Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Способность мононуклеиновых фагоцитов и эндотелиальных клеток отвечать секрецией фактора некроза опухолей-а на действие атерогенных факторов

На правах рукописи

_ 9 И10/1

НИКИТИНА Екатерина Юрьевна

СПОСОБНОСТЬ МОНОНУКЛЕЛРНЫХ ФАГОЦИТОВ И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ОТВЕЧАТЬ СЕКРЕЦИЕЙ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-а НА ДЕЙСТВИЕ АТЕРОГЕННЫХ ФАКТОРОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор И.С.Фрсйдлин.

Официальные оппоненты. доктор медицинских наук А.С.Симбирцев, доктор биологических наук, профессор К.А.Самойлова.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера Минздравмедпрома РФ.

Защита диссертации состоится ". 7. .." .Ч^.^^ТХЧЧ! г.

в /.-Р. часов на заседании Диссертационного совета Д.001.23.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ РАМН. Автореферат разослан ". . 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.А.Бурова.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность.

В последнее время атерогенез рассматривается многими исследователями как аутоиммунный процесс, важнейшую патогенетическую роль в котором играют иммунные комплексы (ИК), содержащие липспротеины (ЛП). Вовлечение в процесс провоспалительных цитокинов способствует развитию в артериальной стенке событий, характерных для воспаления. Одним из таких провоспалительных цитокинов является туморнекротизирующий фактор(ТНФ)-а, который в виде диффузных и гранулярных депозитов постоянно обнаруживается в пораженных атеросклерозом участках стенки сосудов. Не вызывают сомнения причастность ТНФ-а к рекрутированию клеток в места атеросклеротических поражений и к индукции секреции других провоспалительных цитокинов, его вмешательство в гемостаз и в метаболизм липидов и углеводов. Однако, много неясного остается в вопросе о клетках-продуцентах ТНФ-а и факторах, контролирующих его продукцию в очагах атерогенеза.

На ранних стадиях атерогенеза в события, разворачивающиеся в просвете и стенке сосуда, вовлекаются моноциты/макрофаги и эндотелиальные клетки (ЭК). II те, и другие клетки имеют рецепторы к ТНФ-а. Моноциты/макрофаги считаются наиболее активными его продуцентами. Однако, закономерности продукции ТНФ-а в микроокружении в стенке сосудов не изучены. Весьма актуальной остается задача сравнительного изучения интенсивности продукции ТНФ-а разными по степени зрелости мононуклеарными фагоцитами. В связи с тем, что моноцит крови претерпевает существенные функциональные изменения в процессах адгезии к эндотелию, трансэндотелиальной миграции, дифференцировки в макрофаги и трансформации в пенистые клетки, первостепенное значение приобретает вопрос о том, как меняется способность к продукции ТНФ-а у клеток моноцитарного ряда в ходе дифференцировки.

Литературные сведения об участии отдельных атерогенных компонентов сыворотки крови в индукции синтеза цитокинов крайне противоречивы. В связи с этим не утратила актуальности задача сравнительного изучения способности нативных, окисленных (ок) ЛП низкой плотности (ЛПНП) и содержащих ЛП ИК индуцировать продукцию ТНФ-а разными клетками-участниками атерогенеза.

Очевидно, что продукция цитокинов в очагах атерогенеза происходит в условиях сложных межклеточных взаимодействий, в том числе, взаимодействия

моноцитов/макрофагов с ЭК. Кокультивирование этих клеток для моделирования такого взаимодействия представляется достаточно актуальной задачей. Изучение выработки ТНФ-а, индуцированной атерогенными компонентами сыворотки крови, с использованием кокультуры эндотелиальных и моноцитарных клеток позволяет с большей достоверностью судить о протекающих in vivo процессах.

Цель исследования.

Изучить способность клеток моноцитарных линий разной степени зрелости и эндотелиальных клеток продуцировать туморнекротизирующий фактор-a в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.

Задачи исследования:

1. разработать оптимальные экспериментальные условия индукции секреции ТНФ-а клетками перевиваемых моноцитарных линий P388Di, ТНР-1, U937 и HL-60 и ЭК при использовании в качестве индуктора форболмиристатацетата (ФМА);

2. используя разработанные экспериментальные модели, изучить способность клеток перевиваемых моноцитарных линий разной степени зрелости и ЭК продуцировать ТНФ-а в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови;

3. провести сравнительное изучение способности клеток разных перевиваемых моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а до и после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом;

4. провести сравнительное изучение способности различных атерогенных компонентов сыворотки крови вызывать продукцию ТНФ-а у клеток разных перевиваемых моноцитарных линий до и после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом;

5. разработать оптимальные экспериментальные условия кокультивирования ЭК с перевиваемыми клетками одной из моноцитарных линий;

6. используя разработанную экспериментальную модельную систему, изучить продукцию ТНФ-а в кокультуре ЭК и клеток перевиваемой моноцитарной линии в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Способность продуцировать ТНФ-а в ответ на действие ФМА в разной степени выражена у клеток разных перевиваемых моноцитарных линий: в наибольшей степени - у клеток линий ТНР-1, P388Di и HL-60, в наименьшей - у клеток линии U937.

2. Искусственные растворимые ИК, содержащие ЛПНП, в отличие от свободных ЛПНП, индуцируют продукцию ТНФ-а клетками перевиваемых

моноцитарных линий: на ИК, содержащие нативные ЛПНП, отвечают продукцией ТНФ-а клетки линий Р3880|, ТНР-1 и НЬ-бО, а на ИК, содержащие окЛПНП, -клетки линии НЬ-бО.

3. В ходе дифференцировки повышается способность исходно низкодиффе-ренцированных клеток перевиваемых моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а в ответ на действие свободных нативных и окисленных ЛПНП и содержащих их ИК.

4. В условиях кокультивирования ЭК и клеток линии НЬ-60 ТНФ-а обнаруживается в инкубационной среде после воздействия нативными ЛПНП, но не содержащими их ИК.

Научная новизна работы.

Впервые проведено сравнительное изучение искусственных ИК, содержащих нативные или окисленные ЛПНП, в качестве индукторов секреции ТНФ-а клетками перевиваемых моноцитарных линий.

Впервые проверена способность первичной культуры ЭК продуцировать ТНФ-а в ответ на действие широкого спектра агентов, в том числе атерогенных компонентов сыворотки крови.

Впервые выявлены изменения способности клеток моноцитарных линий разной степени зрелости после индукции их дифференцировки форболмиристатацетатом реагировать продукцией ТНФ-а на действие атерогенных компонентов сыворотки крови.

Разработана экспериментальная модельная система, позволяющая оценить продукцию ТНФ-а в кокультуре ЭК и клеток моноцитарной линии в ответ на действие атерогенных компонентов сыворотки крови и вклад отдельных типов клеток в этот ответ.

Впервые получены экспериментальные доказательства различного реагирования на действие атерогенных факторов клеток моноцитарного ряда, в зависимости от их степени дифференцировки и микроокружения.

Теоретическое и практическое значение результатов исследования.

Результаты предпринятых исследований позволяют уточнить роль мононуклеарных фагоцитов, ЭК и их взаимодействия в продукции ТНФ-а в ответ на действие различных атерогенных компонентов сыворотки крови. Экспериментальные данные о способности содержащих ЛП ИК индуцировать продукцию ТНФ-а мононуклеарными фагоцитами свидетельствуют в пользу ранее постулированной аутоиммунной теории атерогенеза.

Выявленные характеристики способности клеток разных моноцитарных линий продуцировать ТНФ-а в ответ на действие стандартного для них индуктора ФМА и атерогенных компонентов сыворотки крови могут быть использованы для пополнения банка данных, касающихся перевиваемых линий Р3880ь ТНР-1, Ш37 и НЫ50.

Оптимизация статистической обработки результатов биологического тестирования ТНФ-а может быть использована в аналогичных исследованиях для повышения надежности количественной оценки ТНФ-а.

Разработанные варианты кокультивирования ЭК и мононуклеарных фагоцитов могут быть использованы при изучении продукции разных цитокинов под действием атерогенных и антиатерогенных факторов, в том числе, лечебных препаратов. Замена перевиваемой клеточной линии на первичную культуру человеческих моноцитов позволит применить эту модельную систему при углубленном обследовании больных атеросклерозом.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены в НИИЭМ РАМН (1993, 1995 годы), на заседании Санкт-Петербургского общества иммунологов (1994 год), на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз", посвященном 110-летию со дня рождения акад. Н.Н.Аничкова (Санкт-Петербург, 1995 год).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 11 ноября 1996 года.

Объем и структура диссертации.

Работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение" и выводов. Объем работы составляет 137 страниц машинописного текста, включая 21 таблицу и 8 рисунков, 4 из которых представляют собой фотографии. Список литературы состоит из 240 наименований, из них 31 работа принадлежит отечественным авторам и 209 - зарубежным.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена с использованием первичной культуры ЭК и клеток перевиваемых линий Р3880], ТНР-1, Ш37, НЬ-60 и 1.929.

ЭК выделяли из вены человеческого пупочного канатика [ДаОе Е.А. еЬ а1., 1973] путем инкубации с 0,15% раствором нейтральной протеазы — диспазы при +37°С в течение 40 минут с последующей перфузией раствором Хенкса. Собранные

клетки (в среднем, 5х105-8х105 клеток с одной вены) отмывали и культивировали на желатиновой подложке в среде КРМ1 1640, содержащей Ь-глютамин (конечная концентрация 2 шМ), ¡00 ЕД/мл натриевой соли бензилпенициллина, 0,! мг/мл сульфата стрептомицина, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), НЕРЕБ (конечная концентрация 20 иМ), пируват натрия (конечная концентрация 1 тМ), 5 ЕД/мл гепарина, 25 мкг/мл (по белку) ростового фактора для эндотелиальных клеток, любезно предоставленного сотрудником Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра (Москва), к.м.н. Ю.А.Романовым, за что автор приносит ему свою искреннюю благодарность. В работе использовали ЭК второго-третьего пассажа. Посевная доза в опытах - 4х 105 клеток (в 2 мл) на лунку.

Клетки линии Р388Б| представляют собой мышиные макрофагоподобные клетки, ТНР-1 - человеческие моноцитоподобные клетки, Ш37 - человеческие монобластоидные клетки, НЬ-60 - человеческие промиелоцитарные клетки. Все они условно объединены общим названием "моноцитарные" и культивировались в сходных условиях: на среде ИРМ1 1640 с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 50 мкг/мл сульфата гентамицина, Ь-глютамина (конечная концентрация 2 шМ) и НЕРЕБ (конечная концентрация 20 тМ). Основные относящиеся к данной работе характеристики перечисленных клеток представлены в табл. 1.

В качестве возможных индукторов образования ТНФ-а использовали нативные ЛПНП, окЛПНП или содержащие их искусственные ИК. Выделение ЛПНП из пулированной донорской плазмы методом последовательного ультрацентрифугирования в солевой плотности [Ьтб^еп Р.Т. й а1., 1972], их Си2+-индуцированное окисление, приготовление ИК и измерение содержания белка в культуре клеток Р388В1 [МагклуеН М.А.К.. е1 а!., 1978] любезно осуществляли под руководством д.м.н. А.Д.Денисенко сотрудники отдела биохимии Института экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург) к.б.н. А.Г.Виноградов, Г.А.Чураков и К.В.Бондарь, за что автор приносит им свою глубокую благодарность. Для приготовления растворимых ИК в качестве антигена использовали нативные или окисленные ЛПНП, а в качестве антитела - иммуноглобулины в антисыворотки кроликов, иммунизированных человеческим очищенным аполипопротеином В. Концентрации ЛПНП и ИК приводятся в соответствии с содержанием в них белка ЛП. В качестве стандартного индуктора синтеза ТНФ-а моноцитами/макрофагами, а также индуктора дифференцировки использовали ФМА. В ходе опытов клетки культивировали на среде, содержащей

Таблица 1.

Некоторые характеристики ЭК и клеток линий P388Di, ТНР-1, U937 и HL-60 (по данным литературы).

клетки характеристики ЭК P388D, ТНР-1 U937 HL-60

FcR + + + + +

CRI + + + + +

ScR + + +* ? ?

способность к продукции ТНФ-а ± + + ± +

Примечание: ScR - скевенджер-рецепторы, FcR - Fc-рецепторы, CRI - СЗЬ-рецеп-торы, + - наличие, ? - нет данных, ± - данные противоречивы, * - после индукции дифференцировки.

делипидированную ЭТС. Посевная доза в опытах была 1x10® клеток (в 2 мл) на лунку. Жизнеспособность клеток суспензионных культур контролировали путем окрашивания мертвых клеток 0,2% раствором трипанового синего.

Содержание ТНФ-а оценивали в инкубационных средах и культурах клеток.

В инкубационных средах ТНФ-а определяли, главным образом, с помощью биологического тсста на их цитотоксичность, используя иммуноферментный анализ (ИФА) в качестве дополнительного и уточняющего метода. В биологическом тесте клетками-мишенями служили мышиные фибробластоподобные клетки линии Ь929, инкубируемые в присутствии 5 мкг/мл актиномицина Д [ВаагесЬ МЛ. е; а]., 1991]. О цитотоксическом действии инкубационных сред судили по степени снижения оптической плотности. Индекс цитотоксичности (процент лизированных клеток) рассчитывали по формуле:

ОПк-ОПо

ИЦ =-х 100%

ОПк

где ИЦ - индекс цитотоксичности, ОПк - среднее значение оптической плотности в контрольных лунках, ОПо - среднее значение оптической плотности в опытных лунках. О количественном содержании ТНФ-а в инкубационных средах судили по последнему разведению инкубационной среды, еще вызывающему лизис 50% клеток, соответствующий 1 ЕД активности ТНФ-а. В случае меньшего ИЦ содержание

ТНФ-а оценивали при помощи основанной на результатах тестирования препарата рекомбинантного человеческого ТНФ-а ("Predicta", Cambridge, USA) формулы:

х = ехр(-4,26+0,059хИЦ+5,06/ИЦ) где х - количество ТНФ-а в 100 мкл тестируемого образца, выраженное в единицах активности, каждая из которых в данном случае равна 60 пг. Автор искренне признателен с.нх. кафедры урологии Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им.акад.И.П.Павлова к.м.н. В.В.Козлову за помощь в разработке данного подхода к оценке результатов биологического тестирования, позволившего эффективно использовать высокую чувствительность этого теста. Выявление ТНФ-а было подтверждено выборочной проверкой инкубационных сред на нейтрализацию их цитотоксической активности моноклокальными антителами к ТНФ-а [Petyovka N. et ai., 1995].

Для ИФА инкубационных сред на выявление ТНФ-а использовали, в соответствии с приложенной инструкцией, набор реагентов "ProCon TNFa" (Институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург).

С целью визуальной оценки содержания в клетках ТНФ-a применяемый морфологами для изучения срезов тканей ИФА in situ [Kuhlmann W.D., 1984] был адаптирован к исследованию культур клеток. Автор признателен за помощь в этой работе сотруднику лаборатории атеросклероза им.Н.Н.Аничкова НИИЭМ РАМН д.м.н. П.В.Пигаревскому. При выполнении иммуноцитохимической методики использовали кроличью антисыворотку к человеческому ТНФ-а ("PharMingen", Sweden) и козлиную антикроличью сыворотку, меченную пероксидазой хрена ('"Sigma*', USA), любезно предоставленные заведующим лаборатории атеросклероза им.Н.Н.Аничкова НИИЭМ РАМН д.м.н. В.А.Нагорневым. Препараты окрашивали гематоксилином и заключали в глицерин желатина. Содержание ТНФ-а оценивали при помощи иммерсионной микроскопии пол)тсоличественным методом.

Для оценки метаболических процессов в клетках применяли окраску лизосом по методу Т.Н.Хавкина и И.С.Фрейдлин (1977) при помощи люминесцентного красителя акридинового оранжевого и окраску липидов по методу В.Д.Кравцова (1980) при помощи люминофора 3-метоксибензантрона. По результатам люминесцентной микроскопии препаратов рассчитывали суммарный индекс люминесценции (СИЛ), как показатель насыщенности клеток лизосомами или липидами, и сравнительный цитохимический показатель - отношение СИЛ лизосом к СИЛ липидов.

Статистическую обработку материала выполняли на ПЭВМ 486DX4-100 с использованием стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statgraphics v.7.0, Statistica for Windows v.5.0 и других). Применяли общеупотребительные методы параметрической и непараметрической статистики, включающие в себя вычисление средних величин, среднеквадратического отклонения, доверительных интервалов, использование t-критерия Стыодента при сравнении групп, а также подходы, основанные на методах кластерного анализа. Предварительный статистический анализ позволил положительно оценить воспроизводимость результатов биологического теста и методическую корректность его выполнения. Введение оценки Хампеля (Н-оценки) помогло значительно повысить достоверность имеющихся результатов без их искажения [Афифи А., Эйзен С., 1982].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основными участниками начальных событий атеросклероза являются эндотелиальные клетки и клетки крови, из которых наибольший интерес представляют моноциты, так как в тканях стенки сосуда они способны превращаться в патогномоничные для атеросклероза пенистые клетки. В связи с этим были поставлены следующие вопросы: как меняется способность к продукции ТНФ-а под влиянием атерогенных агентов у клеток моноцитарного ряда в ходе их дифференцировки и в присутствии зндотелиальных клеток. Для решения первого вопроса проводили эксперименты на клетках моноцитарных перевиваемых линий разной степени дифференцированное™. Для решения второго вопроса использовали различные варианты совместного культивирования (кокультивирования) клеток моноцитарной линии и зндотелиальных клеток вены пупочного канатика.

Ответ клеток моноцитарных линий продукцией ТНФ-а оценивали после их 24-часовой инкубации с ФМА в концентрациях 5, 10, 20 или 100 нг/мл (Рис.1). Клетки всех перечисленных выше линий продуцировали ТНФ-а (от 140 до 900 пг/мл) под действием стандартного для моноцитов/макрофагов индуктора. Причиной противоречивости литературных сведений о продукции 'ГНФ-а клетками линии U937 (несмотря на выявление индукции в них гена ТНФ-а) могла явиться ограниченность возможностей ИФА, не позволяющего обнаружить присутствие в инкубационных средах ТНФ-а в низких концентрациях. Дозозависимость эффекта ФМА

ИЦ 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Р3880.

11937 линии клеток

НЬбО

□ без индуктора ЕЗ 5 нг/мл ФМА И10 нг/мл ФМА Ш20 нг/мл ФМА

□ 100 нг/мл ФМА

Рис. 1. Продукция ТНФ-а клетками линий Р3880г, Ш37 и НЬ-60: спонтанная и индуцированная 24-часовой инкубацией с ФМА. Достоверность отличий от соответствующих контрольных уровней р<0,01.

наблюдалась только у клеток НЬ-60 при концентрациях ФМА 5 и 20 нг/мл (1=4,55; р<0,01). Это позволило избрать для дальнейшей работы концентрацию ФМА 10 нг/мл.

Продукцию ТНФ-а клетками линий Р3880], ТНР-1, и937 и НЬ-60 также оценивали при сроке инкубации с ФМА 6 часов (Рис.2). У клеток 11937 уровень продукции ТНФ-а был достоверно выше (1=2,31; р<0,05) через 24 часа инкубации, что можно объяснить более поздним достижением пика продукции ТНФ-а этими клетками, в сравнении с клетками Р3880: и НЬ-60. В дальнейшем использовали срок инкубации с ФМА 6 часов, исходя из его минимальной достаточности, позволяющей исключить токсические эффекты препарата.

Сравнительный анализ способности клеток Р388В|, ТНР-1, Ш37 и НЬ-60 продуцировать ТНФ-а в ответ на действие ФМА показал, что в наибольшей степени она выражена у клеток ТНР-1 и клеток Р388П|. Клетки НЬ-60 имеют достоверно более низкий уровень продукции ТНФ-а как через 6 часов инкубации со стандартным индуктором ФМА (при сравнении с клетками Р388Э| - 1=2,45, р<0,05; при сравнении с клетками ТНР-1 - 1=4,20, р<0,001), так и через 24 часа (при сравнении с клетками Р38801 - 1=3,56, р<0,01). Наименьшую способность к продукции ТНФ-а при обоих сроках инкубации проявили клетки Ш37 (р<0,001 -при сравнении с клетками Р388В1 и НЬ-60 через 6 часов инкубации с ФМА, р<0,0001 - при сравнении с клетками Р3880[ через 24 часа инкубации с ФМА). Такое распределение клеток разных моноцитарных линий по уровням индуцированной ФМА продукции ТНФ-а не соответствует их распределению по степени дифференцированности.

Вместе с тем. спонтанная продукция ТНФ-а наблюдалась только у наиболее дифференцированных клеток (Р388В|). После нндукции дифференцнровки форболмиристатацетатом исходно менее дифференцированные клетки ТНР-1 и НЬ-60 начинали спонтанно секретировать небольшие количества ТНФ-а (достоверность различий до и после преинкубации с ФМА - р<0,01). С учетом сроков инкубации эту продукцию ТНФ-а можно трактовать как остаточный признак предшествовавшей активации форболмиристатацетатом. Вместе с тем, нельзя исключить, что достигнутая при помощи ФМА дифференцировка клеток линий ТНР-1 и НЬ-60 изменила свойства этих клеток таким образом, что они приобрели способность отвечать продукцией ТНФ-а на некоторые стимулы.

Характеристика способности клеток перевиваемых моноцитарных линий

лЛши

11937

н—с

□ без индуктора ШФМА

ИИК, содержащие нативные ЛПНП Ш ИК, содержащие окЛПНП

§

,4

Н 1.-60

пинии клеток

Рис. 2. Продукция ТНФ-а клетками линий Р388Э|, и937 и НЬ-60: спонтанная и индуцированная 6-часовой инкубацией

с ФМА или ИК, содержащими нативные или окЛПНП. £

- достоверность отличия от соответствующего контрольного уровня р<0,0001.

разной степени дифференцировки к выработке ТНФ-а позволила далее использовать эти линии при изучении влияния нативных и окисленных ЛПНП и содержащих их И К на продукцию клетками ТНФ-а.

Свободные нативные и окисленные ЛПНП в широком диапазоне концентраций (2-200 мкг/мл ЛПНП) не вызывали секреции ТНФ-а клетками Р388Б1 при инкубации в течение 24 часов. Концентрация окЛПНП 200 мкг/мл приводила к снижению (1=2,33; р<0,05) уровня ТНФ-а в инкубационной среде этих клеток, в сравнении с контрольным уровнем. Экспозиция нативных или окисленных ЛПНП с рекомбинантным препаратом ТНФ-а в течение 30 минут или 6 часов не вызывала падения биологической активности последнего. В литературе имеются сведения, что ЛПНП способны на транскрипционном уровне подавлять продукцию ТНФ-а. Однако, снижение содержания белка в культуре клеток Р3880ь инкубированных в присутствии 200 мкг/мл окЛПНП свидетельствует о том, что описанное выше понижение уровня спонтанной продукции ТНФ-а скорее связано с токсическим эффектом окЛПНП на клетки. Такое заключение не противоречит литературным данным по вопросу влияния ЛПНП на клетки. Далее в работе преимущественно использовали концентрацию ЛПНП 50 мкг/мл. При 6-часовой инкубации нативные и окисленные ЛПНП в этой концентрации также не оказывали ТНФ-а-инду-цирующего действия на клетки линий Р388Б|, ТНР-1, Ш37 и НЬ-60. Воздействие окЛПНП на клетки Р3880/ приводило не только к накоплению в них липидных включений, но и к снижению содержания лизосом. Снижение содержания лизосом уже при концентрации окЛПНП 8 мкг/мл может быть следствием повышенного расхода лизосомальных ферментов или симптомом снижения метаболической активности клеток.

В отличие от свободных ЛПНП, содержащие их ПК (50 мкг/мл, инкубация 6 часов) проявили способность индуцировать продукцию ТНФ-а клетками всех указанных линий (Рис. 2). Имеющиеся в литературе единичные сведения об индукции синтеза ТНФ-а содержащими ЛПНП ИК, касаются макрофагов, полученных из моноцитов человеческой крови. Нами показано, что клетки линий Р388В1, ТНР-1 и НЬ-60 также отвечают продукцией ТНФ-а на действие ИК, содержащими нативные ЛПНП. Из них наивысший уровень секреции ТНФ-а выявлен у клеток Р388П| (110-130 пг/мл), достоверно меньший и сходный (30-40 пг/мл) - у клеток ТНР-1 и НЬ-60.

О способности ИК, содержащих окЛПНП, индуцировать продукцию ТНФ-а литературных данных не было обнаружено. Из клеток перечисленных выше линий

только клетки линии НЬ-60 проявили способность к секреции ТНФ-а (32-36 пг/мл) в ответ на действие содержащими окЛПНП ИК. Уровень этой секреции не превышал таковой при действии ИК, содержащих нативные ЛПНП.

Продукция ТНФ-а клетками моноцитарных линий в ответ на действие ИК, содержащих нативные или окисленные ЛПНП. была значительно ниже продукции, индуцированной ФМА (во всех случаях р<0,0001), и существенно ниже ожидаемой, исходя из литературных данных. Повышение дозы индукторов до 100 мкг/мл не изменило уровень продукции ТНФ-а. Возможно, эта продукция имеет значение для образования депозитов ТНФ-а в пораженной атеросклерозом стенке сосудов. Данные, полученные при воздействии свободными ЛПНП и содержащими ЛПНП ИК на преинкубированные с ФМА клетки существенно отличались от описанных выше (Табл. 2).

Для индукции дифференцировки в часть культур клеток ТНР-1, Ш37 и НЬ-60 вносили ФМА (10 нг/мл) на двое суток. Затем истощенную среду заменяли на свежую и клетки оставляли еще на сутки. В ходе дифференцировки замедлялась и прекращалась пролиферация клеток, менялась их морфология: клетки теряли мономорфность, приобретали псевдоподии и, прикрепляясь к дну планшетов, образовывали кластеры. Через трое суток со дня посева клеток к части из них на 6 часов добавляли 10 нг/мл ФМА или 50 мкг/мл нативных ЛПНП, окЛПНП или растворимых искусственных ИК, содержащих нативные или окисленные ЛПНП. Аналогичный эксперимент проводили с использованием высокодифференци-розанных клеток Р388В|.

После предобработки форболмиристатацетатом исходно низкодкфференци-рованные клетки ТНР-1 приобретали способность продуцировать ТНФ-а в ответ на действие свободных ЛПНП и ИК, содержащих окЛПНП, клетки Ьт937 и НЬ-60 - в ответ на действие свободных ЛПНП. Наиболее выраженную секрецию ТНФ-а (более 200 пг/мл) нативные и окисленные ЛПНП вызывали у клеток ТНР-1 (при сравнении с другими клетками р<0,01). У клеток, способных и без преинкубации с ФМА отвечать на действие содержащих ЛПНП ИК продукцией ТНФ-а, такой ответ усиливался. Предобработанные ФМА клетки Р388Й1 не реагировали секрецией ТНФ-а ни на воздействие свободными ЛПНП, ни содержащими ЛПНП ИК. Следует учитывать, что наблюдаемые различия могут быть обусловлены разной видовой принадлежностью упоминаемых клеточных линий.

Эти данные позволяют предположить, что наиболее активными продуцентами ТНФ-а в стенке пораженного атеросклерозом сосуда являются макрофаги, только

Таблица 2.

Изменение продукции ТНФ-а клетками линий Р38ГО|, ТНР-1, и937 и НЬ-60 после их преинкубации с ФМА: спонтанной и индуцированной ФМА, ЛГГНП или ИК, содержащими ЛПНП.

Линии клеток Динамика цитотоксичности супернатантов клеточных культур:

контрольных инкубированных в п рисутствии

ФМА нативных ЛПНП ИК, содержащих нативные ЛПНП окЛПНП ИК, содержащих окЛПНП

Р3880, « *** А 1 " А * 1 ""

ТНР-1 1 Т" ± а *** ! ± ±

и937 1 Г " 1

НЬ-60 1 *** ± т 1 *** !

'-. - без изменений; | - увеличение; - статистически достоверное увеличение; ^ - статистически достоверное снижение; ^ - появление.

* - в пределах контроля; при сравнении с контролем: ** - р<0,05; *** - р<0,01.

что образовавшиеся за счет дифференцировки из моноцитов крови. Так как рекрутирование моноцитов в атеросклеротическую стенку повышено, такие макрофаги представляют собой достаточно многочисленную популяцию, способную внести существенные изменения в цитокиновый баланс в стенке. В этой ситуации свободные ЛПНП (в том числе и нативные) могут играть значительную роль в качестве индукторов секреции ТНФ-а.

Касающиеся продукции ТНФ-а результаты, полученные на клетках моноцитарных линий, подтверждены выявлением расположенного внутриклеточно ТНФ-а. Количество богатых ТНФ-а клеток в культурах, подвергшихся воздействию атерогенных факторов или ФМА, положительно коррелировало с содержанием ТНФ-а в инкубационных средах этих клеток. При низком уровне секреции ТНФ-а в культуре преобладали клетки, содержащие небольшие скопления крупных гранул ТНФ-а. При высоком уровне секреции ТНФ-а в культуре наблюдалось наибольшее количество клеток, содержащих ТНФ-а в виде мелкодисперсных гранул, рассеянных по всей цитоплазме.

Литературные сведения о способности ЭК продуцировать ТНФ-а противоречивы. В наших экспериментах нативные ЛПНП (50 мкг/мл), содержащие их ИК (50 и 100 мкг/мл) и ФМА (10 нг/мл) не индуцировали секреции ТНФ-а человеческими ЭК вены пупочного канатика при экспозиции 6 (Рис. 3) и 24 часа. Более того, ТНФ-а не был выявлен иммуноцитохимически в ЭК, инкубированных в присутствии указанных агентов. Однако, следует учитывать, что реакция ЭК артериального русла на действие атерогенных факторов может отличаться от гакоЕой венозных ЭК.

Немногочисленные описанные в литературе попытки длительно кокультивировать различные клетки показали, что продукция цитокинов и молекул экстрацеллюлярного матрикса в условиях кокультивирования отличается от продукции тех же молекул раздельно культивируемыми клетками. Для воспроизведения условий межклеточной кооперации в атерогенезе и изучения ее влияния на продукцию ТНФ-а, была разработана модельная система, включающая ЭК и клетки моноцитарной линии, в качестве которой была выбрана линия НЬ-60, с учетом изложенных выше результатов сравнительного исследования характеристик различных суспензионных линий.

В части лунок с ЭК инкубационные среды заменяли на культуры клеток линии НЬ-б0. Далее проводились параллельные эксперименты как с изолированными культурами клеток, так и с кокультурами: в лунки вносили нативные ЛПНП

ИЦ 65

55 + 45 35 -25 15 5 -5 -15 -25 + -35

клетки НЬ-60

кокультура ЭК и клеток НЬ-60

□ без индуктора 0ФМА

Н нативные ЛПНП

ППИК, содержащие нативные ЛПНП

кокультура предобрабо-танных ЭК и клеток НЬ-60

кокультура ЭК и предобрабо-танных клеток НЬ-60

Рис. 3. Продукция ТНФ-а кокультивируемыми ЭК и клетками линии НЬ-60: спонтанная и индуцированная ФМА, нативными ЛПНП или И К, содержащими нативные ЛПНП.

(50 мкг/мл), содержащие их ИК (50 мкг/мл) или ФМА (10 нг/мл); в части лунок оставляли клетки для контроля. Через 2 часа инкубации часть ЭК и клеток линии НЬ-60, изолированно культивированных с перечисленными агентами, дважды отмывали средой без добавок и затем совмещали с интактными клетками, создавая кокультуры на базе тех клеток, которые до этого не подвергали воздействию индукторов. Инкубировали б часов: изолированно содержавшиеся клетки - от момента внесения индукторов, кокультивируемые - от момента создания кокультуры.

ТНФ-а в низких концентрациях был обнаружен в инкубационной среде кокультивируемых клеток после их инкубации с нативными ЛПНП или ФМА (23-27 пг/мл, при сравнении с контролем р<0,001), но не окЛПНП (Рис. 3). Значительно более высокие концентрации ТНФ-а присутствовали в среде кокультур после преинкубации клеток НЬ-60 (но не ЭК) с нативными ЛПНП и ФМА (36-57 пг/мл, при сравнении с вариантом без преинкубации р<0,01). Более низкое содержание ТНФ-а в инкубационнной среде при кокультивировании клеток линии НЬ-60 с ЭК в присутствии ФМА, чем при изолированном культивировании клеток НЬ-60, может быть результатом быстрого связывания ТНФ-а с соответствующими рецепторами на поверхности ЭК. Тем же может объясняться и тот факт, что ТНФ-а не удалось обнаружить в среде кокультивируемых клеток после воздействия на них содержащими нативные ЛПНП ИК. Преинкубация с ними клеток НЬ-60 показала, что присутствие ЭК не вызывает полной ингибиции продукции ТНФ-а, однако, не исключено, что в ответ на действие ИК, содержащих нативные ЛПНП, ЭК вырабатывают какие-то молекулы, супрессирующие продукцию ТНФ-а. Примененная нами техника кокультивирования требует дальнейшего совершенствования. Клетки перевиваемой линии НЬ-60 могут быть заменены моноцитами исследуемой крови, после чего данная модельная система может быть использована для изучения продукции клетками ТНФ-а и других цитокинов под влиянием атерогенных, антиатерогенных и иных факторов.

Результаты проведенного экспериментального исследования выявили способность ИК, содержащих как нативные, так и окисленные ЛПНП, индуцировать продукцию ТНФ-а. Показана зависимость секреторного ответа клеток на атерогенные стимулы от дифференцировки клеток под влиянием ФМА. Обнаружена способность свободных нативных и окисленных ЛПНП при определенных условиях индуцировать секрецию ТНФ-а мононуклеарными фагоцитами. Способность нативных ЛПНП и содержащих их ИК вызывать секрецию ТНФ-а

преинкубированными с ФМА клетками сопоставима со способностью ИК, содержащих ок ЛПНП.

Использование разработанных вариантов кокультивироваиия клеток наглядно показало преимущества такой модельной системы, позволяющей оценить взаимное влияние клеток при их совместном ответе на действие атерогенных факторов. Изучение продукции, секреции и рецепции цитокинов при таком подходе позволит в какой-то степени приблизить экспериментальные условия к условиям межклеточных взаимодействий in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Способность к продукции туморнекротизирующего фактора-a в ответ на действие форболмиристатацетата в наибольшей степени выражена у клеток перевиваемых моноцитарных линий ТНР-1, P388Di и HL-60, в наименьшей степени - у клеток линии U937 и отсутствует у человеческих венозных эндотелиальных клеток.

2. Нативные и окисленные липопротеины низкой плотности не индуцируют продукции туморнекротизирующего фактора-a клетками перевиваемых моноцитарных линий P388Di, ТНР-1, U937, HL-60 и человеческими венозными эндотелиальными клетками.

3. Искусственные растворимые иммунные комплексы, содержащие нативные липопротеины низкой плотности, индуцируют продукцию туморнекротизирующего фактора-a клетками перевиваемых моноцитарных линий P388Di, ТНР-1 и HL-60, а иммунные комплексы, содержащие окисленные липопротеины низкой плотности, индуцируют продукцию туморнекротизирующего фактора-a только клетками линии HL-60; иммунные комплексы обоих типов не индуцируют продукцию туморнекротизирующего фактора-a человеческими венозными эндотелиальными клетками.

4. Дифференцировке исходно низкодифференцированных клеток ТНР-1, U937 и HL-60, индуцированной путем преинкубации с форболмиристатацетатом, сопутствует повышение способности продуцировать туморнекротизирующий фактор-a в ответ на действие нативных или окисленных липопротеинов низкой плотности или содержащих их искусственных растворимых иммунных комплексов.

5. Исходно высокодифференцированные клетки линии P388D¡ после преинкубации с форболмиристатацетатом утрачивают способность продуцировать

туморнекротизирующий фактор-а в ответ на действие искусственных растворимых иммунных комплексов, содержащих нативные или окисленные липопротеины низкой плотности.

6. В инкубационной среде кокультивируемых эндотелиальных клеток и клеток линии HL-60 туморнекротизирующий фактор-а обнаруживается после воздействия на кокультуру нативными липопротеинами низкой плотности, но не содержащими их искусственными растворимыми иммунными комплексами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никитина Е.Ю. / Влияние различных концентраций инсулина и липопротеинов низкой плотности на цитохимические характеристики клеток линии P388Di. // Сборник научных трудов Санкт-Петербургского медицинского института им. акад. И.П.Павлова "Актуальные проблемы клинической аллергологии и иммунологии". - Санкт-Петербург, 1993. - 4.II. - С.196-201.

2. Никитина Е.Ю., Бондарь К.В. / Продукция туморнекротизирующего фактора-альфа клетками линии P388Di и липопротеиды низкой плотности. // Тезисы докладов симпозиума "Липопротеиды и атеросклероз", посвященного 110-летию со дня рождения акад. Н.Н.Аничкова. - Санкт-Петербург, 1995. - С.71.

3. Фрейдлин И.С., Малышкин К.А., Никитина Е.Ю., Лаптева E.H. / Возрастные иммунодефициты, связанные с атеросклерозом или дистрофией, как предпосылки особенностей течения туберкулеза. // Туберкулез и экология. - 1996. - Ks2. - С.57-60.

Подписано к печати 15.05.97 г. Заказ 323. Тираж 100 экз. Объем 1,0 пл. Отдел оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198904, Санкт-Петербург, Ст.Петергоф, Университетский пр.2.