***р<0,0001 по отношению к контрольной группе БСА)

Рис. 2. Уровни специфического IgG в сыворотке крови мышей под влиянием сенсибилизатора ХМ-ФЦ и продуктов его фототрансформации на 8 и 21 день после введения

стандартного антигена.

ПФТ25 в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг и ПФТюо в дозе 0,05 мг/кг также угнетали гуморальное звено иммунитета. Максимальная недействующая доза иммунотоксического действия ПФТ25 в настоящем эксперименте не установлена, для ПФТмо она составила 0,01 мг/кг.

Таким образом, уменьшение степени выраженности подавления иммунной системы при действии ПФТюо по сравнению с теми же дозами нативного вещества и ПФТ25 свидетельствует, что по мере увеличения длительности облучения фотосенсибилизатора происходит деструкция опасных продуктов фотолиза, подавляющих специфическую резистентность иммунной системы.

Иная закономерность в изменении токсичности ХМ-ФЦ в результате облучения видимым светом установлена по комплексу физиологических, биохимических, морфологических, цитотоксических и цитогенетических показателей в хроническом эксперименте.

Воздействие ХМ-ФЦ и ПФТ25 в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг, ПФТюо в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг вызывало снижение уровня эритроцитов в крови экспериментальных животных. Выявленные изменения, по-видимому, являются следствием тропности фталодианинов к липопротеинам низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови и фосфолипидам наружных мембран клеток (Hadjur С., et. al., 1997; Martins J. et. al., 2004). В опытах in vitro окисление ЛПНП, а также местный оксидативный стресс приводили к разрушению мембран эритроцитов, выходу из них ионов калия и последующему гемолизу (Martins J. et. al, 2002).

Выраженность и характер изменений показателей оксидантного статуса, активности антиоксидантной системы и показателей повреждения органов и тканей организма зависела от степени фототрансформации ХМ-ФЦ. Это может быть продемонстрировано на примере изменения ряда показателей при поступлении красителя и продуктов его фототрансформации в дозе 0,05 мг/кг.

Так, эффективное функционирование антиоксидантной системы, о чем свидетельствует активация каталазы на 150 и 180 сутки, а также повышение уровня общих SH-групп на 15, 60, 90 и 120 сутки у животных, получавших ХМ-ФЦ, способствовало тому, что уровень АФК

(интенсивность ЛЗХЛ в сыворотке крови) достоверно не отличался от контрольных значений (рис.3 А).

р<0,001

Рис. 3. Динамика интенсивности ЛЗХЛ сыворотки крови, активности каталазы и уровня общих $11-гругш в крови крыс при пероральном поступлении ХМ-ФЦ (А), ПФТ25 (Б) и ПФТюо (В) в дозе 0,05 мг/кг в условиях хронического эксперимента (в % отклонений от контроля).

Недостаточность антиоксидантной системы при действии ПФТ25 (рис. 3 Б) и, в особенности, ПФТюо (рис. 3 В), которые вызывали ее срыв (достоверное снижение активности каталазы на 90 и 120 сутки и уровня SH-rpynn на 60 и 90 сутки), привела к достоверному увеличению интенсивности ЛЗХЛ сыворотки крови - показателя оксидантного равновесия тканей организма (Владимиров Ю.А., 1972). О недостаточности антиоксидантной системы свидетельствует и уменьшение активности глутатионредуктазы (Кулинский В.И., 1990; Зборовская И.А., 1995; Янковский О.Ю., 2000; Зентов Н.К., 2001) при поступлении ПФТюо: на 90 сутки у половины животных ее активность выходила за нижнюю доверительную границу контроля, на 150 сутки у двух третей животных.

Усиление перекисного окисления липидов, произошедшее в результате образования АФК и недостаточности антиоксидантной системы, реализовалось в развитии процессов повреждения органов и тканей (рис. 4).

При этом частота и степень выраженности отклонений показателей, характеризующих эти процессы, увеличивалась с возрастанием длительности освечивания ХМ-ФЦ. В частности, отмечалась активация ацетилэстеразы в сыворотке крови - маркера повреждения микросомальных мембран, существенно более выраженная при воздействии ПФТюо.

Увеличение активности М-ацетил-р-О-глюкозаминидазы в сыворотке крови животных при интоксикации продуктами фототрансформации, обнаруженное на протяжении всего эксперимента, свидетельствует, с одной стороны, об их мембранотоксическом действии, приводящем к высвобождению кислых гидролаз, нарушению нормальных физиологических функций лизосом, дезорганизации внутриклеточного метаболизма и развитию воспаления (Dance N et. al„ 1969; Ding! J. Т. et. а!., 1982; Powells. С. et. а!., 1983; Голиков С.Н. и др., 1986).

С другой стороны, нельзя исключить и увеличения пула фагоцитов для элиминации поврежденных клеток. Правомерность последнего механизма активации косвенно подтверждают и результаты иммуноферментного анализа, свидетельствующие о стимуляции образования макрофагов.

40 20-

-20 -60

Eb—tS" ""

■ " ' TI ' -L!„—P*

15 30 60 ¡Ш 120 150 ISO

-ХЭ —В— АЭ АГА

el, * ***

"fr-;.

* р<0,05 ** р<0,02 *** р<0,01 р<0,001

Рис. 4. Динамика активности холинэстеразы,

ацетилэстеразы и 1Ч-ацетнл-р-0-глюкозамннидазы в сыворотке крови крыс при пероралыюм поступлении ХМ-ФЦ (А), ПФТ25 (Б) и ПФТюо (В) в дозе 0,05 мг/кг в условиях хронического эксперимента (в % отклонений от контроля).

Снижение активности холинэстеразы, как маркера угнетения протеосинтетической функции печени (Покровский A.A., 1969; Silver А., 1974; Jensen F.S. et. al., 1991; Löchrige О. et. а!., 1991; Камышников B.C., 2000), при действии ПФТ25 и, в особенности, ПФТюо позволяет предположить, что деструктивные процессы под влиянием красителя и продуктов его фотолиза развиваются преимущественно в печени.

Предположение о преимущественной локализации процессов повреждения в печени при воздействии ХМ-ФЦ с различной степенью трансформации подтверждают результаты морфологических исследований (таблица 6).

Таблица 6. Оценка степени выраженности токсического воздействия ХМ-ФЦ с разной степенью фототрансформации на печень, почки, 12-перстную кишку и семенники крыс

Орган ХМ-ФЦ, мг/кг ПФТ25, мг/кг ПФТюо, мг/кг

0,05 0,01 0,002 0,05 0,01 0,002 0,05 0,01

Печень +++ +++ - +++ - +++ +++ +

Почки +++ + - - - - - -

12-перстная кишка ++ - - +++ - - +++ -

Семенники ++ - - - - - - -

Примечание: «+++, ++, +.»- выраженность токсического действия,«-»- отсутствие действия.

Так, изменение комплекса структурно-функциональных показателей печени в результате хронического воздействия ХМ-ФЦ в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг, ПФТ25 в дозах 0,05 и 0,002 мг/кг, а также ПФТюо в дозе 0,05 мг/кг свидетельствовало о выраженном токсическом эффекте (Токе.). При этом изменения заключались не только в возрастании индекса альтерации гепатоцитов и их полиплоидизации, но и в уменьшении доли паренхимы печени за счет разрастания соединительной ткани и увеличения доли инфильтратов.

Морфофункциональные изменения в почках были зарегистрированы только при поступлении исходного ХМ-ФЦ, при этом воздействие красителя в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг приводило, в том числе, и к усилению процессов фиброзирования.

Выявленная в эксперименте стимуляция фиброзирования внутренних органов при действии ХМ-ФЦ и продуктов его фототрансформации свидетельствует об угнетении процессов регенерации паренхиматозных клеток и преобладании роста стромального компонента печени и почек. Аналогичное разрастание соединительной ткани в слизистой, подслизистой и мышечной оболочке желудка было обнаружено в другом эксперименте (Loh C.S. et. al., 1992) при введении бисульфата фталоцианина цинка в качестве фармакологического препарата для лечения дисплазии верхних отделов желудочно-кишечного тракта.

Изменения в 12-перстной кишке при действии максимальных доз ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации свидетельствовали о нарушении процессов пищеварения.

Изменения структурно-функциональных показателей семенников наблюдались только при воздействии исходного красителя в максимальной дозе.

Цитогенетическое действие ХМ-ФЦ, его ПФТ25 и ПФТюо не выявлено при анализе полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге и эпителиальных клеток с микроядрами и ядерными протрузиями в эпителиальных клетках толстого кишечника крыс. Соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в костном мозге крыс и доля клеток с атипичной формой ядра в эпителиоцитах толстого кишечника крыс свидетельствовала об отсутствии цитотоксического эффекта исследованных веществ.

Единственным показателем неблагоприятного действия ХМ-ФЦ с разной степенью фототрансформации было появление полихроматофильных эритроцитов неизвестной атипичной формы (с разным количеством «лопастей») (рис. 5А), частота которых и наибольшие изменения формы возрастали с увеличением длительности облучения красителя (рис. 5Б). Такие эритроциты не встречались ранее при изучении других веществ, они не представлены в гематологических атласах.

Рис.5. Полихроматофильные эритроциты атипичной формы (А) и частота их встречаемости (Б) в костном мозге крыс после хронического воздействия ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации (стрелочкой отмечен полихроматофильный эритроцит в норме).

Вместе с тем, учитывая данные литературы (Hadjur С. et. al., 1997; Martins J.. et. al, 2002, 2004) о тропности фталоцианинов к эритроцитам, приводящем к их разрушению, а также эритроцитопению у экспериментальных животных, обнаруженное впервые образование полихроматофильных эритроцитов атипичной формы в костном мозге можно расценить как

эритроцитотоксическое действие ХМ-ФЦ, которое возрастает с увеличением степени его фототрансформации.

Таким образом, комплексная оценка результатов экспериментов показала, чт фотосенсибилизатор ХМ-ФЦ при энтеральном поступлении в организм в дозах 0,05, 0,01 и 0,0С мг/кг обладает эритроцито-, гепато-, мембрано- и ренотоксическим действием, в дозах 0,05, 0,С мг/кг - иммунотоксическим действием. Кроме того, доза 0,05 мг/кг вызывает нарушения структурно-функционального состояния 12-перстной кишки и семенников. Воздействие красите: во всех дозах приводило к образованию АФК в организме. Недостаточность антиоксидантно системы реализовалась в эритроцитопении и нарушении протеосинтетической функции печени. Пороговая и максимальная недействующая дозы исходного сенсибилизатора не установлены.

Поступление ПФТ25 ХМ-ФЦ в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг также приводило к образованы в организме опытных животных АФК, повреждающее действие которых реализовалось в развита эритроцито-, гемато-, нейро- и иммуногоксических эффектов. Воздействие ПФТ25 стимулировал процессы фиброзирования печени и почек на фоне угнетения регенерации паренхиматозны клеток, в результате чего снижалась протеосинтетическая функция печени. Выявленные изменения изученных биохимических и морфологических показателей свидетельствуют, что все изученнь: дозы ПФТ25 являлись действующими при длительном поступлении в организм.

В процессе длительного облучения сенсибилизатора, способствующего близкой к 100% его трансформации, происходит образование более токсичных продуктов, которые при поступлении организм в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг вызывали изменения практически всех изученных показателе) за исключением иммунологических, в те же сроки эксперимента, что и ПФТ25, но с больше степенью выраженности.

Анализ зависимостей «доза-время-эффект» по комплексу физиологических, гематологических, биохимических, структурно-функциональных, цитотоксических, цитогенетических и иммунологических показателей (таблица 7) не позволил установить пороговые и максимальные недействующие дозы ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации.

Таблица 7. Выраженность токсического действия различных доз ХМ-ФЦ в зависимости от _степени фототрансформации__

Критерии ХМ-ФЦ ПФТ25 ПФТюо

0,05 мг/кг 0,01 мг/кг 0,002 мг/кг 0,05 мг/кг 0,01 мг/кг 0,002 мг/кг 0,05 мг/кг 0,01 мг/кг

Биохимические, физиологические +++ ++ ++ +++ ++ + +++ +++

Морфологические (печень, почки, 12-пер. кишка, семенники) +++ ++ - +++ + - +++ +

Цитотоксические (костный мозг, эритроциты, толстый кишечник) н/о + - н/о ++ + +++ +++

Цитогенетические (костный мозг, толстый кишечник) н/о - - н/о - - - -

Иммунотоксические +++ ++ н/о +++ + н/о + -

Примечание:«+++»- выраженность эффектов,«-»- отсутствие эффектов, «н/о» - не определяли.

Токсическое действие красителя проявлялось во всех испытанных дозах, минимальная из которых (0,002 мг/кг) в пересчете на концентрацию (0,04 мг/л) в 75 раз ниже его бактерицидной концентрации (3 мг/л). Кроме того, с увеличением времени облучения ХМ-ФЦ происходит образование продуктов, более токсичных и опасных, чем исходный сенсибилизатор. Поэтому фотодинамический метод с использованием этого сенсибилизатора не может быть разрешен для обеззараживания воды водных объектов хозяйственно-питьевого, рекреационного и оздоровительного назначения. Дальнейшие исследования по обоснованию ПДК ХМ-ФЦ в воде представляются нецелесообразными.

Таким образом, на основании результатов гигиенической оценки новых средств обеззараживания воды - химических фотосенсибилизаторов МГ и ХМ-ФЦ впервые показано, что при облучении видимым светом веществ из тиазинового и тетраазопорфиринового рядов

16

образуются более опасные продукты их трансформации.

Установлены закономерности изменения опасности в зависимости от времени воздействия видимого света. Частичная фототрансформация МГ сопровождается усилением его токсичности, а полный фотолиз исходного красителя приводит к уменьшению его опасности. Опасность и токсичность ХМ-ФЦ возрастает с увеличением степени его фототрансформации.

Показано, что одним из ведущих механизмов интоксикации МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фотолиза является их прооксидантное действие и влияние на антиоксидантную систему. Увеличение перекисного окисления липидов, о чем свидетельствовало возрастание интенсивности люминолзависимой хемилюминесценциит реализовалось в развитии реакций повреждения органов и тканей, а также в возникновении специфических эффектов (МГ - мутагенный, ХМ-ФЦ -эритроцитотоксический и иммунотоксический).

В связи с этим при установлении ПДК и определении допустимости использования в практике хозяйственно-питьевого водоснабжения реагентов, способных к фототрансформации, следует учитывать время появления наиболее опасных компонентов в реальных условиях применения.

выводы

1. При однократном поступлении в желудок в высоких дозах химические фототсенсибилизаторы МГ и ХМ-ФЦ способны к длительному (до 14 дней) сохранению во внутренних органах и тканях, что свидетельствует о выраженной материальной кумуляции; по смертельным эффектам относятся к 3 классу токсичности (ЛД50 МГ - 2500 мг/кг, ХМ-ФЦ составляет 4000 мг/кг).

2. Критическим эффектом воздействия красителей на организм белых крыс в хронических экспериментах является образование активных форм кислорода и влияние на антиоксидантную систему защиты организма. Недостаточность каталазной активности сочеталась с возрастанием интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции, что свидетельствует об увеличении перекисного окисления липидов, реализовавшемся в развитии реакций повреждения органов и тканей. Это свойственно в большей мере продуктам 25% трансформации МГ и 100% трансформации ХМ-ФЦ в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг.

3. На основании сравнения пороговых доз МГ по комплексу физиологических, биохимических, морфологических, цитотоксических и цитогенетических показателей установлено, что частичная (25%) фототрансформация МГ сопровождается усилением его токсичности, о чем свидетельствует снижение пороговой дозы в 5 раз (с 0,01 мг/кг до 0,002 мг/кг), а также мутагенный эффект в эпителиальных клетках толстой кишки ПФТу МГ в дозе 0,05 мг/кг. Дальнейшее облучение светом приводит к снижению токсичности в 25 раз (ПД = 0,05 мг/кг) и исчезновению мутагенных эффектов.

4. Комплекс гигиенических исследований МГ и продуктов его фототрансформации, включающих обоснование пороговых концентраций по органолептическому (0,01 и 0,025 мг/л, соответственно) и общесанитарному (0,05 и 0,01 мг/л) показателям вредности, а также максимальной недействующей концентрации по санитарно-токсикологическому показателю (0,005 мг/л) служит основанием для отнесения МГ к 1 классу опасности. Сопоставление минимальной эффективной в отношении микроорганизмов концентрации (5 мг/л) с токсико-гигиеническими параметрами служит основанием для запрещения использования МГ в качестве дезинфицирующего средства всех видов вод и не позволяет рекомендовать обоснование его ПДК в воде.

5. Воздействие ХМ-ФЦ и продуктов фотолиза в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг приводит к образованию в костном мозге полихроматофильных эритроцитов неизвестной атипичной формы, частота которых и наибольшие изменения формы возрастают с увеличением степени фототрансформации, что в совокупности с выявленной эритроцитопенией свидетельствует о эритроцитотоксическом действии продуктов фототрансформации красителя.

6. Фотосенсибилизатор ХМ-ФЦ и продукты его 25% трансформации при длительном поступлении в организм в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг обладают гемато-, гепато-, рено-, нейро- и иммунотоксическим действием с усилением токсичности по мере увеличения времени облучения. Пороговые и максимальные недействующие дозы ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации не установлены. В связи с тем, что минимальная из изученных доз (0,002 мг/кг, или 0,04 мг/л) в 75 раз ниже бактерицидной концентрации ХМ-ФЦ (3 мг/л), фотодинамический метод с использованием этого сенсибилизатора не может быть разрешен для обеззараживания воды, и обоснование ПДК ХМ-ФЦ нецелесообразно.

7. Сравнительная оценка новых средств обеззараживания воды - химических фотосенсибилизаторов МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фототрансформации показала, что при облучении красителей видимым светом образуются более опасные продукты. Поэтому при установлении ПДК и определении допустимости использования в практике хозяйственно-питьевого водоснабжения реагентов, способных к фототрансформации, следует учитывать время появления наиболее опасных компонентов в реальных условиях применения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Сычева Л.П., Шереметьева С.М., Кривцова Е.К., Журков B.C., Головач Е.Н.. Полякова Е.Е., Синицына О.О. Оценка цитогенетической активности метиленового голубого и продуктов его фотодеструкции в полиорганном микроядерном тесте на крысах // Токсикологический вестник. - 2007. - №1. - С. 18-21.

2. Синицына О.О., Жолдакова З.И., Полякова Е.Е., Головач Е.Н.. Сычева Л.П., Беляева Н.Н., Кузнецова Н.А. Сравнительная токсичность фотосенсибилизаторов при разной степени деструкции // Гигиена и санитария. - 2007. - №5. - С.57-60.

3. Головач Е.Н... Беляева Н.Н., Юрченко В.В. Зависимость токсичности холиниометилзамещенного фталоцианина цинка от степени его фототрансформации // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - Т.23. - №3. - Приложение 2 (часть II). -С.459-460.

В других изданиях:

4. Zholdakova Z.I., Sinitsyna О.О., Polyakova Е.Е., Golovach E.N.. Toxicological evaluation of methylene blue-based photodynamic water disinfection technique // 5th IWA Specialized Conference on Assessment and Control of Micropollutants / Hazardous Substances in Water. International Water Association «MICROPOL & ECOHAZARD 2007». Frankfurt/Main, 2007. - P.564-565.

5. Синицына O.O., Ворожцов Г.Н., Кузнецова H.A., Полякова Е.Е., Калия О.Л., Головач Е.Н.. Беляева Н.Н., Хрипач Л.В., Шереметьева С.М., Жолдакова З.И. Гигиеническая оценка фотодинамического метода обеззараживания воды с использованием метиленового голубого и профлавин ацетата // Тезисы докладов научно-практической конференции по гигиене, эпидемиолигии и дезинфектологии «ДДЦ-2006». М., 2006. - С.62-63.

6. Синицына О.О., Полякова Е.Е., Жолдакова З.И., Головач Е.Н.. Сычева Л.П., Беляева Н.Н., Кузнецова Н.А. Обоснование безопасных условий применения фотодинамического метода обеззараживания воды // Материалы Пленума Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздрава и соцразвития РФ «Современные проблемы гигиены города, методология и пути решения». М., 2006. - С.315-317.

7. Головач Е.Н.. Сравнительная токсичность холиниометилзамещенного фталоцианина цинка и продуктов его фотодеструкции // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань, 2007. -С.20-21.

Обозначения и сокращения.

1Кум - индекс кумуляции;

- иммуноглобулин; АГА - Ы-ацетил-Р-О-глюкозаминидаза; АФК - активные формы кислорода; АЭ - ацетилэстераза; БСА - бычий сывороточный альбумин; ДДмуг - допустимая доза мутагена; ЛД50 - средне смертельная доза; ЛЗХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция; ЛПНП - липопротеины низкой плотности; МГ - метиленовый голубой; МНД- максимальная недействующая доза; ПД - пороговая доза;

ПДК - предельно допустимая концентрация;

ПФТ25 - продукты 25% фототрансформации;

ПФТюо - продукты 100% фототрансформации;

ПФТ - продукты фототрансформации;

ПХЭ - полихроматофильные эритроциты;

Токе. - выраженное токсическое действие;

ХМ-ФЦ - холиниометилзамещенный фталоцианин цинка;

ХЭ - холинэстераза;

ЦНС - центральная нервная система.

Заказ № 134/04/09 Подписано в печать 22.04.2009 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 mvw.cfr.ru; е-таИ:ю/о@с/г.ги

Обеспечение населения питьевой водой, безопасной в эпидемическом отношении, определяет необходимость совершенствования методов обеззараживания [78, 164]. Применяемые в настоящее время физические и химические методы обеззараживания воды сопряжены с рядом общеизвестных недостатков. В частности, наиболее распространённые во всём мире реагенты на основе активного хлора не только высокотоксичны, вызывают аллергические реакции при перехлорировании, раздражают слизистые оболочки, но и приводят к образованию в воде хлорорганических соединений, многие из которых обладают мутагенной и/или канцерогенной активностью [30, 45].

Альтернативные способы обеззараживания - озонирование и ультрафиолетовое облучение, также не универсальны. Несмотря на то, что ультрафиолетовое облучение оказывает на большинство химических веществ гораздо более слабое трансформирующее действие, чем активный хлор [29], в дальнейшем возможна реактивация микроорганизмов. При озонировании также отсутствует остаточное действие обеззараживания и существует опасность образования канцерогенных броматов. В связи с этим, продолжается поиск новых эффективных и безопасных методов обеззараживания воды.

В последние годы предложена новая физико-химическая технология обеззараживания воды фотодинамическим методом. Принцип метода [70] основан на тропности к клеткам фотодинамически активных красителей (химических сенсибилизаторов), которые под действием света в присутствии кислорода генерируют синглетный кислород и другие его активные формы, окисляющие биомолекулы и вызывающие гибель микроорганизмов по месту локализации [47, 115, 127, 191, 268]. Обеззараживание является результатом физико-химических реакций, протекающих в растворе.

Одними из наиболее эффективных дезинфектантов для фотодинамического обеззараживания воды являются красители из тиазинового и тетраазопорфиринового рядов - метиленовый голубой (МГ) и холиниометилзамещенный фталоцианин цинка (ХМ-ФЦ) [3, 188].

Согласно Международной директиве REACH (регистрация, оценка и авторизация химических веществ) все химические вещества, применяемые в промышленности, должны проходить процедуру оценки их опасности [105] включая способность вызывать отдаленные эффекты [79].

Вместе с тем, несмотря на широкое применение красителей в фармакологии, их опасность при длительном поступлении в организм не изучена. Кроме того, в процессе фотохимических реакций происходит трансформация красителей, степень фотолиза которых и спектр образующихся продуктов может зависеть от длительности облучения. При этом наиболее важный с гигиенических позиций аспект этих процессов — сравнительная опасность исходных веществ и продуктов их трансформации [32], также является не изученным.

Важным критерием допустимости применения средств обеззараживания воды, является соотношение «эффективная/безопасная концентрация» [86].

В связи с вышеизложенным, целью данной работы является сравнительная гигиеническая оценка фотосенсибилизаторов и продуктов их трансформации, образующихся под действием видимого света, на примере метиленового голубого и холиниометилзамещенного фталоцианина цинка.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. На примере МГ установить зависимость изменения пороговых концентраций по органолептическому и общесанитарному показателям вредности от времени облучения видимым светом.

2. Изучить токсичность и способность к кумуляции МГ и ХМ-ФЦ при однократном действии.

3. Дать сравнительную оценку токсичности сенсибилизаторов и продуктов их фототрансформации при длительном энтеральном поступлении в организм.

4. На основании сопоставления эффективных в отношении микроорганизмов и безопасных концентраций обосновать рекомендации о возможности применения МГ и ХМ-ФЦ для обеззараживания воды.

Научная новизна работы. Впервые показано, что при облучении видимым светом веществ из тиазинового и тетраазопорфиринового ряда образуются более опасные продукты их трансформации.

Установлены закономерности изменения их опасности в зависимости от времени воздействия видимого света.

Впервые показано, что одним из механизмов токсического действия МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фототрансформации на лабораторных животных является увеличение генерации активных форм кислорода.

Впервые выявлены мутагенные эффекты продуктов 25% фототрансформации МГ в опытах in vivo.

Впервые выявлено эритроцитотоксическое действие продуктов фототрансформации ХМ-ФЦ.

Впервые показано, что ХМ-ФЦ и продукты его частичной фототрансформации обладают иммунотоксичеким действием.

Обосновано, что при установлении ПДК и определении допустимости использования в практике хозяйственно-питьевого водоснабжения реагентов, способных к фототрансформации, следует учитывать время появления наиболее опасных компонентов в реальных условиях применения.

Практическая значимость. Доказана недопустимость обоснования ПДК МГ и ХМ-ФЦ в воде водных объектов.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проектов Методических указаний «Санитарно-эпидемиологические испытания (исследования) продукции, используемой в системах водоснабжения» и «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды».

Работа выполнена в лаборатории эколого-гигиенической оценки и прогнозирования токсичности веществ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н.Сысина

РАМН в рамках плановой научной темы № г/р 02200900946, а также при финансовой поддержке Правительства Москвы.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на Форуме по гигиене и санитарии «ДДД-2006» (Москва, 2006), Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Современные проблемы гигиены города, методология и пути решения» (Москва, 2006), II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007), V Специализированной конференции по оценке и контролю микрозагрязнений опасных веществ в воде Международной водной ассоциации «МКЖОРОЬ & ЕСОНАгАКО 2007» (Франкфурт-на-Майне, 2007), Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «ЭкоФорум-2008» (Санкт-Петербург, 2008).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение опасности МГ при частичной фототрансформации и снижение - при полном фотолизе.

2. Усиление токсичности ХМ-ФЦ с увеличением степени фототрансформации.

3. Механизм интоксикации МГ и ХМ-ФЦ, заключающийся в прооксидантном действии и влиянии на антиоксидантную систему, и сопровождающийся появлением специфических эффектов (МГ — мутагенный, ХМ-ФЦ - эритроцитотоксический и иммунотоксический).

4. Недопустимость применения МГ и ХМ-ФЦ для обеззараживания воды.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 в центральной печати, 3 тезисов и 1 за рубежом. ю

выводы

1. При однократном поступлении в желудок в высоких дозах химические фототсенсибилизаторы МГ и ХМ-ФЦ способны к длительному (до 14 дней) сохранению во внутренних органах и тканях, что свидетельствует о выраженной материальной кумуляции; по смертельным эффектам относятся к 3 классу токсичности (ЛД50 МГ - 2500 мг/кг, ХМ-ФЦ составляет 4000 мг/кг).

2. Критическим эффектом воздействия красителей на организм белых крыс в хронических экспериментах является образование активных форм кислорода и влияние на антиоксидантную систему защиты организма. Недостаточность каталазной активности сочеталась с возрастанием интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции, что свидетельствует об увеличении перекисного окисления липидов, реализовавшемся в развитии реакций повреждения органов и тканей. Это свойственно в большей мере продуктам 25% трансформации МГ и 100% трансформации ХМ-ФЦ в дозах 0,05 и 0,01 мг/кг.

3. На основании сравнения пороговых доз МГ по комплексу физиологических, биохимических, морфологических, цитотоксических и цитогенетических эффектов установлено, что частичная (25%) фототрансформация МГ сопровождается усилением его токсичности, о чем свидетельствует снижение пороговой дозы в 5 раз (с 0,01 мг/кг до 0,002 мг/кг), а также мутагенный эффект в эпителиальных клетках толстой кишки ПФТ25 МГ в дозе 0,05 мг/кг. Дальнейшее облучение светом приводит к снижению токсичности в 25 раз (ПД = 0,05 мг/кг) и исчезновению мутагенных эффектов.

4. Комплекс гигиенических исследований МГ и продуктов его фототрансформации, включающих обоснование пороговых концентраций по органолептическому (0,01 и 0,025 мг/л, соответственно) и общесанитарному (0,05 и 0,01 мг/л) показателям вредности, а также максимальной недействующей концентрации по санитарно-токсикологическому показателю

0,005 мг/л) служит основанием для отнесения МГ к 1 классу опасности.

176

Сопоставление минимальной эффективной в отношении микроорганизмов концентрации (5 мг/л) с токсико-гигиеническими параметрами служит основанием для запрещения использования МГ в качестве дезинфицирующего средства всех видов вод и не позволяет рекомендовать обоснование его ГТДК в воде.

5. Воздействие ХМ-ФЦ и продуктов фотолиза в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг приводит к образованию в костном мозге полихроматофильных эритроцитов неизвестной атипичной формы, частота которых и наибольшие изменения формы возрастают с увеличением степени фототрансформации, что в совокупности с выявленной эритроцитопенией свидетельствует о эритроцитотоксическом действии продуктов фототрансформации красителя.

6. Фотосенсибилизатор ХМ-ФЦ и продукты его 25% трансформации при длительном поступлении в организм в дозах 0,05, 0,01 и 0,002 мг/кг обладают гемато-, гепато-, рено-, нейро- и иммунотоксическим действием с усилением токсичности по мере увеличения времени облучения. Пороговые и максимальные недействующие дозы ХМ-ФЦ с различной степенью фототрансформации не установлены. В связи с тем, что минимальная из изученных доз (0,002 мг/кг, или 0,04 мг/л) в 75 раз ниже бактерицидной концентрации ХМ-ФЦ (3 мг/л), фотодинамический метод с использованием этого сенсибилизатора не может быть разрешен для обеззараживания воды, и обоснование ПДК ХМ-ФЦ нецелесообразно.

7. Сравнительная оценка новых средств обеззараживания воды — химических фотосенсибилизаторов МГ, ХМ-ФЦ и продуктов их фототрансформации показала, что при облучении красителей видимым светом образуются более опасные продукты. Поэтому при установлении ПДК и определении допустимости использования в практике хозяйственно-питьевого водоснабжения реагентов, способных к фототрансформации, следует учитывать время появления наиболее опасных компонентов в реальных условиях применения.