Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Разработка методических приемов повышения гигиенической надежности санитарно-бактериологических методов анализа воды

На правах рукописи

£184605'£!4-:

БУТОРИНА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ ПОВЫШЕНИЯ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ НАДЕЖНОСТИ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ВОДЫ

14.02.01 - Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ИЮН 2010

Москва-2010

004605243

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н. Сысина РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук кандидат биологических наук Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Журков Вячеслав Серафимович

Тартаковский Игорь Семенович

Синицына Оксана Олеговна Артемова Тамара Захаровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « 24 » июня 2010 года в 11°° на заседании Диссертационного Совета Д.001.009.01 НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН

Автореферат разослан « > мая 2010 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук, профессор

Беляева Наталия Николаевн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Обеспечение эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей микробиологического контроля качества воды. Надежность системы контроля, как основы профилактических мероприятий, обусловлена научно-обоснованными показателями и эффективными методами обнаружения и количественного учета возбудителей кишечных инфекций и их индикаторов (Рахманин Ю.А. и др,.2006;.Недачин А.Е. и др.,2007; Рахманин Ю.А., 2009).

Вместе с тем, до настоящего времени отмечаются вспышки кишечных инфекций при соответствии качества воды установленным требованиям (Недачин А.Е. и др.,2002, 2005; Сгаип С.¥. а/ а1. 2002). Это может быть связано с появлением устойчивых штаммов патогенных бактерий, их способностью к размножению, в частности сальмонелл, в чистых водах, и как результат - с нарушением количественных соотношений индикаторных и патогенных бактерий (Гинсбург А.Л. и др., 1999). Поэтому требуется совершенствование существующей нормативно-методической базы в направлении повышения адекватности оценки эпидемической безопасности водопользования.

В этом направлении, а также с целью унификации с международным сообществом, в последние годы происходит пересмотр нормативных требований к качеству воды по бактериологическим показателям, что определяет необходимость разработки и стандартизации методов определения бактериологических показателей: колиформные бактерии и глюкозоположительные колиформные бактерии, как основные надежные индикаторные показатели эпидемической опасности водопользования; Е.соИ, как показатель фекального загрязнения водных объектов.

Методы, утвержденные в МУК 4.2.1018-01, по ряду параметров не отвечают современному уровню: длительные сроки анализа (2-3 суток); низкая воспроизводимость результатов из-за субъективной выборки колоний; отсутствие учета изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий. Аналогичные проблемы существуют и в международных методических документах (ИСО 9308-1:2000). Кроме того, низкое качество выпускаемых отечественными производителями питательных сред требует разработки способов повышения их

чувствительности, ростовых качеств, дифференцирующих свойств в целях увеличения надежности бактериологического анализа.

Перспектива разработки ускоренных методов определения колиформных бактерий заключается в использовании на этапе идентификации специфичности их ферментативных свойств (RompreA., 2002). Отсутствие фермента цитохромоксидазы у представителей семейства Enterobacteriaceae дает возможность их надежной дифференциации с посторонней водной оксидазоположительной микрофлорой. Однако, представление о бактерицидности оксидазных реактивов препятствует эффективному внедрению в методические документы экспрессного теста определения оксидазной активности бактерий непосредственно на мембранном фильтре. Разработка ускоренных методов определения Е. coli может быть основана на наличии у этих бактерий специфических ферментов - глюкуронидазы и триптофаназы.

Метод определения спор Clostridium perfringens, предложенный в Директиве 98/83/ЕС, сложен в выполнении, требует наличия анаэростата, делает методику малопригодной для выполнения рутинных анализов практическими лабораториями, в связи с чем возникает необходимость совершенствования метода выделения спор сульфитредуцирующих клостридий для повышения эффективности обнаружения анаэрбных бактерий в условиях обычного термостатирования.

Разработка в настоящее время новых средств обеззараживания воды ставит задачу увеличения надежности оценки их эффективности с учетом изменения биологических свойств микроорганизмов, на которых основаны методы их индикации (Синицына О.О. и др., 2008, Артемова Т.З. и др., 2010). Основная проблема связана с возникновением стрессированных форм бактерий после недостаточно эффективного обеззараживания, которые не определяются общепринятыми методами, и контролирующие органы не получают достоверную информацию о безопасности воды. В дальнейшем при благоприятных условиях происходит реактивация - восстановление жизнеспособности стрессированных бактерий, что создает возможность эпидемических осложнений {Тстаева Ю.Г. 1979; Павлова И.Б. и др., 2004).

На основании вышеизложенного целью работы являлась разработка методических приемов повышения гигиенической надежности санитарно-бакгериологических методов анализа воды с учетом ферментативных и

культуральных свойств бактерий, а также их способности к реактивации после обеззараживания воды.

Задачи исследования:

1.Обосновать параметры экспрессного теста определения оксидазной активности и разработать на его основе ускоренные методы индикации колиформных бактерий в воде.

2.Модифицировать ускоренные методы определения Е. coli, основанные на специфичности ферментативной активности бактерий.

3.Усовершенствовать метод индикации спор сульфитредуцирующих клостридий в воде в условиях обычного термостатирования.

4.Разработать методические приемы повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды.

Научная новизна работы.

Впервые установлены количественные зависимости степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности, продолжительности контакта бактерий с ним, а также длительности последующего пребывания на питательной среде.

Впервые выявлена зависимость способности бактерий к реактивации после обеззараживания воды от вида и дозы реагента, времени экспозиции.

Обоснована необходимость учета индикаторных и патогенных бактерий с измененными культуральными и биохимическими свойствами для повышения гигиенической надежности оценки обеззараживания воды. Определены признаки, характеризующие изменчивость Е. coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков.

Практическая значимость.

На основании экспериментальных и натурных исследований оптимизирована система санитарно-бактериологического контроля качества воды различного вида водопользования в направлении повышения её эпидемической надежности.

Разработан ускоренный метод индикации в воде основных нормируемых показателей - колиформных бактерий на основе совершенствования экспрессного теста определения оксидазной активности. Метод позволяет получать ответ через 18 - 24 часа (вместо 2-3 суток), а также эффективные и экономичные ускоренные методы определения колиформных бактерий, Е. coli и спор сульфитредуцирующих

клостридий с использованием отечественных питательных сред. Эти методы включены, наряду с международными, в ГОСТ Р 52426 - 2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» (справка № 343-05 от 07.02.2007).

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проекта МУ «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды» (справка №.11-5/279 от 12.05.2009).

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2006 - 2009 гг. для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и Водоканалов РФ по обучению методам санитарно-микробиологического контроля качества воды различного назначения. (Акт № 01-6/274 от 12.05.2010).

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН в рамках плановых тем № г/р 0120.0502725, НИР 098, а также при финансовой поддержке Правительства Москвы.

Апробация материалов диссертации. Результаты исследований доложены и обсуждены на: II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Рязань,29 мая-1 июня 2007 г); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 75-летию Научно-исследовательского института дезинфектологии Роспотребнадзора (г. Москва, 22-23 мая 2008 г); Втором Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «ЭкоФорум-2008» (Санкт-Петербург, 2008 г); Пленуме научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды»(г. Москва, 16-17 декабря 2009 г).

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Зависимость степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности. Методические приемы по устранению негативного влияния диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида с а-нафтолом.

2. Модификация методов определения колиформных бактерий, Е. coli, спор сульфитредуцирующих клостридий в воде с учетом специфичности их ферментативной активности и культуральных свойств.

3. Методические подходы для адекватной оценки эффективности обеззараживания воды с учетом реактивации и изменчивости свойств индикаторных и патогенных бактерий.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 214 страницах компьютерной верстки и состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, 7 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и 16 приложений. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей, 20 рисунками. Библиографический указатель включает 262 источника, из них 113 иностранных авторов.

Личный вклад автора составляет более 80%. Часть исследований проводили совместно с сотрудниками лаборатории эколого-гигиенической оценки и прогнозирования токсичности веществ (д.м.н., проф. З.И. Жолдакова, к.б.н. Е.А. Тульская, Р.А. Мамонов) и лаборатории гигиены питьевого водоснабжения (д.м.н., проф. Р.И. Михайлова, к.м.н. Рыжова И.Н.).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для выполнения поставленных задач был использован комплекс микробиологических, гигиенических и математических методов, которые обеспечивали реализацию экспериментальных и натурных исследований. Общий объем работы и основные направления исследований представлены в таблице 1.

Экспериментальные исследования проведены на воде модельных водоемов, которые создавали путем внесения в стерильную дехлорированную водопроводную воду суточных культур музейных штаммов модельных микроорганизмов. В качестве тест-микроорганизмов были выбраны как музейные, так и выделенные из сточной воды штаммы, которые составляют основу приоритетных показателей при оценке качества воды различного вида водопользования, имеют различную индикаторную значимость, форму, размер клеток: Salmonella enteritidis 5765 А ТСС, Salmonella infantis spp, Salmonella enteritidis spp, Pseudomonas aeruginosa 10145, Pseudomonas aeruginosa spp, Escherichia coli 1257, Escherichia coli 675, Staphylococcus aureus 906,

ЕМегососсш /ЪесаШ 29212. Музейные штаммы, используемые в работе, получены из коллекции музея живых культур ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора.

Таблица 1. Направления и общий объем исследований

Направления исследований Кол-во исследованных проб Общее число определений

1. Обоснование параметров экспрессного теста определения оксидазной активности и разработка на его основе ускоренных методов индикации колиформных бактерий в воде. 594 40531

2. Модификация ускоренных методов определения бактерий Е. coli, основанных на специфичности ферментативной активности бактерий. 270 766

3. Совершенствование метода индикации спор сульфитредуцирующих клостридий в воде в условиях обычного термостатирования. 206 930

4. Разработка методических приемов повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды. 251 757

Всего 1321 42984

Натурные исследования проведены при анализе питьевой воды централизованного водоснабжения, а также расфасованной в емкости, воды из подземных и поверхностных источников, сточных вод. При проведении натурных испытаний определяли следующие показатели: глюкозоположительные (ГКБ), колиформные (КБ), общие (ОКБ) и термотолерантные (ТКБ) колиформные бактерии, E.coli, энтерококки, сальмонеллы, Pseudomonas aeruginosa, споры сульфитредуцирующих клостридий.

Исследования проводили согласно методическим документам: МУК 4.2.1018 — 01; МУК 4.2.1884 - 04; МУ 2.1.5.800 - 99; МУ 2.1.4.1184 - 02; ИСО 9308 - 1:2000; ГОСТ Р 52426 - 2005; MP № 24ФЦ/513.

Данные, полученные в результате экспериментальных и натурных исследований, обработаны с использованием программного обеспечения Microsoft Office 2007, Microsoft Excel 2007, пакета статистических программ Statistic for Windows, БИОСТАТ 2006.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка ускоренного метода индикации колиформных бактерий на основе экспрессного теста определения оксидазной активности

Для определения степени бактерицидное™ оксидазных реактивов в экспериментальных исследованиях изучено два реактива: I. 1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида (ТМ) - рекомендуется как в отечественных, так и в международных (ИСО 9308-1:2000) методических документах; II. 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида и 1% спиртовой раствора а-нафтола в соотношении 7:3 (ДМ) - рекомендуется в МУК 4.2.1018-01.

Эксперименты проводили на модели тест-микроорганизма Е. coli 1257. Мембранные фильтры (МФ) с бактериями накладывались на смоченную оксидазным реактивом (ОР) фильтровальную бумажку. Время воздействия ОР составляло 2; 5; 30; 60 и 120 минут. После контакта с реактивом способность бактерий Е. coli к ферментации лактозы до кислоты и газа определяли путем посева в пробирки с полужидкой средой Гисса (СГ) с лактозой и последующей инкубацией посевов при температуре 37°С. Контроль - скорость ферментации лактозы бактерий E.coli, не подвергнутых действию реактива.

После выдерживания на реактиве ТМ реакция ферментации лактозы бактериями Е. coli развивалась с той же скоростью, что и в контроле (Р>0,05). Признаки роста и образование кислоты отмечали уже через 1 час после посева в пробирки со СГ (рис. 1). Начало газообразования наблюдалось через 2 часа во всех вариантах опыта, кроме бактерий, подвергшихся действию ТМ в течение 120 минут. Реакция ферментации полностью завершилась через 3-4 ч у бактерий, контактировавших с ТМ в течение 2-30 мин, через 5ч- после воздействия ТМ 60120 минут. Таким образом, ТМ не оказывал влияния на скорость роста и биохимическую активность бактерий Е. coli даже при контакте в течение двух часов.

После контакта бактерий с ДМ от 2 до 5 минут ферментация лактозы начиналась и заканчивалась на 1 и 2 часа позже, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 2). Различия с контролем у бактерий, контактировавших с ДМ в течение 2 мин, являлись не достоверными (Р > 0,05), у бактерий, контактировавших с ДМ в течение 5 мин, отличия статистически значимы (Р < 0,01).

Изучение воздействия OP на биохимическую активность бактерий Е. coli, выросших на лактозном агаре с тергитолом-7 и ТТХ (Merck) (JITA), который рекомендован И СО 9308-1:2ООО, подтвердило закономерности, полученные при выращивании бактерий на агаре Эндо, рекомендуемом МУК 4.2.1018-01.

1 2 3 4 5

время ферментации, час

контроль ■ I-ТМ-2МИН —4-1¥5мин ТМ-30 мин -f-TM-бОмин —ТМ-120 мин

Рисунок 1. Влияние оксидазного реактива ТМ на динамику ферментации лактозы бактериями Е. соН, выросшими на агаре Эндо, п=30

0 _I

1 2 3 4 S 6 Г 24 время ферментации, час

контроль ■ ■ -ДМ-2МИН -Х—ДМ-ЗОмин -ДМ-бОмин

ДМ-5 мин ДМ-120 мин

Рисунок 2. Влияние оксидазного реактива ДМ на скорость ферментации лактозы бактериями Е. coli, выросшими на агаре Эндо, п=30

Разрабатывались методические приемы по снижению влияния реактива ДМ на биохимическую активность бактерий Е. coli. Через 1, 2, 3, 4 и 5 минут контакта с ДМ фильтры переносили обратно питательную среду. Посев бактерий на СГ проводили срезу же после переноса МФ на питательную среду, через 5, 30 и 60 минут. При времени контакта с реактивом ДМ в пределах 1-4 минут и посеве колоний на СГ сразу же после переноса МФ с бактериями обратно на питательную среду, а также при посеве через 5-60 мин, статистически значимых различий между контрольным и опытными вариантами не обнаружено (Р>0,05) (таблица 2).

При контакте бактерий, выросших на агаре Эндо, на фильтре с ДМ в течение 5 минут (как это допускается в МУК 4.2.1018-01) ингибирующее действие реактива сохранялось сразу после переноса МФ с бактериями на агар Эндо и через 5 мин пребывания на среде (Р < 0,05). При более длительном выдерживании МФ на среде в течение 30 и 60 минут негативное действие ОР прекращалось, и биохимическая активность бактерий восстанавливалась.

В экспериментах доказано, что торможение биохимической активности Е. соИ ДМ может быть предотвращено в случае контакта МФ с реактивом в пределах 4 минут и дальнейшего нахождения на питательной среде не менее 5 минут.

Таблица 2. Влияние приема переноса мембранного фильтра обратно на питательную среду после контакта с реактивом ДМ на динамику ферментации лактозы бактериями Е. coli.__

Время нахождения Среднее время ферментации лактозы до

Время фильтра на среде газообразования, мин

контакта с после переноса, М±т (п = 40)

реактивом мин Агар Лактозный

ДМ, Эндо агар с

мин тергитолом

контроль - 210±8,94 141±9,00

0 234± 11,66 180±21,82

4 5 225± 16,88 180±14,83

30 156±12,49 174± 16,00

60 144±4,00 168±11,32

0 264±8,94(р<0,01) 201±17,35(р<0,01)

5 5 243±12,21(р<0,05) 216±8,72(р<0,001)

30 204± 17,20 192±17,44(р<0,05)

60 156±4,00 186±23,83(р<0,05)

Проведены исследования по изучению влияния компонентов ДМ на жизнедеятельность бактерий. 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида не влияет на ферментативные свойства бактерий Е. coli даже при длительном в течение 1 часа времени контакта (таблица 3).

Таблица 3. Влияние компонента реактива ДМ 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида на скорость ферментации лактозы бактериями Е.соИ

Варианты опыта Время контакта, мин Среднее время ферментации лактозы до образования газа, мин М±ш (п= 10)

Контроль (питательный агар) - 156±9,80

1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида 5 168±8,00

30 144±9,80

60 144±9,80

Компонент реактива - 1% спиртовой раствор а-нафтола в соотношении с водой 3:7 при контакте с бактериями Е.соН уже в течение 2,5 и 5 минут достоверно задерживал время ферментации лактозы. При соотношении спиртового раствора а-нафтола и воды 2,5 : 7,5 не выявлено влияния испытуемой смеси в течение этого же периода экспозиции на биохимические свойства бактерий (таблица 4).

Результаты проведенных экспериментов позволили усовершенствовать методику выполнения экспрессного теста определения оксидазной активности

II

(ЭТООА) по сравнению с МУК 4.2.1018-01, а также дифференцировать алгоритм его проведения в зависимости от используемого ОР.

Таблица 4. Влияние спиртового раствора а-нафтола на динамику ферментации лактозы бактериями Е. coli __

Варианты опыта Время контакта с реактивом ДМ, мин Среднее время ферментации лактозы до образования газа, мин М±т (п= 10)

Контроль (питательный агар) - 138±4,90

Соотношение спиртового раствора а-нафтола и воды 3:7 2,5 165±11,8 (р< 0,05)

5 192± 14,97 (р <0,01)

30 855±195,00 (р< 0,001)

Соотношение спиртового раствора а-нафтола и воды 2,5:7,5 2,5 156±9,80

5 147±13,75

30 168±4,90 (р < 0,01)

При использовании ДМ, в случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий, пересев колоний на подтверждающие среды целесообразно производить после переноса МФ на питательную среду и последующего выдерживания свыше 5 минут. Этот прием полностью исключит негативное действие ДМ и ускорит время получения ответа по тесту ферментации лактозы на 1-2 часа. Изменено соотношение 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшено допустимое время контакта с реактивом до 4-х минут, исключено ограничение времени посева бактерий в подтверждающие среды для идентификации после переноса МФ обратно на питательную среду.

При работе с ТМ, исключен этап переноса МФ обратно на среду после проявления оксидазной активности, не ограничено время посева бактерий в подтверждающие среды для дальнейшей идентификации КБ и E.coli.

Усовершенствованный ЭТООА позволил разработать ускоренный метод индикации КБ, применение которого сокращает время проведения анализа на 48 ч по сравнению с МУК 4.2.1018-01, и на 24 ч - по сравнению с ИСО 9308-1:2000. Метод исключает субъективную выборку колоний - основную причину ошибок микробиологического анализа.

Ускоренный метод определения КБ апробирован в натурных условиях при анализе типов вод с разной степенью бактериального загрязнения. Валидизация разработанного метода проводилась путем сравнения с результатами, получаемыми по методике ИСО 9308-1:2000. При исследовании воды поверхностных и подземных

источников частота проб, в которых по методике ИСО определено более низкое содержание КБ, составила 21,4% и 8,3%, соответственно, что указывает на большую надежность ускоренного метода в оценке эпидемической опасности воды.

Достоинством усовершенствованного метода индикации КБ по сравнению с методикой ИСО, помимо сокращения времени проведения анализа, является предварительное исключение из дальнейшей идентификации посторонней водной оксидазоположительной микрофлоры (ОПМ). Наибольшее количество ОПМ отмечено при исследовании питьевой воды подземных источников (57,3±18,7%), наименьшее - в загрязненной сточными водами питьевой воде (39,3±17,3%). ЭТООА особенно эффективно упрощал исследование воды с предполагаемой низкой степенью микробного загрязнения (бутылированной, подземных источников) в случаях, когда на МФ вырастала только ОПМ. В этих случаях через 4 минуты дается ответ, в то время, как по методике ИСО 9308-1:2000 колонии микроорганизмов необходимо пересевать на неселективный агар для постановки оксидазного теста (ОТ) через 24 часа. Ускоренный метод определения КБ вместе с международным методом ИСО 93 08-1:2000 включен в ГОСТ Р 52426-2005.

Усовершенствованный ЭТООА особенно необходим для методического обеспечения наиболее надежного показателя эпидемической безопасности воды -ГКБ. Определение этого показателя предполагает ОТ в качестве основного этапа идентификации от посторонней водной микрофлоры, что связано с использованием для первичного посева лактозных дифференциальных сред, позволяющих выделить бактерии, ферментирующие лактозу. Разработан алгоритм выполнения метода определения ГКБ с использованием ЭТООА одновременно всех выросших на МФ колоний и ускоренного теста ферментации глюкозы на полужидкой СГ, время анализа составляет 24 - 28 часов.

Модификация ускоренных методов определения бактерий Е. coli на основе специфичности ферментативной активности Отличительной особенность КБ является наличие специфического фермента -ß-галактозидазы (Frampton Е. IV., 1988; Kilian М., 1976). При этом бактерии Е. coli характеризуются наличием ферментов как ß-галактозидазы, так и ß-D-глюкуронидазы. Эти свойства используются при выращивании бактерий на специальных хромогенных питательных средах (ХПС), содержащих субстрат, разлагая который колонии окрашиваются в цвет, отличный от других видов

микроорганизмов. Этот принцип, помимо ускорения анализа на 24 часа, позволяет проводить количественный учет Е. coli, исключая ошибки метода, связанные с выборочной проверкой колоний для идентификации.

Проведена сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения КБ и E.coli в воде с использованием ХПС (Chromocult® Coliform Agar, Merck (хромокульт колиформ агар)); Chromocult® триптонный агар с желчью и X-глюкуронидом (Merck) (хромокульт-ТЖХ) и классического двухэтапного метода индикации этих бактерий на JITA и на агаре Эндо, производства НПО «Микроген», г. Махачкала (контроль). Посев микроорганизмов производили методом мембранной фильтрации.

Достоверные различия в количестве КБ, идентифицированных в одной и той же пробе воды ускоренным методам с использованием хромокульт колиформ агара (ХКА) и классическим методом, не выявлены (Р > 0,05). При определении в этих же посевах бактерий E.coli наблюдались более выраженные различия в полученных данных (рис. 3). Наиболее эффективным в данном исследовании оказался ЛТА (Р<0,05). Однако на ХПС при определении E.coli ускоренными методами, получены сопоставимые результаты с традиционным методом на агаре Эндо (Р>0,05).

| 1800

§ 1600 Т~

§ 1400

% 1200

I 1000

Ü 800 ю

¡£ 600

0

§ 400

1 200

0

1 0

агар Эндо (контроль)

среда с тергитолом

1 Р<0,05

_ _ -г

1 -4 - I

/

т ч

1 1 1 3

II1II

■

хромокульт хромокульт-ТЖХ колиформ агар

питательные среды

Эколифориныебактерии □E.coli

Рисунок 3. Сравнительная оценка метода определения КБ и E.coli на хромогенных средах и классического метода на агаре Эндо и лактозном агаре с тергитолом (п=6).

Как показано в работе Ossmer R. (1999), на чувствительность методов индикации микроорганизмов в воде могут оказывать влияние типы используемых МФ. Установлено, что при работе на ХКА с применением фильтров «Владипор» из смеси ацетатов целлюлозы (АЦ) и «Владисарт» из нитрата целлюлозы (НЦ) наблюдается четкая дифференциация колоний по цвету. Фильтры «Владисарт» из АЦ оказались неэффективны для работы на ХКА, что выражалось в снижении выявленных КБ и Е. coli на 34,1% и 60,3%, соответственно, по сравнению с МФ из НЦ. Эти результаты свидетельствуют о необходимости внесения дополнения в MP № 24ФЦ/513 с указанием пригодных для работы на ХКА марок МФ.

На следующем этапе исследований проводилась сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения Е. coli на основе двуслойной среды (ДС), по ИСО 9308-1:2000, и разработанной нами модификации с использованием отечественных ингредиентов.

Принцип ускоренного метода анализа на ДС заключается в выявлении бактерий, способных образовывать индол при выращивании колоний на триптофансодержащих средах. Все колонии, изменившие цвет на розовый (при наложении МФ на реактив Ковача), учитывают как бактерии Е. coli. ДС состоит из верхнего слоя триптон-соевого агара (ТСА) и нижнего слоя триптон-желчного агара (ТЖА). На этой среде рост сопутствующей микрофлоры тормозится солями желчных кислот и высокой температурой инкубации (44 0 С). ДС по прописи ИСО готовили из импортных ингредиентов, а в модифицированной ДС заменили неселективный ТСА на питательный агар (НПО «Микроген», г. Махачкала) с добавлением 1 г/л триптофана.

При исследовании загрязненной питьевой воды показано, что на ДС и модифицированной ДС статистической разницы между количеством бактерий E.coli, не обнаружено (Р > 0,05). По сравнению с ЛАТ (контроль), бактерий E.coli на обоих ДС выделено больше на 29,6±8,4% и 28,3±10,5%. Для выявления причины расхождения результатов, каждая окрашенная по ускоренному тесту колония была исследована на принадлежность к бактериям E.coli. Установлено, что 18,9±8,6% колоний, учтенных ускоренным методом по окраске колоний как E.coli, не были отнесены к этому виду по другим биохимическим тестам. Это связано, по-видимому, с наличием триптофаназы у бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae, таких как: Citrobacter, Klebsiella, Yersinia (Берджи, 1997), которые считаются

условно-патогенными, и поэтому гипердиагностика при единичных случаях их обнаружения не снижает гигиеническую надежность оценки качества воды.

Для ускоренного определения КБ и Е. coli в практике бактериологического контроля воды может быть рекомендовано использование ХКА. Ускоренное определение Е. coli может проводиться на среде хромокульт-ТЖХ или на модифицированной ДС, состоящей из ТЖА и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана. При использовании ХКА допустима фильтрация воды только на МФ из НЦ или из смеси АЦ. Отсутствие необходимости проведения дополнительной идентификации бактерий, которая применяется в классическом двухэтапном методе, позволяет сократить время анализа до 18-24 часов.

Совершенствование методики выделения спор сульфитредуцирующих клостридий из воды

Для ускорения и повышения эффективности методики выделения спор сульфитредуцирующих клостридий (CK) в условиях обычного термостатирования проведена оптимизация питательной среды - железо-сульфитного агара (ЖА), рекомендованного МУК 4.2.1018-01, путем добавления тиогликолята натрия (ТГ) в концентрациях 1 и 0,1 г/л. Это вещество вводят для создания необходимой степени окислительно-восстановительного потенциала среды, что поддерживает размножение анаэробных микроорганизмов (Мейнелл Д., ¡967; Шшьникова И.И., 2005).

Помимо двух вариантов ЖА с ТГ проводилась оценка готовых сред производства НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич: полужидкой железо-сульфитной среды (ЖСС-1) и плотной железо-сульфитной среды (ЖСС -2), рекомендованных для выращивания CK. Исследования выполнялись при анализе воды с разной степенью бактериального загрязнения: из поверхностных источников (п-10 КОЕ/20 мл) и загрязненной питьевой воды (п-102 - п-103 КОЕ/20 мл). На рисунке 5 видно, что статистически значимые различия в количестве спор CK, обнаруженных в воде поверхностных источников, при использовании ЖА без добавок (контроль), ЖА с добавлением 0,1 г/л ТГ и среды ЖСС-1 отсутствовали (Р > 0,05). Две другие среды -ЖА с добавлением 1 г/л ТГ и среда ЖСС-2 показали наличие статистически значимых различий по сравнению с контрольной средой (Р < 0,05). Но если в случае с ЖА с добавлением 1 г/л ТГ количество выделенных спор CK было выше, по сравнению с контрольной средой, то в отношении среды ЖСС-2 имело место

статистически значимое обратное соотношение. Аналогичные закономерности получены при исследовании загрязненной питьевой воды (рис. 4). Споры СК были обнаружены в 100% проб на всех питательных средах, кроме среды ЖСС-2 (обнаружены в 93,34 % проб).

- 200 л-1 Р<0,05 |-

I 180-----V -

Ф 160---^■'"'У--

I 140 ТЛ\*У -

¡МЖ llW^te

i -HJ вЖ±1- ..ija;

ф

g ЖА ЖА (1,0 г/л ЖА (0,1 г/л ЖСС-1 ЖСС-2

д (контроль) ТГ) ТГ) (вязкая) (твердая)

Ввода поверхностных источников Ввода, загрязненная сточными водами

Рисунок 4. Сравнительная оценка методов определния спор сульфирредуцирующих клостридий на оптимизированной среде и средах, рекомендованных для их выращивания.

Скорость роста спор СК на всех исследуемых средах при анализе загрязненной питьевой воды, была примерно одинаковой. При исследовании воды поверхностных источников почернение среды и начальные признаки газообразования наблюдались через 4-5 часов в 53,3% проб на ЖА с добавлением 1 г/л ТГ, в 40% проб - на ЖА и ЖА с добавлением 0,1 г/л ТГ. Учет колоний полностью завершался через 10-12 часов.

Добавление к ЖА восстановителя ТГ в количестве 1 г/л позволяет повысить эффективность выделения спор СК в условиях обычного термостатирования. При исследовании воды поверхностных источников эффективность выделения на оптимизированной среде выше на 55,2±27,6%, при исследовании загрязненной питьевой воды - на 35,9±14,9% по сравнению с ЖА. Данная модификация ЖА обладает рядом преимуществ: проста в изготовлении, не имеет сложных или дефицитных компонентов, изготовлена из непищевого сырья. Добавление ТГ позволяет в большей степени стандартизовать модифицированную среду по сравнению со средами, где в качестве добавок для понижения окислительно-восстановительного баланса среды используются нестандартизуемые компоненты (лизированная кровь, измельченное мясо).

Разработка методических приемов повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды

Одной из причин вторичного роста микроорганизмов в воде водопроводных сетей является восстановление жизнеспособности (реактивации) бактерий за время поступления питьевой воды к потребителю после бактериостатического действия обеззараживающих агентов (Alonso Е., 2004; Qi Y.N. 2004). При этом на выходе с водопроводных сооружений бактерии, временно утратив способность вырастать на питательных средах, не определяются общепринятыми методами контроля, и вода ошибочно характеризуется как безопасная в эпидемическом отношении. Под термином «реактивация» понималась способность бактерий после зафиксированной общепринятыми методами их полной инактивации восстанавливать жизнеспособность при благоприятных условиях.

В работе изучена возможность реактивации индикаторных, условно-патогенных и патогенных бактерий после воздействия обеззараживающих средств различного состава и механизма действия: гипохлорита натрия; диоксида хлора; гуанидинсодержащего препарата и двух фотосенсибилизаторов - профлавин ацетата и метиленового голубого.

Воспроизводился процесс обеззараживания воды (ОВ) на водопроводных станциях, базирующихся на поверхностном источнике, реагентами гипохлоритом натрия (ГН) и диоксидом хлора (ДХ) в дозах: 1; 2; 3; 4 мг/л. Исходные уровни индикаторных бактерий составляли п- 103 КОЕ/100 мл, с добавлением S.eníeritidis и S.infantis и Ps.aeruginosa до концентрации п-103 КОЕ/л. Экспозиция - 0,5; 1; 2; 3; 24 часа после внесения дезинфектантов.

Воздействие ДХ в дозе 1 мг/л через 30 мин экспозиции приводило к резкому снижению содержания уровня сальмонелл - от 1500 КОЕ/л до 20 КОЕ/л. Через 2 часа сальмонеллы не были обнаружены. Однако, через 24 часа наблюдалась слабая реактивация сальмонелл до 25 КОЕ/л. ДХ в дозах 2 и 3 мг/л вызвал 100%-ную инактивацию ГКБ, ОКБ, ТКБ через 30-180 мин экспозиции. Однако через 24 часа наблюдалась реактивация бактерий: ГКБ, ОКБ до 5 КОЕ/ 100 мл, ТКБ - до 4 КОЕ/ЮО мл. При дозах ДХ - 4,0 мг/л, ГН - 2, 3, 4 мг/л отмечался полный бактерицидный эффект. Воздействие ГН в концентрации 1 мг/л через 30 минут экспозиции приводило к резкому снижению содержания КБ до единичных клеток в 100 мл, с дальнейшей инактивацией бактерий через 3 часа. Через 24 часа выявлена

реактивация бактерий ГКБ и ОКБ до 82 и 80 КОЕ в 100 мл. Увеличение срока наблюдения за динамикой инактивации бактерий до 24 ч дало возможность определить бактериостатические дозы ДХ (2 и 3 мг/л) и ГН (1 мг/л), при которых стрессированные индикаторные и патогенные бактерии после снижения остаточных количеств реагентов восстанавливают жизнеспособность и размножаются в воде до эпидемически опасных уровней.

Проведены исследования по изучению возможности реактивации бактерий после обеззараживания сточных вод с использованием ГН в дозах 2, 5 и 10 мг/л по активному хлору и экспозиции 1, 2, 20, 120 часов. Исходный уровень микробного загрязнения в модельных водоемах п-105 КОЕ/ЮО мл. ГН в дозе 5 мг/л через 2 часа контакта вызывал 100%-ную инактивацию всех исследованных бактерий (остаточный хлор 2,1 мг/л). Через 20 часов при снижении остаточного хлора до 1,0 мг/л наблюдалось увеличение ОМЧ, размножение КБ и сальмонелл (рис.5).

заражение

время экспозиции

Рисунок 5. Численность сальмонелл при различных дозах гипохлорита натрия.

Через 120 часов численность сальмонелл возросла до 100 КОЕ/л, ОКБ и ГКБ до 5000 КОЕ/ЮО мл, ТКБ - до 400 КОЕ/ЮО мл, ОМЧ - до 25000 КОЕ/ мл. 100% инактивация всех изученных групп бактерий достигнута только при дозе ГН 10 мг/л. Полученные данные объясняют причину размножения сальмонелл на значительных расстояниях от места сброса сточных вод {Талаева Ю.Г.и соавт., 1979) и обнаружения патогенных бактерий в воде у водозаборов.

В экспериментальных исследованиях по изучению эффективности гуанидинсодержащего препарата (полигексаметиленгуанидин-гидрохлорида (ПГМГ-ГХ) и четвертичного аммонийного соединения) в концентрациях 0,24 и 0,5 мг/л по ПГМГ-ГХ в отношении индикаторных и условно-патогенных бактерий выявлена реактивация ОМЧ (через 24 ч) и Pseudomonas aeruginosa (через 48 ч), что свидетельствует о бактериостатическом (БС) действии исследованных доз препарата в отношении этих микроорганизмов. Отсутствие размножения всех групп КБ и энтерококков в течение 48 ч после OB в сочетании с коагулированием и фильтрацией является доказательством бактерицидного (БЦ) действия дезинфектанта в изученных концентрациях в отношении этих микроорганизмов.

В последние годы предложен новый метод OB с использованием фотодинамически активных красителей - фотосенсибилизаторов (Кузнецова H.A., Калия О.Л.,1998; патент №2235688 от 10.09.2004), в том числе, метиленового голубого (МГ) и профлавина ацетата (ПА). Для установления возможности реактивации бактерий после фотообеззараживания (ФО) с использованием МГ и ПА проведены исследования на воде модельных водоемов, зараженных суточными культурами музейных штаммов и бактерий, выделенных из сточных вод: Salmonella infantis spp, Salmonella enteritidis spp, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Pseudomonas aeruginosa 10145, Pseudomonas aeruginosa spp, Escherichia coli 1257, Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 29212. Исходный уровень заражения составил n-106 КОЕ/100 мл, концентрации МГ и ПА: - 0,25; 0,5; 1; 1,5 и 2 мг/л.

Установлена возможность реактивации бактерий E.coli после воздействия МГ в концентрации 0,5 мг/л. Сразу после освечивания воды бактерии E.coli не были обнаружены, а через 24 часа бактерии не только восстановили свои ростовые свойства, но и размножились до высокого уровня - 2,4-10 3 КОЕ/100 мл. МГ и ПА, в концентрации 1 мг/л оказали полное БЦ действие.

Изучена эффективность ФО в отношении индикаторных (Ent. faecalis) и патогенных (St. aureus) бактерий. ПА в концентрации 1,0 мг/л оказывал полное БЦ действие в отношении энтерококков, МГ в концентрации 0,75 мг/л - в отношении стафилококков и энтерококков. Выявлено БС действие МГ в концентрации 0,25 мг/л в отношении стафилококков и в концентрации 0,5 мг/л в отношении энтерококков через 24 часа, с последующей реактивацией через 5 суток (таблица 5).

Таблица 5. Влияние фотосенсибилизаторов на бактерии Ent. faecalis и St. aureus в процессе фотообеззараживания

Микроорганизм Фотосенсибилизатор Концентрация фотосенсиби лизатора, мг/л КОЕ/100 мл

Исходный уровень заражения Сразу после освечивания Через 1 сутки Через 5 суток

КОЕ эффективность, %

Enterococcus faecalis - контроль 3,210б ЗД-106 - 7,2-Ю5 5,1-104

МГ 0,25 3,1-Ю2 99,990 3,0-10' 3,2-10'

0,5 6,010' 99,998 0 6,0-103

0,75 0 100,000 0 0

ПА 0,5 4,0-101 99,99 9,4-10' 2,МО2

1,0 0 100,00 0 0

Staphylococcus aureus - контроль 4,9-106 4,8-106 - 3,8 -Ю'" 2,5-10'

МГ 0,25 2,7-10' 99,999 0 2,8-10'

0,5 7,6-10' 99,998 0 0

0,75 0 100,000 0 0

ПА 0,5 4,1-Ю3 99,916 8,7-10' 0

1,0 3,1-10' 99,940 0 0

Выявлена большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями при воздействии сенсибилизаторов МГ и ПА. 100%-ная инактивация установлена только при высокой дозе МГ 2 мг/л в отношении музейного штамма 5. еМегШсИъ (таблица 6). После окончания освечивания при дозе МГ 1 мг/л численность сальмонелл снизилась на 4 порядка, при дозе 1,5 мг/л - на 5 порядков с последующим интенсивным размножением сальмонелл до исходного уровня заражения. Эффективность обеззараживания МГ в концентрации 1 мг/л в отношении сальмонелл, выделенных из сточных вод (Б. ш/ал/дг ярр.), была меньше (98,59%) по сравнению с действием на музейный штамм (99,84%). МГ в концентрации 2 мг/л оказывал БС действие на Я. ш/апШ зрр. с проявлением реактивации после ФО. Во всех вариантах опыта, где отсутствовала 100%-ная инактивация сальмонелл наблюдалось их последующее интенсивное размножение. Через 5 суток после ФО воды уровень сальмонелл превышал исходный и контрольный, что представляет большую эпидемическую опасность. Полученные данные об интенсивном (в сотни и тысячи раз) размножении сальмонелл после ФО в фильтрованной через угольный фильтр и автоклавированной водопроводной воде опровергают представление о том, что возбудители кишечных инфекций не способны увеличивать популяцию при попадании в водную среду с небольшим содержанием питательных веществ (Немыря В.И., 1980).

Таблица 6. Влияние фотосенеибилизаторв на бактерии S. enteritidis и S. infantis spp. в процессе фотообеззараживания

Микроорганизм Фотосенсибилизатор Концентрация Фотосенсиби лизатора, мг/л КОЕ/100 мл

Исходный уровень заражения Сразу после освечивания Через 1 сутки Через 5 суток

КОЕ эффективность, %

Salmonella enteritidis - контроль 2,5-10 6 2,5-106 - 7,2-10 ' 1,4-107

МГ 1,0 4,0-102 99,840 2,2-106 1,2-10 7

1,5 2,0-10 1 99,992 3,5-10' 5,2-106

2,0 0 100,000 0 0

ПА 0,25 5,7 105 71,500 6,0-10" 8,5 • 10'

1,0 6,1 • 104 96,950 4,1 • 104 2,5 • 10'

Salmonella infantis spp. - контроль 2,9-10 6 3,0-106 - 7,8-10" 2,8-106

МГ 0,25 4,8-105 83,450 9,4-10" 1,810s

1,0 4,МО4 98,590 2,8-105 4,1-10 7

2,0 0 100,000 1,0-102 6,3-102

ПА 0,5 4,2 106 0 1,8-10' 9,8 • 107

1,0 8,4 10" 71,030 2,4 • 10' 2,7 • 108

1,5 8,5 105 70,690 4,2 • 10" 8,8 • 107

Наиболее высокая устойчивость к ФО установлена у бактерий Ps. aeruginosa. Как и в опытах с сальмонеллами, выявлена большая чувствительность музейного штамма по сравнению с выделенным из сточных вод. Сразу после освечивания уровень условно-патогенных бактерий даже в присутствии больших концентраций фотосенсибилизаторов (1,0 и 1,5 мг/л) снизился всего на 1 порядок. В течение 5 суток численность Ps. aeruginosa возросла до более высоких количеств по сравнению с контролем.

Выявление способности микроорганизмов к реактивации после ФО позволило установить БС дозы сенсибилизатора МГ в отношении St. aureus (0,25 мг/л), E.coli (0,5 мг/л), Eni. faecalis (0,5 мг/л), S. infantis spp .(2 мг/л), при действии которых наблюдалась 100%-ная инактивация микроорганизмов сразу после завершения процесса ФО с последующим восстановлением их жизнеспособности через 1-5 суток. В случае полного обеззараживающего эффекта ПА реактивация микроорганизмов не наблюдалась.

В результате экспериментов установлена возможность реактивации бактерий через 24 и более часов после воздействия обеззараживающих средств различного состава. БС эффект дезинфектантов проявляется в реактивации стрессированных бактерий после зафиксированного их отсутствия, что вызывает необходимость оценивать эффективность OB при изучении новых средств и подборе режимов 22

обработки воды в течение 1 - 5 суток. Большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями свидетельствует о необходимости выполнения исследований не только на индикаторных, но и на патогенных бактериях. При выборе модельных бактерий необходимо учитывать меньшую устойчивость музейных штаммов, по сравнению с выделенными из окружающей среды.

Изучалось изменение культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий (таблица 7). Изменчивость в процессе ФО культуральных свойств бактерий Е. coli выявлена в 60 % проб, сальмонелл - в 50 % проб, Eni. faecalis и St. aureus - в 73% проб. Отсутствие типичных культуральных особенностей колоний может привести к ложноотрицательному результату оценки эпидемической безопасности воды.

Таблица 7. Изменчивость культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий_

Свойства бактерий Микроорганизмы

Е. coli Сальмонеллы Энтерококки Стафилококки

Культуральные особенности Отсутствие металлического блеска колоний на среде Эндо; отсутствие способности бактерий ферментировать лактозу Отсутствие характерного зеркального блеска вокруг колонии на висмут-сульфитном агаре Отсутствие блеска колоний на энтерококкагаре Задержка образования пигмента и проявления лецитовителлазной активности

Бактериальный рост Контроль: 1-2 суток Опыт: 3-4 суток

Размер колоний Контроль: все колонии одного размера Опыт: выраженный полиморфизм по рамеру

Даны рекомендации по усовершенствованию методики микробиологического анализа с учетом изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий: удлинение срока инкубации посевов до 5 суток, учет не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнение пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использование нескольких методов посева в случае отсутствия дезактиватора дезсредства.

выводы

1. Научно обоснованы алгоритмы экспрессного теста определения оксидазной активности одновременно всех бактерий, выросших на мембранном фильтре (1-4 мин вместо 24 ч). Показано, что оксидазньш реактив 1 % водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина не оказывает влияния на жизнеспособность и ферментативную активность бактерий Escherichia coli после контакта в течение 2 часов. Комплексный реактив диметил-п-фенилендиамин за счет а-нафтола подавляет биохимическую активность бактерий через 5 мин воздействия. Изменение соотношения 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшение допустимого времени контакта с реактивом до 4-х минут, обратный перенос мембранного фильтра на питательную среду устраняют негативное влияние комплексного реактива на бактерии Escherichia coli.

2. В сравнительных исследованиях на основе предложенных алгоритмов экспрессного теста определения оксидазной активности разработаны ускоренные методы определения колиформных бактерий, общих колиформных бактерий, глюкозоположительных колиформных бактерий, которые ускоряют анализ воды по сравнению с отечественным методом на двое суток (24-28 ч вместо 72 ч) и по сравнению с международным методом на сутки (24 ч вместо 48 ч).

3. Совместное определение колиформных бактерий и Escherichia coli на хромогенных средах, избирательно Escherichia coli - на модифицированной двуслойной среде, состоящей из триптон-желчного агара и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана, ускоряет микробиологический анализ с 48 часов до 18-24 часов. При использовании хромокульт кольформ агара допустима фильтрация воды только на мембранах из нитрата целлюлозы или из смеси ацетатов целлюлозы.

4. Добавление к железо-сульфитному агару восстановителя тиогликолята натрия в количестве 1 г/л позволило повысить на 36-55% эффективность выделения спор сульфитредуцирующих клостридий из воды в условиях обычного термостатирования.

5. Установлена реактивация колиформных бактерий и сальмонелл через 24 часа после обеззараживания как воды поверхностного источника гипохлоритом натрия в дозе 1 мг/л и диоксидом хлора в дозах 2, 3 мг/л, так и сточных вод гипохлоритом натрия в дозе 5 мг/л. Гуанидинсодержащий препарат в дозах 0,24 и 0,5 мг/л вызывает

реактивацию в отношении ОМЧ через 24 часа и Pseudomonas aeruginosa через 48 часов. После фотообеззараживания с использованием метиленового голубого восстановление жизнеспособности Staphylococcus aureus отмечено через 5 суток в концентрации 0,25 мг/л, Escherichia coli и Enterococcus faecalis - через 5 суток в концентрации 0,5 мг/л, Salmonella infantis spp. - через 1 сутки в концентрации 2 мг/л. Бактериостатический эффект дезинфектантов проявляется в реактивации стрессированных бактерий после зафиксированного их отсутствия, что вызывает необходимость оценивать эффективность обеззараживания при изучении новых средств и подборе режимов обработки воды в течение 1 -5 суток.

6. Неполное бактерицидное действие дезинфектантов приводит к адаптивной изменчивости культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий - Escherichia coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков. Адекватность гигиенической оценки эффективности обеззараживания воды повышается за счет удлинения срока инкубации посевов до 5 суток, учета не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнения пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использования нескольких методов посева.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева Р.А., Доскина Т.В., Талаева Ю.Г., Иванова JI.B., Буторина Н.Н.. Лаврова Д.В., Санамян А.Г., Загайнова А.В., Колбасникова И.А., Ибрагимова Л.М., Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина С.В., Панасовец О.П., Савилов Е.Д., Мамонтова ДМ., Анганова Е.В.Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения России // Гигиена и санитария, 2005. -№6. - С.14-18.

2. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Богатырева И.А., Буторина Н.Н.. Загайнова А.В. Совершенствование нормативной и методической базы бактериологического мониторинга качества питьевой воды // Гигиена и санитария, 2007. - №5. - С.36 - 39.

3. Артемова Т.З., Недачин А.Е., Жолдакова З.И., Синицына О.О., Гипп Е.К., Буторина Н.Н.. Мамонов Р.А., Тульская Е.А. Проблема реактивации микроорганизмов в оценке эффективности средств обеззараживания воды // Гигиена и санитария. -2010. - №1. - С.15-18.

В других изданиях:

4. Буторина Н.Н.. Загайнова А.В. Разработка ускоренного метода определения колиформных бактерий // Сборник Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Суздаль, 2005. - С.330-331.

5. Загайнова А.В., Буторина Н.Н. Проблема оценки риска возникновения кишечных инфекций связанных с питьевым водопользованием населения // Там же. -С. 217-219.

6. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Иванова J1.B., Загайнова А.В., Колбасникова И.А., Буторина Н.Н.. Ибрагимова JI.M. Сравнительное значение индикаторных бактерий в оценке потенциальной опасности возникновения кишечных инфекций при питьевом водопользовании // Сборник докладов «Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды» М., 2005. - С.48-63.

7. Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина С.В., Панасовец О.П., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Загайнова А.В., Буторина Н.Н., Ибрагимова JI.M., Колбасникова И.А. Значение индикаторных микроорганизмов в оценке микробного риска при питьевом водопользовании // Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки». М., 2005. - С.178-180.

8. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова JI.B., Колбасникова И.А., Загайнова А.В., Буторина Н.Н., Ибрагимова JI.M. Состояние и перспектива регламентирования качества питьевой воды по бактериологическим показателям // Материалы научно-практической конференции «Вода, напитки, соки, технологии и оборудование». М., 2006. - С.25-26.

9. Буторина Н.Н. Проявление бактерицидного и бактериостатического эффекта в процессе обеззараживания хлором очищенных городских сточных вод // Материалы 2-ой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Рязань, 2007. - С.235-237.

10. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина Н.Н.. Загайнова А.В., Кузнецова Н.А. Изучение возможности реактивации Enterococcus faecalis и Staphylococcus aureus в процессе фотообеззараживания // Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды». М., 2009. - С.191-193.

11. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Гипп Е.К., Буторина Н.Н.. Загайнова А.В. Обеспечение эпидемической безопасности потребителей в условиях реализации Технического регламента «О безопасности питьевой воды» // Там же. -С.193-195.

12. Буторина Н.Н. Экспериментальное обоснование параметров экспрессного метода определения оксидазной активности бактерий на мембранном фильтре // Там же. - С.51-53.

13. Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина С.В., Панасовец О.П., Недачин А.Е., Талаева Ю.Г., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Загайнова А.В., Буторина Н.Н. Методические подходы к индикации сальмонелл в водных объектах // Там же. -С.30-32.

14. Загайнова А.В., Талаева Ю.Г., Иванов С.И., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина Н.Н.. Недачин А.Е. Использование метода вероятностной оценки для установления зависимости между качеством воды и заболеваемостью населения кишечными инфекциями при оценке микробного риска // Там же. - С.92-95.

15. Загайнова А.В., Талаева Ю.Г., Иванов С.И., Дмитриева Р.А., Ингель Ф.И., Юрченко В.В., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина Н.Н.. Недачин А.Е., Снегирев Д.В. Изучение степени опасности патогенных и условно-патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования по их биологической активности // Там же.- С.95-98.

16. Недачин А.Е., Жолдакова З.И., Синицина О.О., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина H.H.. Мамонов P.A. Изучение возможности реактивации бактерий при обеззараживании воды гуанидинсодержащими реагентами с воспроизведением условий очистки (коагуляция, фильтрация) // Методологические проблемы изучения оценки и регламентирования физических факторов в гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ, Москва,2008,С.15-18.

17. Жолдакова З.И., Тульская Е.А., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Буторина H.H. Новые подходы к оценке средств обеззараживания воды // Вестник Российской военно-медицинской академии. - С.-П. - 2008. - Т.23. - №3. - Приложение 2(ч.Н). -С.457. Москва, 2008, С.15-18.

Список сокращений

АЦ - ацетат целлюлозы БС - бактериостатический БЦ - бактерицидный

ГКБ - глюкозоположительные колиформные бактерии ГН - гипохлорит натрия

ДМ - 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида и 1%

спиртовой раствор а-нафтола

ДС - двуслойная среда

ДХ - диоксид хлора

ЖА - железо-сульфитный агар

ЖСС-1 - железо-сульфитная среда вязкая

ЖСС-2 - железо-сульфитная среда плотная

КБ - колиформные бактерии

КОЕ - колонии образующие единицы

ЛАТ - лактозный агар с тергитолом и ТТХ

МГ - метиленовый голубой

МФ - мембранный фильтр

НЦ - нитрат целлюлозы

ОВ - обеззараживание воды

ОКБ - общие колиформные бактерии

ОМЧ - общее микробное число

ОПМ - оксидазоположительная микрофлора

ОР - оксидазный реактив

ОТ - оксидазный тест

ПА - профлавин ацетат

ПГМГ-ГХ - полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид СГ- среда Гисса

СК - сульфитредуцирующие клостридии

ТГ - тиогликолят натрия

ТЖА - триптон-желчный агар

ТКБ - термотолерантные колиформные бактерии

ТМ -1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида

ТСА - триптон-соевый агар

ТТХ - 2,3,5,-трифенилтетразолиум хлорид

ФО - фотообеззараживание

ХКА - хромокульт колиформ агар

ХПС - хромогенные питательные среды

Хромокульт-ТЖХ - СИготосик® триптонный агар с желчью и Х-глюкуронидом ЭТООА - экспрессный тест определения оксидазной активности

Заказ № 127-а/05/10 Подписано в печать 20.05.2010 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

(П»

Обеспечение эпидемической безопасности водопользования в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей микробиологического контроля качества воды. Надежность системы контроля, как основы профилактических мероприятий, обусловлена научно-обоснованными показателями и эффективными методами обнаружения и количественного учета возбудителей кишечных инфекций и их индикаторов [84, 109, 112, 113].

Вместе с тем до настоящего времени отмечаются вспышки кишечных инфекций при соответствии качества воды установленным требованиям [80, 82] Это может быть связано с появлением устойчивых штаммов патогенных бактерий, их способностью к размножению, в частности сальмонелл, в чистых водах, и как результат - с нарушением количественных соотношений индикаторных и патогенных бактерий [30, 85]. Поэтому требуется совершенствование существующей нормативно-методической базы в направлении повышения адекватности оценки эпидемической безопасности водопользования.

В этом направлении, а также с целью унификации с международным сообществом, в последние годы происходит пересмотр нормативных требований к качеству воды по бактериологическим показателям, что определяет необходимость разработки и стандартизации методов определения бактериологических показателей: колиформные бактерии и глюкозоположительные колиформные бактерии, как основные надежные индикаторные показатели эпидемической опасности водопользования; Escherichia coli, как показатель фекального загрязнения водных объектов.

Методы, утвержденные в МУК 4.2.1018-01 [121], по ряду параметров не отвечают современному уровню: длительные сроки анализа (2-3 суток); низкая воспроизводимость результатов из-за субъективной выборки колоний; отсутствие учета изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий. Аналогичные проблемы существуют и в международных методических документах (ИСО 9308-1:2000) [43].

Кроме того, низкое качество выпускаемых отечественными производителями питательных сред требует разработки способов повышения их чувствительности, ростовых качеств, дифференцирующих свойств в целях увеличения надежности бактериологического анализа.

Перспектива разработки ускоренных методов определения колиформных бактерий заключается в использовании на этапе идентификации специфичности их ферментативных свойств [236].Отсутствие фермента цитохромоксидазы у представителей семейства Enterobacteriaceae дает возможность их надежной дифференциации с посторонней водной оксидазоположительной микрофлорой. Однако, представление о бактерицидности оксидазных реактивов препятствует эффективному внедрению в методические документы экспрессного теста определения оксидазной активности бактерий непосредственно на мембранном фильтре. Разработка ускоренных методов определения Escherichia coli может быть основана на наличии у этих бактерий специфических ферментов -глюкуронидазы и триптофаназы.

Метод определения спор Clostridium perfringens, предложенный в Директиве 98/83/ЕС [35], сложен в выполнении, требует наличия анаэростата, делает методику малопригодной для выполнения рутинных анализов практическими лабораториями, в связи с чем возникает необходимость совершенствования метода выделения спор сульфитредуцирующих клостридий для повышения эффективности обнаружения анаэрбных бактерий в условиях обычного термостатирования.

Разработка в настоящее время новых средств обеззараживания воды ставит задачу увеличения надежности оценки их эффективности с учетом изменения биологических свойств микроорганизмов, на которых основаны методы их индикации [6, 39, 128]. Основная проблема связана с возникновением стрессированных форм бактерий после недостаточно эффективного обеззараживания, которые не определяются общепринятыми методами, и контролирующие органы не получают достоверную информацию о безопасности воды. В дальнейшем при благоприятных условиях происходит реактивация - восстановление жизнеспособности стрессированных бактерий, что создает возможность эпидемических осложнений [12, 96, 137].

На основании вышеизложенного целью работы являлось хсовершенствование санитарно-бактериологических методов анализа воды, направленное на повышение чувствительности, точности, экспрессности, эпидемической надежности и обеспечивающее соответствие международному уровню, с учетом изменчивости биологических свойств и способности к реактивации бактерий после обеззараживания воды.

Задачи исследования:

1.Обосновать параметры экспрессного теста определения оксидазной активности и разработать на его основе ускоренные методы индикации колиформных бактерий в воде.

2.Модифицировать ускоренные методы определения Escherichia coli, основанные на специфичности ферментативной активности бактерий.

3.Усовершенствовать метод индикации спор сульфитредуцирующих клостридий в воде в условиях обычного термостатирования.

4.Разработать методические приемы повышения гигиенической надежности оценки эффективности процессов обеззараживания воды.

Научная новизна работы.

Впервые установлены количественные зависимости степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности, продолжительности контакта бактерий с ним, а также длительности последующего пребывания на питательной среде.

Впервые выявлена зависимость способности бактерий к реактивации после обеззараживания воды от вида и дозы реагента, времени экспозиции.

Обоснована необходимость учета индикаторных и патогенных бактерий с измененными культуральными и биохимическими свойствами для повышения гигиенической надежности оценки обеззараживания воды. Определены признаки, характеризующие изменчивость Escherichia coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков.

Практическая значимость.

На основании экспериментальных и натурных исследований оптимизирована система санитарно-бактериологического контроля качества воды различного вида водопользования в направлении повышения её эпидемической надежности.

Разработан ускоренный метод индикации в воде основных нормируемых показателей - колиформных бактерий на основе совершенствования экспрессного теста определения оксидазной активности. Метод позволяет получать ответ через 18-24 часа (вместо 2-3 суток).

Разработаны эффективные и экономичные ускоренные методы определения колиформных бактерий, Escherichia coli и спор сульфитредуцирующих клостридий с использованием отечественных питательных сред.

Разработанные методы включены, наряду с международными, в ГОСТ Р 52426 - 2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» (справка № 343-05 от 07.02.2007).

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке проекта МУ «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды» (справка №.11-5/279 от 12.05.2009)

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проведенных в 2006 - 2009 гг. для специалистов бактериологических лабораторий Роспотребнадзора и Водоканалов РФ по обучению методам санитарно-микробиологического контроля качества воды различного назначения. (Акт исх. № 01-6/274 от 12.05.2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Зависимость степени ингибирования ферментативных реакций колиформных бактерий от типа оксидазного реагента, используемого в экспрессном тесте определения оксидазной активности. Методические приемы по устранению негативного влияния диметил-п-фенилендиам ина дигидрохлорида с а-нафголом.

2. Модификация методов определения колиформных бактерий, Е. coli, спор сульфитредуцирующих клостридий в воде с учетом специфичности их ферментативной активности и культуральных свойств.

3. Методические подходы для адекватной оценки эффективности обеззараживания воды с учетом реактивации и изменчивости свойств индикаторных и патогенных бактерий.

выводы

1. Научно обоснованы алгоритмы экспрессного теста определения оксидазной активности одновременно всех бактерий, выросших на мембранном фильтре (1-4 мин вместо 24 ч). Показано, что оксидазный реактив 1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина не оказывает влияния на жизнеспособность и ферментативную активность бактерий Escherichia coli после контакта в течение 2 часов. Комплексный реактив диметил-п-фенилендиамин за счет а-нафтола подавляет биохимическую активность бактерий через 5 мин воздействия. Изменение соотношения 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшение допустимого времени контакта с реактивом до 4-х минут, обратный перенос мембранного фильтра на питательную среду устраняют негативное влияние комплексного реактива на бактерии Escherichia coli.

2. В сравнительных исследованиях на основе предложенных алгоритмов экспрессного теста определения оксидазной активности разработаны ускоренные методы определения колиформных бактерий, общих колиформных бактерий, глюкозоположительных колиформных бактерий, которые ускоряют анализ воды по сравнению с отечественным методом на двое суток (24-28 ч вместо 72 ч) и по сравнению с международным методом на сутки (24 ч вместо 48 ч).

3. Совместное определение колиформных бактерий и Escherichia coli на хромогенных средах, избирательно Escherichia coli - на модифицированной двуслойной среде, состоящей из триптон-желчного агара и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана, ускоряет микробиологический анализ с 48 часов до 18-24 часов. При использовании хромокульт кольформ агара допустима фильтрация воды только на мембранах из нитрата целлюлозы или из смеси ацетатов целлюлозы.

4. Добавление к железо-сульфитному агару восстановителя тиогликолята натрия в количестве 1 г/л позволило повысить на 36-55% эффективность выделения спор сульфитредуцирующих клостридий из воды в условиях обычного термостатирования.

5. Установлена реактивация колиформных бактерий и сальмонелл через 24 часа после обеззараживания как воды поверхностного источника гипохлоритом натрия в дозе 1 мг/л и диоксидом хлора в дозах 2, 3 мг/л, так и сточных вод гипохлоритом натрия в дозе 5 мг/л. Гуанидинсодержащий препарат в дозах 0,24 и 0,5 мг/л вызывает реактивацию в отношении ОМЧ через 24 часа и Pseudomonas aeruginosa через 48 часов. После фотообеззараживания с использованием метиленового голубого восстановление жизнеспособности Staphylococcus aureus отмечено через 5 суток в концентрации 0,25 мг/л, Escherichia coli и Enterococcus faecalis — через 5 суток в концентрации 0,5 мг/л, Salmonella infantis spp. - через 1 сутки в концентрации 2 мг/л. Бактериостатический эффект дезинфектантов проявляется в реактивации стрессированных бактерий после зафиксированного их отсутствия, что вызывает необходимость оценивать эффективность обеззараживания при изучении новых средств и подборе режимов обработки воды в течение 1-5 суток.

6. Неполное бактерицидное действие дезинфектантов приводит к адаптивной изменчивости культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий - Escherichia coli, сальмонелл, энтерококков, стафилококков. Адекватность гигиенической оценки эффективности обеззараживания воды повышается за счет удлинения срока инкубации посевов до 5 суток, учета не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнения пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использования нескольких методов посева.

ГЛАВА 8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

Обеспечение эпидемической безопасности в отношении кишечных инфекций, распространяющихся водным путем, является первостепенной задачей. Совершенствование методической базы контроля качества воды по микробиологическим показателям является одной из актуальных проблем в решении этой задачи. Быстрое получение ответа о микробном загрязнении воды является основой проведения своевременных профилактических мероприятий. Кроме того, повышение надежности результата бактериологического анализа, адекватности оценки процессов очистки и обеззараживания невозможно без учета изменчивости бактерий под воздействием неблагоприятных факторов, в том числе обеззараживающих реагентов.

Основное направление работы заключалось в разработке и усовершенствовании методов, повышающих скорость, надежность микробиологического контроля и адекватность оценки качества воды различного вида водопользования, а таюке эффективности обеззараживания питьевых и сточных вод.

Для определения степени бактерицидности оксидазных реактивов и их влияния на биохимическую активность колиформных бактерий в экспериментальных исследованиях изучено два реактива, которые альтернативно используют при постановке оксидазного теста: 1.1% водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида (ТМ) рекомендуется как в отечественных, так и в международных (ИСО 93081:2000) [43] методических документах; П. 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида и 1% спиртовой раствора а-нафтола в соотношении 7:3 (ДМ) - рекомендуется в МУК 4.2.1018-01 [121].

Эксперименты проводили на модели тест-микроорганизма Escherichia coli 1257, как основного представителя колиформных бактерий. Мембранные фильтры с выросшими на них колониями накладывались колониями вверх на смоченную оксидазным реактивом фильтровальную бумажку. Время воздействия реактива составляло 2; 5; 30; 60 и 120 минут. После контакта с реактивом способность бактерий Е. coli к ферментации лактозы до кислоты и газа определяли путем посева в пробирки с полужидкой средой Гисса с лактозой и последующей инкубацией посевов при температуре 37 °С. Контролем служили результаты определения скорости ферментативных реакций бактерий E.coli, не подвергнутых действию реактива

После выдерживания на реактиве ТМ реакция ферментации лактозы бактериями Е. coli развивалась с той же скоростью, что и в контроле (Р>0,05). Признаки роста и образование кислоты отмечали уже через 1 час после посева в пробирки со средой Гисса с лактозой. Начало газообразования наблюдалось через 2 часа во всех вариантах опыта, кроме бактерий, подвергшихся действию ТМ в течение 120 минут. Реакция ферментации полностью завершилась через 3 ч у бактерий, контактировавших с ТМ в течение 2 мин, через 4 ч - в контроле и после контакта с ТМ в течение 5 и 30 мин, через 5ч- после 120-минутного воздействия ТМ. Таким образом, реактив ТМ не оказывал влияния на скорость роста и биохимическую активность бактерий Е. coli даже при длительном контакте в течение двух часов.

После контакта бактерий с реактивом ДМ в интервале времени от 2 до 5 минут ферментация лактозы начиналась и заканчивалась на 1 и 2 часа позже, соответственно, по сравнению с контролем. Однако, различия с контролем у бактерий после контакта с ДМ в течение 2 мин являлись не достоверными (Р>0,05), тогда как у бактерий, контактировавших с ДМ в течение 5 мин, отличия статистически значимы (Р < 0,01).

Более продолжительный контакт с реактивом в течение 30 — 60 минут оказывал существенное бактериостатическое (в 40-60% посевов) и частичное бактерицидное действие, а после 120 минут контакта - полностью бактерицидное действие в 100% посевов. При этом существенно возросла продолжительность ферментации лактозы - до 24 ч, в то время как в контроле биохимическая реакция полностью завершалась через 4 ч.

Изучение воздействия оксидазных реактивов на биохимическую активность бактерий Е. coli, выросших на лактозном агаре с тергитолом, который рекомендован ИСО 9308-1:2000, подтвердило закономерности, полученные при выращивании бактерий на агаре Эндо, рекомендуемом МУК 4.2.1018-01.

Следующий этап работы заключался в разработке методических приемов по снижению влияния реактива ДМ на биохимическую активность бактерий Е. coli. Через 1, 2, 3, 4 и 5 минут контакта с реактивом ДМ мембранные фильтры переносили обратно на агар Эндо или лактозный агар с тергитолом. Посев бактерий на среду Гисса с лактозой проводили сразу же после переноса фильтра на питательную среду, через 5, 30 и 60 минут.

Как видно из таблицы 2, при времени контакта с реактивом ДМ в пределах 1-4 минут и посеве колоний на среду Гисса с лактозой сразу же после переноса мембранного фильтра с бактериями обратно на питательную среду, а также через 5-60 мин статистически значимых различий между контрольным и опытными вариантами не обнаружено (Р>0,05). Полученные результаты доказывают, что более длительное, по сравнению с рекомендуемым в МУК 4.2.1018-01, пребывание мембранного фильтра, пропитанного оксидазным реактивом ДМ, на питательной среде не оказывает влияние на биохимические свойства бактерий Е. coli.

При контакте бактерий, выросших на агаре Эндо, на фильтре с реактивом ДМ в течение 5 минут, как это допускается в МУК 4.2.1018-01, ингибирующее действие реактива сохранялось сразу после переноса фильтра с бактериями на агар Эндо и через 5 мин пребывания на среде. Различия между контрольным и опытным вариантами являлись статистически значимыми (Р < 0,05). При более длительном выдерживании фильтра на среде в течение 30 и 60 минут негативное действие реактива прекращалось, и биохимическая активность бактерий восстанавливалась.

После контакте бактерий, выросших на лактозном агаре с тергитолом, с реактивом на фильтре в течение 5 минут начало ферментации лактозы достоверно задерживалось на 60 мин (Р < 0,01). Дальнейшее выдерживание фильтра на среде после 5-ти минутного контакта с оксидазным реактивом не привело к существенному сниженшо времени ферментации лактозы (Р<0,01). Это может быть объяснено тем, что лактозный агар с тергитолом является менее ингибиторной средой, чем агар Эндо, и воздействие реактива ДМ на выросшие на нем бактерии более выражено.

Таким образом, в экспериментах с использованием двух питательных сред (агара Эндо и лактозного агара с тергитолом) доказано, что торможение биохимической активности Е. coli оксидазным реактивом ДМ может быть предотвращено в случае контакта мембранного фильтра с реактивом в пределах 4 минут и дальнейшего нахождения на питательной среде без ограничения времени, но не менее 5 минут.

С целью обоснования рекомендаций по уменьшению неблагоприятного действия реактива ДМ на жизнедеятельность бактерий проведены исследования по изучению влияния компонентов реактива на жизнедеятельность бактерий. Основная составная часть реактива ДМ - 1% водный раствор диметил-п-фенилендиамина дигидрохлорида не влияет на ферментативные свойства бактерий Е. coli даже при длительном в течение 1 часа времени контакта. Другая составная часть реактива - 1% спиртовой раствор а-нафтола в соотношении с водой 3:7 при контакте с бактериями E.coli уже в течение 2,5 и 5 минут достоверно задерживал время ферментации лактозы. В то же время, при соотношении спиртового раствора а-нафтола и воды 2,5 : 7,5 не выявлено влияния испытуемой смеси в течение этого же периода экспозиции на биохимические свойства бактерий.

Для оценки влияния мембранных фильтров, используемых в практике бактериологического контроля, на биохимическую активность бактерий E.coli использовано три типа фильтров: «Владипор» из смеси ацетатов целлюлозы, «Владисарт» из нитрата целлюлозы и «Владисарт» из ацетата целлюлозы.

При соблюдении рекомендуемого времени контакта с оксидазным реактивом ДМ до 4 мин статистически достоверных отличий от контроля для всех марок фильтров не выявлено (Р>0,05). Некоторое незначительное различие во влиянии фильтров на ферментативную активность могут быть связаны с особенностями структуры мембран, которые влияют на степень проникновения оксидазного реактива. Полученные результаты свидетельствуют о допустимости применения исследованных мембранных фильтров для выполнения экспрессного теста определения оксидазной активности.

Результаты проведенных экспериментов позволили усовершенствовать методику выполнения экспрессного теста определения оксидазной активности по сравнению с МУК 4.2.1018-01, а также дифференцировать алгоритм его проведения в зависимости от используемого оксидазного реактива. При использовании комплексного реактива ДМ, в случае необходимости дальнейшей идентификации оксидазоотрицательных бактерий, пересев колоний на подтверждающие среды целесообразно производить не сразу же после проявления реакции, а после переноса мембранного фильтра на питательную среду и последующего выдерживания свыше 5 минут. Этот прием полностью исключит негативное действие реактива ДМ и ускорит время получения ответа по тесту ферментации лактозы на 1-2 часа. Кроме того, изменено соотношение 1% спиртового раствора а-нафтола (2,5 части) и 1% водного раствора диметил-п-фенилендиамина (7,5 частей), уменьшено допустимое время контакта с реактивом до 4-х минут, исключено ограничение времени посева бактерий в подтверждающие среды для идентификации после переноса мембранного фильтра обратно на питательную среду.

При работе с реактивом ТМ, не влияющим на жизнедеятельность бактерий, исключен этап переноса фильтра обратно на среду после проявления оксидазной активности, не ограничено время посева бактерий в подтверждающие среды для дальнейшей идентификации колиформных бактерий и E.coli. Предложенные приемы существенно упрощают алгоритм экспрессного теста.

Усовершенствованный экспрессный тест определения оксидазной активности позволил разработать ускоренный метод индикации колиформных бактерий, применение которого сокращает время проведения анализа на 48 ч по сравнению с МУК 4.2.1018-01, и на 24 ч - по сравнению с ИСО 9308-1:2000. Метод исключает субъективную выборку колоний -основную причину ошибок микробиологического анализа, существенно уменьшает время контакта исследователя с канцерогенными оксидазными реактивами, а также экономичен и доступен для выполнения практическими лабораториями.

Ускоренный метод определения колиформных бактерий апробирован в натурных условиях при анализе различных типов вод с разной степенью бактериального загрязнения. Валидизация разработанного метода проводилась путем сравнения с результатами, получаемыми по методике ИСО 9308-1:2000. При исследовании воды поверхностных и подземных источников частота проб, в которых по методике ИСО определено более низкое содержание колиформных бактерий, составила 21,43% и 8,33%, соответственно, что указывает на большую надежность ускоренного метода в оценке эпидемической опасности воды. При работе по методу ИСО ошибки результатов возрастают за счет субъективной выборки колоний исследователем.

Анализ материалов исследований воды показал, что достоинством усовершенствованного метода индикации колиформных бактерий по сравнению с методикой ИСО, помимо сокращения времени проведения анализа, является предварительное исключение из дальнейшей идентификации посторонней водной оксидазоположительной микрофлоры, что особенно актуально при исследовании таких вод, где оксидазоположительные бактерии преобладают над индикаторными. Наибольшее количество оксидазоположительных бактерий отмечено при исследовании питьевой воды подземных источников (57,3±18,7%), наименьшее - в загрязненной сточными водами питьевой воде (39,3±17,3%). Экспрессный тест особенно эффективно упрощал исследование воды с предполагаемой низкой степенью микробного загрязнения (бутылированной, подземных источников) в случаях, когда на мембранном фильтре вырастала только оксидазоположительная микрофлора. В этих случаях через 4 минуты дается ответ, в то время, как по методике ИСО 9308-1:2000 колонии микроорганизмов необходимо пересевать на неселективный агар для постановки оксидазного теста через 24 часа. Ускоренный метод определения колиформных бактерий вместе с международным методом ИСО 9308-1:2000 включен в ГОСТ Р 52426-2005 [23].

Усовершенствованный экспрессный тест определения оксидазной активности особенно необходим для методического обеспечения наиболее надежного показателя эпидемической безопасности воды — глюкозоположительных колиформных бактерий. Определение этого показателя предполагает оксидазный тест в качестве основного этапа идентификации от посторонней водной микрофлоры, что связано с использованием для первичного посева лактозных дифференциальных сред, которые позволяют выделить в первичном посеве только бактерии, ферментирующие лактозу. На основании исследований разработан алгоритм выполнения метода определения глюкозоположительных колиформных бактерий с использованием экспрессного теста определения оксидазной активности одновременно всех выросших на фильтре колоний и ускоренного теста ферментации глюкозы на полужидких средах Гисса, время анализа составляет 24 — 28 часов.

Отличительной особенностью колиформных бактерий является наличие специфического фермента - Р-галактозидазы [173, 195]. При этом бактерии Е. coli характеризуются наличием ферментов как р-галакгозидазы, так и p-D-глюкуронидазы. Эти свойства используются при выращивании бактерий на специальных хромогенных питательных средах, содержащих субстрат, разлагая который колонии окрашиваются в цвет, отличный от других видов микроорганизмов. Этот принцип, помимо ускорения анализа на 24 часа, позволяет проводить количественный учет Е. coli, исключая ошибки метода, связанные с выборочной проверкой колоний для идентификации.

На первом этапе исследований проведена сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения колиформных бактерий и E.coli в воде с использованием хромогенных питательных сред (Chromocult® Coliform Agar, Merck (хромокульт колиформ агар); Chromocult® триптонный агар с желчью и Х-глюкуронидом (ТЖХ-агар), Merck) и классического двухэтапного метода индикации этих бактерий на лактозном агаре с тергитолом-7 и ТТХ (Merck) и на агаре Эндо, производства НПО «Микроген», г. Махачкала (контроль). Посев микроорганизмов производили методом мембранной фильтрации.

Достоверные различия в количестве колиформных бактерий, идентифицированных в одной и той же пробе воды ускоренным методам с использованием хромокульт колиформ агара и классическим методом, не выявлены (Р > 0,05). При определении в этих же посевах бактерий E.coli наблюдались более выраженные различия в полученных данных. Наиболее эффективным в данном исследовании оказался лактозный агар с тергитолом (Р<0,05). Однако на хромогенных средах при определении E.coli ускоренными методами, получены сопоставимые результаты с традиционным методом на агаре Эндо (Р>0,05).

Изучение ингибиторных свойств оцениваемых питательных сред в отношении посторонней микрофлоры, препятствующей росту изолированных колоний колиформных бактерий и искажающей результаты идентификации при наложении и соприкосновении колоний, показало, что наименее ингибиторной являлась среда с тергитолом, что соответствует рекомендациям ИСО 9308-1:2000. Посторонние бактерии на этой среде преобладали над колиформными в 2 раза, на агаре Эндо и на хромокульт колиформ агаре - в 1,5 раза. Меньше всего посторонних колоний вырастало на ТЖХ-агаре, содержащем желчные соли, при температуре инкубации посевов 44°С — треть от общего числа бактерий, что очень важно для выполнения ускоренного метода определения Е. coli на этой среде.

Как показано в работе Ossmer R. [222] , на чувствительность методов индикации микроорганизмов в воде могут оказывать влияние типы используемых для фильтрации мембран. В наших исследованиях установлено, что при работе на хромокульт колиформ агаре с применением фильтров «Владипор» из смеси ацетатов целлюлозы и «Владисарт» из нитрата целлюлозы наблюдается четкая дифференциация колоний по цвету. Фильтры «Владисарт» из ацетата целлюлозы оказались неэффективны для работы на хромокульт колиформ агаре, что выражалось в снижении выявленных колиформных бактерий и Е. coli на 34,1% и 60,3%, соответственно, по сравнению с фильтрами из нитрата целлюлозы. Эти результаты свидетельствуют о необходимости внесения дополнения в MP № 24ФЦ/513 [91] с указанием пригодных для работы на хромогенных средах марок мембранных фильтров.

Недостатком хромогенных питательных сред является их высокая стоимость и отсутствие отечественных аналогов. В связи с этим, на следующем этапе проводилась сравнительная оценка эффективности ускоренного метода определения Е. coli на основе двуслойной среды (по ИСО 9308-1:2000) и разработанной нами модификации с использованием отечественных ингредиентов.

Принцип ускоренного метода анализа на двуслойных средах заключается в выявлении бактерий, способных образовывать индол при выращивании колоний на триптофансодержащих средах. Все колонии, изменившие цвет на розовый, учитывают как бактерии Е. coli. Двуслойная агаризованная среда состоит из верхнего слоя триптон-соевого агара (ТСА) и нижнего слоя триптон-желчного агара (ТЖА). На этой среде рост сопутствующей микрофлоры тормозится солями желчных кислот и высокой температурой инкубации (44 ° С). Двуслойную среду по прописи ИСО готовили из импортных ингредиентов, а в модифицированной среде заменили неселективный ТСА на питательный агар (НПО «Микроген», г. Махачкала) с добавлением 1 г/л триптофана.

Сравнительную оценку разработанной среды и рекомендуемой ИСО проводили на питьевой воде, загрязненной бытовыми сточными водами. Анализ полученных данных показал, что на двуслойной среде и модифицированной двуслойной среде, по сравнению с лактозным агаром с тергитолом (контроль), бактерий E.coli выделено больше на 29,6±8,4% и 28,3±10,5%, соответственно. Статистической разницы между количеством бактерий E.coli, обнаруженных на двуслойной среде и модифицированной среде, не обнаружено (Р > 0,05).

Для выявления причины расхождения результатов, полученных ускоренным методом на двуслойных средах и при использовании лактозного агара с тергитолом, каждая окрашенная по ускоренному тесту колония была исследована на принадлежность к бактериям E.coli. Установлено, что 18,9±8,6% колоний, учтенных ускоренным методом по окраске колоний как E.coli, не были отнесены к этому виду по другим биохимическим тестам. Это связано, по-видимому, с наличием триптофаназы у бактерий других родов, вырастающих на двуслойной среде. В соответствии с международной классификацией 33 вида бактерий семейства Enterobacteriaceae способны образовывать индол из триптофана [92]. Эти виды принадлежат к таким родам как Citrobacter, Edwardsiella, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Providencia, Serratia, Yersinia и др., которые считаются условно-патогенными, и поэтому гипердиагностика при единичных случаях их обнаружения не снижает гигиеническую надежность оценки качества воды.

Таким образом, для ускоренного определения колиформных бактерий и Е. coli в практике бактериологического контроля воды может быть рекомендовано использование хромокульт колиформ агара. Ускоренное определение Е. coli может проводиться на хромогенной питательной среде ТЖХ-агар или на модифицированной двуслойной среде, состоящей из триптон-желчного агара и питательного агара с добавлением 1 г/л триптофана. При использовании хромогенных питательных сред допустима фильтрация воды только на мембранах из нитрата целлюлозы или из смеси ацетатов целлюлозы. Отсутствие необходимости проведения дополнительной идентификации бактерий, которая применяется в классическом двухэтапном методе, позволяет сократить время анализа до 18-24 часов.

Для ускорения и повышения эффективности методики выделения спор сульфитредуцирующих клостридий (СК) в условиях обычного I термостатирования проведена оптимизация питательной среды - железо-сульфитного агара (ЖА), рекомендованного МУК 4.2.1018-01, путем добавления тиогликолята натрия (ТГ) в концентрациях 1 и 0,1 г/л. Это вещество вводят для создания необходимой степени окислительно-восстановительного потенциала среды, что поддерживает размножение анаэробных микроорганизмов [69,145].

Помимо двух вариантов ЖА с ТГ проводилась оценка готовых сред производства НПЦ «Биокомпас-С», г. Углич: полужидкой железо-сульфитной среды (ЖСС-1) и плотной железо-сульфитной среды (ЖСС -2), рекомендованных для выращивания СК.

Исследования выполнялись при анализе воды с разной степенью бактериального загрязнения: из поверхностных источников (п-10 КОЕ/20 мл)

2» 3 и загрязненной питьевой воды (п-10 - п-10 КОЕ/20 мл). Статистически значимые различия в количестве спор СК, обнаруженных в воде поверхностных источников, при использовании ЖА без добавок (контроль), ЖА с добавлением ОД г/л ТГ и среды ЖСС-1 отсутствовали (Р > 0,05). Две другие среды - ЖА с добавлением 1 г/л ТГ и среда ЖСС-2 показали наличие статистически значимых различий по сравнению с контрольной средой (Р < 0,05). Но если в случае с ЖА с добавлением 1 г/л ТГ количество выделенных спор СК было выше, по сравнению с контрольной средой, то в отношении среды ЖСС-2 имело место статистически значимое обратное соотношение.

Аналогичные закономерности получены при исследовании загрязненной питьевой воды. Споры СК были обнаружены в 100 % проб на всех питательных средах, кроме среды ЖСС-2 (обнаружены в 93,34 % проб).

Скорость роста спор СК на всех исследуемых средах при анализе загрязненной питьевой воды, примерно одинаковой. При исследовании воды поверхностных источников почернение среды и начальные признаки газообразования наблюдались через 4-5 часов в 53,3% проб на железосульфитной среде с добавлением 1, г/л ТГ, в 40% проб - на ЖА и ЖА с добавлением 0,1 г/л ТГ. Учет колоний полностью завершался через 10-12 часов. На средах ЖСС-1 и ЖСС-2 признаки роста через 5-6 часов наблюдались только в 26,7% проб, окончательный результат был получен через 12-14 часов. По видимому, разница во времени выделения спор СК при исследовании воды поверхностных источников связана с длительностью пребывания спор в окружающей среде.

Таким образом, добавление к железо-сульфитному агару восстановителя (тиогликолята натрия) в количестве 1 г/л позволяет повысить эффективность выделения спор СК в условиях обычного термостатирования. При исследовании воды поверхностных источников эффективность выделения на оптимизированной среде выше на 55,2±27,6%, при исследовании питьевой воды, загрязненной сточными водами - на 35,9±14,9% по сравнению с железо-сульфитным агаром. Данная модификация железо-сульфитной среды обладает рядом преимуществ: проста в изготовлении, не имеет сложных или дефицитных компонентов, изготовлена из непищевого сырья. Добавление химического реагента, такого как тиогликолят натрия, позволяет в большей степени стандартизовать модифицированную среду по сравнению со средами, где в качестве добавок для понижения окислительно-восстановительного баланса среды используются нестандартизуемые компоненты (лизированная кровь, измельченное мясо).

Одной из причин вторичного роста микроорганизмов в воде водопроводных сетей является восстановление жизнеспособности (реактивации) патогенных, условно-патогенных и индикаторных бактерий за время поступления питьевой воды к потребителю после неполного бактерицидного действия обеззараживающих агентов. При этом на выходе с водопроводных сооружений бактерии, временно утратив способность вырастать на питательных средах, не определяются общепринятыми методами контроля, и вода ошибочно характеризуется как безопасная в эпидемическом отношении.

В связи с актуальностью проблемы, в работе изучена возможность реактивации индикаторных, условно-патогенных и патогенных бактерий с различными морфологическими и биохимическими свойствами после воздействия обеззараживающих средств различного состава и механизма действия: гипохлорита натрия; диоксида хлора; гуанидинсодержащего препарата и двух фотосенсибилизаторов — профлавин ацетата и метиленового голубого.

В эксперименте воспроизводился процесс обеззараживания воды на водопроводных станциях, базирующихся на поверхностном источнике, реагентами гипохлоритом натрия и диоксидом хлора в дозах: 1; 2; 3; 4 мг/л. Исходные уровни индикаторных бактерий составляли п- 103 КОЕ/ЮО мл, с добавлением S.enteritidis и S.infantis и Ps.aeruginosa до концентрации п-Ю3 КОЕ/л. Микроорганизмы определяли через сроки экспозиции: 0,5; 1; 2; 3; 24 часа после внесения дезинфекгантов.

Воздействие диоксида хлора в дозе 1 мг/л через 30 мин экспозиции приводило к резкому снижению содержания уровня сальмонелл - от 1500 КОЕ/л до 20 КОЕ/л. На протяжении 2 часов сальмонеллы не были обнаружены. Однако, через 24 часа наблюдалась слабая реактивация сальмонелл до 25 КОЕ/л. Диоксид хлора в дозах 2 и 3 мг/л вызвал 100%-ную инактивацию ГКБ, ОКБ, коли через 30-180 мин экспозиции. Однако через 24 часа наблюдалась частичная реактивация бактерий: ГКБ, ОКБ до 5 КОЕ/ 100 мл, Е. coli - до 4 КОЕ/100 мл. При более высоких дозах диоксида хлора - 4,0 мг/л, гипохлорита натрия - 2, 3, 4 мг/л отмечалась инактивация колиформных бактерий, сальмонелл и достигался полный бактерицидный эффект. Реактивация энтерококков, клостридий, Ps.aeruginosa не наблюдалась.

При концентрации гипохлорита натрия 1,0 мг/л через 30 минут экспозиции, также как при действии диоксида хлора, происходит резкое снижение содержания колиформных бактерий до единичных клеток в 100 мл, с дальнейшей инактивацией. Через 24 часа выявлен эффект реактивации бактерий до 82 и 80 КОЕ ГКБ и ОКБ в 100мл. Что же касается Е. coli, то эффекта реактивации через 24 часа не было отмечено.

Таким образом, увеличение срока наблюдения за динамикой инактивации бактерий до 24 ч дало возможность определить бактериостатические дозы диоксида хлора (2 и 3 мг/л) и гипохлорита натрия (1 мг/л), при которых индикаторные и патогенные стрессированные бактерии после снижения остаточных количеств реагентов восстанавливают жизнеспособность и размножаются в воде до эпидемически опасных уровней.

Проведены исследования по изучению возможности реактивации бактерий после обеззараживания сточных вод с использованием гипохлорита натрия в дозах 2, 5 и 10 мг/л по активному хлору и экспозиции 1, 2, 20, 120 часов. Исходный уровень микробного загрязнения в модельных водоемах п-105 КОЕ/ЮО мл. Гипохлорит натрия в дозе 5 мг/л через 2 часа контакта вызывал 100%-ную инактивацию всех исследованных бактерий (остаточный хлор 2,1 мг/л). Через 20 часов при снижении остаточного хлора до 1,0 мг/л наблюдалось увеличение ОМЧ, размножение КБ и сальмонелл.

Через 120 часов численность сальмонелл возросла до 100 КОЕ/л, ОКБ и ГКБ до 5000 КОЕ/ЮО мл, ТКБ - до 400 КОЕ/ЮО мл, ОМЧ - до 25000 КОЕ/мл. 100% инактивация всех изученных групп бактерий достигнута только при дозе гипохлорита натрия 10 мг/л. Полученные данные объясняют причину размножения сальмонелл на значительных расстояниях от места сброса сточных вод [137] и обнаружения патогенных бактерий в воде у водозаборов.

В экспериментальных исследованиях по изучению эффективности гуанидинсодержащего препарата (полигексаметиленгуанидин-гидрохлорида (ПГМГ-ГХ) и четвертичного аммонийного соединения) в концентрациях 0,24 и 0,5 мг/л по ПГМГ-ГХ, в отношении индикаторных и условно-патогенных бактерий выявлена реактивация ОМЧ (через 24 ч) и Pseudomonas aeruginosa (через 48 ч), что свидетельствует о бактериостатическом эффекте препарата в отношении этих микроорганизмов. Отсутствие размножения всех групп колиформных бактерий и энтерококков в течение 48 ч после обеззараживания воды в сочетании с коагулированием и фильтрацией является доказательством бактерицидного действия дезинфектанта в концентрациях 0,24 и 0,5 мг/л по ПГМГ-ГХ в отношении этих микроорганизмов.

В последние годы предложен новый метод обеззараживания воды с использованием фотодинамически активных красителей -фотосенсибилизаторов [52], в том числе, метиленового голубого (МГ) и профлавина ацетата (ПА).

Для установления возможности к реактивации индикаторных, условно-патогенных и патогенных бактерий после фотообеззараживания с использованием МГ и ПА проведены исследования на воде модельных водоемов, зараженных суточными культурами музейных штаммов и бактерий, выделенных из сточных вод: Salmonella infantis spp, Salmonella enteritidis spp, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Pseudomonas aeruginosa 10145, Pseudomonas aeruginosa spp, Escherichia coli 1257, Staphylococcus aureus 906, Enterococcus faecalis 29212. Исходный уровень заражения составил п-106 КОЕ/ЮО мл. Количество микроорганизмов определяли после контакта с фотосенсибилизаторами в темноте в течение 30 минут и последующего освечивания в течение 30 минут при температуре 20°С, а также через 24 часа и через 5 суток. Исследовались концентрации МГ и ПА как допустимые по токсикологическому признаку [129], так и более высокие, создающие агравированные условия эксперимента: 0,25; 0,5; 1; 1,5 и 2 мг/л.

В результате проведенных исследований установлена возможность реактивации бактерий E.coli после воздействия МГ в концентрации 0,5 мг/л. Сразу после освечивания воды в присутствии МГ в концентрации 0,5 мг/л и через 24 ч бактерии E.coli не были обнаружены. МГ, как и ПА, в концентрации 1 мг/л оказали полное бактерицидное действие в отношении E.coli в процессе фотообеззараживания без проявления реактивации на протяжении 5 суток.

В следующей серии экспериментов изучена эффективность фотообеззараживания в отношении грам положительных индикаторных (Ent. faecalis) и патогенных (St. aureus) бактерий. Как видно из таблицы 4, ПА концентрация 1,0 мг/л оказывал полное бактерицидное действие в отношении энтерококков, МГ в концентрации 0,75 мг/л - в отношении стафилококков и энтерококков. Выявлено бактериостатическое действие МГ в концентрации 0,25 мг/л в отношении стафилококков и в концентрации 0,5 мг/л в отношении энтерококков. В этих случаях в течение 24 ч стрессированные бактерии утратили способность образовывать видимые колонии на плотных средах с последующим через 5 суток восстановлением ростовых и биохимических свойств. МГ в концентрации 0,25 мг/л и ПА в концентрации 0,5 мг/л не вызывали 100% инактивациина Ent. faecalis, и через 5 суток наблюдалось не только восстановление жизнеспособности, но и размножение бактерий.

Выявлена большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями при воздействии сенсибилизаторов МГ и ПА. 100%-ная инактивация установлена только при высокой дозе МГ 2 мг/л в отношении музейного штамма S. enteritidis. После окончания освечивания при дозе МГ 1 мг/л численность сальмонелл снизилась на 4 порядка, при дозе 1,5 мг/л - на 5 порядков с последующим интенсивным размножением сальмонелл до исходного уровня заражения.

Эффективность обеззараживания МГ в концентрации 1 мг/л в отношении сальмонелл, выделенных из сточных вод (S. infantis spp.), была меньше (98,59%) по сравнению с действием на музейный штамм (99,84%). МГ в концентрации 2 мг/л оказывал бактериостатическое действие на S. infantis spp. с проявлением реактивации после фотообеззараживания воды: сразу после освечивания бактерии не были обнаружены, а через сутки бактерии размножились на 2 порядка.

Во всех вариантах опыта, где отсутствовала 100%-ная инактивация сальмонелл наблюдалось их последующее интенсивное размножение. Через 5 суток после фотообеззараживания воды уровень сальмонелл превышал исходный и контрольный, что представляет большую эпидемическую опасность. Полученные данные об интенсивном (в сотни и тысячи раз) размножении сальмонелл после фотообеззараживания в фильтрованной через угольный фильтр и автоклавированной водопроводной воде опровергают представление о том, что возбудители кишечных инфекций не способны увеличивать популяцию при попадании в водную среду с небольшим содержанием питательных веществ [85].

Наиболее высокая устойчивость к фотообеззараживанию установлена у бактерий Ps. aeruginosa. Как и в опытах с сальмонеллами, выявлена большая чувствительность музейного штамма, по сравнению с выделенным из сточных вод. Сразу после освечивания уровень условно-патогенных бактерий даже в присутствии больших концентраций фотосенсибилизаторов (1,0 и 1,5 мг/л) снизился всего на 1 порядок, эффективность беззараживания колебалась в пределах 81,67-95,42%. Через 24 часа численность бактерий Ps. aeruginosa во всех вариантах опыта увеличилась на 1 порядок с дальнейшим размножением в течение 5 суток до более высоких количеств по сравнению с контролем.

Выявление способности микроорганизмов к реактивации после фотообеззараживания позволило установить бактериостатические дозы сенсибилизатора МГ в отношении St. aureus (0,25 мг/л), E.coli (0,5 мг/л), Ent. faecalis (0,5 мг/л), S. infantis spp .(2 мг/л), при действии которых наблюдалась 100%-ная инактивация микроорганизмов сразу после завершения процесса обеззараживания с последующим воостановлением их жизнеспособности через 1-5 суток. В случае полного обеззараживающего эффекта ПА реактивация микроорганизмов не наблюдалась.

Таким образом, в результате экспериментов установлена возможность реактивации патогенных, условно-патогенных и индикаторных бактерий через 24 и более часов после воздействия обеззараживающих средств различного состава (диоксида хлора и гипохлорита натрия, гуанидинсодержащего препарата, фотосенсибилизатора метиленового голубого). Выявленная способность стрессированных бактерий к восстановлению жизнеспособности в случае неполного бактерицидного эффекта вызывает необходимость оценивать эффективность обеззараживания при изучении новых средств и подборе режимов обработки воды в течение 1 -5 суток.

Большая устойчивость сальмонелл по сравнению с индикаторными бактериями свидетельствует о снижении индикаторного значения последних и о необходимости выполнения исследований не только на индикаторных, но и на патогенных бактериях. Для более надежной оценки эффективности обеззараживания при выборе модельных бактерий необходимо учитывать меньшую устойчивость музейных штаммов, по сравнению с выделенными из окружающей среды.

С целью совершенствования методических подходов к контролю качества воды после обеззараживания помимо выявления возможности реактивации изучалась изменчивость культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий. Изменчивость в процессе фотообеззараживания культуральных свойств бактерий Е. coli выявлена в 60 % проб, сальмонелл - в 50 % проб. Измененные колонии Ent. faecalis и St. aureus выявлены в 73% случаев (таблица 8.1.). Отсутствие типичных культуральных особенностей колоний может привести к ложноотрицательному результату оценки эпидемической безопасности воды. Таблица 8.1. Изменчивость культуральных и биохимических свойств индикаторных и патогенных бактерий

Свойства бактерий Микроорганизмы

Е. coli Сальмонеллы Энтерококки Стафилококки

Культуральные особенности Отсутствие металлического блеска колоний на среде Эндо; отсутствие способности бактерий ферментировать лактозу Отсутствие характерного зеркального блеска вокруг колонии на висмут-сульфитном агаре Отсутствие блеска колоний на энтерококк-агаре Задержка образования пигмента и проявления лецитови-теллазной активности

Бактериальный рост Контроль: 1-2 суток Опыт: 3-4 суток

Размер колоний Контроль: все колонии одного размера Опыт: выраженный полиморфизм по рамеру

Для повышения адекватности оценки эффективности обеззараживающих агентов даны рекомендации по усовершенствованию методики микробиологического анализа с учетом изменчивости культуральных и биохимических свойств бактерий: удлинение срока инкубации посевов до 5 суток, учет не характерных для тест-микроорганизмов колоний на дифференциальных средах, выполнение пассирования подозрительных колоний через оптимальные жидкие и плотные среды, использование нескольких методов посева в случае отсутствия дезактиватора дезсредства.