Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Спектр цитокиновых дисфункций в генезе рецидивирующей герпес-вирусной инфекции. Пути коррекции

На правах рукописи

Зуйкова Ирина Николаевна

СПЕКТР ЦИТОКИНОВЫХ ДИСФУНКЦИЙ В ГЕНЕЗЕ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ. ПУТИ КОРРЕКЦИИ.

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ □317'561'1

Москва, 2007 г

003175671

Работа выполнена в Государственном научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

Научные руководители:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Шульженко А Е Каримова И.М

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Феденко Е.С Кадагидзе 3 Г

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И И. Мечникова Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится 2007 г. в 14*00 на заседании

диссертационного совета Д 208.017.01 в Государственном научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства» по адресу. 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корпус 2. Факс (499) 61710-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства».

Автореферат разослан " " ^¿¿^¿ф? 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ¿г

доктор медицинских наук Л.С. Сеславина^-^ "

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Герпетическая инфекция занимает одно из ведущих мест среди вирусных заболеваний человека в связи с повсеместной распространенностью вируса и способностью к пожизненной персистенции у человека после первичного инфицирования. Одной из наиболее часто встречающихся форм рецидивирующей герпес-вирусной инфекции, вызванной вирусами простого герпеса (ВПГ) 1,2 типа, является генитальный герпес За последние десять лет отмечено значительное увеличение частоты генитального герпеса, регистрирующейся в разных странах, что в значительной мере связано с распространением бессимптомной и недиагностированной форм герпетической инфекции [Борисенко К К, 1997, Семенова Т Б , 2003, Шульженко А.Е, 2003, Исаков В А , 2006, Armstrong G, 2002, Corey L., 2004, Looker К., 2005]. По данным проведенных исследований более 80% сексуально активного населения России инфицированы генитальным герпесом, при этом клинические проявления в виде рецидивов отмечаются в 50-75% случаев [Масюкова С А, 2000, Исаков В А, 2004, Марченко Л А , 2005].

Вирус простого герпеса обуславливает патологию беременности и родов, иногда приводя к спонтанным абортам, гибели плода, или вызывает генерализованную инфекцию новорожденных [Кузьмин В Н, 2000, Масюкова С А и др , 2004, Редышн Ю В. и др , 2006]

Способность к длительному персистированию возможна в связи с наличием у герпес-вирусов многочисленных механизмов, воздействующих на формирование противовирусной иммунной защиты и способствующих уклонению вируса от иммунологического надзора В ряду факторов, играющих основную роль в противовирусной защите стоят цитотоксические лимфоциты, естественные киллеры, макрофаги, специфические антитела, система интерферона и интерлейкинов [Ковальчук JI В. и др, 2001, Халдин А А, 2001, Westra D , 2000, Ellermann-Eriksen S et al, 2005] В результате длительных мутаций вирусами герпеса выработаны многочисленные способы уклонения от иммунного контроля, касающиеся как нарушения работы клеточного звена защиты, так и цитокиновой сети Индуцированная вирусами иммунная недостаточность способствует их активной репликации в течение длительного времени.

Цитокиновый ответ составляет основу специфических иммунных реакций и оказывает непосредственное влияние на механизмы иммунорезистентности при герпес-вирусной инфекции. Синтез таких цитокинов как ИФН-сс, ИФН-у, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-а при ВПГ-инфекции приводит к активации основных антигенпрезентирующих клеток и развитию Thl-клеточного противовирусного иммунного ответа [Ершов Ф И. и др., 2001, Ковальчук Л.В. и др., 2004, Paludan S , 2000, Imanishi J, 2000, Salazar-Mather Т et al, 2000, Mogensen S etal,2004]

Терапия и профилактика рецидивов генитального герпеса в настоящее время заключаются в применении препаратов как этиотропного, так и иммунотропного действия [Халдин А.А., 2001, Марченко JI.A. и др, 2005, Шульженко А Е , 2005, Diaz-Mitoma F. et al., 1998, Miller R et al., 2002, Brady R et al, 2004, Barton S et al, 2007]. Препараты, применяемые для терапии герпес-вирусной инфекции, составляют около 80% всех существующих противовирусных препаратов [Масюкова С А, 2001, Corey L., 2004]. Однако общим недостатком ациклических нуклеозидов является неспособность полной элиминации вируса из организма Кроме того, возможно развитие устойчивости к этой группе препаратов

В последнее время в лечении и профилактике герпетических заболеваний перспективным стало применение препаратов, модулирующих ответ иммунной системы против вирусной инфекции [Хахалин JIH, 1998, Галегов ГА и др, 2002, Ершов ФИ и др., 2005]. При детальных исследованиях установлено, что противовирусный эффект этих препаратов опосредован индукцией не только ИФН, но и других про- и противовоспалительных цитокинов В результате действие препаратов этой группы направлено на ограничение репликации вируса в инфицированных клетках, стимуляцию ВПГ-специфического иммунного ответа и предотвращение распространения вируса в здоровые клетки.

В настоящее время роль цитокинов в формировании противогерпетического иммунитета у больных рецидивирующим генитальным герпесом несомненна, однако сведения о них в литературе крайне ограничены и противоречивы. Поэтому, актуальной задачей остается изучение механизмов функционирования цитокиновой сети при рецидивирующей герпес-вирусной инфекции и поиск новых препаратов с противовирусной и иммуномодулирующей активностью для лечения этого заболевания

Дель исследования

Изучение особенностей интерферонового и интерлейкинового профиля у пациентов с хронической часто рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией и коррекция выявленных нарушений.

Задачи исследования

1 Изучить клинические особенности течения генитальной герпес-вирусной инфекции у пациентов с высокой частотой рецидивов

2 Исследовать закономерности клеточного и цитокинового ответа у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией в зависимости от продолжительности периода высокой частоты рецидивов

3. Оценить взаимосвязь нарушений в клеточном и интерфероновом, интерлейкиновом ответе у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией

4 Исследовать изменения цитокинового ответа на фоне терапии индукторами интерферона у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.

5 Провести сравнительный анализ клинической эффективности проводимой терапии и изменений цитокинового профиля у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.

Научная новизна работы

На основании данных клинического течения генитальной герпес-вирусной инфекции впервые определены основные различия по формированию клеточного и цитокинового ответа в группах больных с коротким и продолжительным периодом частых обострений герпес-вирусной инфекции.

Впервые показано, что при высокой частоте рецидивов более одного года формируется вторичная иммунная недостаточность. Выявлено, что при высокой частоте рецидивов более одного года снижается суммарный уровень киллерных клеток с фенотипом CD8+ и CD 16+, играющих важную роль в иммунопатогенезе герпес-вирусной инфекции

Благодаря сравнительному изучению получены новые данные о формировании более выраженной недостаточности продукции ИФН и тенденции к ТЪ2-направленности цитокинового ответа у пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года.

Впервые отмечено снижение или отсутствие специфического клеточного ответа in vitro на антигены ВПГ-1 и 2 типа у 88,0% пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года

Впервые показано, что комбинированная терапия Анафероном и ациклическими нуклеозидами благоприятно влияет на течение рецидива генитального герпеса, приводя к укорочению периода купирования общих и местных симптомов, ускорению процесса образования корочек.

Выявлено, что в начале рецидива генитального герпеса наблюдается развитие цитокинового ответа по Th-2 пути, при этом применение терапии, способствующей усилению экспрессии мРНК ИФН-гамма, способствует переключению иммунного ответа по Th-1 пути.

Впервые показана тенденция смещения цитокинового ответа у пациентов в сторону Th-1 пути (клеточного иммунного ответа) при положительном клиническом эффекте во время комбинированной терапии Анафероном. Обнаружено, что отрицательный клинический эффект наблюдается при отсутствии изменений в экспрессии генов цитокинов или тенденции изменения цитокинового ответа по Th-2 пути у данных пациентов

Практическая значимость работы

Показано, что при высокой частоте рецидивов (10-12 раз в год) более одного года пациентам с генитальной герпес-вирусной инфекцией

необходимо проведение комбинированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии в связи с формированием иммунной недостаточности

Выявлена клиническая эффективность комбинированной терапии Анафероном и ациклическими нуклеозидами при рецидивирующем генитальном герпесе в виде сокращения продолжительности общих и местных симптомов, уменьшения периода образования корочек

Комплексная терапия, включающая Анаферон и ациклический нуклеозид, показана для применения у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции и незначительным нарушением способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма.

Выявлена способность комбинированной терапии Анаферном и ациклическими нуклеозидами усиливать экспрессию мРНК ИФН-гамма и переключать цитокиновый ответ с Th-2 пути на более эффективный Th-1 путь у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции.

Определение эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии при рецидивирующем герпесе может осуществляться под контролем показателей экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10

Исследование показателей цитокинового профиля и специфического клеточного ответа у пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом является адекватным методом оценки сложных взаимовлияний различных звеньев противовирусного иммунного ответа и эффективности выбора проводимой терапии.

Апробация диссертационной работы

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых в ГНЦ Институт Иммунологии ФМБА России (Москва, 2005), на IV научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 2006), на конференции «Герпес-вирусные инфекции в практике врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и неврологов» (Москва, 2006), на научно-практической конференции «Профилактика, диагностика, иммунокоррекция вирусных и бактериальных инфекций» (ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи, Москва, 2006), «Современные представления о роли ИППП в нарушениях репродуктивного здоровья» (ГУ НИИЭМ им НФ. Гамалеи, Москва, 2007), на Межрегиональной VI научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и медицинской косметологии» (Хабаровск, 2007), на VIH Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007), на 2-м Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни от теории к терапии» (Москва, 2007)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», главы «Результаты собственных исследований», заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 214 источников (98 отечественных, 116 иностранных) Текст иллюстрирован 35 таблицами и 14 рисунками, сопровождается клиническими примерами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

За период 2004-2006 года в работу включено 102 пациента с хронической рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией (ХРГВИ), которые проходили амбулаторное и стационарное обследование в ГНЦ Институте иммунологии ФМБА России и ГУ НИИЭМ им. Н Ф Гамалеи РАМН (отдел интерферонов) и получали лечение в ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России.

Критериями выбора пациентов для обследования являлись 1) наличие высокой частоты рецидивов генитального герпеса - более 8 раз в год, 2) продолжительность генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года, 3) обследование в фазе обострения процесса или в периоде продромы, не более 48 часов от момента появления высыпаний; 4) отсутствие приема иммуномодулирующей терапии в течение последних 3 месяцев до включения в обследование. В процессе проведения обследования были сформированы 2 группы пациентов I группа - 30 человек с частыми рецидивами менее одного года, II группа - 72 человека с частыми рецидивами более одного года

Методы обследования больных

1 Клиническое обследование: анамнез жизни и заболевания, выявление сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, а также регулярный осмотр мест поражения При осмотре выяснялись жалобы пациента (зуд, жжение, общее состояние, температура, миалгия и др), оценивалось состояние кожных покровов и слизистых (наличие везикулезных элементов, изъязвлений, эпителизации, отечности, гиперемии).

2 Клинический анализ крови (с подсчетом лейкоцитарной формулы)

3. Исследование на наличие вируса простого герпеса с помощью мазка из области поражения методом ПНР.

4 Иммунный статус с определением следующих параметров:

• Субпопуляции лимфоцитов с фенотипом CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD19+ (В-лимфоциты), иммунорегуляторный индекс (ИРИ)

• Реакция торможения миграции лейкоцитов при взаимодействии со специфическими антигенами (ВПГ-1, ВПГ-2, St Aureus)

• Иммуноглобулины классов А, М, G.

Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов проводилась методом иммунофенотипирования лимфоцитов с помощью моноклональных антител и проточной лазерной цигометрии с одинарной флюоресцешной меткой. В основе метода лежало взаимодействие моноклональных антител, меченных флюоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном лазерном питометре.

Оценка специфического клеточного ответа проводилась с помощью модифицированной реакции торможения миграции лейкоцитов - PTMJI (Симонова A.B., Пинегин Б В, 2006) С помощью модифицированного варианта PTMJI оценивали ответ на политональный митоген (ФГА), специфические антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, St. aureus в плоскодонных 96-луночных планшетах Количественный учет результатов после инкубации производили на инвертированном микроскопе (Leitz, Germany) Индекс подавления миграции (ИПМ) после изменения диаметра вычисляли по формуле

ИПМ = ± [(D02/Dk2) - 1]х 100%, где

Do - средний диаметр для параллельных опытных культур,

Dk- средний диаметр для контрольных микрокультур.

Знак «+» указывал на усиление миграции, в процентах

Знак «-» указывал на подавление миграции, в процентах

Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini и соавт

5. Определение расширенного интерферонового статуса, включающего следующие параметры:

• Уровень циркулирующего в крови ИФН (сывороточный ИФН),

• Уровень продукции спонтанно вырабатываемого ИФН,

• Уровень продукции ИФН-альфа лейкоцитами при индукции клеток крови in vitro вирусными индукторами (вирус болезни Ньюкасла -ВБН),

• Уровень продукции ИФН-гамма при индукции клеток крови in vitro митогенами (фитогемагглютинин — ФГА);

• Определение чувствительности к препаратам ИФН-альфа (Реаферон, Лейкинферон, человеческий лейкоцитарный ИФН -ЧЛИ, Роферон, Интрон), к препаратам ИФН-гамма (Гаммаферон);

• Определение чувствительности к индукторам ИФН (Ридостин, Циклоферон, Амиксин)

Титрование ИФН проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах с культурой диплоидных фибробластов человека (ДФЧ), полученных из музея клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г Москва) и выращенных в ростовой среде до образования монослоя В качестве индикаторного тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМК), который был получен из музея вирусов НИИ вирусологии им. ДИ Ивановского РАМН (г Москва) За единицу активности ИФН (Ед/мл) принимали величину, обратную его

максимальному разведению, которая защищала 50% клеток от цитопатического действия 100 ТЦЦ50 вируса Для перевода полученной активности ИФН в международные единицы (МЕ) в каждом титровании использовался референс-препарат ИФН.

Показатели ИФН-альфа в норме соответствовали 80-640 Ед/мл, ИФН-гамма - 16-128 Ед/мл, сывороточного ИФН — <2-4 Ед/мл, спонтанно продуцируемого ИФН <2 Ед/мл (Мезенцева М.В., 2006)

Чувствительность к ИФН-индуцирующему воздействию индукторов ИФН оценивали по способности препаратов индуцировать ИФН, титры которого превышают титр спонтанно продуцируемого ИФН на один и более log2. Чувствительность к праймирующему воздействию препаратов ИФН оценивали по способности препаратов усиливать ИФН-индуцирующее воздействие стандартных индукторов на один и более log2

6 Цитокиновый профиль оценивали методом ОТ-ПЦР (определение активности мРНК цитокинов в мононуклеарах периферической крови методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции).

Выделение РНК проводили по методике P.Chomczynsky, N Sacchi методом кислой гуанидин-тиоцинат-фенол-хлороформ экстракции Обратная транскрипция и ПЦР-амплификация были выполнены в соответствии с методикой, предложенной Gelder В работе были использованы пары праймеров для следующих цитокинов- ИФН-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-альфа В качестве контроля использовали ß-актин Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega (G 1861).

После обследования пациенты из II группы с продолжительностью периода частых рецидивов более одного года были распределены на три равночисленные группы, в которых была изучена взаимосвязь между эффективностью проводимой терапии и параметрами иммунного, интерферонового статусов и цитокинового профиля. Оценку эффективности противовирусной и иммуномодулирующей терапии проводили с использованием нового отечественного препарата Анаферон (НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) и стандартного противовирусного препарата Ацикловир (Stada Arzneimittel, Германия) согласно схемам, описанным ниже Схема приема препарата Анаферон по 1 таблетке 8 раз в день в течение 3 дней, по 1 таблетке 7 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 6 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 5 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 4 раза в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней, рассасывая в ротовой полости (полный курс - 21 день, 98 таблеток)

Схема приема препарата Ацикловир по 1 таблетке (200 мг) 5 раз в сутки в течение 7 дней.

1 группа пациентов получала монотерапию Анафероном по выше приведенной схеме

2 группа пациентов получала комбинированную терапию Ацикловиром и Анафероном по выше приведенной схеме.

3 группа пациентов получала стандартную базисную терапию Ацикловиром по выше приведенной схеме.

Клиническая эффективность терапии оценивалась по 4 основным критериям.

1 уменьшение степени тяжести клинического течения рецидива,

2 уменьшение продолжительности рецидива;

3 удлинение периода ремиссии генитального герпеса,

4. уменьшение тяжести последующих рецидивов.

Все клинические параметры оценивали в течение 6 месяцев после окончания курса лечения. Степень тяжести последующих рецидивов оценивали в баллах путем анкетного опроса больных. Дня определения частоты и длительности рецидивов заболевания проводили осмотр всех пациентов, включенных в исследование

Статистические методы обработки полученных данных

Статистическую обработку данных проводили стандартным пакетом БТАНБПСА 5.11. Во время исследования использовались варианты количественного и качественного анализа При расчетах количественных изменений, произошедших в одной группе до и после лечения, использовались параметрический (парный критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Уилкоксона) методы. При анализе качественных показателей были применены непараметрические критерии X2 (хи - квадрат) и критерий Манна - Уитни. Кроме этого, связь признаков определялась методом регрессионного анализа и вычисления коэффициента корреляции Пирсона (параметрические методы), а также вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (непараметрический метод).

Результаты исследования

I. Клинико-иммунологическая характеристика пациентов с ХРГВИ

В исследование включено 102 пациента, страдающих генитальной формой хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции, из них 29 мужчин (28,5%) и 73 женщины (71,5%) в возрасте от 18 до 65 лет Средний возраст пациентов составил 38,2±4,1 лет Как среди мужчин, так и среди женщин, преобладали пациенты в возрасте от 18 до 40 лет Среди обследованных пациенток 35,6% составили молодые женщины в возрасте 1829 лет, при этом среди мужчин большую долю (41,4%) составили пациенты в возрастном диапазоне 30-39 лет В целом, во всех возрастных группах достоверно чаще обращались к врачу женщины

Длительность генитальной герпес-вирусной инфекции у всех больных, включенных в исследование, составила в среднем 7,3±2,4 года. Около 30% пациентов страдали заболеванием от 1,5 до 3-х лет, а 29,4% пациентов - более 8 лет. У 7,8% пациентов длительность заболевания не превышала 1,5 года, у 21,6% - генитальный герпес наблюдался от 3 до 5 лет, у 9,8% - от 5 до 8 лет

По локализации у 79,3% мужчин и 50,7% женщин высыпания возникали только в области гениталий, у 6,8% мужчин и 15,1% женщин наблюдалось экстрагенитальное поражение с очагами в области ягодиц, параанальной, лобковой области и внутренней поверхности бедер. Смешанное поражение (генитальная и экстрагенитальная локализация) выявлено у 13,8% мужчин и 31,5% женщин Отмечено, что среди мужчин достоверно чаще распространена генитальная локализация высыпаний (р<0,05).

Провоцирующими рецидивы факторами у женщин являлись сексуальные контакты, взаимосвязь с менструальным циклом и стресс У мужчин ведущей причиной обострения заболевания являлись переутомление, употребление алкогольных напитков и стресс На взаимосвязь обострений с переохлаждением и простудными заболеваниями мужчины и женщины указывали одинаково часто - 48,3% и 53,4%, соответственно.

Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 23% пациентов использовали только местную терапию (мазь с ацикловиром, интерфероном, растворы антисептиков). Выявлено, что у 17,6% больных прием специфических ациклических нуклеозидов в период рецидива заменялся на препараты из групп интерфероногенов и иммуномодуляторов Только около 60% пациентов использовали ациклические нуклеозиды, при этом более половины из них применяли Ацикловир, часть пациентов (4 человека) ранее использовала Фамвир (таб 1).

Таблица 1

Характеристика ранее используемой терапии до включения в обследование

пациентов с генитальным герпесом (п-102)

Группы препаратов Частота применения (количество и % пациентов)

Только местная терапия 23 чел 22,5%

Ациклические нуклеозиды 61 чел 59,9%

- Ацикловир - 35 чел -34,3%

- Валтрекс -22 чел -21,6%

- Фамвир - 4 чел -3,9%

Препараты других групп (индукторы ИФН, иммуномодуляторы) 18 чел 17,6%

Оценивая способ применения противовирусной терапии пациентами до начала обследования выявлено, что в 98% случаев лечение проводилось эпизодически (в периоды обострения герпес-вирусной инфекции) Только в 2% случаев в анамнезе пациентам назначалась супрессивная терапия продолжительностью до 3-х месяцев

Изучение особенностей клинического течения герпес-вирусной инфекции у обследуемых пациентов показало, что такие параметры как длительность заболевания, локализация высыпаний, продолжительность и тяжесть рецидивов, учащение рецидивов от дебюта заболевания носили индивидуальный характер. Однако анализ продолжительности периода частых рецидивов генитального герпеса показал, что около 30% обратившихся

пациентов жаловались на появление обострений заболевания с частотой 1 раз в месяц в течение последнего одного года. В это же время у большинства пациентов (70,9%) высокая частота рецидивов наблюдалась в течение более продолжительного времени (более одного года). Это позволило распределить их на группы с различной продолжительностью периода высокой частоты рецидивов заболевания (таб 2)

Таблица 2

Распределение пациентов с генитальным герпесом на группы в зависимости _от продолжительности периода высокой частоты рецидивов_

Параметры I группа II группа

Период частых рецидивов (до 1 раза в месяц) В течение или менее одного года Более одного года (2-5 лет)

Число пациентов абс (%) 30 чел (29,1%) 72 чел (70,9%)

Длительность заболевания 1 4,2±1,5 9,7±2,8*

* - разница между группами достоверна (р<0,05) 1 - длительность заболевания от момента появления первого рецидива

Таким образом, в зависимости от продолжительности частых рецидивов до 1 раза в месяц все обследуемые пациенты были разделены на две группы

• I группа - 30 пациентов (29,1%) с частыми рецидивами менее одного года,

• II группа - 72 пациента (70,9%) с частыми рецидивами более одного года (в течение последних 2-5 лет).

Выделение таких групп способствовало более полному анализу результатов исследования, так как учитывало параметры клинического течения генитальной герпес-вирусной инфекции у обследуемых больных

Как показал проведенный нами анализ сопутствующих заболеваний у пациентов I группы с высокой частотой рецидивов в течение последнего года, чаще встречаются урогенитальные инфекции - в 60,0%. По спектру сопутствующей урогенитальной микрофлоры у женщин наиболее часто встречались Ureaplasma urealyticum, HPV 16/18 типа, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, у мужчин - Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma gemtahum, Candida albicans Во II группе у 38,8% пациентов также выявлены сопутствующие урогенитальные инфекции

Из таблицы 3 видно, что пациенты II группы преимущественно страдают рецидивирующими воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей (62,5%), заболеваниями щитовидной железы (29,2%) По данным литературы у больных с часто рецидивирующими формами генитального герпеса часто выявляются нарушения в щитовидной железе (Щеголева В И , Халдин А.А , 2003) У данной категории больных ВПГ рассматривается как триггерный фактор развития аутоиммунного процесса в щитовидной железе Встречаемость заболеваний желудочно-кишечного тракта одинакова в обеих группах (таб. 3)

Таблица 3

Частота встречаемости сопутствующих заболеваний внутри групп пациентов _с генитальным герпесом _

Заболевания I группа(п=30) II группа (п=72)

Хр рецидивирующий тонзиллит, фарингит, бронхит 11 чел (36,6%) 45 чел (62,5%)*

Патология щитовидной железы 3 чел (10,0%) 21 чел (29,2%)*

Заболевания ЖКТ 26 чел (86,6%) 58 чел (80,5%)

Урогенитальные инфекции 18 чел (60,0%)* 28 чел (38,8%)

* - достоверность различий между группами пациентов р<0,05 (%2- критерий)

Изучение состояния клеточного иммунного ответа показало, что в начале обострения у пациентов I группы с высокой частотой рецидивов в течение одного года достоверно выше относительное и абсолютное содержание цитотоксических СБ8+ лимфоцитов (среднее значение - 38,4±1,3%, 822,5+35,7/мкл) и натуральных киллеров (среднее значение - 13,0±0,8%, 271,7±26,8/мкл) по сравнению с пациентами II группы (р<0,05, таб 4)

Таблица 4

Показатели иммунного статуса у пациентов I и II групп в фазу обострения

герпес-вирусной инфекции

Показатели Норма I группа(п=30) II группа (п=72)

Лейкоциты (* 10у/л) 4,0-9,0 6,3±1,7 6,7+1,7

Лимфоциты, % 19-37 34,9±2,5 32,2+1,8

Лимфоциты (* 10у/л) 1200-3000 2138,0±86,4 2076,7±70,4

СБЗ+, % 55-80 72,3±1,4 74,4±0,8

СБЗ+, кл/мкл 800-2200 1542,2±67,8 1537,7±51,6

СБ4+, % 31-51 37,6±1,4* 46,1±0,9*

СБ4+, кл/мкл 600-1600 795,1±40,1* 951,9+33,9*

С08+,% 19-40 38,4±1,3* 27,0±0,9*

СЭ8+, кл/мкл 300-800 822,5±35,7* 564,9±29,2*

ИРИ 1,0-2,5 0,99±0,10* 1,81±0,06*

Ж (СБ 16+), % 6-20 13,0±0,8* 7,8±0,6*

Ж (СБ 16+), кл/мкл 150-500 271,7±26,8* 160,6±14,3*

Сумма киллеров (СБ8+ и СБ16+), % >45% 49,2±1,8* 32,6±1,6*

В-лимф (СБ 19+), % 5-19 6,0±0,6 7,2±0,5

В-лимф, кл/мкл 100-500 125,3±11,6 147,4±9,4

1бА, мг% 100-350 216,9±15,7 187,68±11,3

мг% 80-250 143,7±10,1 157,78±9,5

мг% 900-1800 1244,8±53,8 1203,32±43,7

* - достоверность различий между группами пациентов р<0,05

Уровень естественных киллеров с фенотипом СО 16+ у пациентов II

группы был значительно ниже показателей I группы, а относительное и абсолютное содержание Т-хелперов (СБ4+) сохранялось в пределах нормальных значений и превышало результаты I группы (951,9±33,9/мкл, 46,1 ±0,9%, р<0,05) Также получены достоверные различия по значению ИРИ, который был снижен в I группе пациентов.

У пациентов обеих групп изучен такой показатель как «сумма киллеров», который отражает цитотоксический потенциал лимфоцитов в крови Данный показатель равен сумме относительного содержания цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров и должен составлять более 45% (Симонова А.В., 2001). В I группе у 83,3% пациентов (25 человек) сумма киллеров превышала 45% в первые сутки обострения герпес-вирусной инфекции и в среднем составляла 49,2±1,8% Во П группе только у 4,2% пациентов (3 человека) сумма киллеров имела должный уровень Большая часть пациентов этой группы 95,8% имела достоверно более низкое содержание киллеров в среднем 32,6±1,6% (р<0,02) по сравнению с показателями I группы

Таким образом, у пациентов с высокой частотой рецидивов менее одного года отмечено увеличение суммарного содержания лимфоцитов с фенотипом СБ8+ и СБ16+, выполняющих цитотоксическую функцию, в фазу активации герпес-вирусной инфекции При течении генитального герпеса с высокой частотой рецидивов более одного года содержание этих клеток достоверно снижается

В период обострения герпес-вирусной инфекции показатели интерферонового статуса у всех больных генитальным герпесом были снижены за счет индуцированной альфа- и гамма-фракции интерферона (таб 5). Не отмечено повышения уровня сывороточного интерферона у пациентов всех групп на фоне активации герпес-вирусной инфекции. Спонтанная интерфероновая реакция лейкоцитов также не имела различий между пациентами обеих групп и не превышала значения нормы (таб 5)

Таблица 5

Показатели интерферонового статуса у пациентов I и II групп в фазу

обострения герпес-вирусной инфекции

Показатели Титр ИФН в норме (ЕД/мл) I группа (п=30) II группа (п=72)

сыв ИФН, (1о§2) <2-4 0,82±0,19 0,68±0,13

спонт ИФН, (1о§2) <2 0,18±0,08 0,06+0,02

ИФН-альфа, (титр, Ед/мл) 80-640 42,64±6,20* 16,6313,50

ИФН-гамма, (титр, Ед/мл) 32-128 18,23±3,07 12,11±1,52

* - достоверность различий между группами р<0,05

Уровень стимулированного ИФН-альфа у пациентов I группы в среднем был выше по сравнению с показателями II группы (42,64±6,20 и 16,63±3,50 Ед/мл, соответственно, р<0,05) Однако ни в одной группе эти

показатели не достигали нижней границы нормы. Стимулированная выработка ИФН-гамма была снижена у пациентов II группы (12,11±1,52 Ед/мл) и менее значительно пациентов I группы (18,23±3,07 Ед/мл), что является проявлением ИФН-недостаточности у пациентов с часто рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией

Кроме того, у 43,3% пациентов I группы и 63,9% пациентов II группы отмечалась низкая чувствительность к препаратам ИФН-альфа. Аналогично снижение чувствительности к препарату ИФН-гамма и индукторам ИФН наблюдалось у 46,6% и 66,7% пациентбв I группы и 55,6% и 69,4% II группы, соответственно (различия не достоверны).

Для более подробного выяснения направленности изменений в иммунном ответе пациентов с генитальным герпесом, использовался метод оценки экспрессии генов ряда цитокинов по продукции их мРНК Получено, что у больных по сравнению со здоровыми добровольцами, повышалась экспрессия мРНК ИФН-а, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, ИЛ-18, ИЛ-4 При этом выявлено снижение синтеза мРНК ИЛ-12 у всех обследованных пациентов по сравнению со здоровыми донорами (таб 6)

Таблица 6

Показатели экспрессии мРНК цитокинов у пациентов I и II групп в фазу _ обострения герпес-вирусной инфекции_

Показатели Здоровые добровольцы (п=40) I группа(п=30) II группа (п=72)

ИФН-а 2,0% 100% (30 чел)* 100% (72 чел)*

ИФН-у 30,0% 23,3% (7 чел) 20,8% (15 чел)

ИЛ-13 35,0% 60,0% (18 чел) * 86,1% (62 чел)* *

ФНО-а 75, 0% 66,7% (20 чел)" 44,4% (32 чел)*

ИЛ-6 20,0% 36,7% (11 чел) 52,7% (38 чел)

ИЛ-8 10,0% 90,0% (27 чел)* 91,6% (66 чел)*

ИЛ-2 0% 40,0% (12 чел)*" 13,8% (10 чел)*

ИЛ-12 70,0% 6,6% (2 чел)* 5,5% (4 чел)*

ИЛ-18 30,0% 100% (30 чел)* 95,8% (69 чел)*

ИЛ-4 0% 13,3% (4 чел) 36,1% (26 чел)* *

ИЛ-10 20,0% 20,0% (6 чел) 20,8% (15 чел)

- достоверность различий между группами пациентов р<0,05 (х2- критерий)

- достоверность различий по сравнению со здоровыми добровольцами р<0,03 (-/2-критерий)

При сравнении показателей цитокинового профиля пациентов с рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией в начале рецидива можно наблюдать следующие закономерности (рис 1)'

- у пациентов I группы тенденция к превалированию ИФН-а, ИЛ-18, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-1Р, ИЛ-2 - что указывает на активацию макрофагально-моноцитарного звена и ТЫ-лимфоцитов,

у пациентов II группы тенденция к превалированию ИФН-а, ИЛ-1Э, ИЛ-18, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-4 - что указывает на активацию макрофагально-моноцитарного звена и ТЬ2-лимфоцитов

Рисунок 1. Различия в экспрессии мРНК цнтокинов у пациентов I и II группы в фазу обострения герпес-вирусной инфекции

100,00% -1 80,00% -60,00% -40,00% -20,00% -0,00%

ИЛ-1Ь ФНО-а ■ I группа III группа

ИЛ-6 ИЛ-2 ИЛ-4 □ здоровые добровольцы

* - различия достоверны по сравнению со здоровыми добровольцами р<0,03

* - различия достоверны между группами пациентов р<0,05 (%2- критерий)

При сравнении данных, полученных разными методами, отмечено, что нарушение выработки ИФН-гамма у пациентов обеих групп происходило на уровне транскрипции гена этого цитокина (отсутствие мРНК) Синтез ИФН-альфа был нарушен у данных пациентов на посттранскрипционном уровне (на этапе продукции).

В связи с выявленной недостаточностью в клеточной защите у 25 пациентов II группы была проведена оценка специфического клеточного ответа на герпес-вирусные антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, стафилококковый антиген Выявлено, что для 68,0% пациентов характерно снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 Отмечено, также снижение клеточного ответа на поликлональный митоген (ФГА) у 68,0% пациентов (таб. 7)

Таблица 7

Характеристика специфического клеточного ответа на различные антигены у

Ответ на антигены ФГА (положительный контроль) ВПГ-1 ВПГ-2 аигеш

Отсутствие ответа 3 0 19чел /76,0% Пчел/68,0% 7чел /28,0%

Сниженный ответ2 17чел/68,0% Зчел/12,0% 5чел /20,0% 8чел /32,0%

Нормальный ответ 1 8чел /32,0% Зчел/12,0% Зчел /12,0% Ючел /40,0%

- значения индекса подавления миграции (в %) соответствуют показателям доноров 1 - индекс подавления миграции ниже значений М-1,5ст для доноров ' - индекс подавления миграции менее 20%

Кроме того, выявлено снижение и отсутствие ответа на другие специфические антигены, в частности стафилококковый, у 60,0% пациентов, что связано с наличием сопутствующих хронических воспалительных заболеваний бактериальной этиологии в различной локализации.

В фазу ремиссии заболевания сохранялось выявленное снижение или отсутствие ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 у 68,0% и 64,0% пациентов, соответственно При этом клеточный ответ на митоген ФГА также оставался сниженным у 56,0% пациентов, что является показателем выраженной функциональной недостаточности лейкоцитов при часто рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекции.

Таким образом, снижение суммарного содержания киллерных клеток (ХЮ8+ и С016+), недостаточность стимулированной ИФН-реакции лейкоцитов периферической крови как в отношении ИФН-а, так и в отношении ИФН-у, снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, тенденция направленности цитокинового ответа по ТЬ2-типу являются иммунопатогенетической особенностью противовирусного ответа у пациентов с высокой частотой рецидивов более года. С учетом формирования иммунной недостаточности пациентам с генитальной герпес-вирусной инфекцией при высокой частоте рецидивов более одного года показано проведение противовирусной и иммуномодулирующей терапии

II. Изучение эффективности иммуномодулирующей терапии

Оценку клинической эффективности терапии проводили 72 пациентам с рецидивирующим генитальным герпесом и высокой частотой рецидивов более одного года. В качестве иммунокорригирующего препарата, влияющего на синтез цитокинов, выбран отечественный препарат Анаферон, в котором активное действующее вещество представляет собой сверхмалые дозы антител к ИФН-у Экспериментальным путем показано, что действие Анаферона основано на индукции эндогенных ИФН-у и ИФН-а, Р и влиянии на экспрессию функционально сопряженных с ними цитокинов, в том числе ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 (Мартюшев-Поклад А В и др, 2003) Пациенты были распределены методом случайной выборки на три группы по 24 человека 1 -я группа получала монотерапию Анафероном по схеме (см выше) в течение 21 дня. 2-я группа принимала комплексную терапию Анафероном по схеме в течение 21 дня и Ацикловиром в течение 7 дней. Пациенты 3-ей группы (контрольная) получали стандартную терапию Ацикловиром в течение 7 дней. Клиническое обследование пациентов включало регулярный осмотр мест поражения с оценкой состояния кожных покровов и слизистых Выяснялись выраженность и продолжительность местных симптомов (зуд, болезненность, жжение, покалывание), симптомов интоксикации (температура, миалгия, головная боль, озноб, слабость)

До начала лечения выраженность местных симптомов рецидива генитального герпеса у пациентов 1 группы колебалась от 1,77 до 2,37 баллов, во 2 группе - от 1,75 до 2,58 баллов, в 3 группе - от 2,00 до 2,55 баллов (для покалывания и зуда, соответственно). На начало рецидива

наиболее выражены были зуд и болезненность в области поражения у пациентов всех групп.

Купирование местных симптомов на фоне лечения наиболее эффективно происходило у пациентов 2-й группы. Достоверные изменения касались укорочения продолжительности зуда и жжения (в среднем - на 0,6 и 0,9 дня, р<0,05) при сравнении с контрольной группой, принимавшей Ацикловир. У пациентов, принимавших только Анаферон, купирование зуда, боли и покалывания в области высыпаний происходило достоверно медленнее по отношению к контрольной группе (в среднем на 1,7, 2,0 и 1,2 день, соответственно)

Важными критериями эффективности влияния лечения на течение рецидива герпес-вирусной инфекции являются время, необходимое для образования корочек и сроки полного выздоровления (полной реэпителизации). В ходе проведения сочетанной терапии Анафероном с Ацикловиром период образования корочек составил около 3,0 дней и достоверно отличался от показателей 3-й контрольной и 1-й группы (р<0,05) У пациентов, принимавших только Анаферон, период формирования корочек, как и период полной реэпителизации оказались наиболее продолжительными (таб. 8)

Таблица 8

Сроки образования корочек и полной реэпителизации у пациентов

генитальным герпесом в ходе лечения

Параметры 1 группа п=24 2 группа п=24 3 группа п=24

Время, необходимое для образования корочек, дни (М±т) 5,48±0,31* 3,02±0,23#* 3,68±0,22

Время достижения полной реэпителизации, дни (М±т) 6,78±0,32* 5,37±0,38# 5,50±0,32

- достоверность различий между группами р<0,05

* - достоверность различий с контрольной группой (3 группа) р<0,05

При изучении периода до наступления первого рецидива получено, что пациенты, получавшие комплексную терапию, имели среднюю продолжительность ремиссии в среднем 52,1 ±8,1 дней (медиана периода - 43 дня), достоверно отличавшуюся от показателя в других группах пациентов В группах пациентов, получавших монотерапию Анафероном или Ацикловиром, этот период был в 2 раза короче - 30,0±2,9 и 28,9+2,3 дней, соответственно

В целом, клиническая эффективность в отдаленном периоде наблюдения у пациентов, получавших комбинированную терапию, отмечена в 70,8% случаев, включая как увеличение периода ремиссии, так и уменьшение тяжести последующих обострений В контрольной группе и группе с монотерапией Анафероном клиническая эффективность составила 8,3% и 16,7% , соответственно (таб 9)

Таблица 9.

Результаты клинической эффективности проводимой терапии в отдаленном

Параметры эффективности 1 группа п=24 2 группа п=24 3 группа п=24

Увеличение периода ремиссии (в 2 и более раза) 4,2% (1 чел) 45,8% (11 чел)* 8,3% (2 чел)

Уменьшение тяжести последующих рецидивов 12,5% (3 чел) 58,3% (14 чел)* 0

Отсутствие эффекта 83,3% (21 чел) 29,2% (7 чел) 91,7% (22 чел)

: - достоверность различий с контрольной группой (3 группа) р<0.05

Достоверного изменения показателей субпопуляций лимфоцитов и уровня иммуноглобулинов А, М, О на фоне лечения выявлено не было во всех группах пациентов. Изучение показателей расширенного интерферонового статута в динамике показало, что в результате лечения показатели сывороточного ИФН, как и спонтанная интерфероновда реакция лейкоцитов не изменились и сохранялись в норме почти у всех пациентов, получавших терапию.

Показатели синтеза ИФН-альфа лейкоцитами крови в ответ на стимуляцию ВБН на фоне лечения имели сходный характер изменений во всех группах. Так, к 8-м суткам этот показатель имел тенденцию к снижению, а к 21-м суткам увеличивался, наиболее значимо в группе пациентов, получавших терапию Ацикловиром и Анафероном.

Рисунок 2. Динамика уровня индуцированной продукции ИФН-альфа и гамма

на фоне лечений

100,0 1 50,0 -0,0

ИФН-альфа

гЪ

1

1-е сутки 8-е сутки 21-е сутки

з 40,0 -

й; 30,0 -

™ 20,0 -

| 50,0 -

ИФН-гамма

1-е сутки

8-е сутки 21-е сутки

□ Анаферон ЕЗ Анаферон+ Ациклопир ■ Лчикловир □ Здоровые добровольцы * - лостовеоность изменений до и после лечения р<0.05

Выработка ИФН-гамма лейкоцитами периферической крови в ответ на стимуляцию ФГА на 8-е сутки лечения в среднем по группам незначительно изменялась, оставаясь меньше показателей здоровых добровольцев. К моменту окончания курса лечения уровень выработки ИФН-гамма у пациентов, получавших комбинированную терапию, имел тенденцию к восстановлению (среднее значение по группе 25,7+1,9 МЕ/мл). В группе пациентов, получавших монотералию Анафероном, способность

лейкоцитов к продукции ИФН-гамма имела тенденцию к снижению среднего по группе показателя на 8-е н 21-е сутки лечения (рис.2).

Исследование влияния терапии на параметры интерфероне во го статуса показало различную эффективность восстановления продукции ИФН в зависимости от исходных показателей. Выявлено, что у 66,7% пациентов 2-й группы наиболее выражено восстановление продукции ИФН-гамма происходило при исходно незначительно сниженной выработке -исходный титр 16-32 МЕ/мл (в среднем 14,7+1,2 МЕ/мл). При более существенном исходном нарушении синтеза ИФН-гамма (титр 2-8 МЕ/мл, среднее значение 8.8+1,4 МЕ/мл) получено отсутствие эффекта (рис. 3).

Рисунок 3. Динамика показателей продукции ИФН-гамма на фони лечения в зависимости от исходных показателей у пациенте« 2- а 3-й групп

40 п

5

30 -

1 20 -

(X

Я 1 10 -

О

- а

- №1 -1- ■■А шь

исход 8-е сутки 21-е сутки

□группа^ титр ИНФ-гамма 16-32 МЕ/мл В группа 2; титр ИФН-гамма 2-Я МЕ/мл □ контрольная группа 3 * - достоверность изменений до и пост лечения р<0,05

В контрольной группе не наблюдалось восстановления способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма на фоне терапии при любом исходном уровне выработки. Поэтому максимальную эффективность комбинированной терапии .Ал афер оном и Ацикловиром следует ожидать при ее назначении пациентам с исходно незначительно сниженным уровнем продукции ИФН-гамма (титр 16-32 МЕ/мл).

Кроме того, при проведении лечения Анафероном отмечено достоверное повышение чувствительности к препаратам ИФН-у у 50,0% и препаратам ИФН-а у 41,6% пациентов 2-й группы.

Таким образом, отсутствие клинического эффекта наблюдалось у больных при совокупном изменении следующих параметров: повышение циркулирующего и спонтанно вырабатываемого ИФН, снижение или отсутствие восстановления способности лейкоцитов к продукции ИФН-а, ИФН-у. И наоборот, нормализация большинства параметров ИФН статуса соответствовала хорошему или удовлетворительному клиническому эффекту.

Изучение цитокинового профиля обследованных больных в процессе лечения показало, что сохранялась активность мРНК ИФН-а и ИЛ-18 во всех группах обследованных пациентов. Наиболее значимые изменения по группам касались активности мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-10. В группе, получавшей комбинированную терапию Анафероном и Ацикловиром, активность мРНК ИФН-гамма достоверно увеличивалась к 8-

суткам лечения и сохранялась на значимом уровне к окончанию лечения. В остальных двух группах отмечалось снижение этого показателя {ряс. 4).

Рисунок 4. Динамика экспрессии мРНК ИФН-гамма и ИЛ-2 на фоне лечения

мРНК ИФН-гамма

мРНК ИЛ-2

80,0% -г 60,0% -40,0% -20,0% 0,0%

80,0% -1 | 60,0% -I 40,0% -20,0% -0,0%

ш

о*

1-е сутки 8-е сутки 21-есутки 1-есутки 8-есутки 21-есутки

3 Анаферон В Анаферон+Ацикловир ■ Ацикловир □ здоровые добровольцы

* - достоверность изменений до и после лечения р<0,05

Аналогичные изменения касались синтеза мРНК ИЛ-2 - повышение синтеза мРНК ИЛ-2 к моменту завершения лечения в группе с комбинированной терапией и снижение этого параметра в остальных группах.

Продукция мРНК Ш1-12, одного из важных противовирусных цитокинов, была снижена во всех группах и имела тенденцию к повышению только у пациентов, получавших лечения Ацикловиром и Анафероном. При этом уровень синтеза мРНК ИЛ-10 в этой группе практически не изменился во время лечения. В двух других группах активность мРНК ИЛ-10 достоверно повышалась (рис. 5).

Рисунок 5. Дипамика экспрессии мРПК ИЛ-12 и ИЛ-10 на фоне лечения

мРНК ИЛ-10

мРНК ИЛ-12

80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0%

ЕЯ,- 1 1 ''

£

30,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0%

1-е сутки 8-е сутки 21-е сутки

1-е сутки

8-е сутки

21-е сутки

О Анаферон Я Анэферон+ Ацикловир ■ Ацикловир □ здоровые добровольца

* - достоверность изменений до и после лечения р<0,05

Снижение синтеза мРНК ИФН-у, ИЛ-2 и повышение акгиваости мРНК ИЛ-10 на форе лечения свидетельствуют о сохранении нарушений в клеточном звене и активации гуморального ответа у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.

Среди пациентов, получавших комбинированную терапию Анафероком и Адикловиром, отмечена экспрессия мРНК ИФН-гамма на 8-е и/или 21-е сутки лечения у 17 человек (66,7%). Нами были изучены изменения цитокинового профиля на фоне лечения у пациентов с положительной выработкой мРНК ИФН-гамма. Для сравнения выбраны 26 человек (из 1 и 3 групп, получавших лечения Анафероном или Ацикловиром) с отсутствием экспрессии мРНК ИФН-гамма на фоне лечения.

В случае отсутствия активности мРНК ИФН-гамма цитокиновый ответ к 8-м суткам лечения развивался с увеличением синтеза мРНК ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, на 21-е сутки также сохранялась активация Т1г-2-ответа на герпес-вирусную инфекцию. У пациентов с положительной экспрессией мРНК ИФН-гамма возникшая парадоксальная активация ^морального ответа па 8-е сутки переключается к 21-м суткам наТЪ-1 ответ (рис. 6).

Рисунок 6. Динамика экспрессии мРНК цитокннов у пациентов с наличием {+) и отсутствием (-) синтеза мРНК ИФН-гамма на фоне лечения

исход 8-е сутки 21-е сутки исход 8-е сутки 21-е сутки

* - достоверность изменений до и после печения р<0,05

Проведенные исследования изменений цитокинового профиля пациентов с гещггальным герпесом в зависимости от клинического эффекта показали, что в результате лечения положительный эффект (ускорение процесса заживления, быстрое купирование местных симптомов, удлинение периода ремиссии) наблюдался при закономерностях, представленных в таблице 10, Снижению активности герпес-вирусной инфекции сопутствовала тенденция к увеличению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, нормализация синтеза мРНК ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-4 и ИЛ-10. Сохранение повышенной активности мРНК ИЛ-1(5, ИЛ-6 у данных пациентов свидетельствовало о хроническом течении заболевания с частыми обострениями. При отрицательном клиническом эффекте отмечалась тенденция к снижению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-а, повышение синтеза мРНК ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-4 и ИЛ-10 и сохранение повышенного уровня синтеза мРНК ИЛ-8.

Таблица 10.

Эффективность терапии пациентов с генитальным герпесом в зависимости от _изменений показателей цитокинового статуса_

Показатели Положительный клинический эффект Отрицательный клинический эффект

До лечения После лечения До лечения После лечения

мРНК ИФН-у N4 N

мРНКИЛ-2 Т т t 4

мРНК ИЛ-12

мРНК ФНО-а N

мРНК HJI-lß Т не изм t Т

мРНКИЛ-6 т t/N т

мРНКИЛ-8 т 1 t не изм

мРНКИЛ-4 N незначит Т t Т/не изм

мРНК ИЛ-10 N N N

Т - повышение синтеза мРНК N - уровень синтеза в норме (здоровые добровольцы) 1 - снижение синтеза мРНК не изм - нет изменений в синтезе мРНК

Таким образом, изучение показателей цитокинового профиля у пациентов с генитальным герпесом может являться информативным методом оценки эффективности проводимой терапии

ВЫВОДЫ

1 У 83,3% пациентов с высокой частотой рецидивов генитального герпеса менее одного года отмечалось адекватное повышение суммарного уровня киллерных клеток с фенотипом СР8+ и СБ 16+ до 49,2% При высокой частоте рецидивов более одного года суммарное содержание киллеров было снижено и составило 32,6%.

2. В фазу обострения генитального герпеса при высокой частоте рецидивов более одного года выявлено снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 в 88,0% случаев В фазу ремиссии заболевания нормализация клеточного ответа на антигены ВПГ-1 отмечена у 20,0% и ВПГ-2 у 24,0% пациентов

3 У пациентов с высокой частотой рецидивов генитального герпеса менее одного года выявлен цитокиновый ответ с тенденцией к активации макрофагально-моноцитарного звена и ТЫ-пути. Пациенты с высокой частотой рецидивов более одного года имеют тенденцию к цитокиновому ответу по Т112-пути.

4 Проведение комплексной терапии Анафероном и Ацикловиром пациентам с высокой частотой рецидивов более одного года приводило к нормализации продукции ИФН-гамма в 66,7% случаев и чувствительности к препаратам ИФН-гамма в 50,0%, увеличению активности мРНК ИФН-гамма в 70,8%, ИЛ-12 в 12,5% и ИЛ-2 в 41,7%, что сопровождалось положительным

клиническим эффектом (увеличением периода ремиссии, снижением тяжести рецидивов генитального герпеса)

5 Усиление экспрессии мРНК ИФН-гамма у 70,8% пациентов на фоне комплексной терапии способствовало переключению цитокинового ответа по Th-1 пути Отсутствие синтеза мРНК ИФН-гамма у пациентов контрольной группы или при монотерапии Анафероном сопровождалось развитием цитокинового ответа по Th-2 пути

6 У пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года выявлена корреляционная взаимосвязь между положительным клиническим эффектом лечения Анафероном и Ацикловиром и цитокиновым ответом с тенденцией к увеличению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12 Отрицательный клинический эффект коррелировал с цитокиновым ответом по Th-2 типу с тенденцией к снижению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, повышению синтеза мРНК ИЛ-10

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В связи с формированием иммунной недостаточности пациентам с высокой частотой рецидивов (>10 раз в год) генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года необходимо проведение комбинированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии.

2 Комплексная терапия, включающая Анаферон и ациклический нуклеозид, показана для применения у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции и незначительным нарушением способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма.

3 Исследование показателей цитокинового профиля методом определения экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-10 у пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом является информативным тестом оценки эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Галавит в терапии хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции». Новые лекарства, 2003, № 3, с 23-27

2 Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Галавит в комплексной терапии больных с хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией» Matena Medica, 2003, №4, с 94-102

3 Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н «Эффективность препарата Анаферон у больных с хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией», Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, с. 724.

4 Зуйкова И Н, Шульженко А Е. «Продукция интерферонов и цитокинов при рецидивирующем генитальном герпесе» Материалы научно -практической конференции «Современные технологии в иммунологии иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, 2006, с. 167-168

5. Зуйкова И Н. «Хроническая рецидивирующая герпес-вирусная инфекция -иммунологическое понимание проблемы» материалы к конференции «Герпес-вирусные инфекции в практике врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и неврологов», Москва, 2006, с 33-40

6 Зуйкова ИН, Шульженко АЕ «Психосоциальные аспекты генитальной герпес-вирусной инфекции» Российский журнал кожных и венерических болезней, 2007, N 1. - Прил. Герпес с. 13-18

7 Зуйкова И Н, Шульженко А Е, Смольников А В «Эффективность применения препарата Фамвир в лечении хронической герпес-вирусной инфекции» Клиническая дерматология и венерология, 2007, №1, с. 39-45

8 Зуйкова И Н, Шульженко А Е «Новые возможности этиотропного лечения больных с высокой частотой рецидивирующего генитального герпеса» Российский журнал кожных и венерических болезней 2007, N 3 - Прил Герпес- с. 24-29

9 Зуйкова И Н., Шульженко А Е «Дифференциальная диагностика атипичной формы генитальной герпес-вирусной инфекции с аллергодерматозами и подходы к терапии». Российский аллергологический журнал, 2007, № 1, с 20-29.

10 Зуйкова ИН., Шульженко А.Е «Особенности клеточного и цитокинового ответа при генитальной герпес-вирусной инфекции с высокой частотой рецидивов». Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с.293

11. Зуйкова И.Н., Шульженко А Е. «Новые подходы к применению индукторов интерферона у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией» Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с 294

12 Чирвон Е.А., Зуйкова И.Н, Муругин В.В., Симонова A.B., Шульженко А Е , Пинегин Б.В. «Герпес-вирусная инфекция - оценка иммунного ответа на антигены HSVI, HSVII». Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с.305

13. Шульженко АЕ., Зуйкова И.Н. «Современные подходы к диагностике и лечению герпес-вирусных инфекций» Лечащий врач, 2007, №5, с 52-55

14 Зуйкова И Н, Шульженко А.Е «Цитокиновый профиль у пациентов с генитальной формой хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции на фоне терапии Анафероном». Материалы VI международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств», 2007, Москва, с. 63.

15 Зуйкова ИН, Шульженко АЕ «Эффективность применения препарата Анаферон в комплексной терапии генитального герпеса» Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, № 7, с 144-149.

16 Зуйкова И.Н, Шульженко А Е «Клинико-иммунологические особенности течения генитальной формы хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции на фоне терапии Анафероном» Материалы II Национального конгресса терапевтов, 2007, Москва, с 129.

Подписано в печать^8.10 0? г Формат 60x84/16 Тираж 100 экз Заказ 6Ь 7 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н Блохина РАМН И 5478, Москва, Каширское ш, 24