Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Создание тест-системы для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови человека
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Оглавление диссертации Аббасова, Светлана Георгиевна :: 1999 :: Москва
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Fas/FasL система в норме и при патологии обзор данных литературы).
1.1. Fas и семейство peueirropoBTNF.
1.2. FasL и семейство TNF.
1.3. Функции Fas-системы в организме.
1.3.1. Регуляция иммунного ответа.
1.3.2. FasL - эффектор цитотоксических Т- лимфоцитов и натуральных киллеров.
1.3.3. Иммунная привилегия.
1.4. Молекулярные механизмы Fas-Опосредованных процессов.
1.4.1. Основные белки, участвующие в передаче сигнала апоптоза от активированного Fas к протеазам.
1.4.2. Значение ICE-протеаз в Fas-индуцированном апоптозе.
Каскад 1СЕ-протеаз.
1.4.3. Fas-опосредованная активация Nf-кЬ.
1.5. Ингибиторы сигнального пути.
1.5.1. Семейство Вс1-2.
1.5.2. FLICE-ингибирующий белок - FLIP.
1.6. Другие рёгуляторы сигнального пути.
1.7. Fas-система при патологии.
1.7.1. Снижение активности Fas-системы. Растворимый Fas.
1.7.2. Повышенная активность Fas-системы.
Введение диссертации по теме "Онкология", Аббасова, Светлана Георгиевна, автореферат
Актуальность проблемы. Апоптоз, или программированная клеточная гибель - исключительно важный механизм поддержания гомеостаза многоклеточного организма. Нарушения этого процесса лежат в основе многих патологий, к числу которых, в первую очередь, относятся злокачественные опухоли. Основной характеристикой этих новообразований является способность к неограниченному росту и устойчивость к действию факторов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки. Среди других заболеваний, обусловленных апоптоз-зависимыми патогенетическими механизмами, следует отметить болезнь Альцгеймера, множественный рассеянный склероз, амиотрофный латеральный склероз, некоторые лимфопролиферативные нарушения и др.
Одним из ключевых рецепторов, запускающих апоптоз в клетке, является Fas. Fas/APO-l/CD95 - трансмембранный гликопротеин первого типа, относящийся к семейству рецепторов TNF/NGF (Itoh et al., 1991; Oehm et al., 1992). Fas экспрессируется в различных тканях организма - тимусе, почках, печени, сердце, легких, он также экспонирован на активированных лимфоцитах, натуральных киллерах, вирус-инфицированных и опухолевых клетках (Nagata and Golstein, 1995).
Подобно рецептору TNF р55, Fas запускает в клетке апоптоз после взаимодействия со своим лигандом (FasL) или агонистическими моноклональными антителами (MA) против Fas. В последние годы усилиями многих исследователей были выявлены основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Взаимодействие Fas с FasL или агонистическими МА против Fas приводит к активации протеаз caspase-8 или caspase-2 через адапторные белки FADD/MORT-1 или RIP и RAIDD. FLICE-ингибирующий белок FLIP блокирует активацию caspase-8, таким образом, ингибируя апоптоз. Активированные протеазы расщепляют жизненно необходимые для клетки субстраты, такие как поли(АДФ)рибозилполимеразу, ламин и другие и опосредуют функциональные и морфологические изменения цитоплазмы и ядра клетки, типичные для апоптоза.
Были выявлены значительные отклонения в экспрессии, структуре, и функционировании этих белков при различных заболеваниях, таких как злокачественные опухоли, СПИД, тйреоидиты, гепатиты, миокардиты и др.
Кроме мутаций в генах Fas и FasL, приводящих к неэффективной работе Fas-системы, причиной устойчивости различных типов клеток к Fas-зависимому апоптозу может быть повышенная продукция растворимого Fas этими клетками. Растворимый Fas связывается с FasL, ингибируя действие последнего, и обеспечивает клеткам-продуцентам растворимого Fas преимущества в выживании и размножении. С помощью молекулярного клонирования и анализа нуклеотидной последовательности было показано, что растворимый Fas (sFas) является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas
Cheng et al., 1994; Cascino et al.,1995). Актуальность исследования определяется необходимостью количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови онкологических больных, как одного из возможных факторов, определяющих злокачественность опухоли, причем в конкретной клинической ситуации.
Цель настоящего исследования - разработать иммуноферментную тест-систему типа «сэндвич» для количественного определения sFas в сыворотке крови человека. В соответствии с этим, нам предстояло решить следующие задачи:
1.Получить гибридомы, продуцирющие высокоспецифичные антитела против полноразмерного Fas. Эта часть работы включала иммунизацию животных, тестирование мышиных антисывороток в ходе иммунизации, гибридизацию иммунных спленоцитов мыши с клетками мышиной миеломы, тестирование культуральной жидкости выращенных гибридом методом ИФА, клонирование и реклонирование положительных гибридных клеток, выделение полученных МА из асцитных жидкостей мышей.
2.0характеризовать полученные моноклональные антитела. Этот этап исследования состоял в получении гомогенных препаратов моноклональных антител, определении констант аффинности и классификации МА, определении специфичности МА по отношению к Fas методом иммуноблоттинга, тестировании функциональной активности полученных антител.
3.Разработать иммуноферментную тест-систему типа «сэндвич» на основе полученных моноклональных антител и оценить её чувствительность.
4.0пределить количественное содержание растворимого Fas в сыворотке крови онкологических больных с различной морфологией и локализацией злокачественных новообразований, а также в сыворотке крови практически здоровых лиц контрольной группы.
Научно-практическая значимость исследования. Впервые в нашей стране разработана тест-система для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови человека. С помощью этой системы на большом клиническом материале проведено определение растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных злокачественными новообразованиями различной морфологии и.локализации.
Апробация работы. Диссертация апробирована на межотделенческой конференции РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 26 января 1999г. Материалы диссертации доложены на IV чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, ноябрь 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, раздела собственных данных, краткого заключения, выводов, списка
Заключение диссертационного исследования на тему "Создание тест-системы для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови человека"
ВЫВОДЫ:
Г. Получена и охарактеризована панель из девяти моноклональных антител против человеческого Fas-антигена: определены класс и подкласс тяжелой цепи иммуноглобулинов, типы их легких цепей, константы связывания с антигеном.
2. Показана возможность применения моноклональных антител против Fas SA-8 и SA-7 в иммуноблоттинге.
3. Антитела SA-8 при концентрации 10 и более мкг/мл обладали цитотоксической активностью относительно человеческой Т-клеточной линии Jurkat в присутствии циклогексимида.
4. На основе полученных антител разработана тест-система в варианте "сэндвич"-ИФА для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови человека. Нижний предел чувствительности метода составляет 0,52 нг/мл данного белка. i
5. Растворимый Fas-антиген выявлялся наиболее часто и уровни его определения были самые высокие в сыворотке крови больных опухолью Юинга (100% - 6,66 нг/мл), остеосаркомой (85,7% -7,46 нг/мл), раком яичников (87,6% - 4,74 нг/мл), раком предстательной железы (80% - 3,35 нг/мл) и узловым эутиреоидным зобом (71,4% - 6,02 нг/мл) по сравнению с контрольной группы практически здоровых людей (36% - 0,86 нг/мл). Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать разработанную тест-систему для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови в клинических исследованиях.
Заключение.
Апоптоз, или программированная клеточная гибель — один из важнейших физиологических процессов, обеспечивающих гибель клеток во время эмбриогенеза, метаморфозов, эндокрин-зависимой атрофии тканей и в процессе удаления стареющих или активированных клеток. Устойчивость некоторых типов клеток к факторам, индуцирующим апоптоз, может создать основу для размножения опасных для организма клеток, к числу которых, в первую очередь, относятся клетки злокачественных опухолей. Целью настоящей работы было создание иммуноферментной тест-системы типа "сэндвич" для количественного определения растворимого Fas-антигена в сыворотке крови онкологических больных, как одного из ключевых регуляторов апоптоза, изучение его роли в прогнозе заболевания.
Задача, поставленная перед нами, включала в себя три основных этапа: получение МА к полноразмерной молекуле человеческого Fas-антигена; возможно более полную характеристику полученных антител и создание на их основе тест-системы для количественного определения растворимого рецептора. Нам предстояло также определить концентрацию растворимого Fas в сыворотке крови онкологических больных и практически здоровых лиц контрольной группы.
Для выполнения поставленной задачи необходимо было получить достаточно представительную панель МА против полноразмерной молекулы коммерчески доступного препарата человеческого рекомбинантного бакуловирусного Fas. Для создания подобной тест-системы необходимы антитела к достаточно удаленным друг от друга эпитопам, а получение именно такой пары антител — процесс случайный. Создание представительной панели антител было определяющим этапом работы. Нам удалось получить 18 положительных гибридов, продуцирующих МА против Fas, из которых для дальнейшей работы было отобрано 9 наиболее активных клонов. Антитела были наработаны в асцитной жидкости мышей, выделены, охарактеризованы. Характеристика полученных антител включала в себя определение классов и подклассов иммуноглобулинов, типов их легких цепей, а также констант связывания с антигеном, определение специфичности полученных антител по отношению к Fas методом иммуноблоттинга и оценку цитотоксической активности полученных антител. Для антител SA-7 и SA-8 была показана возможность их применения в методе Western-блот анализа. Результаты применения антител в этом методе для клеточных экстрактов некоторых человеческих клеточных линий показали, что не во всех случаях определяется лишь одна полоса, соответствующая молекулярной массе молекулы Fas, хотя эта полоса всегда является мажорной. Антитела в этом методе не взаимодействовали с белками экстракта мышиной линии L929, что может свидетельствовать о видоспецифичности полученных антител. Хотя иммуноблоттинг не позволяет количественно оценить содержание антигена, тем не менее, способность антител работать в этом варианте анализа является в некоторых случаях достаточно полезной и значительно расширяет возможности экспериментатора.
Оценку цитотоксической активности проводили при помощи МТТ-теста. Антитела SA-8 (IgGl) обладали цитотоксической активностью относительно линии человеческих клеток Jurkat в концентрации 10 и более мкг/мл, что, возможно, объясняется константой связывания этих антител с экстраклеточной частью Fas.
Один из наиболее важных этапов работы состоял в разработке тестсистемы типа "сэндвич" на основе полученных антител. Лишь один из всех i возможных вариантов удовлетворял требованиям, которым должна была отвечать данная тест-система, а именно: обладать высокой чувствительностью и специфичностью. Нижний предел чувствительности разработанной тест-системы составил 0,52 нг/мл, что не уступает чувствительности аналогичных тест-систем, описанных в литературе.
На третьем заключительном этапе работы нами была определена концентрация растворимого Fas-антигена в сыворотке первичных пациентов с остеосаркомой и синовиальной саркомой, опухолью Юинга, раком яичников, желудка, предстательной железы и толстой кишки, узловым эутирео'идным зобом, доброкачественной гиперплазией предстательной железы, а также у практически здоровых лиц контрольной группы. Всего было протестировано более 200 образцов различных сывороток, полученных стандартным способом и хранившихся до использования при -20°С. Концентрация растворимого Fas была весьма различной: от 0 до 28 нг/мл. Наиболее часто растворимый Fas определялся при остеогенной саркоме (85,7%), саркоме Юинга (100%), раке яичников (87,6%) при частоте выявления у здоровых лиц — 36%. Наиболее высокие показатели были также при этих заболеваниях: при остеогенной саркоме — от 1,95 до 24,6 нг/мл, опухоли Юинга— 1,28-12,3 нг/мл, раке яичников — 0,65-14,9 нг/мл, тогда как в контрольной группе этот показатель колебался от 0,7 до 1,2 нг/мл.
Значимость полученных показателей в прогнозе заболевания пока не определена, для выяснения этого вопроса необходимо дальнейшее наблюдение всех групп обследованных больных, поиск корреляции уровня растворимого Fas с другими биохимическими показателями, клинико-морфологическими критериями онкологического заболевания и общепризнанными факторами прогноза болезни.
Таким образом, полученные результаты позволяют рекомендовать использование данной тест-системы для определения концентрации растворимого Fas в сыворотке крови человека.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 1999 года, Аббасова, Светлана Георгиевна
1. Abreu-Martin, М.Т., A. Vidrich, D.H. Lynch, & S.R. Targan (1995). Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF-a and ligation of Fas antigen. J. Immunol. 155, 4147-4154
2. Adachi, M., S. Suematsu, T. Kondo et al. (1995). Targeted mutation in the Fas gene causes hyperplasia in peripheral lymphoid organs and liver. Nature Genet. 11, 294-299.
3. Alnemri, E.S., D.J. Livingston, D.W. Nicolson et al. (1996). Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell 87, 171.
4. Androlewicz, M.J., J.L. Browning, and C.F. Ware (1992). Lymphotoxin is expressed as a heteromeric complex with a distinct 33-kDa glycoprotein on the surface of an activated human T cell hybridoma. J. Biol. Chem. 261, 25422547.
5. Banner, D.W., A. D'Arcy, W. Janes et al. (1993). Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNFß complex: implication for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445.
6. Baryshnikov A.Yu., Zabotina T.N., Sedyakhina N.P. et al. (1994). Thecoexpression of CD34-antigen of early hemopoietic precursors and Fas/APO-1 (CD95) antigen mediating apoptosis. Exp. Oncology 16, 343-347.
7. Beatty, J.D., Beatty B.G. and Vlahos W.G. (1987). Measurement of monoclonal antibody by non-competitive enzyme immunoassay. J. Immunol.1. Methods 100,113-119.
8. Beg, A.A. and D. Baltimor (1996). An Essential Role for NF-kB in Preventing
9. TNF-a-Induced Cell Death. Science 274, 782-784.
10. Behrmann, I., Walczak, H., Krammer, P. Eur. J. Immunol. 24, 3057 (1994).1 l.Bellgrau, D., D. Gold, H. Selawry et al. (1995). A role for CD95 ligand in preventing graft rejection. Nature 377, 630-632.
11. Bodmer, J. et al. Immunity 6, 79 (1997).
12. Boise, L.H., A.J. Minn, P.J. Noel et al. (1995). CD28 costimulation canipromote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-xL. Immunity 3, 87-98.
13. Boldin, M.P., E.E. Varfolomeev, Z. Pancer, I.L. Mett, J.H. Camonis, and D. Wallach (1995b). A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APOl contains a sequence motif related to the death domain. J. Biol. Chem. 270, 7795-7798.
14. Boldin, M., T.M. Goncharov, Y.V. Goltsev, and D. Wallach (1996). Involvment of MACH, a Novel MORTl/FADD-Interacting Protease, in Fas/APO-1- and TNF Receptor-Induced Cell Death. Cell 85, 803-815.
15. Boldin M., Mett I., Varfolomeev E. et al. (1995a). Self-association of the "Death Domains" of the p55 Tumor Necrosis Factor and Fas/APOl Prompts Signaling for TNF and Fas/APOl Effects. J. Biol. Chem. 270, 387-391.
16. Brodeur, B.R., Tsang P. and Larose Y. (1984). Parameters affecting ascites tumor formation in mice and monoclonal antibody production. J. Immunol1. Methods 71, 265-272.
17. Brojatsch, J., J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler, and J.A.T. Young (1996).
18. CAR1, a TNFR-related protein, is a cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87, 845-855.
19. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., and Ruberti G. (1995). Three Functional
20. Soluble Forms of the Human Apoptosis-Inducing Fas Molecule Are Producedby Alternative Splicing. J. of Immunol. 154, 2706-2713. i .
21. Cheng J., Zhou T., Liu C. et al. (1994). Protection from Fas-Mediated
22. Apoptosis by a Soluble Form of the Fas Molecule. Science 263, 1759-1762.
23. Chinnaiyan, A.M., K. O'Rourke, G.-L. Yu et al. (1996). Signal transduction by DR-3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274, 990-992.
24. Chinnaiyan, A.M., K. O'Rourke, M. Tewari, and V.M. Dixit (1995). FADD, a Novel Death Domain-Containing Protein, Interacts with the Death Domain of Fas and Initiates Apoptosis. Cell 81, 505-512.
25. Ciusani E., S. Frigerio, M. Gelati et al. (1998). Soluble Fas (Apo-1) levels in cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients. J. Of Neuroimmunol. 82: 512.
26. Clark, R., Engvall E. (1981) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Theoretical and practical aspects. Enzyme-Immunoassay (E.T. Maggio ed.) Boca Raton, Florida, 167-169.
27. Cohen, P.L., and R.A. Eisenberg (1991). Lpr and gld: single gene models of systemic autoimmunity and lymphoproliferative disease. Annu. Rev. Immunol. 9, 243-269.
28. Darmon, A.J., D.W. Nicholson, and R.C. Bleackley (1995). Activation of theapoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Naturei.377, 446-448.
29. Duan, H. and Dixit V. (1997). RAIDD is a new 'death' adaptor molecule. Nature 385, 86-89.
30. Ellis, R.E., J. Yuan, and H.R. Horvitz (1991). Mechanisms and functions of cell death. Annu. Rev. Cell Biol. 7, 663-698.
31. Ellis, R.E., Jacobson, D., Horvitz, H. (1991) Genetics 129, 79.
32. Enari, M., R.V. Talanian, W.W. Wong, and S. Nagata (1996). Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis. Nature 380, 723-726.
33. Enari, M., A. Hase, and S. Nagata (1995a). Apoptosis by a cytosolic extractfrom Fas-activated cells. EMBOJ. 14, 5201-5208.
34. Enari, M., H. Hug and S. Nagata (1995b). Involvment of an ICE-like protease in Fas-mediated apoptosis. Nature 375, 78-81.
35. Fadeel B., C.J. Thorpe, S. Yonehara, and F. Chiodi (1997). Anti-Fas IgGl antibodies recognizing the same epitope of Fas/APO-1 mediate different biological effects in vitro. Int. Immunol. 9: 201-209.
36. Fadok, V. et al. (1992) J. Immunol. 148,2207.
37. Fazekas, de St.Groth. (1985). Monoclonal antibodies production: principlesand practice. In: Handbook of Monoclonal Antibodies. Applications in
38. Biology and Medicine. Ferrone S. and Dierich M.P. (Eds.), Noyes Publ., New1. Jersey, USA,.i £
39. Fazekas, de St.Groth and Scheidegger D. (1980). Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. J. Immunol. Methods 35, 1-21.
40. Fisher, G.H., F.J. Rosenberg, S.E. Straus et al. (1995). Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Cell 81, 935-946. f
41. Fushimi, M., F. Furukawa, Y. Tokura et al. (1998). Membranous and soluble forms of Fas antigen in cutaneous lupus erythematosus. J. Dermatol. 25, 302308.
42. Gajewski, T.F. and C.B. Thompson (1996). Apoptosis meets signal transduction: elimination of BAD influence. Cell 87, 589-592.
43. Garnen, S., I. Marzo, A. Anel, A. Pineiro, and J. Naval (1996). CPP32 inhibition prevents Fas-induced ceramide generation and apoptosis in human cells. FEBS Lett 390, 233-237.
44. Goel N., D.T. Ulrich, E. William et al. (1995). Lack of Correlation between Serum Soluble Fas/APO-1 Levels and Autoimmune Disease. Arthritis&Rheumatism 38: 1738-1743.
45. Goodwin, R.G., D Freind., S.F. Ziegler et al. (1990). Cloning of the human and murine interleukin 7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell 60, 941-950.
46. Grell, M., E. Douni, H. Wajant et al. (1995). The transmembrane form of thetumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumori.
47. Grell, V., P.H. Krammer, and P. Scheurich (1994). Segregation of APO-l/Fas antigen- and tumor necrosis factor receptor-mediated apoptosis. Eur. J. Immunol. 24: 2563-2566.
48. Griffith, T.S., T. Brunner, S.M. Fletcher, D.R. Green, and T.A Ferguson (1995). Fas Ligand-Induced Apoptosis as a Mechanism of Immune Privilege. Science 270, 1189-1192.
49. Hahne, M., D. Rimoldi, M. Schröter et al. (1996). Melanoma Cell Expression of Fas(Apo-l/CD95)Ligand: Implications for Tumor Immune Escape. Science 274, 1363-1366.
50. Hasunuma T., N. Kayagaki, H. Asahara et al. (1997). Accumulation of soluble Fas in Inflamed Joints of Patients with Rheumatoid Arthriris. Arthritis&Rheumatism 40: 80-86.
51. Heller, R.A., Song K., Onasch M.A. et al. (1990). Complementary DNA cloning of a receptor for tumor necrosis factor and demonstration of a shed form of the receptor. Proc. Natl, Acad. Sei. USA 87, 6151-6155.
52. Hengartner, M.O., and H.R. Horvitz (1994). C. elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian protooncogene bcl-2. Cell 76, 665-676.
53. Hoogenraad, N., Helman E. and Hoogenraad J. (1983). The effect of preinjection of mice with pristan on ascites tumor formation and monoclonali.
54. Hsu, H., H.-B. Shu, M.-G. Pan, and D.V. Goeddel (1996). TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transcription pathways. Cell 84, 299-308.
55. Hsu, H., J. Xiong, D.V. and Goeddel (1995). The TNF Receptor 1-Associated Protein TRADD Signals Cell Death and NF-kB Activation. Cell 81, 495-504.
56. Huang, B., M. Eberstadt, E.T. Olejniczak, R.P. Meadows & S.W. Fesik (1996). NMR structure and mutagenesis of the Fas(APO-l/CD95) death domain. Nature 384, 638-641.
57. Hueber A., Zornig M., Lyon D. et al. (1997). Requirement for the CD95
58. Itoh, N., Y. Tsujimoto, and S. Nagata (1993b). Effect of bcl-2 on Fas antigenmediated cell death. J. Immunol. 151, 621-627. 60.Itoh, N. and S. Nagata (1993a). A Novel Protein Domain Required for Apoptosis. J. Biol. Chem. 268, 10932-10937.
59. Jodo, S., S. Kobayashi, Y. Nakajima et al. (1998). Elevated serum levels of a soluble Fas/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma. Clin. Exp. Immunol. 112,166-171.
60. Josimovic-Alasevic, O., Herrmann T., and Diamastein T. (1988). Demonstration of two distinct forms of released low-affinity type interleukin 2 receptors. Eur. J. Immunol. 18, 1855-1891.
61. Kdhler, G. and Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of redefined specificity. Nature 256, 495-497
62. Kang S.-M.,-Schneider D.B., Lin Z. et al. (1997). Fas ligand expression in islets of Langerhans does not confer immune privilege and instead targets them for rapid destruction. Nature Med. 3, 738-743.
63. Kennett, R.J., McKearn TJ. and Bechtol K.B. (1980). (Eds.). Monoclonal antibodies hybridomas: A new dimension in biological analysis. New York, Plenum Press.
64. Kischkel, F.C., S. Hellbardt, I. Behrmann et al. (1995). Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with receptor. EMBO J. 14, 5579-5588.
65. Kiston, J., T. Raven, Y.-P. Jiang et al. (1996). A death-domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nature 384, 372-375.
66. Knipping E., P.H. Krammer, K.B. Onel et al. (1995). Levels of soluble Fas/APO-l/CD95 in systemic lupus erythematosus and juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis&Rheumatism 38: 1735-1737.
67. Knudson, C.M., K.S. Tung, W.G. Tourtellotte, G.A. Brown, and S.J. Korsmeyer (1995). Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science 270,96-99.
68. Krippner, A., A. Matsuno-Yagi, R. Gottlieb, and B. Babior (1996). Loss of function of cytochrome c in Jurkat cells undergoing Fas-mediated apoptosis.
69. J. Biol Chem. 271,21629-21636.
70. Kuida K., Zheng T.S., Na S. et al. (1996). Decreased apoptosis in the brain and premature lethality in CPP32-deficient mice. Nature 384, 368-372.
71. Lacronique V., Mignon A., Fabre M. et al. (1996). Bcl-2 protects from lethal hepatic apoptosis induced by an anti-Fas antibody in mice. Nature Med. 2, 8086.
72. Langone, J.J. and van Vunakis FL (1983). (Eds.). Immunochemical techniques part E: Monoclonal antibodies. Methods in Enzymology, v. 92, New York, Acad. Press.
73. Lau, H.T., M. Yu, A. Fontana, and C.J. StoeckertJr. (1996). Prevention of islet allograft rejection with engineered myoblasts expressing FasL in mice. Science 273,109-112. ' '
74. Lee S.H., S.Y. Kim, J.Y. Lee et al. (1998). Detection of soluble Fas mRNA Using In Situ Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. Lab. Invest. 4:453-459.
75. Lenczowski, J.M., L. Dominguez, A. Eder et al. (1997). Lack of a role for Jun kinase and AP-1 in Fas-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17, 170-181.
76. Li, P., H. Allen, S. Banerjee et al. (1995). Mice deficient in IL-1 (3-Converting enzyme are defective in production of mature IL-1(3 and resistant to endotoxic shock. Cell 80, 401-411.
77. Liu, Z.-G., H. Hsu, D. Goeddel, and M. Karin (1996). Dissection of TNFreceptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kB activation prevents cell death. Cell 87, 565-576.
78. Los, M., M. Craen, L.C. Penning et al. (1995). Requirement of an ICE/CED-3 protease for Fas/APO-1-mediated apoptosis. Nature 375, 81 -83.
79. Malinin N., Boldin M., Kovalenko A., &Wallach D. (1997). MAP3K-related kinase involved in NF-kB induction by TNF, CD95 and IL-1. Nature 385, 540544.
80. Marsters S.A., Sheridan J.P., Pitti R.M. et al. (1998). Identification of a ligand for the death-domain-containing receptor Apo3. Curr. Biol. 8, 525-528.
81. Marzo I., S.A. Susin, P.X. Petit et al. (1998) Caspases disrupt mitochondrialmembrane barrier function. FEBS Lett 427, 198-202. ■
82. Montgomery, R.I., M.S. Warner, B.J. Linn, and P.G. Spear (1996). Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87, 427-436.
83. Mosley, B., Beckman M.P., March C.J. et al. (1989). The murine interleukin-4 receptor molecular cloning and characterization of secreted and membrane bound forms. Cell 59, 335-343.
84. Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. J. Immunol. Methods, 65(1), 55-63.
85. Motoyama, N., F. Wang, K.A. Roth et al. (1995). Massive cell death ofimmature hematopoietic cells and neurons in Bcl-x-deficient mice. Science 261, 1506-1510.
86. Muchmore, S.W., M. Sattlet, H. Liang et al. (1996). X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death. Nature 381, 335-341.
87. Munker-R; Younes-A; Cabanillas-F; Andreeff-M. (1997). Soluble CD95 in the serum of patients with low and intermediate grade malignant lymphomas: absence of prognostic correlations. Leuk-Lymphoma 27(5-6) : 517-521.
88. Muzio, M., A.M. Chinnaiyan, F.C. Kischkel et al. (1996). FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95(Fas/APO-1) death-inducing signaling complex. Cell 85, 817-827.
89. Nagata, S. and Golstein P. (1995). The Fas Death Factor. Science 267, 14491456. '91 .Nagata, S. (1997). Apoptosis by Death Factor. Cell 88, 355-365.
90. Raff, M., Barres, B.A., Burne, J.F., et al. (1993). Programmed Cell Death and the Control of Cell Survival: Lessons from the Nervous System. Science 262, 695-697. • * ' '
91. Raff, M. C. (1992). Nature 356, 397.
92. Rathmell, J., Townsend, S., Xu, J., Flavell, R., and Goodnow, C. (1996). Cell 87,319.
93. Rieux-Laucat, F., F. Le Deist, C. Hivroz et al. (1995). Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science 268, 1347-1349.
94. Rodriguez, I., K. Matsuura, K. Knatib et al. (1996). A bcl-2 transgene expressed in hepatocytes protects mice from fulminant liver destruction but not from rapid death induced by anti-Fas antibody injection. J. Exp. Med. 183,1031-1036.
95. Rose L.M., D.S. Latchman, and D.A. Isenberg (1997). Elevated soluble fas production in SLE correlates with HLA status not with disease activity. Lupus 6: 111-122.
96. Rothe, M., S.C. Wong, W.J. Henzel, and D.V. Goeddel (1994). A novel family of putative signal transducers associated with the cytoplasmic domain of the 75 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell 78, 681 -692.
97. Rothstein? T.L., J.K.M. Wang, D.J. Panka et al. (1995). Protection against Fas-dependent Thl -mediated apoptosis by antigen receptor engagement in B cells. Nature 374, 163-165.
98. Rouvier, E., Luciani, M.-F., Golstein, P. (1993). Fas Involvement in Ca2"i.independent T Cell-mediated Cytotoxicity; J. Exp. Med. 177, 195-197.
99. Ruggero De Maria, L. Lenti, F. Malisan et al. (1997). Requirement for GD3 Ganglioside in CD95- and Ceramide-Induced Apoptosis. Science 277, 16521655.
100. Sato T., Shinjhirie, Kitado S., Reed J.C. (1995). FAP-1: A Protein Tyrosine Phosphatase That Associates with Fas. Science 268, 411-415.
101. Schulze-Osthoff, K., H. Walczak, W. Dröge, and P.H. Krammer (1994). Cell nucleus and DNA fragmentation are not required for apoptosis. J. Cell Biol. 127, 15-20.
102. Schumann H., Morawietz H., Hakim K. et al. (1997). Alternative Splicingof the Primary Fas Transcript Generating Soluble Fas Antagonists Is Supressed in the Failing Human Ventricular Myocardium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 239, 794-798.
103. Screaton, G. Xu X.-N., Olsen A.L. et al. (1997). LARD: A new lymphoid-specific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,4615-4619.
104. Seishima M., M. Takemura, K. Saito et al. (1996). Highly sensitive ELISA for soluble Fas in serum: increased soluble Fas in the ejdery. Clin. Chem. 42: 1911-1914.
105. Seishima M., Takemura, K. Saito, K. Ando, and A. Noma (1997). Increased serum soluble Fas (sFas) concentrations in HCV-positive patients with liverc.ciihosis. J. of Hepatol. 2~7: 424-427.
106. Shaham, S., and H.R. Horvitz (1996). Developing Caenorhabditis elegans neurons may contain both cell-death protective and killer activities. Genes Dev. 10,578-591.
107. Shimaoka, Y., Y. Hidaka, M. Okumura et al. (1998). Serum concentration of soluble Fas in patients with autoimmune thyroid diseases. Thyroid 8, 43-47.
108. Singer, G.G., and A.K. Abbas (1994). The Fas antigen is involved in peripheral but not thymic deletion of T lymphocytes in T cell receptor transgenic mice. Immunity 1,365-371.
109. Spiegel, S., D. Foster, and R. Kolesnick (1996). Signal transduction throughlipid second messenger. Curr. Opin. Cell Biol. 8, 159-167.
110. Spitz, M., Spitz L., Thorpe R., and Eugui E. (1984 ). Intrasplenic Primary Immunization for the Production of Monoclonal Antibodies. J. of Immunological Methods 70, 39-43.
111. Stanger B., Leder P., Lee T.-H., Kim E., and Seed B. (1995). RIP: A Novel Protein Containing a Death Domain That Interacts with Fas/APO-1 (CD95) in Yeast and Causes Cell Death. Cell 81, 513-523.
112. Steller, H. and Grether, M. (1994). Neuron 13, 1269.
113. Strand, S., W.J. Hofmann, H. Hug et al. (1996). Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (APO-l/Fas) ligand expressing tumor cells — A mechanism of immune evasion. Nature Med. 2, 1361-1366.
114. Strasser A., Harris A.W., Huang D., Krammer P.H. and Cory S. (1995). Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis. EMBO J. 14,6136-6147.
115. Strasser A., and O'Connor L. (1998). Fas ligand—caught between Scylla and Charybdis. Nature Med. 4,21-22.
116. Suda, T. and Nagata, S. (1994). Purification and Characterization of the Fas-ligand that Induces Apoptosis. J. Exp. Med. 179, 873-877.
117. Suda, T.,T. Takahashi, P. .Golstein, and S. Nagata (1993). Molecular Cloning and Expression of the Fas Ligand, a Novel Member of the Tumor Necrosis Factor Family. Cell 75, 1169-1178.
118. Sugahara, K., Y. Yamada, Y. Hiragata et al. (1997). Soluble and membrane isoforms of Fas/CD95 in fresh adult T-cell leukemia (ATL) cells and ATL-cell lines. Int. J. Cancer 72,128-132.
119. Takahashi, T., M. Tanaka, J. Inazawa, T. Abe, T. Suda and S. Nagata (1994b). Human Fas ligand: gene structure, chromosomal location and species specificity. Int. Immunol. 6,1567-1574.
120. Takahashi, T., M. Tanaka, C.I. Brannan et al. (1994a). Generalizedi.
121. Tanaka, M., T. Suda, K. Haze et al. (1996). Fas ligand in human serum. Nature Med. 2,317-322.
122. Tanaka M., Itai T., Adachi M., and Nagata S. (1998). Downregulation of Fas ligand by shedding. Nature Med. 4, 31-36.
123. Tartaglia, L.A., T.M. Ayres, G.H.W. Wong, and D.V. Goeddel (1993). A novel domain within the 55 kd.TNF receptor signals cell death. Cell 74, 845853.
124. Tewari, M. and V.M. Dixit (1995). Fas- and tumor necrosis factor-inducedapoptosis is inhibited by the poxvirus crmA gene product. J. Biol Chem. 270, 3255-3260.
125. Thorn, D., A J. Powell, C.W. Lloid, and D.A Rees. (1977) Rapid isolation of plasma membranes in high yield from cultured fibroblasts. Biochem. J., 168, 187-191.
126. Thornberry, N.A., H.G. Bull, J.R. Calaycay et al. (1992). A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1 (3 processing in monocytes. Nature 356, 768-774.
127. Tokano Y., Miyake S., Kayagaki N. et al. (1996). Soluble Fas Molecule in the Serum of Patients with Systemic Lupus Erythematosus. J. of Clin. Immunol. 16, 261-265.
128. Tomokuni A., T. Aikoh, T. Matsuki et al. (1997). Elevated soluble Fas/APO-1 levels in silicosis patients without clinical symptoms of autoimmune diseases or malignant tumors. Clin. Exp. Immunol. 110: 303-309.
129. Trauth, B.C., C. Klas, A.M. Peters et al. (1989). Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression by Induction of Apoptosis. Science 245, 301-304.
130. Van Antwerp, D.J., S.J. Martin, T. Kafri, D:R. Green, and I.M. Verma (1996). Supression of TNF-a-induced apoptosis by Nf-KB. Science 274, 787789.
131. Vandenabeele, P., W. Declercq, R. Beyaert, and W. Fiers (1995). Twotumor necrosis factor receptors: structure and function. Trends Cell Biol 5, 392-399.
132. Veis, D.J., C.M. Sorenson, J.R. Shutter, and S.J. Korsmeyer (1993). Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell 75,229-240.
133. Wajant H., Johannes F.-J., Haas E. et al. (1998). Dominant-negative FADD inhibits TNFR60-, Fas/Apol- and TRAIL-R/Apo2-mediated cell death but not gene induction. Curr. Biol. 8, 113-116.
134. Wang, C.-Y., M.W. Mayo, and J.A.S. Balwin (1996). TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of Nf-tcB. Science 274, 784-787.
135. Watanstbe-Fukunaga, "R., C.I. Brannan,'N. Itoh et al. (1992). The cDNA Structure, Expression, and Chromosomal Assignment of the Mouse Fas Antigen. J. Immunol. 148, 1274-1279.
136. Yang, E., and S J. Korsmeyer (1996). Molecular thanatopsis: a discourse on the Bcl2 family and cell death. Blood 88, 386-401.
137. Yang X., Khosravi-Far K., Chang H., and Baltimore D. (1997). Daxx, a
138. Novel Fas-Binding Protein That Activates JNK and Apoptosis. Cell 89, 10671076.
139. Yonehara, S., A. Ishii, and M. Yonehara (1989). A Cell-Killing Monoclonal Antibody (Anti-Fas) to a Cell Surface Antigen Co-Downregulated with the Receptor of Tumor Necrosis Factor. J. Exp. Med. 169, 1747-1756.
140. Yuan, J., S. Shaham, S. Ledoux, H.M. Ellis, and H.R. Horvitz (1993). The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-lp-converting enzyme. Cell 75, 641-652.
141. Zamzami, N., S.A. Susin, P. Marchetti, et al. (1996). Mitochondrial control of nuclear apoptosis. J. Exp. Med. 183, 1533-1544.
142. Zha, J., H. Harada, E. Yang, J. Jockel, and S.J. Korsmeyer (1996). Serine phosphorylation of death agonist BAD in responce to survival factor results in binding to 14-3-3 not Bcl-x. Cell 87, 619-628.
143. Zhang J., Cado D., Chen A., Kabra N., and Winoto A. (1998). Fas-mediated apoptosis and activation-induced T-cell proliferation are defective in mice lacking FADD/Mortl. Nature 392, 296-299.