Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Экспериментальное изучение нового фотосенсибилизатора "Фталосенс" для фотодинамической терапии злокачественных новообразований

На правах рукописи

МОРОЗОВА НАТАЛЬЯ БОРИСОВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ НОВОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА «ФТАЛОСЕНС» ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2007

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П А Герцена» Росмедтехнологий (директор - академик РАМН, профессор ЧИССОВ В.И.)

Научный руководитель-

доктор биологических наук, профессор, Раиса Ивановна Якубовская Официальные оппоненты:

1 Доктор биологических наук, Нина Петровна Коновалова, ИПХФ РАН

2 Доктор медицинских наук, Елена Вячеславовна Филоненко, ФГУ «МНИОИ им П А Герцена» Росмедтехнологий

Ведущая организация-

Федеральное государственное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится «■{£> » Ок^ШЛ-^и^. 2007 г в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208 047 01 при ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П А Герцена» Росмедтехнологий по адресу 125284, г Москва, 2-ой Боткинский проезд, д 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П А Герцена» Росмедтехнологий

Автореферат разослан »

ее^ЩЯ^^ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

С.А. Седых

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Диссертационная работа посвящена изучению специфической активности нового фотосенсибилизатора «Фталосенс-лио» для фотодинамической терапии злокачественных новообразований (максимум поглощения - 685 нм)

Актуальность темы исследования

Метод фотодинамической терапии рака (ФДТ) применяется в клинической практике около 25 лет Это перспективный метод лечения злокачественных новообразований с успехом используемый как в России, так и за рубежом Фотодинамическая терапия представляет собой метод локальной активации светом определенной длины волны, накопившегося в опухоли фотосенсибилизатора (ФС) В присутствии кислорода тканей происходит развитие фотохимической реакции, приводящее к разрушению опухолевых структур [Красновский А А, 1990, Красновский А А, 2004]

Несомненным преимуществом метода ФДТ перед традиционными методами лечения в онкологии является высокая избирательность при минимальном повреждении здоровых тканей, разрушение опухолей в труднодоступных зонах, возможность многократного повторения лечебного процесса и комбинированной терапии, отсутствие тяжелых системных осложнений, относительно низкая стоимость, а также одновременное проведение как лечебного, так и диагностического воздействия

Основное ограничение метода ФДТ - глубина действия лазерного излучения Используемые в клинике фотосенсибилизаторы имеют спектр фотодинамического воздействия с максимумами в области 630 - 670 нм Это препараты на основе

- производного гематопорфирина - «Фотофрин» (США), «Фотосан» (ФРГ), «Фотогем» (Россия) с К™ = 630 нм [Dougherty Т, et al ,1992, Миронов А Ф ,1996, Странадко Е Ф и др, 2001, Новикова Б Г и др, 2005],

- 5 аминоливулиновой кислоты (5-АЛК) - «Аласенс» (Россия), «Левулан» (США), «Метвикс» (Норвегия), вызывающие в нормальных и опухолевых клетках индукцию синтеза протопорфирина IX с /„ш* = 632 нм [Чиссов В И и др , 2003,Соколов В В и др, 2005, Bellmer D А , et al, 2006, Oseroff A R et al, 2006],

- хлорина еб - «МАСЕ» (Япония), «Foscan» (Англия), «Радахлорин» и «Фотодитазин» (Россия) с Хпш = 662-664 нм [Решетников А В и др , 2001, Вакуловская Е Г и др , 2004, Аветисов С Э и др, 2005, Biel М, 2006],

- сульфофталоцианина алюминия - «Фотосенс» (Россия), с Xmax = 670 нм [Соколов В В и др, 1999, Странадко Е Ф и др, 2002, Соколов В В и др , 2006]

Проницаемость биологических тканей в эффективном диапазоне длин волн

используемых в настоящее время ФС незначительна и составляет всего несколько миллиметров Известно, что наиболее прозрачный диапазон для проникновения света в биологическую ткань находится в дальней красной и ближней ИК-области и составляет 650 - 800 нм, что соответствует диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров

К недостаткам используемых в настоящее время ФС относятся трудности со стандартизацией препарата, невысокая селективность накопления в опухолевой ткани, медленное выведение из организма («Фотогем», «Фотосенс»), лечение не глубоко расположенных опухолей

Актуальным в настоящее время является также разработка оптимизации метода ФДТ с целью повышения его эффективности Сказанное выше свидетельствует о необходимости поиска, создания и внедрения новых ФС, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в дальней красной области спектра, обладающих более высокой активностью и быстрым выведением из организма, а также отработка оптимальных режимов терапии с ними

Одним из наиболее перспективных красителей являются фталоцианины Вследствие своей химической природы, они обчадают рядом преимуществ относительно простая и дешевая технология производства, химическая стабильность и воспроизводимость состава, высокие квантовые выходы (~ 0 4 - Об) и величина экстинкции (е > 100000), определяющие эффективность фотодинамического воздействия в красной области спектра, интенсивный максимум поглощения в длинноволновой части спектра (Яти > 670 нм), то есть в районе большей световой проницаемости тканей

Фотосенсибилизаторы для красной и ближней ИК-области спектра позволяют увеличить эффективность ФДТ благодаря возможности излечивать более глубоко локализованные опухоли В связи с этим, разработка нового отечественного препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина (Хпш = 685 нм) в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ опухолей различных локализаций представляет большой интерес Фтадосенс, обладая достоинствами фотосенса, позволяет существенно снизить используемую для ФДТ дозу и тем самым уменьшить нежелательные побочные эффекты

Цель исследования

Разработка и изучение т vivo нового фотосенсибилизатора на основе безметального сульфофталоцианина

Задачи исследования

1 Разработать лекарственную и инъекционную формы нового препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина

2 Изучить биораспределение препарата «Фталосенс-лио» в органах и тканях интактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза

3 Отработать оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на модели лимфолейкоза Р388

4 Изучить противоопухолевую активность препарата «Фталосенс-лио» у животных с опухолями различного гистогенеза в оптимальных условиях

5 Оценить влияние ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на метастатическую активность опухоли Льюиса

6 Изучить переносимость препарата «Фталосенс-лио»

7 Оценить кожную фоточувствительность препарата «Фталосенс-лио» на интактных животных

8 Провести сравнительный анализ нового препарата и официнального препарата «Фотосенс»

Научная новизна

Экспериментально обоснованы и раскрыты возможности применения нового фотосенсибилизатора «Фталосенс-лио» и проведено его доклиническое изучение

Изучено биораспределение фталосенса в нормальных и опухолевых тканях животных

Отработаны оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» в эксперименте на животных с различными опухолями, доказана эффективность ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» для опухолей различного гистогенеза

Проведено изучение «острой», «хронической» токсичности и кожной фототоксичности препарата «Фталосенс-лио» на мелких лабораторных животных, показано, что препарат относится к нетоксичным лекарственным средствам

Практическая значимость

1 Разработано новое лекарственное средство для ФДТ рака - фотосенсибилизатор «Фталосенс-лио» на основе сульфированного безметального фталоцианина в виде лиофилизата, предложена инъекционная форма препарата - 0,02% раствор препарата «Фталосенс-лио» в физиологическом растворе Проведено всестороннее изучение нового препарата в сравнении с официнальным препаратом «Фотосенс»

2 На животных с опухолью определены оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» (дозы препарата, плотность энергии, интервалы между введением препарата и облучением)

3 На основании изучения безвредности препарата, определены мишени токсического воздействия и стартовые дозы для изучения препарата на I фазе клинических испытаний

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения «Модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им П А Герцена, Росмедтехнологий», на следующих форумах и международных конгрессах Thtrd Congress of the European Society for Photobiology Eleventh Internationa! Congress on Photobiology (Granada, Spam 1999), 9th Congress of the European Society for Photobiology (Lillehammer, Norway 2001), III съезде фотобиологов России (Воронеж, Россия 2001), 9th World Congress of The International Photodynamic Association, (Miyazaki, Japan 2003), Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» в рамках 1-ой Международной медицинской специализированной выставки «Медицина 2005», (Москва 2005), IV съезде фотобиологов России (Саратов, Россия 2005), на II, III, IV, V Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, Россия 2003, 2004, 2005, 2007), lllfi World Congress of The International Photodynamic Association, (Shanghai, China 2007)

Публикации

По теме диссертации опубликовано И печатных работ в отечественных и зарубежных журналах

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 184 публикаций отечественных и зарубежных авторов Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 30 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы и методы

Фотосенсибилизаторы

Субстанция препарата «Фталосенс» - смесь средних натриевых солей ди-, три- и тетрасульфофталоцианина со средней степенью сульфирования ~ 2 5 (PcH2(S03Na)~2 5), порошок темно синего цвета, медленно растворим в воде, без запаха, 'kmi¡x - 660, 692 нм (синтезированные в ФГУП «ГНЦ РФ НИОПИК»)

Препарат «Фталосенс-лио» - смесь средних натриевых солей ди-, три- и тетрасульфофталоцианина со средней степенью сульфирования ~ 2 5 (PcH2(S03Na)~2 5),

флаконы (20 мл) содержащие 10 мг активного вещества в виде пористой таблетки, образованной мелкими кристаллами цвета морской волны, легко и быстро растворимые в воде и физиологическом растворе, без запаха, Я.тах = 662, 693 нм

Препарат «Фотосенс» - смесь определенного состава натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия (ди-, три- и тетразамещенного) в дистиллированной воде Раствор Фотосенса 0 2% для инъекций, прозрачный интенсивного сине-бирюзового цвета, без запаха в стеклянных флаконах по 50 мл, Хтах = 670 нм

Биологические объекты

Животные - 1900 мышей гибридов BDFi, самок, массой 20 - 25 г и 150 мышей линии Balb/c, самок, массой 19 - 23 г Донорами опухолевого материала служили мыши DBA/2 самцы, C57BL/6 самки и самцы, беспородные самцы массой 19 -28 г

Модели опухолевых штаммов лимфолейкоз Р388 (Р388), эпидермоидная карцинома легкого Льюис (LLC), саркома 37 (S37), меланома В16 (В16) получены из банка ОНЦ РАМН Аденокарцинома толстой кишки Colo26 (С26) получена из ИБГ РАН

Аппаратура.

- Лазерная электронно-спектральная установка для флуоресцентной диагностики и контроля ФДТ «ЛЭСА-06» (ТОО «БИОСПЕК», Москва),

- Источники излучения для ФДТ Аппарат АТО-1 галогеновая лампа с фильтрами КС-10 и СЗС-26 - X = 600-800 нм, светодиодный источник оптического излучения для препарата «Фотосенс» - X = 674-682 нм, светодиодный источник оптического излучения для препарата «Фталосенс» - X = 685 нм,

- Измеритель плотности мощности ИПМО (НПО «Полюс», Москва)

Методики исследований

Регистрацию флуоресценции фотосенсибилизаторов в растворах методом локальной флуоресцентной спектроскопии проводили контактным способом на лазерной электронно-спектральной установке для флуоресцентной диагностики опухолей «ЛЭСА-06» Флуоресценцию возбуждали излучением He-Ne лазера (длина волны генерации 632 8 нм, спектральный диапазон 640-800 нм) Измерение флуоресценции растворов проводили в кюветах 120 MCLKB для хемилюминесценции В ходе исследований определяли положение максимума (^тах) и интенсивность флуоресценции в пределах Я,т!К ± 10 нм

Регистрацию экзогенной флуоресценции Фотосенсибилизаторов в биотканях методом локальной флуоресцентной спектроскопии проводили контактным способом на лазерной электронно-спектральной установке для флуоресцентной диагностики опухолей

и контроля ФДТ «ЛЭСА-06» Флуоресценцию возбуждали излучением He-Ne лазера (длина волны генерации 632 8 нм, спектральный диапазон измерения 640-800 нм)

Исследования осуществляли следующим образом через различные интервалы времени после введения фотосенсибилизатора (5 секунд, 5,15, 30 минут, 1,2,4 часа, I, 2, 3, 7, 14 суток, 1, 1 5, 3, 6 месяцев) мышей умерщвляли дислокацией шейных позвонков и затем извлекали образцы различных органов и тканей Объектами исследования являлись печень, почки, селезенка и ткани опухоли, кожи, мышцы, жировая ткань Измерение экзогенной флуоресценции тканей проводили ex vivo сразу после умерщвления животного На каждый срок наблюдения исследовали материал, полученный от 3-х животных Накопление ФС в тканях оценивали по максимальным значениям нормированной флуоресценции при длине волны, соответствующей максимуму флуоресценции ФС

Математическая обработка спектров флуоресценции При возбуждении флуоресценции в красной области спектра, интегральную интенсивность флуоресценции в диапазоне 645-736 нм нормировали на интегральную интенсивность сигнала обратного диффузного рассеяния в ткани возбуждающего лазерного излучения (^.тах = 632 8 нм), определяя, таким образом, нормированную флуоресценцию (ФН) тканей [Жаркова Н Н, 1992] В ходе исследования оценивали флуоресцентную контрастность (ФК), рассчитанные как отношение ФН в опухоли к ФН в коже и мышце ФК] и ФКг, соответственно ФК| = ФН опухоль/ФН кожа, ФКг = ФН опухоль/ФН мышца

Методика проведения ФДТ Облучение проводили дистанционно на 6 или 7 день роста опухоли у мышей Источник излучения - аппарат АТО-1 Плотность мощности контролировали с помощью измерителя мощности ИПМО В качестве анестезии применяли 5% раствор ketammi в дозе 2 5 мг/мышь внутрибрюшинно Интервал между введением фотосенсибилизатора и облучением составлял 5, 15, 30 минут, 1, 2, 4, 16 и 24 часа ФС вводили животным внутривенно в дозах 0 1, 0 25, 0 5, 1 0 и 2 0 мг/кг День проведения ФДТ принимали за нулевой день фотодинамического воздействия

Для оценки эффективности ФДТ с фотосенсибилизаторами использовали общепринятые в экспериментальной онкологии критерии [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005, с 647-648] торможение роста опухоли ТРО = [(VK - Von) / VJ 100%, где Von и VK -объем опухоли (первичный очаг) в опытной и контрольной группах соответственно, увеличение продолжительности жизни УПЖ = [(СПЖоП - СПЖК) / СПЖК] 100%, где СПЖоп и СПЖК - средняя продолжительность жизни в опытной и контрольной группах соответственно, критерий излеченности КИ = [N„ / N0] 100%, где NM и N0 - количество излеченных животных и общее количество животных в опытной группе соответственно

Объем опухоли (первичный очаг) рассчитывали по формуле V = ¿1 сЬ <1з, где ё], сЬ и <1з - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли

Исследования по влиянию ФДТ на метастатическую активность опухоли проводили на мышах с карциномой легкого Льюис (1АС) Опухоль имплантировали внутримышечно на бедро ФДТ проводили на 7 сутки после инокуляции опухоли На 25 день после трансплантации опухоли, всех животных как в опухолевой, так и в контрольной группах умерщвляли дислокацией шейных позвонков, вскрывали грудную полость, извлекали легкие и взвешивали Критериями оценки эффективности лечения являлись частота метастазирования опухоли (ЧМ) - процент животных с метастазами по отношению к общему количеству животных в группе и уровень торможения метастазирования (ТМ), рассчитывали по формуле ТМ = [(Мк - Моп) I Мк] 100%, где Моп и Мк - средняя масса метастазов в пересчете на одну мышь в опытной и контрольной группах, соответственно [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005, с 681-682]

Кожную фототоксичность оценивали у мышей, которым за 7 суток до облучения шерсть в месте облучения (правое бедро) удаляли с помощью крема-депилятора Препараты вводили внутривенно в терапевтических дозах (ТД) (0 5 и 10 мг/кг -фталосенс и 2 0 и 5 0 мг/кг - фотосенс) В качестве анестезии применяли 0 25% раствор ф-орепсЫг в дозе 0 25 мг/мыхпь

Облучение проводили с использованием светодиодных источников красного света, длина волны которых соответствовала максимуму поглощения красителей фотосенс -674-682 нм и фталосенс - 685 нм Плотность энергии составляла 90 Дж/см2 Контролями служили животные, которым проводили только облучение светодиодным источником соответствующей длины волны и животные, которым вводили только ФС Облучение депилированного участка бедра мыши проводили через различные интервалы времени (ДО после введения красителей 2 часа (фталосенс) и 4 часа (фотосенс) - сроки максимального накопления в коже, а также 1 и 7 суток после их введения

Состояние облученного участка кожи животных и размеры отека оценивали сразу после и через каждые 24 часа после облучения до полного исчезновения проявлений кожной токсичности Критериями оценки кожной фоточувствительности являлись наличие или отсутствие отека и струпа, время сохранения струпа, объем отека V = с!] <12 <1з, где с!ь ¿2 - две взаимно перпендикулярных толщины бедра мыши, <1з - длина части бедра мыши, соответствующая диаметру светового пятна, время его сохранения (Ту) Рассчитывали также относительный объем отека № = [(У2 - V)) / 100%, где VI и У2 - объемы отека до и через различные интервалы времени после облучения,

соответственно, время сохранения отека относительно контроля т = [(Tv0 - Tvx) / TvK] 100%, где Tv0 и TvK - время сохранения отека в опытной и контрольной группах, соответственно

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, OriginPro 7 0 Линейные величины сравнивали по методу Стьюдента Достоверными считали отличия при р<0,05

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Разработка препарата «Фталосенс-лио»

В предварительных исследованиях, проводимых в лаборатории модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им П А Герцена, совместно с ФГУП «ГНЦ РФ НИОПИК» в течение нескольких лет, изучены в сравнении различные производные безметального сульфофталоцианина (БСФ) с преимущественным содержанием ди-, три- и тетрасульфогрупп (H2Pc(S03Na)„) и препарата «Фотосенс», представляющего собой смесь ди-, три- и тетрасульфированных производных фталоцианина алюминия (А1Рс(80зЫа)п), где п = 2,3, 4

По фотофизическим свойствам безметальные сульфофталоцианины (БСФ) имеют ряд преимуществ перед алюминиевыми производными максимум поглощения в более длинноволновой области спектра (Я-max = 692 - 695 нм), менее устойчивую структуру, способную к более легкой деградации, в том числе и в биологической среде, не содержит атом металла, способный связывать и инактивировать белковые структуры.

Сравнительные исследования противоопухолевой активности БСФ с различной степенью сульфирования показали, что все производные (H2Pc(S03Na)n, где п = 2, 3, 4) являются перспективными для дальнейшего изучения Их активность оказалась сравнима между собой Однако, наибольшей активностью как в системе in vitro, так и т vivo обладали ди- и трисульфопроизводные БСФ, а трисульфопроизводное (НгРс(80зНа)з) имело наилучшие физико-химические свойства Поэтому для дальнейших исследований нами была выбрана структура, со средним содержанием сульфогрупп n ~ 2 5 На основе стандартной субстанции H2Pc(S03Na)~2 s нами разработан препарат, получивший название «Фталосенс-лио» В качестве лекарственной формы препарата была выбрана лиофилизированная форма, а в качестве инфузионной формы - 0 02% раствор препарата «Фталосенс-лио» в 0 9% хлориде натрия Проведено экспериментальное изучение специфической активности и безвредности препарата

2. Изучение специфической активности препарата «Фталосенс-лио»

Исследование включало в себя

- изучение флуоресценции фталосенса у интактных животных в интервале 5 секунд - 6 месяцев и животных с опухолями различного гистогенеза (Р388, С26, LLC, S37, В16) в интервале 5 секунд - 72 часа, позволившее оценить биораспределение фотоактивной формы красителя,

- изучение противоопухолевой активности фталосенса у животных с опухолями различного гистогенеза, в которое входили выбор оптимальных условий проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на модели лимфолейкоза Р388, оценка спектра противоопухолевой активности фталосенса (модели С26, LLC, S37, В16) и влияние ФДТ с фталосенсом на метастатическую активность опухоли LLC

2.1. Распределение препарата «Фталосенс-лио» в органах и тканях

Эффективность ФДТ определяется уровнем накопления красителя в опухолевой ткани и особенностями его распределения в окружающих тканях Величина нормированной флуоресценции (ФН) в тканях животных отражает, как правило, содержание мономерной формы фотосенсибилизатора, которая в присутствии кислорода способна инициировать развитие фотохимической реакции, приводящей к гибели опухоли В данной работе на основе флуоресценции оценивали распределение мономерной (флуоресцирующей) формы препарата в тканях В качестве препарата сравнения использовали структурный аналог фталосенса - препарат «Фотосенс»

2.1.1. Изучение флуоресценции фталосенса у интаюгных животных

Флуоресценция у интактных животных исследовали в интервале от 5 секунд до 6 месяцев Для препарата «Фталосенс-лио» использовали дозы 1 0, 0 5 и 0 25 мг/кг, для препарата сравнения «Фотосенс» - дозы 2 0 и 1 0 мг/кг Наиболее интересными являются результаты, полученные при сравнении распределения сенсибилизаторов в средней эффективной дозе - 0 5 мг/кг для фталосенса и терапевтической дозе (ТД) 2 0 мг/кг для фотосенса (рисунки 1а, б и 2а, б и таблица 1)

Сравнительная оценка биораспределения фталосенса и фотосенса во времени, показала, что характер кривых накопления и выведения имеет общие черты Так, для обоих препаратов уровни флюорохромов в органах и тканях зависят от дозы В коже, мышце и жировой ткани нормированная флуоресценция фталосенса и фотосенса существенно ниже, чем во внутренних органах (печень, почки, селезенка) на все сроки наблюдения

Анализ полученных данных выявил также и отличия в биораспределении фотосенсибилизаторов Данные флуоресцентного анализа свидетельствуют о том, что препарат «Фталосенс-лио» в течение 5 минут поступает в ткани организма и удерживается в течение суток в коже и жировой ткани, 4 часов - в мышце, а затем его флуоресценция

медленно снижается Фталосенс в мономерной форме в эффективной дозе 0 5 мг/кг в мышце и жировой ткани сохраняется до 14 суток, в коже остаточная флуоресценция регистрируется до 1 месяца (табл 1)

5

с

о >

х" ©

Ж а )

6 0 -

— ■— печень

4 0 - —•— почки

—ж— селезенка

2 0

0 10 20 30 40 50 60 70 Время после введения,часы

6 0 -

9

§

4 0 -

-20-

0 -

печень

почки

селезенка

О 10 20 30 140150160170180 Время после введения,сутки

Рисунок 1. Нормированная флуоресценция фталосенса в органах и тканях интактных мышей в интервале 5 секунд - 72 часа (а) и интервале 5 секунд - 6 месяцев (б). Доза фталосенса 0 5 мг/кг Флуоресценцию возбуждали излучением Не-N6 лазера (Хшх = 632.8 им), измерения проводили в диапазоне 640-800 им

Во внутренние органы (печень, почки и селезенка) фталосенс поступает быстро (в течение 15 минут) после введения и удерживается в них в течение 4 часов, а затем его флуоресценция медленно снижается Нормированная флуоресценция фталосенса в фазе накопления выше в селезенке и печени, чем в почках, а в фазе выведения наблюдается обратная картина Низкий уровень флуоресценции, отражающий следовые количества препарата «Фталосенс-лио», фиксируется в печени и селезенке до 3 месяцев, в почках

остаточное количество препарата определяется до 6 месяцев (рис 1а, б) Это обстоятельство косвенно свидетельствует о том, что основной путь элиминирования препарата из организма животных происходит через почки с мочой

6 О

4 0-

§

^20-х 0

0 -

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 Время после введения,часы

6 0-,

5

с;

о >«

х" в

4 0 -

2 0

б )

— ш — - п е ч е н ь

— « — - Г1 о ч к и

~ - ж с е л е з е н к а

0 10 20 30 140150160170180 Время после введения,сутки

Рисунок 2. Нормированная флуоресценция фотосенса в органах и тканях интактных мышей в интервале 5 секунд - 72 часа (а) и интервале 5 секунд - 6 месяцев (б). Доза фотосенса 2.0 мг/кг. Флуоресценцию возбуждали излучением НЫЧе лазера ().тах = 632 8 нм), измерения проводили в диапазоне 640-800 им.

Препарат сравнения «Фотосенс» в течение 1 часа поступает в ткани организма, удерживается в них на высоком уровне в течение 4 часов, а затем его флуоресценция медленно снижается Мономерная форма фотосенса в терапевтической дозе 2 0 мг/кг сохраняется в мышце и жировой ткани до 14 суток, в коже - более 6 месяцев (табл 1)

Во внутренние органы (печень и селезенку) фотосенс поступает в течение 4 часов после введения, в почки - почти мгновенно, а затем его флуоресценция медленно

снижается Нормированная флуоресценция фотосенса в фазе накопления и выведения выше в селезенке и печени, чем в почках Следовые количества препарата «Фотосенс» в почках регистрируются в течение 3 месяцев, в печени и селезенке - более 6 месяцев (рис 2а, б) Это обстоятельство косвенно свидетельствует о том, что основной путь элиминирования препарата из организма животных происходит через печень с желчью

Таблица 1

Нормированная флуоресценция фталосенса и фотосенса в тканях интактных _ мышей.

Интервал времени после введения Нормированная флуоресценция, усл.ед.

Фталосенс Фотосенс

кожа мышца жировая ткань кожа мышца жировая ткань

5 секунд 0 6±0 2 2 6±0 4 1 7±1 3 2 8±1 2 3 7±0 6 6 4±1 4

5 минут 0 9±0 3 4 2±0 9 1 8*0 5 4 9±1 1 5 9±0 9 7 4±3 8

15 минут 0 8±0 2 3 6±0 б 2 0±0 5 7 5±1 2 б 8±0 6 7 9±2 7

30 минут 0 9±0 3 4 4±1 0 3 3±0 6 10 1±0 9 9 8±2 1 7 7±1 9

1 час 1 0±0 3 3 6±0 4 2 2±1 4 >15 14 6±3 8 10 9±4 8

2 часа 0 9±0 2 3 1±0 4 2 3±0 6 >15 13 9±1 4 10 8±0 8

4 часа 0 8±0 3 2 9±0 2 2 3±0,4 >15 14 1±2 8 11 3±2 2

24 часа 0 9±0 2 2 1±0 6 2 4±0 6 б 1±1 2 2 8±0 5 2 8±0 б

2 суток 0 7±0 2 2 0±0 5 1 9±0 3 5 7±0 5 2 4±0 б 2 3±0 7

3 суток 0 6±0 1 1 2±0 2 0 8±0 5 3 5±0 б 1 7±0 4 1 8±0 3

7 суток 0 4±0 1 0 7±0 4 0 7±0 3 3 2±0 9 0 7±0 3 0 4±0 1

14 суток 01±01 0 3*01 02±0 1 2 6±0 4 0 2±0 2 01±01

1 месяц 0 1±0 1 0 0 2 2±0 б 0 0

1.5 месяца 0 0 0 0 4*0 2 0 0

3 месяца 0 0 0 0 2±0 2 0 0

6 месяцев 0 0 0 0 2±0 1 0 0

Доза фталосенса 0 5 мг/кг, фотосенса 2 0 мг/кг Флуоресценцию возбуждали излучением Не-.\е лазера (632 8 нм), измерения проводили в диапазоне 640-800 нм

Таким образом, препарат «Фталосенс-лио» (флуоресцирующая форма) быстро (в течение 5-15 минут) накапливается в различных органах и тканях животных, затем медленно выводится из них с различной скоростью. Остаточная флуоресценция Фталосенса в коже, определяющая кожную фототоксичность, регистрируется до 1 месяца. Флуоресцирующая форма фотосенса - препарата сравнения, накапливается в органах и тканях животных в течение 1-4 часов, затем медленно, с различной скоростью выводится из них В коже остаточная флуоресценция фотосенса определяется более 6 месяцев. Флуоресцентный анализ косвенно свидетельствует о том, что основной путь выведения фталосенса нз организма животных происходит через почки; фотосенса - через печень

2.1.2 Изучение флуоресценции фталосенса у животных с опухолями различного гистогенеза

Методом локальной флуоресцентной спектроскопии проведено сравнительное изучение распределения фотоактивной формы препарата «Фталосенс-лио» в динамике в опухолевой и окружающих тканях у мышей с опухолями различного гистогенеза лимфолейкозом Р388 (Р388), меланомой В16 (В16), эпидермоидной карциномой легкого Льюис (LLC) - высокометастазирующая опухолевая модель, саркомой 37 (S37), аденокарциномой толстой кишки Colo26 (С26) Препарат «Фталосенс-лио» вводили внутривенно в эффективной дозе 0 5 мг/кг Результаты представлены на рисунке За, б, в, г, д Следует отметить, что в пределах ошибки метода, распределение в нормальных органах и тканях мышей не зависит от линии и пола мышей, а также наличия у них опухоли

Анализ полученных данных показал, что имеются общие закономерности в накоплении и выведении фталосенса в тканях мышей с различными опухолями Так, препарат в мономерной форме мгновенно регистрируется в опухолевых тканях Флуоресценция достигает максимальных значений через 30 минут (LLC, В16, Р388) и 1 час (С26, S37) после введения, и сохраняется на высоком уровне в течение 4 часов, а затем медленно снижается

Однако в течение всего срока наблюдения уровень нормированной флуоресценции в опухолевых тканях С26, LLC S37 и В16 был в 1 5 - 2 5 раза выше, чем в опухолевой ткани Р388 Это свидетельствует о худшем накоплении фталосенса в ткани лимфолейкоза Р388 (солидный вариант) по сравнению с другими опухолями Интересным является факт накопления и регистрации флуоресцирующей формы препарата в меланоме В16 на уровне, соответствующем карциноме легкого LLC

Нормированная флуоресценция в окружающей опухоль коже у мышей с опухолями С26, LLC, S37 и В16 на все сроки наблюдения выше, чем у мьппей с опухолью Р388 в 2 раза При этом максимальная величина нормированной флуоресценции в окружающей коже у мышей с опухолью Р388 наблюдается через 5 минут, с опухолями LLC и В16 -через 15 минут, а с опухолями С26 и S37 через 30 минут после введения Высокие значения нормированной флуоресценции сохраняется в коже в течение 1 часа у мышей с опухолью В16, 4 часов - у мьппей с опухолями С26 и S37, 48 часов - у животных с опухолями Р388 и LLC

В окружающей мышечной ткани на все сроки наблюдения флуоресценция у мьппей с опухолями С26, LLC, S37, В16 и Р388 практически одинакова Ее максимальные значения наблюдаются через 5 минут (Р388), 15 минут (С26 и LLC) и 30 минут (S37 и В16) и сохраняются в течение 4 часов

Величина флуоресцентной контрастности рассчитанная как отношение нормированной флуоресценции в опухоли к нормированной флуоресценции в коже (ФК[) и мышце (ФКг) зависит от времени, прошедшего с момента введения препарата Показатели контрастности представлены в таблице 2

5 4 >>

е 2

а) Р388

О 10 20 30 40 50 60 70 Время после введения, часы

16 14 12 S 10

8-

с;

S.

х" ©

б)С26

0 10 20 30 40 50 60 70 Время после ведения, часы

Рисунок 3. Нормированная флуоресценция фталосенса в опухоли и окружающих тканях мышей: а) лимфолейкоз Р388, б) аденокарцинома толстой кишки С26, в) карцинома легкого Льюис LLC, г) саркома S37, д) меланома В16 в интервале 5 секунд -72 часа. Доза фталосенса 0.5 мг/кг. Флуоресценцию возбуждали

излучением He-Ne лазера (Хтах = 632.8 нм), измерения проводили в диапазоне 640-800 нм.

Флуоресцентная контрастность ФКь независимо от модели, возрастала на ранние сроки (до 30 минут) и в течение первых 4 часов сохранялась на максимальном уровне, а затем медленно снижалась

Флуоресцентная контрастность ФК2 для опухолей С26, LLC, S3 7 и В16 в 2 раза выше, чем для опухоли Р388 Причем ФК2 для LLC и В16 достигала максимума уже к 30 минутам после введения, для S37 - к 1 часу, для С26 и Р388 - к 4 часам, а затем сохранялась на том же уровне в течение всего срока наблюдения (72часа)

Таблица 2.

Флуоресцентная контрастность фталосенса в тканях опухолей._

Опухоль Показа» тель Флуоресцентная контрастность, усл. ед.

5 секунд 5 минут 15минут ЗОминут 1 часа 4 часа 24 часа 48 часов 72 часа

Р388 ФК, ФК2 2 5±0 3 1 0±0 1 3 4±0 8 1 0±0 1 3 5±0 8 1 2±0 1 4 6±1 3 1 4±0 3 4 1±0 5 1 3±0 1 4 3±1 4 1 7+0 6 3 7+1 3 1 5+0 2 3 9±0 4 1 5±0 3 3 7±0 7 1 6±0 2

С26 ФК] ФК2 1 6±0 2 1 3±0 2 2 6+0 7 2 1+0 6 3 0+0 7 2 2±0 5 3 4+0 5 2 5+0 7 4 4±0 3 3 2±0 5 4 4+0 7 3 9+0 5 4 4±0 7 3 9±0 5 3 3±0 6 3 0+0 3 2 4+04 2 2±0 4

LLC ФК, ФК2 2 6+0 1 1 5+0 1 2 9+0 3 1 8±0 2 3 9+0 6 3 0±0 5 5 2+0 6 3 3+0 5 4 3+1 2 3 0±0 9 4 4+1 1 2 6±0 3 3 9±1 1 3 4+0 8 3 8±0 7 3 5±0 3 3 3±0 5 3 8+0 8

S37 ФК, ФК2 2 9±0 3 2 0+0 3 2 8+0 2 2 1±0 2 3 1±0 2 2 3±0 3 3 5±0 4 2 3±0 2 3 9±0 7 2 9±0 3 3 6+0 5 2 5+0 I 3 6±0 4 2 6±0 3 3 5+0 4 2 5±0 2 3 4±0 6 2 9±0 6

В16 ФК, ФК2 2 5±0 2 2 0±0 3 3 5+0 2 2 5±0 2 4 1 ±0 5 3 0+0 5 5 2г0 2 3 4±0 2 3 9+0 2 2 5±0 2 4 5+0 5 2 4+0 3 4 2±0 8 2 7+0 7 4 2±0 1 2 б±0 4 4 4±0 5 3 2±0 5

Доза фталосенса 0 5 мг/кг Флуоресценцию возбуждали излучением Не-№ лазера (632 8 нм), измерение проводили в диапазоне 640-800 нм

Исследования с препаратом сравнения фотосенсом проведены на мышах с

лимфолейкозом Р388 Полученные данные приведены на рисунке 4 и в таблице 3

30 25-£201.15

5 ю ©

5 0

О 10 20 30 40 50 60 70 Время после введения, часы

Рисунок 4. Нормированная флуоресценция фотосенса в опухоли и окружающих тканях мышей с лимфолейкозом Р388 в интервале 5 секунд - 72 часа. Доза фотосенса 2 0 мг/кг. Флуоресценцию возбуждали излучением Не-1Че лазера (Хтах = 632.8 нм), измерения проводили в диапазоне 640-800 нм.

Таблица 3

Флуоресцентная контрастность фотосенса в опухолевой ткани Р388.

Опухоль Показатель Флуоресцентная контрастность, усл. ед.

5 секунд 5 минут 15 минут 30 минут 1 час 4 часа 24 часа 48 часов 72 часа

Р388 ФК, 4 6±1 9 3 8±0 6 3 3±0 7 ~3 ~2 ~2 ~5 2 7±0 5 2 7±0 2

ФК2 4 1±1 0 3 2±0 1 3 5±0 6 ~3 ~2 ~2 ~6 4 6+0 9 3 6±0б

Доза фотосенса 2 0 мг/кг Флуоресценцию возбуждали излучением Не-№ лазера (632 8 нм), измерение проводили в диапазоне 640-800 нм

Анализ полученных данных показал, что мономерная форма препарата «Фотосенс» сразу начинает накапливаться в опухолевой ткани, достигая максимальных значений уже через 15 минут после введения, и сохраняется на высоком уровне в течение 24 часов В последующие сроки флуоресценция снижается Максимальное значение ФН в коже и мышце у мышей с опухолью Р388 наблюдается через 1-4 часа после введения, затем медленно снижается

Величина флуоресцентной контрастности ФК] = ФН опухоль/ФН кожа и ФК2 = ФН опухоль/ФН мышца зависит от времени, прошедшего с момента введения препарата Показатель флуоресцентной контрастности ФКь в интервале до 4 часов снижается, затем возрастает до 24 часов, а затем снова медленно снижается

Показатель флуоресцентной контрастности ФК2 вначале также снижается до 4 часов, затем достигает максимума к 24 часам и медленно снижается в течение всего срока наблюдения до 72 часов

Таким образом, препарат «Фталосенс-лио» накапливается в тканях опухолей различного гистогенеза (Р388, С26, LLC, S37, В16) и в течение 4 часов в них удерживается; наибольшая флуоресценция и флуоресцентная контрастность фталосенса достигается через 30 минут - 4 часа после введения и составляет опухоль/кожа 3.5 - 5 0 усл. ед., опухоль/мышца 2 0 - 4.0 усл. ед. Препарат «Фотосенс» накапливается в опухолевой ткани Р388 и удерживается в ней в течение суток; наибольшая флуоресценция и флуоресцентная контрастность фотосенса достигается через 24 - 48 часов после введения и составляет опухоль/кожа 2.7 - 5.0 уел ед., опухоль/мышца 4.6 - 6.0 усл. ед

2.2. Противоопухолевая активность фталосенса у животных с опухолями различного

гистогенеза

Для изучения фотоиндуцированной противоопухолевой активности были использованы модели Р388, В16, LLC, S37, С26 Методом локальной флуоресцентной спектроскопии показано, что все опухоли накапливают фотоактивную форму препарата с высокой флуоресцентной контрастностью в течение 30 минут и сохраняют его на высоком уровне в течение 4 часов, что является ориентиром для выбора интервалов между введением красителя и облучением At Наиболее оптимальное время проведения ФДТ через 30 минут - 4 часа после внутривенного введения препарата

2 21. Выбор оптимальных условий проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио»

Эффективность ФДТ зависит от дозы фотосенсибилизатора, интервала между введением ФС и началом облучения (At) и плотности энергии (Ps) Для выбора оптимальной схемы проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» в качестве модели использовали лимфолейкоз Р388, который является удобной моделью, позволяющей за короткое время в многопараметрической системе провести оценку противоопухолевой эффективности фотосенсибилизатора

В предварительных исследованиях были определены эффективные плотность мощности (100 мВт/см2) и плотность энергии (270 Дж/см2), а также диапазон эффективных доз (0 1 - 2 0 мг/кг), при которых обнаруживался выраженный терапевтический эффект Зависимость фотоактивности от интервала At изучали при внутривенном введении препарата «Фталосенс-лио» в различных дозах 0 1, 0 25, 0 5, 1 0 и 2 0 мг/кг (рисунок 5)

Использование в схеме лечения низких доз (0 5 и 0 25 мг/кг) при облучении через короткие интервалы времени (05-4 часа) позволяет добиться высоких показателей ТРО Наблюдается также корреляция между максимальной эффективностью ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» при этих интервалах и максимальными значениями нормированной флуоресценции, а также показателями селективности накопления препарата в опухоли

Следует отметить, что при всех использованных схемах ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» гибели животных во время и после облучения отмечено не было В течение суток после облучения у животных развивался отек, который постепенно уменьшался в течение 7-9 суток На 2 - 3 сутки после ФДТ в зоне подвергшейся облучению образовывался некротический струп, который сберегался в течение 14 суток после ФДТ

На основании данных по выбору оптимальной схемы применения препарата, полученных, на модели Р388 (рисунок 5) и результатов флуоресцентного анализа (рисунки 1а, б) максимальное накопление флуоресцирующей формы препарата в опухолевой ткани происходит через 0,5 - 4 часа, максимальная флуоресцентная контрастность в опухоли отмечается также через 0 5-4 часа после введения препарата Была выбрана оптимальная схема проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» доза препарата - 0 5 мг/кг, интервал At - 2 часа при плотности энергии - 270 Дж/см2

Исследования с фотосенсом - препаратом сравнения проводили на мышах с лимфолейкозом Р388 при различных дозах фотосенсибилизатора, в зависимости от

интервала Дг и при одинаковой плотности энергии - 270 Дж/см2 По данным флуоресцентного анализа фотосенса максимальное накопление флуоресцирующей формы препарата в опухолевой ткани регистрируется в интервале от 15 минут до 24 часов, максимальная флуоресцентная контрастность в опухоли отмечается через 24 - 48 часов после введения препарата Поэтому оценку фотоиндуцированной активности препарата проводили в интервале от 15 минут до 48 часов, варьируя дозы препарата (0 5, 2 0 и 5 О мг/кг) Полученные данные по эффективности ФДТ представлены на рисунке 6

| 1 6 ч

ч? 1 4 в4 О

° 1 2

к 1 о о

£ 8

-15м и нут

—— 3 0м и н у т

— 1 ч а с

— 2 ч а с а —■4 ч а с а

•— 2 4 ч а с а

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Доза фталосенса, мг/кг

Рисунок 5. Зависимость длительности максимального противоопухолевого эффекта (ТРО 90 - 100 %) от дозы фталосенса и интервала между введением препарата и световым воздействием на модели лимфолейкоза Р388.

1 6 1 4 1 2 1 0

О а. ь л

ь - ——— 15м и нут

—•— 2 ч а с а

ь - — ж— 4 ч а с 8

- —▼— 2 4 ч а с а

4 - -—- 4 8 ч а с о в

0 2 4 6 8 1 0

Доза фотосен.са, мг/кг

Рисунок 6. Зависимость длительности максимального противоопухолевого эффекта (ТРО 90 - 100%)от дозы фотосенса и интервала между введением препарата и световым воздействием на модели лимфолейкоза Р388.

После проведенного облучения гибели животных отмечено не было В течение нескольких часов наблюдалось развитие отека, который сохранялся в течение 6-7 суток после ФДТ

Доза фотосенса, при которой наблюдается выраженный противоопухолевый эффект (длительное торможение роста опухоли на 90 -100 %) составляет 5 0 мг/кг при интервале между введением препарата и облучением 4 и 24 часа

На основании данных по выбору оптимальной схемы применения препарата «Фотосенс», полученных, на модели Р388 (рисунок 6) и результатов флуоресцентного анализа (рисунки 2а, б) максимальное накопление препарата в опухолевой ткани происходит в интервале до 48 часов, максимальная селективность в опухоли отмечается через 24 - 48 часов после введения препарата Была выбрана оптимальная схема проведения ФДТ с препаратом «Фотосенс» доза препарата - 5 0 мг/кг, интервал Д1 - 24 часа при плотности энергии - 270 Дж/см2

Для установления возможности снижения плотности энергии во время облучения изучена противоопухолевая активность ФДТ с фталосенсом в зависимости от плотности энергии при условии сохранения высокой эффективности Препарат «Фталосенс-лио» вводили в дозе 1 0 мг/кг, облучение проводили через 24 часа после введения Результаты исследования представлены в таблице 4

Таблица 4.

Влияние ФДТ с использованием фталосенса в дозе 1.0 мг/кг на рост Р388 в

зависимости от плотности энергии.

Плотность энергии Дж/см2 Показатель Объем опухоли см1 (1). ТРО % (2) Сроки наблюдения ПЖ(1) УПЖ % (2)

До ФДТ 8 суток И суток 13 суток 15 суток

Контроль 1 0 06±0 0¡ 0 9!±0 08 1 35±0 16 2 28±0 32 3 04±0 42 24 1±1 0

90 1 2 0 05±0 01 0 61±0 12 33 0 0 90±0 19 33 3 1 37±0 31 39 9 2 07±0 52 31 9 25 9±2 6 7 5

180 1 2 0 06±0 02 0 21±0 11 76 9 0 47±0 24 65 2 0 80±0 32 64 9 1 21±0 86 60 2 25 3±2 2 5 0

270 1 2 0 06±0 01 0 100 0 14±0 10 89 6 0 36±0 19 84 2 0 72±0 37 76 3 26 1±2 4 83

Интервал М 24 часа Доза фталосенса 1 0 мг/кг

Полученные результаты показали, что эффективность ФДТ с фталосенсом зависит от плотности энергии, причем, с ее уменьшением от 270 до 90 Дж/см2, фотоактивность уменьшается Так, при плотности энергии 270 Дж/см2 ТРО составляет 76 3 - 100 % во все сроки наблюдения, при плотности энергии 180 Дж/см2 - 60 2 - 76 9%, а при 90 Дж/см2 -31 9 - 39 9 % Снижение плотности энергии при использовании в качестве источника лампы ATO 1 приводит к снижению противоопухолевой эффективности препарата Уточнение параметров облучения (плотности мощности, плотности энергии и времени

облучения) необходимо проводить в начале первой фазы клинических испытаний препарата

Сравнение эффективности препаратов «Фталосенс-лио» и «Фотосенс» на мышах с лимфолейкозом Р388 показало, что фталосенс превосходит по противоопухолевой активности фотосенс. Оптимальные дозы для препарата «Фталосенс-лио» в 5 - 8 раз меньше, чем для препарата «Фотосенс».

2.2.2 Спектр противоопухолевой активности препарата «Фталосенс-лио» у животных с опухолями различного гистогенеза при оптимальной схеме ФДТ

Оценку эффективности ФДТ с фталосенсом проводили на различных опухолевых моделях аденокарциноме толстой кишки С26, эпидермоидной карциноме легкого Льюис LLC, саркоме S37 и меланоме В16, используя один из эффективных режимов отработанных на модели Р388 Исследования проведены совместно с Панкратовым А А (МНИОИ им П А Герцена, отделение модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии) Полученные результаты представлены в таблице 5

Таблица 5.

Влияние ФДТ с использованием фталосенса на рост опухолей различного

гистогенеза.

Опухоль ТРО % УПЖ*, % ки, %

Сроки наблюдения

7 суток 9 суток 11 суток 14 суток 16 суток

С26 100 100 100 100 100 57 33

LLC 100 100 100 100 100 - 100

S37 97 89 87 84 80 47 43

В16 100 99 98 92 85 32 -

Р388 100 100 91 92 90 31 -

Доза фталосенса 05 мг/кг, интервал между введением красителя и началом облучения А! 2 часа, плотность энергии 270 Дж/см2, *УПЖ зарегистрировано на 90 день наблюдения

Противоопухолевая эффективность ФДТ с использованием препарата «Фталосенс-лио» при оптимальной схеме лечения (доза препарата - 0 5 мг/кг, интервал At - 2 часа при плотности энергии - 270 Дж/см2) оказалась для всех опухолей высокой ТРО на все сроки наблюдения (16 суток) составило 100% для С26 и для LLC, 80 - 97% - для S3 7 и 85 -100% - для В16 Наибольшая эффективность ФДТ наблюдалась в отношении опухолей С26 и LLC Следует отметить, что на моделях С26, LLC и S37 не наблюдалось возобновления опухолевого роста у животных к 90-ому дню после ФДТ по результатам вскрытия На этот срок УПЖ для животных с опухолями С26 и S37 составило 57% и 47%, соответственно (таблица 9) Высокие значения величины УПЖ связаны с высокими показателями излеченности животных 43% на модели S37, 33% на модели С26 и 100% на

модели LLC, в то время как для опухолей Р388 и В16 случаев полной излеченности отмечено не было

В настоящее время, в отделении модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им ПА Герцена, проводятся исследования по изучению противоопухолевой активности фотосенса - препарата сравнения на модели S3 7 Показана высокая противоопухолевая эффективность ФДТ с препаратом «Фотосенс» при дозе препарата - 2 5 мг/кг, интервале Д£ - 24 часа и плотности энергии - 90 Дж/см2 КИ достигает 25%, что не превышает эффективность ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» (КИ - 43%) при оптимальной схеме ФДТ для этой модели (неопубликованные данные)

Таким образом, препарат «Фталосенс-лио» обладает высокой фотоиндуцированной противоопухолевой активностью в отношении опухолей Р388, С26, LLC, S37 и В16. ТРО в зависимости от опухолевой модели составляет 80-100%, УПЖ - 31-57%, КИ — 33-100%, что соответствует критериям эффективности новых препаратов, рекомендованных для клинического изучения

2.2.3. Влияние ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на метастатическую активность эпидермоидной карциномы легкого Льюис LLC

Проведено исследование влияния ФДТ с фталосенсом на метастатическую активность опухоли LLC ФДТ проводили на 7-е сутки после внутримышечной инокуляции опухоли на бедро при оптимальной схеме доза красителя 0 5 мг/кг, плотность энергии 270 Дж/см2, интервал At - 2 часа Показано, что ФДТ с фталосенсом тормозит развитие метастазов, ТМ составляет 25 5±3 5 % Кроме этого, на все сроки наблюдалось торможение роста опухоли LLC при ее внутримышечной инокуляции от 29 до 41 % (таблица б)

Таблица б.

Влияния ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на метастатическую активность

опухоли LLC

Схема лечения V опухоли СМ*(1) ТРО% (2) Сроки наблюдения чм % ТМ %

До ФДТ 7 сутки 9 сутки 11 сутки 14 сутки

Контроль 1 1 02±0 12 8 73+0 43 10 42±0 52 12 12+0 66 15 08±0 98 100

0 5 мг/кг 2 часа 1 2 088+0 10 5 60±0 61 36 6 46±! 08 38 7 15±1 45 41 1065±1 75 29 83 25 5±3 5

Доза фталосенса 0 5 мг/кг Плотность энергии 270 Дж/см2.

Следует отметить, что при подкожной инокуляции опухоли LLC и проведении ФДТ в тех же условиях (доза красителя 0 5 мг/кг, плотность энергии 270 Дж/см2, интервал At - 2 часа), ТРО на все сроки наблюдения составило 100%

Таким образом, ФДТ с фталосенсом влияет на метастатическую активность опухоли LLC, тормозя развитие метастазов на 25.5±3.5%.

Проведенные исследования позволили оценить распределение фталосенса в органах и тканях в динамике, определить оптимальный интервал времени между введением препарата и проведением ФДТ, составляющий 0.S - 4 часа (для фотосенса этот интервал составляет 4-24 часа) и показали высокую фотоиндуцированную противоопухолевую активность препарата «Фталосенс-лио», значительно превосходящую по своей активности препарат «Фотосенс».

3. Изучение безвредности препарата «Фталосенс-лио»

Целью изучения безвредности нового препарата «Фталосенс-лио» являлось установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценка его безопасности

В задачи исследований входило изучение «острой» токсичности на мышах и крысах при однократном внутривенном применении препарата, изучение «хронической» токсичности на крысах и кроликах при многократном внутривенном применении, изучение кожной фототоксичности на мышах при внутривенном введении терапевтических доз препарата Исследования по изучению «острой» и «хронической» токсичности проведены совместно с к б н А А Панкратовым (МНИОИ им П А Герцена отделение модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии)

3 1 «Острая» токсичность фталосенса

При изучении «острой» токсичности на мышах показано, что токсичность препарата «Фталосенс-лио» зависит от концентрации вводимого раствора (концентрация раствора фталосенса для внутривенного применения не должна превышать 0 2%) Доза препарата «Фталосенс-лио», равная 100 мг/кг (концентрация 0 2%) охарактеризована как максимально переносимая (превышает предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 2000 раз) Причиной смерти мышей от однократного внутривенного введения препарата «Фталосенс-лио» в летальных дозах является острая сердечно-сосудистая недостаточность

Изучение «острой» токсичности на крысах показало, что однократное внутривенное введение фталосенса в дозах от 20 мг/кг до 40 мг/кг удовлетворительно переносилось животными и не приводило их к гибели от токсичности Максимально

введенная доза препарата, равная 40 мг/кг, превышала предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 800 раз

3.2 «Хроническая» токсичность фталосенса

При изучении «хронической» токсичности препарата «Фталосенс-лио» на крысах показано, что препарат при многократном (в течение 10 дней) внутривенном введении в диапазоне исследуемых доз (суммарные дозы - 6 мг/кг, 12 мг/кг и 24 мг/кг) не оказывал токсического действия на периферическую кровь, печень, почки, органы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и центральной нервной системы (ЦНС) Максимально вводимая доза препарата (24 мг/кг) превышала предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 480 раз

При изучении «хронической» токсичности фталосенса на кроликах установлено, что исследуемый фотосенсибилизатор при многократном (в течение 10 дней) внутривенном введении в суммарной дозе, равной 10 мг/кг, не оказывал токсического действия на периферическую кровь, печень, почки, органы ЖКТ и ЦНС Препарат «Фталосенс-лио» в суммарной дозе, равной 20 мг/кг, оказывал обратимое токсическое действие на печень, нарушая ее барьерную и синтезирующую функции, и не оказывал токсического действия на периферическую кровь, почки, органы ЖКТ и ЦНС Максимально вводимая доза препарата (20 мг/кг) превышала предполагаемую терапевтическую дозу для человека в 400 раз Это позволило отнести препарат «Фталосенс-лио» к не токсичным препаратам

3 3 Кожная фототоксичность фталосенса

Изучение кожной фототоксичности препарата «Фталосенс-лио» проводили в сравнении с препаратом «Фотосенс»

Исследования проводили, используя терапевтические дозы препаратов 0 5 и 1 0 мг/кг (фталосенс) и 2 0 и 5 0 мг/кг (фотосенс) Облучение проводили светодиодными источниками с максимумом излучения 685 нм (фталосенс) и 674 - 682 нм (фотосенс), плотность мощности - 50 мВт/см2, плотность энергии - 90 Дж/см2 (оптимальные условия облучения для исследуемых ФС) Интервалы времени между введением ФС и облучением (Д^ были подобраны с учетом флуоресценци в коже, полученным ранее Максимальное значение нормированной флуоресценции (ФН) фталосенса в коже наблюдается в интервале от 5 минут до 24 часов после введения Оптимальным временем проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» является 2 часа Максимальное значение нормированной флуоресценции фотосенса в коже наблюдается через 1-4 часа после введения Оптимальным временем проведения ФДТ с препаратом «Фотосенс» является 4

-24 часа. Поэтому облучение кожи проводили при максимальном накоплении ФС а коже, в сроки соответствующие срокам проведения ФДТ - 2 часа для фталосенса и 4 часа для фотосенса, а также через 24 часа Й 7 суток после введения препаратов,

Результаты проведенных исследований показали, что у всех животных после облучения в течение первых суток развивался отек, причем интенсивность отека зависела от дозы препарата для вссх наследованных интервалов времени. На рисунках 7 и 8 представлено сравнение кожной токсичности в минимальных терапевтических дозах.

а 200-,

8

S 175 -

I 150 -

на

щ ' 12.S Ч

s ^ lLZ> т

1 U 100 -

т ^

75 -50 -25 -О

6 8 II 13 15 18 Время после облучения, сутки.

20

22

Рнсункн 7, Относительный объем отека кожи в зависимости от интервала между введением фталосенса и облучением при дозе 0,5 мг/кг: Щ — 2 часа, Щ — 24 часа, Ц - 7 суток.

200 -1 175 -150 -125 -100 -75 -50 -25 -

I

1 .lb,

0,003

6 8 И 13 15 Время после облучения, сутки.

IS

10

22

Рисунки 8. Относительный ооьен отека Кожи в чавнеимости от интервала между введением фотосенеа it облучен нем при дозе 2.0 мг/кг: й — Л часа, §§ - 24 часа, Ц - 7 суток.

Фотоповреждение кожи во время сеанса ФДТ для препаратов «Фталосенс-лио» и «Фотосенс» в ТД одинаково В то же время, имеются существенные различия Так при увеличении интервала времени между введением фталосенса и облучением до 7 суток, время сохранения отека относительно контроля (т) пропорционально уменьшалось Это свидетельствовало о снижении кожной фоточувствительности фталосенса через 7 суток после введения в 5 9 раза при использовании дозы 0 5 мг/кг и в 4 5 раза при использовании дозы 1 0 мг/кг Для фотосенса при увеличении интервала до 7 суток т снижалась в 2 5 раза при использовании дозы 2 0 мг/кг и в 1 б раза при использовании дозы 5 0 мг/кг (таблица 7)

Таблица 7.

Время сохранения отека кожи (Ту) и время сохранения струпа после облучения мышей с фталосенсом и фотосенсом в зависимости от дозы препарата и времени _ после его введения. Плотность энергии 90 Дж/см2. _

Препарат ТД, мг/кг Интервал после введения препаратов А1 Время сохранения отека Время сохранения струпа, сутки

Tv, сутки -г*, %

Фталосенс 0,5 2 часа 15,7±0,6 292,5 7,7±0,б

24 часа 12,7+1,3 217,5 4,3±2,0

7 суток 6,0+0,1 50,0 отсутствует

1,0 2 часа 19,0+1,9 375,0 7,7+2,1

24 часа 15,0+1,0 275,0 5,7+0,8

7 суток 7,3±0,6 82,5 отсутствует

Фотосенс 2,0 4 часа 18,0±0,9 300,0 6,0+0,9

24 часа 14,3±1,2 217,8 отсутствует

7 суток 10,0±1,9 122,2 отсутствует

5,0 4 часа 23,3+0,6 417,8 10,0+1,9

24 часа 19,9±1,9 322,2 6,7±2,1

7 суток 16,0±0 9 255,6 5,3±1,5

т* - время сохранения отека относительно контроля (%)

У животных после введения фталосенса и облучения через 2 и 24 часа в течение 3-х суток формировался некротический струп Причем при облучении через 2 часа время сохранения струпа не зависело от дозы При облучении через 7 суток после введения струпы отсутствовали (таблица 7) У животных, после введения фотосенса, некротический струп формировался при использовании дозы 2 0 мг/кг только после облучения через 4 часа, а при использовании дозы 5 0 мг/кг, струп формировался после облучении через все интервалы времени При облучении через 4 часа время сохранения струпа с увеличением дозы препарата увеличивалось С увеличением интервала от 4 часов до 7 суток при использовании фотосенса в дозе 5 0 мг/кг время сохранения струпа уменьшалось

Таким образом, фотоповреждение кожи во время сеанса ФДТ для фталосенса и фотосенса, при введении их в терапевтических дозах, одинаково. Через 7 суток

после ведения препаратов в тех же дозах кожная фоточувствительность фталосенса ниже, чем фотосенса. Препарат «Фталосенс-лио» обладает менее продолжительной и менее выраженной кожной фоточувствительностью, чем применяемый в настоящее время препарат «Фотосенс».

Проведенные исследования по изучению безвредности препарата «Фталосенс-лио» не выявили противопоказаний для передачи препарата «Фталосенс» на I фазу клинического изучения у больных злокачественными новообразованиями. На основании данных по специфической противоопухолевой эффективности фотодинамической терапии с препаратом «Фталосенс-лио» у животных с перевиваемыми злокачественными опухолями и безвредности на I фазу клинического изучения у больных злокачественными новообразованиями рекомендована доза фотосенсибилизатора, равная 0 02-0 05 мг/кг веса тела человека

ВЫВОДЫ

1 Разработана лекарственная и инъекционная формы нового препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина, в качестве лекарственной формы выбрана лиофилизированная форма, а в качестве инфузионной формы - 0 02 % раствор препарата «Фталосенс-лио» в физиологическом растворе

2 Препарат «Фталосенс-лио» (флуоресцирующая форма) быстро накапливается в органах и тканях животных, флуоресцентный анализ косвенно свидетельствует, что основной путь выведения фталосенса из организма животных происходит через почки, Величина регистрируемой экзогенной флуоресценции прямопропорциональна дозе препарата

3 Препарат «Фталосенс-лио» (флуоресцирующая форма) накапливается в тканях опухолей различного гистогенеза (Р388, С26, 1ХС, 837, В16) и в течение 4 часов в них удерживается, наибольший флуоресцентный контраст опухоль/кожа и опухоль/мышца достигает через 30 минут - 4 часа после его введения и составляет 3 5-50 уел ед и 2 0 -4 0 уел ед, соответственно

4 Оптимальными условиями проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» для мышей являются доза 0 25 - 0 5 мг/кг, интервал между введением препарата и облучением 0 5-4 часа, плотность энергии 270 Дж/см2

5 Препарат «Фталосенс-лио» обладает высокой фотодинамической противоопухолевой активностью у животных с опухолями различного гистогенеза (Р388, С26, ЬЬС, 837, В16) в оптимальных условиях (0 5 мг/кг, Д1 2 часа, 270 Дж/см2) В

зависимости от опухолевой модели ТРО составляет 80-100%, УПЖ - 31-57%, КИ - 33100%

6 Противоопухолевая эффективность препарата «Фталосенс-лио» превосходит эффективность препарата «Фотосенс» при использовании оптимальных режимов проведения ФДТ Терапевтическая доза препарата «Фталосенс-лио» в 5 - 8 раз меньше, чем препарата «Фотосенс»

7 ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» влияет на метастатическую активность опухоли LLC, тормозя развитие метастазов на 25 5±3 5 %

8 Максимально переносимая доза препарата «Фталосенс-лио» для животных (100 мг/кг - мыши) превышает рекомендованную терапевтическую дозу для человека (0 05 мг/кг) в 2000 раз, что позволяют отнести препарат к не токсичным лекарственным средствам

9 Фотоповреждение кожи через 7 суток после введения препаратов в терапевтических дозах для фталосенса ниже, чем для фотосенса Время сохранения отека при использовании фталосенса в 1 б - 2 2 раза меньше, чем - фотосенса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Казачкина Н И , Фомина Г И , Якубовская Р И , Морозова Н Б. Сульфированные фталоцианины как агенты для фотодинамической терапии рака // Материалы III съезда фотобиологов России, Воронеж, Россия, 2001

2. Kazachkma N I, Morozova N.B., Fomma GI, Yakubovskaya R I, Pecherskikh E V , Sokolov V V , Derkatchova V M, Lukyanets E A Influence of the phthalocyanine central atom on its biodistnbution and the phototoxicity // Abstracts of 9th Congress of the European Society for Photobiology, Lillehammer, Norway, 2001

3. Lukyanets E A , Derkacheva V M, Chissov VI, Yakubovskaya RI, Kazachkma N I, Morozova N.B., Karmakova T A , Plyutmskaya A D The study of sulphonated metalfree phthalocyanmes in vitro and m vivo // Abstracts of 9th World Congress of The International Photodynamic Association, Miyazaki, Japan, 2003, P-015, p 42

4. Якубовская P И , Морозова Н.Б., Кармакова T А , Плютинская А Д , Деркачева В М, Лукьянец Е А, Чиссов В И, Ворожцов Г Н Фталосенс - новый препарат на основе безметального фталоцианина для ФДТ рака // Российский Биотерапевтический журнал, 2004, №2, с 60-61

5. Yakubovskaya R I, Morozova N В., Karmakova Т А, Plyutmskaya A D, Chissov VI, Derkacheva V М, Lukyanets Е А, Vorozhtsov G N Comparative study of photo-

induced activity of di- and tn sulhhonated derivatives of metal-free phthalocyanme and Photosens // Current Research on Laser Use m Oncology 2000-2004, Edited by Ivanov AV etal 2005, v 5973, p 111-118

6. Якубовская P И, Морозова Н.Б., Панкратов A A, Кармакова T А, Плютинская А Д, Чиссов В И, Деркачева В М, Лукъянец Е А, Ворожцов Г Н Фотоиндуцированная противоопухолевая активность препарата фталосенса у животных с опухолями различного гистогенеза // Российский онкологический журнал, 2006, № 3, с 26-32

7. Панкратов А А, Морозова Н.Б., Андреева Т Н, Якубовская Р И Оценка токсических свойств оригинального препарата фталосенса, предназначенного для фотодинамической терапии злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал, 2006, № 6, с 31-34

8. Морозова Н.Б., Якубовская Р И, Деркачева В М, Лукъянец Е А Биораспределение препарата фталосенса у интактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза // Российский онкологический журнал, 2007, № 1, с 37-43

9 Якубовская Р И, Морозова Н.Б , Кармакова Т А Плютинская А Д, Чиссов В И, Деркачева В М, Лукъянец Е А, Ворожцов Г М Изучение эффективности сульфированных производных фталоцианина для ФДТ злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал, 2007, № 3, с 29-34

10. Yakubovskaya RI, Chissov V I, Feofanov A V , Karmakova T A, Morozova N.B., Pankratov A A, Plyutinskaya A D, Lukyanets E A, Vorozhtsov G N In vitro and m vivo study of new photosensitizes foT photodynamic therapy // Abstracts of 111,1 World Congress of The International Photodynamic Association, Shanghai, China 2007, S01-P6, p 64

11. Морозова Н.Б., Якубовская P И, Чиссов В И, Мизин В М, Плешков Г М Изучение кожной фоточувствительности сульфированных производных фталоцианина // Российский Биотерапевтический журнал, 2007, № 2, с 50-54

Подписано в печать 10 09 2007 Исполнено 11 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 693 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Актуальность темы

В настоящее время наиболее острой проблемой ВОЗ является высокая смертность населения, превышающая рождаемость в 1.7 раза. Неблагоприятные демографические тенденции и сложная экологическая обстановка сопровождаются неуклонным ростом числа онкологических заболеваний. Каждый год в Российской Федерации впервые в жизни выявляется более 500 тысяч случаев злокачественных новообразований [28]. Прирост данного показателя ежегодно составляет около 0.5%. Лидирующими локализациями рака в мире являются рак желудочно-кишечного тракта (рак желудка, пищевода, толстой и прямой кишок) и рак легкого.

В последние годы генеральной концепцией клинической и экспериментальной онкологии является органосохраняющее лечение. Арсенал методов, позволяющих проводить органосохраняющее лечение, расширился благодаря разработке и внедрению принципиально новых методов лечения. Среди них наиболее развивающимся методом является фотодинамическая терапия (ФДТ).

Метод ФДТ рака применяется в клинической практике около 25 лет. Это перспективный метод лечения злокачественных новообразований с успехом используемый как в России, так и за рубежом. Фотодинамическая терапия представляет собой метод локальной активации светом определенной длины волны, накопившегося в опухоли фотосенсибилизатора (ФС). В присутствии кислорода тканей происходит развитие фотохимической реакции, приводящее к разрушению опухолевых структур [11,12].

ФДТ довольно быстро нашла свое место в онкологии и оказалась эффективной при тяжелых дисплазиях, начальных поверхностно расположенных опухолях различных локализаций, рецидивах и внутрикожных метастазах после хирургического, лучевого или комбинированного лечения, а также у больных с тяжелой возрастной или сопутствующей патологией. Полиативно ФДТ проводят для лечения распространенных обтурирующих раках пищевода, желудка, трахеи, толстой кишки с целью реканализации стенозированного органа и улучшения качества жизни.

Несомненным преимуществом метода ФДТ перед традиционными методами лечения в онкологии является: высокая избирательность при минимальном повреждении здоровых тканей, разрушение опухолей в труднодоступных зонах, возможность многократного повторения лечебного процесса и комбинированной терапии, отсутствие тяжелых системных осложнений, относительно низкая стоимость, а также одновременное проведение как лечебного, так и диагностического воздействия.

Побочным эффектом метода ФДТ является фоточувствительность кожи к солнечному свету, которая может длиться от 24 часов до 6 недель в зависимости от используемого фотосенсибилизатора.

Основное ограничение метода ФДТ - глубина действия лазерного излучения. Используемые в клинике фотосенсибилизаторы имеют спектр фотодинамического воздействия с максимумами в области 630 - 670 нм. Это препараты на основе:

- производного гематопорфирина - «Фотофрин» (США), «Фотосан» (ФРГ), «Фотогем» (Россия) с = 630 нм [17,20,29,46,83];

- 5 аминолевулиновой кислоты (5-AJ1K) - «Аласенс» (Россия), «Левулан» (США), «Метвикс» (Норвегия), вызывающие в нормальных и опухолевых клетках индукцию синтеза протопорфирина IX с Хтах = 632 нм [4,27,35,52,139];

- хлорина еб - «МАСЕ» (Япония), «Foscan» (Англия), «Радахлорин» и «Фотодитазин» (Россия) с = 662-664 нм, [5,22,54,142];

- сульфофталоцианина алюминия - «Фотосенс» (Россия), с = 670 нм [3,4,10,24,26,167].

Проницаемость биологических тканей в эффективном диапазоне длин волн используемых в настоящее время ФС незначительна и составляет всего несколько миллиметров. Известно, что наиболее прозрачный диапазон для проникновения света в биологическую ткань находится в дальней красной и ближней ИК-области и составляет 650 - 800 нм, что соответствует диапазону генерации эффективных, надежно работающих и доступных лазеров.

К недостаткам используемых в настоящее время ФС относятся: трудности со стандартизацией препарата, невысокая селективность накопления в опухолевой ткани; медленное выведение из организма («Фотогем», «Фотосенс»), лечение не глубоко расположенных опухолей.

Актуальным в настоящее время является также разработка оптимизации метода ФДТ с целью повышения его эффективности. Сказанное выше свидетельствует о необходимости поиска, создания и внедрения, новых ФС, обеспечивающих эффективную генерацию синглетного кислорода в дальней красной области спектра, обладающих более высокой активностью и быстрым выведением из организма, а также отработка оптимальных режимов терапии с ними.

Направленный поиск таких фотосенсибилизаторов проводится среди производных хлоринов, бактериохлоринов, пурпуринов, бензопорфиринов, тексафиринов, этиопурпуринов, нафтало- и фталоцианинов. При этом особый интерес представляют ФС, обладающие способностью не только быстро накапливаться в опухолях, но и с высокой скоростью распадаться или выводиться. Со временем, как это принято в химиотерапии опухолей, будет создан банк препаратов адресного спектра применения, адаптированных к определенным нозологическим и гистологическим формам рака.

В результате анализа большого объема экспериментальных и клинических материалов были сформулированы основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору. Прежде всего, это:

• низкая темновая и световая токсичность в терапевтических дозах;

• высокая селективность накопления в тканях злокачественных новообразований и быстрое выведение ФС из кожи и эпителиальной ткани;

• интенсивное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК-диапазоны);

• оптимум между величинами квантового выхода флуоресценции и квантового выхода интерконверсии, второй из которых определяет способность ФС к генерации синглетного кислорода;

• высокий квантовый выход синглетного кислорода в условиях in vivo;

• доступность получения или синтеза, однородный химический состав;

• хорошая растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;

• стабильность при световом воздействии и хранении.

Одним из наиболее перспективных красителей являются фталоцианины. Вследствие своей химической природы, они обладают рядом преимуществ [15]:

- относительно простая и дешевая технология производства;

- химическая стабильность и воспроизводимость состава;

- высокие квантовые выходы 0.4 - 0.6) и величина экстинкции (с > 100000), определяющие эффективность фотодинамического воздействия в красной области спектра;

- интенсивный максимум поглощения в длинноволновой части спектра (Хтах > 670 нм), то есть в районе большей световой проницаемости тканей.

Фотосенсибилизаторы для красной и ближней ИК-области спектра позволяют увеличить эффективность ФДТ благодаря возможности излечивать более глубоко локализованные опухоли. В связи с этим, разработка нового отечественного препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина (Хтах = 685 нм) в качестве фотосенсибилизатора для ФДТ опухолей различных локализаций представляет большой интерес. Фталосенс, обладая достоинствами фотосенса, позволяет существенно снизить используемую для ФДТ дозу и тем самым уменьшить нежелательные побочные эффекты.

Цель исследования

Целью настоящей работы является разработка и изучение in vivo нового фотосенсибилизатора на основе безметального сульфофталоцианина.

Задачи исследования

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать лекарственную и инъекционную формы нового препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина.

2. Изучить биораспределение препарата «Фталосенс-лио» в органах и тканях интактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза.

3. Отработать оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на модели лимфолейкоза Р388.

4. Изучить противоопухолевую активность препарата «Фталосенс-лио» у животных с опухолями различного гистогенеза в оптимальных условиях.

5. Оценить влияние ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» на метастатическую активность опухоли Льюиса.

6. Изучить переносимость препарата «Фталосенс-лио»

7. Оценить кожную фоточувствительность препарата «Фталосенс-лио» на интактных животных.

8. Провести сравнительный анализ нового препарата и официнального препарата «Фотосенс».

Научная новизна

• Экспериментально обоснованы и раскрыты возможности применения нового фотосенсибилизатора «Фталосенс-лио» и проведено его доклиническое изучение.

• Изучено биораспределение фталосенса в нормальных и опухолевых тканях животных.

• Отработаны оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом

Фталосенс-лио» в эксперименте на животных с различными опухолями; доказана эффективность ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» для опухолей различного гистогенеза.

• Проведено изучение «острой», «хронической» токсичности и кожной фототоксичности препарата «Фталосенс-лио» на мелких лабораторных животных; показано, что препарат относится к нетоксичным лекарственным средствам.

Практическая значимость

• Разработано новое лекарственное средство для ФДТ рака -фотосенсибилизатор «Фталосенс-лио» на основе сульфированного безметального фталоцианина в виде лиофилизата, предложена инъекционная форма препарата - 0,02% раствор препарата «Фталосенс-лио» в физиологическом растворе. Проведено всестороннее изучение нового препарата в сравнении с официнальным препаратом «Фотосенс».

• На животных с опухолью определены оптимальные условия проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» (дозы препарата, плотность энергии, интервалы между введением препарата и облучением).

• На основании изучения безвредности препарата, определены мишени токсического воздействия и стартовые дозы для изучения препарата на I фазе клинических испытаний.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных журналах.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения «Модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им. П.А.Герцена, Росмедтехнологий»; на следующих форумах и международных конгрессах: Third Congress of the European Society for Photobiology Eleventh

International Congress on Photobiology (Granada, Spain 1999); 9th Congress of the

European Society for Photobiology (Lillehammer, Norway 2001); III съезде th — фотобиологов России (Воронеж, Россия 2001), 9 World Congress of The

International Photodynamic Association, (Miyazaki, Japan 2003); Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» в рамках

1-ой Международной медицинской специализированной выставки

Медицина 2005», (Москва 2005); IV съезде фотобиологов России (Саратов,

Россия 2005); на II, III, IV, V Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, Россия 2003, 2004, 2005, 2007); 1 Ith

World Congress of The International Photodynamic Association, (Shanghai, China

2007).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 184 публикации отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 30 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Разработана лекарственная и инъекционная формы нового препарата «Фталосенс-лио» на основе безметального сульфофталоцианина; в качестве лекарственной формы выбрана лиофилизированная форма, а в качестве инфузионной формы - 0.02 % раствор препарата «Фталосенс-лио» в физиологическом растворе.

2. Препарат «Фталосенс-лио» (флуоресцирующая форма) быстро накапливается в органах и тканях животных; флуоресцентный анализ косвенно свидетельствует, что основной путь выведения фталосенса из организма животных происходит через почки. Величина регистрируемой экзогенной флуоресценции прямопропорциональна дозе препарата.

3. Препарат «Фталосенс-лио» (флуоресцирующая форма) накапливается в тканях опухолей различного гистогенеза (Р388, С26, LLC, S37 и В16) и в течение 4 часов в них удерживается; наибольший флуоресцентный контраст опухоль/кожа и опухоль/мышца достигает через 30 минут - 4 часа после его введения и составляет 3.5 - 5.0 усл.ед. и 2.0 - 4.0 усл.ед., соответственно.

4. Оптимальными условиями проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» для мышей являются: доза 0.25 - 0.5 мг/кг, интервал между введением препарата и облучением 0.5 - 4 часа, плотность энергии 270 Дж/см2.

5. Препарат «Фталосенс-лио» обладает высокой фотодинамической противоопухолевой активностью у животных с опухолями различного гистогенеза (Р388, С26, LLC, S37 и В16) в оптимальных условиях (0.5 мг/кг,

О

At 2 часа, 270 Дж/см ). В зависимости от опухолевой модели ТРО составляет 80-100%, УПЖ - 31-57%, КИ - 33-100%

6. Противоопухолевая эффективность препарата «Фталосенс-лио» превосходит эффективность препарата «Фотосенс» при использовании оптимальных режимов проведения ФДТ. Терапевтическая доза препарата «Фталосенс-лио» в 5 - 8 раз меньше, чем препарата «Фотосенс».

7. ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио» влияет на метастатическую активность опухоли LLC, тормозя развитие метастазов на 25.5±3.5 %.

8. Максимально переносимая доза препарата «Фталосенс-лио» для животных (100 мг/кг - мыши) превышает рекомендованную терапевтическую дозу для человека (0.05 мг/кг) в 2000 раз, что позволяют отнести препарат к не токсичным лекарственным средствам.

9. Фотоповреждение кожи через 7 суток после введения препаратов в терапевтических дозах для фталосенса ниже, чем для фотосенса. Время сохранения отека при использовании фталосенса в 1.6 - 2.2 раза меньше, чем - фотосенса.

114

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена разработке и изучению в системе in vivo нового фотосенсибилизатора на основе безметального сульфофталоцианина, получившего название «Фталосенс».

На основании стандартной субстанции разработан препарат «Фталосенс-лио» и предложена его инфузионная форма - 0.02% раствор препарата в изотоническом (0.9%) растворе хлористого натрия.

Методом локальной флуоресцентной спектроскопии изучено биораспределение препарата «Фталосенс-лио» в органах и тканях интактных мышей в интервале от 5 секунд до 6 месяцев в зависимости от дозы препарата и в тканях мышей с опухолями различного генеза в интервале от 5 секунд до 72 часов в терапевтической дозе 0.5 мг/кг. Исследование проведено в сравнении с препаратом «Фотосенс» - его официальным аналогом. Установлено, что:

- при снижении дозы препаратов, снижается их ФН во всех органах и тканях, что приводит к сокращению срока циркуляции сенсибилизаторов в организме животного;

- фталосенс в течение 15 минут поступает во внутренние органы и удерживается в них в течение 4-х часов. Флуоресцентный анализ косвенно свидетельствует, что основной путь элиминирования препарата из организма животных происходит через почки с мочой;

- фотосенс в течение 4 часов накапливается во внутренних органах и выводится с различной скоростью. Флуоресцентный анализ косвенно свидетельствует, что основной путь элиминирования препарата из организма животных происходит через печень с желчью;

- фталосенс поступает в ткани организма в течение 5 минут и удерживается в коже в течение суток, мышце - 4 часа; в терапевтической дозе мономерная форма препарата сохраняется до 1 месяца;

- фотосенс в течение часа поступает в ткани организма и удерживается в них в течение 4 часов; мономерная форма препарата в ТД сохраняется в коже более 6 месяцев:

- все изученные опухоли (Р388, С26, LLC, S37 и В16) накапливают фталосенс в разной степени с высокой флуоресцентной контрастностью в течение 30 минут и сохраняют его на высоком уровне в течение 4 часов; наибольшая флуоресцентная контрастность препарата наблюдается в интервале 30 минут - 4 часа;

На животных с лимфолейкозом Р388 отобрана оптимальная схема проведения ФДТ с препаратом «Фталосенс-лио»: доза препарата 0.25 - 1.0 мг/кг; интервал между введением препарата и облучением 30 минут - 4 часа, л плотность энергии 270 Дж/см (лампа АТО-1).

Оптимальная схема использования фотосенса - доза препарата 2.0 - 5.0 л мг/кг; интервале At 4 - 24 часа, плотность энергии 270 Дж/см (лампа АТО 1).

У животных с перевивными опухолями различного генеза (Р388, С26, LLC, S37 и В16) установлена высокая фотоиндуцированная активность препарата «Фталосенс-лио» в ТД; ТРО составляет 80-100%, УПЖ - 31-57% и КИ - 33-100% в зависимости от опухолевой модели.

ФДТ с фталосенсом в терапевтической дозе 0.5 мг/кг влияет на метастатическую активность опухоли LLC, тормозя развитие метастазов на 25.5±3.5%. Кроме этого при внутримышечной инокуляции опухоли LLC наблюдается ТРО от 29 до 41 %.

Проведено изучение общетоксического действия препарата «Фталосенс-лио». Установлено, что концентрация раствора фталосенса для внутривенного введения не должна превышать 2 мг/мл (0,2% раствор). Причиной смерти мышей от однократного внутривенного введения препарата «Фталосенс-лио» в летальных дозах является острая сердечнососудистая недостаточность.

Максимально переносимая доза препарата «Фталосенс-лио» для животных (100 мг/кг - мыши, 40 мг/кг - красы, 20 мг/кг - кролики) на 3-4 порядка превышает терапевтическую дозу, рекомендованную для человека (0.02 0.05 мг/кг), что позволяют отнести препарат «Фталосенс-лио» к не токсичным препаратам.

Разработан простой экономичный метод оценки кожной фоточувствительности, позволяющий в короткие сроки определить фототоксичность фотосенсибилизаторов в коже.

Сравнение кожной фоточувствительности препаратов «Фталосенс-лио» и «Фотосенс» в ТД (0.5 - 1.0 мг/кг и 2.0 - 5.0 мг/кг соответственно) показало, что фотоповреждение кожи во время сеанса ФДТ одинаково. После облучения через 7 суток после ведения препаратов время сохранения отека снижалось соответственно в 5.9 - 4.5 раза (фталосенс) и 2.5 - 1.6 раза (фотосенс).

Таким образом, все изученные опухоли (Р388, С26, LLC, S37 и В16) накапливают фталосенс с селективностью от 1.3 до 5.2 усл. ед. в интервале 30 минут - 4 часа. Разработанный препарат «Фталосенс-лио» показал высокую противоопухолевую активность у животных с перевивными опухолями различного генеза. Фталосенс значительно превосходит по своей активности фотосенс (рисунки 4.8 и 4.9) и может быть рекомендован для клинического изучения.

112