Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Спектр специфических иммуноглобулинов Е и распределение генов HLA II класса у детей с атопическими заболеваниями

Аллергические болезни у детей по распространенности занимают первое место среди всех неинфекционных заболеваний детского возраста и являются чрезвычайно актуальной проблемой современной педиатрии.

За последнее десятилетие возросла распространенность бронхиальной астмы и атопических заболеваний в целом, в особенности, среди молодого населения. Атопическая бронхиальная астма — одно из самых распространенных хронических заболеваний детского возраста во всем мире, в различных регионах нашей страны распространенность бронхиальной астмы варьирует: 2,6% - 20,3% [8].

Атопический дерматит - хроническое рецидивирующее заболевание, характеризующееся сильным зудом, которое часто предшествует развитию аллергического ринита и бронхиальной астмы. Популяционные исследования показывают, что распространенность этого заболевания постоянно' увеличивается. Распространенность атопического дерматита в России и странах СНГ колеблется от 5,2% до 1'5,5% [9].

Известно, что у части детей, страдающих атопическим' дерматитом в раннем возрасте, впоследствии развивается полная ремиссия этого заболевания, однако по данным различных авторов, у 30-50% впоследствии развивается' атопическая. бронхиальная астма. В то же время, бронхиальная астма достаточно часто развивается у детей, не имевших в анамнезе проявлений дерматита, но с отягощенным семейным анамнезом по атопии [15].

Атопия или генетическая предрасположенность к продукции антиген-специфического иммуноглобулина Е после контакта с аллергеном, является общим компонентом атопических болезней, таких как бронхиальная астма, аллергический ринит, поллиноз и атопический дерматит. Кроме того, патогенетические факторы общие для аллергических заболеваний включают острое и хроническое воспаление, затрагивающее тучные клетки, базофилы, аллерген-специфичные Т-клетки и эозинофилы [10].

Одним из главных признаков атопии является наследственная предрасположенность, и роль генетики в развитии аллергических заболеваний была признана еще в начале 20-го века. К настоящему времени установлено множество генов, связанных с наследованием атопических болезней. Однако не только наследственная предрасположенность формирует атопический фенотип. Влияния факторов внешней среды, среди которых значительное место занимают аллергены, инфекционные агенты, поллютанты и многие другие приводит к развитию аллергических заболеваний у генетически предрасположенных людей.

Одной из основных задач в изучении генетики атопических болезней является определение клинического фенотипа, и сосуществование трех клинических фенотипов атопических болезней (бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита) потенциально усложняет поиск генов, определяющих фенотип [86].

В большинстве полно-геномных исследований была установлена связь между генетической предрасположенностью к развитию атопических болезней и участком хромосомы 6р, на котором расположены гены системы HLA, которым принадлежит ведущая роль в регуляции иммунного ответа [37, 45, 67, 124, 136]. Одной из важнейших физиологических функций системы МНС, лежащей в основе развития и регуляции иммунного ответа, является процессинг и представление иммунодоминантных пептидов, являющихся продуктом внутриклеточного протеолиза чужеродных антигенов, против которых и будет индуцирован, а затем и будет развиваться сам иммунный ответ [14]. Таким образом, система генов HLA обеспечивает генетический контроль иммунного ответа и поддержание «нормального» иммунного гомеостаза, нарушение которого лежит в основе целого ряда патологических процессов, включая аутоиммунные заболевания и развитие опухолей. В последние 7-8 лет исследование системы HLA осуществляется на новом молекулярно-генетическом уровне. Принципиальным отличием нового подхода от используемого ранее явился переход с использования в качестве объекта исследования белковых молекул HLA, экспрессированных на мембранах клеток, на исследование непосредственно генетического материала - участков ДНК, определяющих аллельный полиморфизм системы HLA. Результатом этого стало более чем терхкратное увеличение числа выявляемых HLA специфичностей, причем не только за счет открытия их новых аллельных вариантов, но также за счет установления факта наличия в некоторых из локусов системы HLA нескольких экспрессирующих генов [13]. Популяционное исследование полиморфизма системы HLA позволили определить, что ассоциированность заболеваний с различными аллельными вариантами генов HLA напрямую зависят от этнического состава изучаемой группы [4].

Первые работы по изучение возможной роли антигенов HLA класса II в развитии атопических заболеваний были проведены в 70-х годах. В таких работах исследовалась связь определенных, в основном пыльцевых, аллергенов с системой HLA [16, 62]. Данные методы имели ряд ограничений, таких как трудоемкость и недостаточная достоверность, так, например, серологические методы позволяли различать аллели лишь на уровне групп. На сегодняшний день имеется значительное количество исследований по изучению ассоциаций между развитием атопических болезней и системой HLA, однако четких и достоверных данных явно недостаточно. В ряде исследований была установлена связь генов главного комплекса гистосовместимости с развитием чувствительности к определенным аллергенам [48], в других описана связь с конкретным фенотипом [140], и, наконец, существуют публикации, в которых показана роль определенных аллелей в формировании феномена атопии в целом [20].

Цель работы

Данная работа ставит целью изучить распределение групп аллелей гена DRB1 и аллелей генов DQA1 DQB1 и спектр специфических иммуноглобулинов Е у детей московского региона, страдающих бронхиальной астмой и атопическим дерматитом.

Задачи исследования

1. Сформировать группы пациентов с максимально сходными клиническими проявлениям бронхиальной астмы и атопического дерматита.

2. Определить спектр сенсибилизации к атопическим аллергенам с помощью тестов in vitro и in vivo у исследуемых больных.

3. Провести HLA-генотипирование обследованных больных с атопическими заболеваниями для установления ассоциаций между различными атопическими заболеваниями и системой HLA.

4. Оценить вклад аллелей гена DRB1 в развитии чувствительности к определенным аллергенам, формировании одного из фенотипов атопических болезней или в целом феномена атопии.

Научная новизна

Впервые на молекулярно-генетическом уровне был проведен анализ полиморфизма специфичностей генов HLA II класса (DRB1, DQB1 и DQA1) у больных с различными атопическим заболеваниями (атопическая бронхиальная астма, атопический дерматит), русских, проживающих в московском регионе.

При обследовании указанных больных был выявлен ряд особенностей в распределении специфичностей гена DRB1 у больных с атопическими заболеваниями: было установлено увеличение частоты встречаемости специфичности DRB1*07 у больных атопической бронхиальной астмой; было установлено увеличение частоты встречаемости специфичности DRB1*07 у больных атопическим дерматитом; при сравнении относительного риска (ОР) для развития атопического дерматита и атопической бронхиальной астмы, связанного со специфичностью DRB1*07, были получены одинаковые показатели; отсутствие различий в распределении других специфичностей генов HLA II класса, показало достоверность проведенных исследований (индивидуумы контрольной и экспериментальной группы были представителями одной популяции) сравнение полученных данных с результатами подобных исследований, проведенных во Франции, Испании, Англии и Турции, позволяет считать специфичность DRB1*07 маркером повышенного риска развития атопии.

Практическая значимость

Полученные в работе результаты представляют интерес для уточнения патогенетических механизмов развития атопических заболеваний. Полученные данные могут быть использованы для оценки риска развития атопической бронхиальной астмы у детей, страдающих атопическим дерматитом, позволят оценить относительный риск развития атопии у детей с отягощенным семейным анамнезом, а также предположить вероятность развития атопии у детей раннего возраста с повторяющимися эпизодами бронхообструкции.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. У больных атопнческим дерматитом и атопической бронхиальной астмой установлено повышение частоты встречаемости аллеля DRB1*07 по сравнению с контрольной группой (25% у больных в обеих группах и 13,33% в контрольной группе). Относительный риск в обоих случаях составил 2,17. Распределение частот других аллелей не отличалось от таковых в контрольной группе.

2. Обнаруженная связь аллеля DRBI*07 с атопической бронхиальной астмой и атопическим дерматитом не влияет на формирование определенного фенотипа болезни, а связана с наличием общей предрасположенности к развитию атопических заболеваний.

3. Широта спектра аллерген-специфических IgE положительно коррелирует с уровнем общего IgE, то есть и у больных атопическим дерматитом и бронхиальной астмой более высокие показатели общего IgE отмечались при выявлении специфических IgE к большому количеству исследуемых аллергенов, у больных с антителами к одному классу аллергенов установлены самые низкие уровни общего IgE.

4. Сравнение различных методов оценки сенсибилизации у детей показало, что при выявлении аллерген-специфических IgE к ограниченному числу аллергенов, результаты исследования полностью совпадают с данными аллергологического анамнеза и кожного тестирования. При расширении спектра специфических IgE клинические проявления сенсибилизации и результаты исследования in vivo не совпадали за счет отсутствия клинических признаков сенсибилизации, несмотря на выявление аллерген-специфических IgE в сыворотке.

5. Для больных атопической бронхиальной астмой, так и для больных атопическим дерматитом характерным являлось обнаружение аллерген-специфических IgE в сыворотке более чем к одному классу аллергенов. У больных бронхиальной астмой антитела к одному классу аллергенов были выявлены только в 12,6%, а у больных атопическим дерматитом в 20% случаев.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение генетической природы атопических болезней, которая в настоящее время является очевидной, представляет сложную многопараметрическую задачу. Определение клинического фенотипа одна из главных задач в изучении генетики атопических болезней. Так, например, не существует количественного маркера, специфичного для астмы, и нет никакого «золотого стандарта», обосновывающего диагностическую полноценность физиологических критериев, типа бронхиальной гиперреактивности [33]. В большей степени это даже применимо к таким атопическим заболевания как аллергический ринит и атопический дерматит, диагностика которых основывается на субъективных симптомах (заложенность носа, чихание, зуд), так как не существует базовых физиологических параметров, которые можно использовать для диагностики. Кроме того, клинические проявления аллергических болезней часто носят эпизодический характер и могут изменяться в течение жизни. Однако выделение конкретных признаков исследуемой болезни позволяет разделять генетические компоненты и анализировать более гомогенные черты [86].

Основным критерием для включения в исследуемую группу пациентов с атопической бронхиальной астмой были повторяющиеся эпизоды бронхообструкции, не менее 3-х эпизодов на момент включения, потребовавших применения бронхолитической терапии дома или в условиях стационара, а также повышение уровня общего IgE и наличие аллерген-специфических IgE в сыворотке крови, определяемых при помощи MAST-теста. Пациенты младше 3-х лет, а также больные, у которых не определялись аллерген-специфические IgE в сыворотке, в исследовании не участвовали. У большинства обследованных детей, не включенных в исследование, эпизоды бронхообструкции были связаны с течением респираторной вирусной инфекции, что подтверждалось при исследовании мазка с задней стенки глотки методом ПЦР-диагностики. В большинстве случаев была выявлена риновирусная инфекция, реже обнаруживались респираторно-синцитиальный и аденовирусы [12].

Для формирования группы больных с максимально схожим фенотипом атопического дерматита диагностика основывалась на критериях, сформулированных Hanifln и Rajka [64]. Кроме того, учитывая, что для атопического дерматита характерно волнообразное течение, наблюдение за больными, включенными в исследование, проводилось в течение не менее 2-х лет. При отсутствии рецидивов дерматита в течение этого времени пациенты исключались из исследования.

Анализируя содержание сывороточных аллерген-специфических IgE, было установлено, что обнаружение AC-IgE к нескольким классам аллергенов было характерно как для больных бронхиальной астмой, так и для больных атопическим дерматитом. При этом в группе больных бронхиальной астмой антитела к одному классу аллергенов были выявлены только у 12,6%, а у больных атопическим дерматитом в 20% случаев. Сравнивая качественный состав спектра можно отметить преобладание аллерген-специфических IgE к бытовым и эпидермальным аллергенам-у больных бронхиальной астмой, в то время как у больных атопическим дерматитом преобладали антитела к грибковым- и пищевым аллергенам. При этом отмечалась высокая корреляция между уровнем общего IgE и распространенностью спектра специфических IgE. Соответственно, чем, выше уровень общего IgE, тем шире качественный состав спектра специфических иммуноглобулинов Е. При этом, важно- отметить, что клинические проявления сенсибилизации при расширении спектра специфических IgE нарастали не существенно, и выявленные антитела, по всей видимости, являлись латентной сенсибилизацией. Хотя определение аллерген-специфических IgE в сыворотке хорошо воспроизводимая методика, связь этого параметра с силой дегрануляции тучных клеток, развивающейся после контакта с аллергеном и приводящей к развитию клинических' проявлений атопических заболеваний, изучена недостаточно. Так в исследовании, проведенном Marchand и др. на линии генетически модифицированных тучных клеток крыс (RBL), имеющих а-цепь высокоаффинного человеческого рецептора к IgE (FcepsilonRI), была обнаружена высокая степень корреляции между дегрануляцией тучных клеток и пропорциональным содержанием фиксированных на поверхности тучных клеток аллерген-специфических IgE. В то же время, корреляции между содержанием сывороточных аллерген-специфических IgE и степенью дегрануляции тучных клеток установлено не было [93]. Таким образом, активация тучных клеток через IgE-зависимый механизм у пациентов с атопией - это результат сложного взаимодействия, которое зависит не только от содержания алллеген-специфических IgE, но и других факторов, обеспечивающих эффективное взаимодействие IgE с рецепторами на поверхности тучных клеток, а также поступлению сигналов, приводящих к развитию дегрануляции тучных клеток.

С другой стороны, можно предположить, что выработка высоких уровней общего IgE, которая определяется генетическими факторами, и развивается не только при атопии, но и при других состояниях, например паразитарных болезнях, приводит к появлению IgE антител различной специфичности без развития феномена сенсибилизации (фиксации IgE на тучных клетках).

Учитывая современные представления о природе гетерогенных болезней с наследственной предрасположенностью, предполагается, что совокупность генов, отвечающих за формирование подверженности к ним, образуют сеть связанных между собой элементов, эффекты взаимодействия которых, на уровне белковых продуктов определяют биохимическую индивидуальность человека. В зависимости от этого у индивидуума формируется присущая ему высокая или низкая степень предрасположенности к тому или иному заболеванию, которая» в случае действия соответствующих факторов внешней среды реализуется патологическим фенотипом.

В настоящее время установлено множество генов, играющих ключевую роль в развитии атопических заболеваний. Наиболее очевидные доказательства получены для генов, расположенных на следующих хромосомах. Участок 5q23-35 содержит гены ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9, ИЛ-13, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, р2 - адренергический-рецептор и глюкокортикостероидный рецептор, хромосома 6р21-23 содержит гены, кодирующие комплекс генов МНС и ФНО, участок хромосомы. Ilql3 содержит гены р-цепи FceRI, 12ql4-24 - интерферон у, р субъединицу нуклеарного фактора Y, STAT-6, нитрооксид синтазу 1 и участок 14qll-13 а и Р-цепи Т-клеточного рецептора.

Однако большинство заключений, сделанных на основании исследования этих сцеплений, в лучшем случае, спекулятивны. Каждый из регионов, для которых были получены достоверные доказательства сцепления, содержит множество кандидатных генов. Сцепление с любым из этих регионов распространяется на достаточно большую часть хромосомы 10 сантимогран (сМ), (1сМ равен 1 миллиону пар оснований) и более, следовательно, точное определение специфичного локуса достаточно затруднительно [55].

Статистические подходы, обычно используемые для анализа сцепления, позволяют определить узкую область, которая все еще может включать сотни генов. Поэтому изучение полиморфизма аллелей определенных генов может стать следующим шагом в изучении генетической структуры атопических болезней.

В большинстве полно-геномных исследований было установлено стойкое сцепление атопии и региона, генов МНС, который можно рассматривать как один из главных локусов, влияющих на развитие атопических болезней [37, 45, 66, 105, 124, 135]. Важнейшими функциями системы генов тканевой гистосовместимости являются генетический контроль иммунного ответа и поддержание «нормального» иммунного гомеостаза, нарушение которого лежит в основе целого ряда патологических процессов. Первые работы по изучение возможной роли антигенов HLA класса II в развитии атопических заболеваний были проведены в 70-х годах [62]. В таких работах исследовалась связь определенных, в основном пыльцевых аллергенов с системой HLA. Проведенные в последние годы исследования, в которых для определения HLA генотипа использовалось молекулярно-генетическое ДНК-типирование, в основе которого лежит полимеразная цепная реакция, установили связь различных проявлений атопии с некоторыми аллелями генов DR, DQ, DP HLA II класса [19, 20, 38, 73, 117]. В таблице 19 представлены наиболее очевидные доказательства связи системы HLA с атопией, полученные в последние годы.

Табл. 19. Связь аллей HLA II класса с развитием атопических заболеваний.

Аллель HLA II класса Состояние Авторы, страна

DRB1*07 Атопия Агоп и др. [19], Франция

DRB1*07 DRB1*04 Атопия Агоп и др. [20], Франция

DRB1*07 Атопия Senechal и др. [117], Франция

DRB1*07 Атопия Kalpaklioglu и др. [73], Турция

DRB1*07 Атопия Cardaba и др. [38], Испания

DRB1*07 Сенсибилизация к аллергенам лабораторных животных (крыс) Jeal и др. [71], Англия

DRB1*07 Сенсибилизация к клещам домашней пыли Kim и др. [77], Китай

DRB1*0101 и DRB1*0102 Сенсибилизация к аллергену тараканов Donfack др. [48], Америка, (хуттериты и афро-американцы)

Из таблицы 19 видно, что в различных работах по изучению связей определенных аллелей генов HLA класса II с развитием атопических заболеваний, было продемонстрировано существенное увеличение частоты встречаемости аллеля DRB1*07 у атопиков. Причем присутствие этого аллеля определяло не выраженность определенного клинического фенотипа или повышенную чувствительность к какому-либо аллергену, а влияло на развитие атопии в целом. Такие выводы были сделаны различными авторами, независимо, от первоначального дизайна исследований. В большинстве случаев в исследуемую группу набирались пациенты с определенной сенсибилизацией, однако, при расширенном обследовании выявлялась сенсибилизация и к другим аллергенам. При оценке выраженности клинических проявлений, которые варьировали от ринита до астмы, также не удавалось выявить каких-либо закономерностей. В тоже время, исследуемая группа достоверно отличалась от контрольной по частоте встречаемости определенных аллелей, следовательно, эти аллели были связаны в целом с развитием феномена атопии.

При проведении генетических исследований, особенно при изучении полигенных заболеваний, важно, чтобы результаты, получаемые для представителей одной расы, были соотносимы между собой.

Мы сравнили частоту встречаемости аллелей HLA II класса у детей, страдающих атопической бронхиальной астмой, атопическим дерматитом и контрольной группой. В исследование были включены больные, русские, проживающие в Москве. В качестве контрольной группы были использованы результаты HLA-типирования здоровых русских, проживающих в г. Москве.

В нашем исследовании как больные атопической бронхиальной астмой, так и больные атопическим дерматитом достоверно отличалась по частоте встречаемости аллеля DRB1*07 от здоровых представителей популяции. Частота встречаемости специфичности DRB1*07 у больных атопическим дерматитом и бронхиальной астмой была одинаковой и составила 25%, в контрольной группе 13,33%. При сравнении распределения других специфичностей гена DRB1 у больных бронхиальной астмой и атопическим дерматитом, а также здоровыми представителями популяции не было установлено статистически' значимых отличий. При этом важно отметить, что относительный риск для этого аллеля у больных и астмой и дерматитом был одинаковым и составлял 2,17. Известно, что можно судить о связи определенных аллелей с различными болезнями, если относительный риск равен или больше 2. Как уже было продемонстрировано, большая часть пациентов с бронхиальной астмой имели признаки атопического дерматита на первом году жизни или проявления дерматита, присутствовавшие у больного на момент включения, которые, однако, не являлись ведущим симптомом для обращения к врачу или определяющими тяжесть состояния. В тоже время у части пациентов с диагнозом атопический дерматит были установлены признаки бронхиальной астмы, которые также не определяли тяжесть состояния и не являлись основным симптомом. У части больных с атопическим дерматитом бронхиальная астма развилась в течение 2-х лет от момента включения в исследование. Как уже отмечалось выше, сенсибилизация к одной группе аллергенов была выявлена у небольшого числа обследованных. Таким образом, установленные ассоциации для специфичности гена DRB1*07 не связаны с развитием повышенной чувствительности к определенному аллергену, и не влияют на формирование одного из клинических фенотипов атопических болезней, а связаны в целом с развитием феномена атопии.

Результаты, полученные в ходе нашей работы, схожи с данными, полученными при исследовании пациентов из Франции, Испании и Турции, где также исследовались представители кавказоидной расы. На основании результатов этих наблюдений были сделаны заключения о повышении относительного риска для аллеля DRB1*07 при различных проявлениях атопии. Следует отметить, что частота встречаемости аллеля DRB1*07 в популяции у французов, русских и испанцев находится приблизительно на одинаковом уровне (15,33%, 13,33%,13,71%).

В настоящее время рассматривается теория, по которой в формировании атопических болезней участвуют, как минимум, три группы генов: первая группа - гены, в общем предрасполагающие к развитию атопии, вторая - гены, специфичные для определенного заболевания, в этой группе рассматриваются гены, влияющие на развитие гиперреактивности бронхов, хронического воспаления дыхательных путей, и, третья группа - потенциально меньшие гены, определяющие выраженность того или иного клинического фенотипа. Ключевой компонент сложной мозаики - влияние окружающей среды, которая определяет проявления атопических болезней. Повышенная чувствительность к специфическому аллергену развивается, как правило, при низкодозовой экспозиции аллергена, что приводит к последующему развитию специфического IgE-ответа у генетически-предрасположенного индивидуума. Примером чего является развитие сенсибилизации к бытовым аллергенам при бронхиальной астме. При этом взаимодействие факторов окружающей среды и генетической предрасположенности можно разделить на две категории: (1) влияние окружающей среды на риск развития болезни у людей с различным генотипом, и (2) влияние специфического генотипа на риск развития атопических болезней у индивидуумов, подвергающимся воздействию различных факторов окружающей среды.

По всей видимости, гены системы HLA влияют на развитие атопии, и аллель DRB1*07 может рассматриваться как маркер атопии у представителей кавказоидной расы. При этом особый интерес представляет поиск аллеля -протектора. В некоторых работах сообщается о достоверном повышении частоты встречаемости некоторых аллелей у представителей контрольной группы, не страдающих атопическими заболеваниями [77]. Однако, таких работ не достаточно. В нашем исследовании несколько чаще в контрольной группе по сравнению с двумя исследуемыми определялись аллели DRB1*15 DRB1*11, в то же время проведение статистического анализа не выявило достоверных различий.