Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Создание антитоксинных лекарственных препаратов на основе фторпроизводных бензимидазола

3 41 .

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 615.451.372.214.122

АСТАШКИН Евгений Иванович

Создание антитоксинных лекарственных препаратов на основе фторпроизводных бензимидазола

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте биотехнологии.

Директор—доктор биологических наук Р. Г. Василов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент АМН СССР Л. Д. Лукьянова

доктор медицинских наук, профессор Б. С. Утешев

доктор медицинских наук Г. Я. Шварц

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится > ЛЖ&Я/ьь' 1992 г. в « » часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д.001.25.01 при Научно-исследовательском институте фармакологии АМН СССР по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной части института

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук

А. П. Якорскин

OV.a-'i ;

НСС&рТРЦЦЙ j

общая характеристика работы

актуальность проблемы. Ведущими факторами патогенно ста ряда бактерия и мегаскопических грибов являются токеины, образующиеся в процессе их жизнедеятельности, которые часто и определяют основные симптомокомплексы различных ■заболеваний.

Высокомолекулярные белковые экзоэнтеротоксины, продуцируемые холерным вибрионом (холерный токсин - СТ), энтэротоксигенными штаммами кишечных палочек, сальмонеллами и др. приводят к заболеваниям, ведущим ст"штомокоишзэксом которых является диарея.

По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно диарея регистрируется более чем у I млрд человек, причем примерно у 5 млн детей в возрасте от 1-5 лет диарея служит причиной смергги

CKolmgren ,Г., 19313. СНИЖЭНКв ВЫраЖвННОСТИ ДКарвИ С ПОМОЩЬЮ фармЭКО-Л0ГИЧ8СКИХ препаратов всего на 3055 имеет важное практическое значение, т.к. повышает эффект от применен™ других Tej. .пэвтич&ских подходов, уменьшает тяжесть течения заболевания и смертность от обезвоживания.

Использование антибиотиков и других антибактериальных препаратов для лечения диарей ведет к 'возникновению устойчивых и высо-котоксигенных бактериальных штаммов. Б связи с этим во всем мире особое внимание удаляется поиску и созданию лекарственных препаратов, обладающих антигоксинным действием, т.е. прерывающих развитие биохимических процессов,- запускаемых белковыми токсинами - в клетках-мишенях.

СТ является универсальным стимулятором аденилатциклазной системы (АЦС) в клетках млекопитающих. Действие СГ связано с ферментативным adp-рибозилированием ss- белка, который стимулирует каталитический компонент АЦС, увеличивая уровень сAMP в цитоплазме клеток. Оказалось, что СТ вызывает диарею не только за счет увеличения cAMP, но и в резу^тате выброса б-пщрокситриптамина (5-НТ, серото-нина) из энтерохромаффинных клеток, который, в свою очередь, влияет на метаболизм арахидоновой кислоты. Остается однако неясным, какой из путей метабс.лизма арэхвдоновой кислоты цикло- или липоксигензз-ный и какие метаболиты ответственны за возникновение диареи.

В качества антидаарейных средств используют препараты разных Классов: НбйрОЛеЯГИКИ ИЗ ГРУППЫ феНОТИаЗИНа CLorinroth I. et .11., 1977; Holmgren J. et al., 1379; Lsrscn J.J. 19823, НарКОТИЧОСКИО

аналгетики CSaridhu В. et al.,1931; Watt J. et al., 1982; Naftali R.J., 1932; Clouert D.H. et al., 19331 , НеСТЭрОИДНЫв ПрОТИВОВОСПЗ-ЛИтеДЬЕЫе препараты CBennett A., 1971; JaUoby H. I., Marshall С. H. , 1972; Fink A.D., Katz R.L., 19721, бЛОКЭТСрЫ КаЛЬЦИвВЫХ КЗНЗЛОВ IBeubler E. et al., 1Э8Э1 И ЕбКОТОрЫб ДРУГИЗ.

Однако эти препараты обладают широким спектром фармакологического действия и вызывают ряд побочных эффектов, что затрудняет их широкое применение пр^ диареях, особенно у детей, или малоэффективны.

Таким образом поиск эффективных антвдиарейных антитоксинных препаратов, остается весьма актуальным.

К низкомолекулярным токсинам отпасется большая группа микото-ксипов, продуцируемых грибами. Наиболее известным представителем этой группы является афлатоксиг Bp обладающий выраженным гепато-токсическим действием. Эта токсины попадают в организм человека и животных с яицэвыш продуктами. Продуценты микотоксинов распространены по всем регионам нашей страны. В результате биотрансформзциа микотоксины превращаются в высокорэакционные токсичные метаболита, которые вызывают но только гибель клетки при высоких концентрациях токсина■ (Ю-6 - 10-5М), по и приводят к разнообразным мутациям при низких концентрациях (Ю-8 - IC~7M) св.А. Тутедьян, Л.В. Кравченко, 18853. До настоящего времени лекарственные препараты, защищающие от действия-микотоксинов не найдены.

Многие производные имидазола имеют широкий спектр фармакологической активности и ряд из них. используются в качестве лекарственных препаратов. Бензимидазол и его прозводные имитируют пуриновые основания, играющие важную роль как в энергетике клеток (атр, gtp), так и в осуществлении внутриклеточной сигнализации (camp, cümp), Ферменты, участвующие в синтезе и гидрожгза циклических нуклеоти-дов, а такие в трансмембранной и внутриклеточной передаче информации имеют? участки, ответственные за связывыание цуриновых нуклеоти-дов. Вещества схожие с пуриновыми основаниями могут взаимодействовать с этими участками и изменять активность соответствующих ферментов, что позволяет их использовать для регуляции указанных про-дессоа Кс в вэрспектиаа, создавать на их основе лекарственные препараты.

Цель исследования - изучение механизма действия некоторых токсинов и отбор среди производных бензимвдазала наиболее зффектив-

ных соединений дая создания на их основе антитоксинных лекарственных препаратов

задачи исследования: i. Установление новых закономерностей во взаимодействии СТ с клетками животных и человека;

2. Выяснение механизма тггогенного действия В-субЪэдиницы СТ;

3. Выяснение механизма авти,т*чарзйяого действия производных бензимидазола;

4. Изучение иммунотропной активности фторпроизводных бензимидазола;

5. Изучение влияние производных бензимидазола на активность ферментов, ответственных за бштрансформацию ксенобиотиков;

6. Изучение возможности использования производных бензимидазола для защиты от цито- и генотоксического действия некоторых низкомолекулярных токсинов и ксенобиотиков;

7. Создание оригинального антнтоксинного антидиарейного лекарственного препарата "Фторазол".

научная новизна. Впервые установлено, что один из ведущий меха- • низмов возникновения диареи, вызываемой СТ, обусловлен влиянием на энтероцигы продуктов липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты.

Впервые показано, что митогенный эффект В-субЪединицы СТ не связан с увеличением внутриклэточЕОй концентрации свободных ионов Са^+, изменением внутриклеточного значения р!^ и изменением трансмембранной разности потенциалов в лимфоцитах человека и лабораторных шивотных. Учитывая, что ганглиозид >зм1 является "рецептором" дая СТ, эти данны. свидетельствуют о принципиально новой роли ган-глиозидов в згтускэ деления клеток.

Впервые установлена способность фторпроизводных бензимидазола подавлять действие СТ и холероподобного токсина е.со11 на тонкий кишечник. Это послужило основой 'для создания оригинального отечественного антидиарейного препарата анпггоксинного действия "Фгоразо-ла".

Впервые установлена способность фторпроизводных бензимидазола влиять на АЦС, подавлять активность ее ключевых ферментов за счет связывания с их адениловыми центрами.

Обнаружена способность фторпроизводных бензимидазола алиягь на ключевые ферменты бкотрансформации ксенобиотиков - систону.ци-

тохрома Р-450 и цитохрома Р-448, что позволило использовать их для подавления цито- и генотоксического действия афлатоксина Вр фуро-семида, а также для усиления фармакологического действия ряда лекарственных препаратов (гексенал, фуросемид). Показана принципиальная возможность использования фторпротаводных бензимвдазола для вменения выраженноста фармакологических эффектов других лекарственных препаратов.

практическая значимость работы. I. Разработана система методов, позволяющих эффективно проводить поиск соединений, подавляющих действие холероподобной группы токсинов, гекотоксическке эффекты некоторых микотокешов и цитотоксическое действие ряда ксенобиотиков.

2. Создан азтидиарейный препарат "Фторазол" для медицинской и ветеринарной практики (таблетки и масляная форма, соответственно).

3. Показана принципиальная возможность создания на основе фторпроизводных бензимвдазола препаратов, обладающих иммунотроп-ной активностью.

4. Показана возможность подавления гепатотоксического действия фуросемида с помощью бензимвдазола и его производных, а такт усиление терапевтического эффекта фуросемвда цри его сочетанием ' применении с бензилбензимидазолом.

5. Показана возможность фармакологической защиты клеток человека и животных от гено- и цитотоксического действия афлатоксина

V

основные сведения об апробации работы. Основные результаты работы доложены на Всесоюзных сЪзздах, конференциях и симпозиумах: "Радиационная микробиология и иммунология", Москва, 1977» "Эпидемиология, клиника, диагностика и профилактика инфекционных болезней", Таллинн, 1978; "'Ранние проявления тканевой несовместимости", Москва, 1979? "Криоконсервирований имму. жомпатвнтных тканей", Харьков, 1979; "Циклические нуклеотиды", Кмзв,198С1; Минск, 1982, Рязань 1905; "Молекулярная структура бактериальных токсинов", Моск-вз, 1985) " Медицинская энзимология", Махачкала, 1986; "Изучение и применение лакпшов", Таллинн, 1989; "Создание лекарственных форм с заданными бшфзрмацэвтическими свойствами", Харьков 1990. 1-ый Всесоюзный биофизический сЪезд, Москва, 1982? Г-ый Всесоюзный

сЪвзд гематологов и трансфузиологов, Баку,1979; 4-ый Всесоюзный сЪезд патофизиологов, Кишинев, 1989;

Материалы были представлены на Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функция", Ташкент, 1933; Международном конгрессе По иммунологии, Париж, 1980; Меядународном конгрессе по биохимии, Прага, 1988.

структура и обьем диссертдции. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", 5 глав результатов собственных исследований, обсувдения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего^^ отечественных и зарубежных публикаций. Диссертация изложена на/¿^страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 5Г рисунком.

материалы и методы исследования

Фторпроизводные бензимидазола были синтезированы в ИНЭОС АН СССР им.А.Н.Несмеянова под руководством академика АН СССР A.B. Фокина в лаборатории• А.Ф.Коломийца. Всего изучено 25 соединений.

Антидаарэйное действие соединений изучали на модели экспериментальной диареи на иышах- самцах линии 05731/6, зфысах-самцах линии wistar и кроликах обоего пола, которым под гексеналовым наркозом вводили в просвет изолированных сегментов тонкого кишечника холерный знтеротоксш (CI, sigma, США) или термолзбильныа токсин E.coii (LT, sigma, США), и изучаемое соедшениэ (ИКТрЭЛШИНаЛЬНОЭ . введение ). Эффект оценивали также при введении соединений внутримышечно или внутрижэлудочно. Контролем служили штли, в которые вводили физиологический раствор с растворителем, используемым для соединения (dmso, этанол). Вэзультаты одаривали через 16 ч - у кроликов, 3 ч - у мышей и 4 ч - у крыс и выражали через индекс дилята-ции, представляющий собой отношение объема жадности (мл) или массы штли кишечника (мг) к длине петли в см.

Оценку влияния исследуемых соединений на пролиферацию клеток проводили с помощью f*1 акции бла (трансформации лимфоцитов человека и крыс. Лимфоциты человека выделяли из донорской крови центрифуги-гированием в градиенте плотности фиколл-гипак своуит, i-37-n, фи- ' колл-верографин (1.077 г/мл). Тимоцигы крыс получали с помощью промывания раствором Хеякса нелко измельченного тимуса через наалоно-В08 сито. Для оценки жизнеспособности изол1фованных клэток исхюль-

зовали растворы трепановой сини или эозина.

В качестве мигогенов использовали фитогемагглютинин (ФГА-Р. Di feo, США), конканавалин А (Кон A, Pharmacia, Швеция) и ионофор-НЫЙ антибиотик A23I87 (Sigma, США). Культуры лимфоцитов (2 мл) инкубировали в 10 мл стеклянных пробирках с резиновыми пробками при 37°С в термостате, или микроплатах (обЪем лунки 0,2 мл) в С02 инкубаторе в течение 72 ч. Реакцию бластфансформации оценивали по включению меченого ^-тимидина в ДНК клеток, обработанных 5% ТХУ и осажденных на фильтрах gf/f. Радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляцию ином счетчике Mark-з (Голландия). Результаты выражали в количестве имп в. мин на I млн клеток.

Определение концентрации сАМР в образцах проводили радиоиммунным методом (наборы фщш Amersham, АНГЛИЯ) ПО Gilman A.C. С19723 .

Измерение свободной концентрации ионов Са2+ в цитоплазме лимфоцитов человека, тимоцитов крыс, сгшноцитах и фагоцитирующих клетках линии Р-388 проводили с помощью флуоресцентных красиггелей

(КВИН-2, фура-2) СTsien R.Y. et al., 13023.

Мембранный потенциал определяли с помощью дипропилтиадикар-боцианина cois-cs-csn CGeifand E.w. et ai.,iv37i, а внутриклеточные значения рЕ^ - ':2¡ 7' -бис(карбоксиэтил)-5,6-карбо*.си флуорес-

ЦЭИНа (CCECF) CRink Т. J. et al., 1-32; Htí = lcf=th t.r. et 'al. ,1985].

Измерение флуоресценции проводили на спекгрофлуориметре Хитачи F-4000 или Шимадзу rf-sio (Япония) в термостатируемой иоветэ тфи 37°С, оборудованной магнитной мешалкой.

Изучали влияние исследуемых соединений на функциональную ак-

ос

ТИВНОСТЬ g белков ПО связыванию C^sl-gtpj's CSternws?is p.c., Robi-show J.D., 1984 j; ПО ИЗМЭНОНИО gtp-аЗНОЙ аКТИВНОСТИ, КОТОРУЮ ИЗМ6-ряли с помощью гидролиза с3^зетр; по изменению активности каталитического компонента аденилатциклазы в присутствии g£ белка св.Л. Воейков и соавт., 19883. adp-рибозшировячиэ g белков, катализируемое CT и коклюшным токсинами, определяли по методам, описанным в

работах Cassel D. , Pfeuffer т.С1Э7ВЗ; Catada т., Ui Y. C19823..

Каталитическуи субТадамсу протоинкиназы А из мозга свиньи получали но методу сМ.В.Нестерова и соавт., 1975:. Фосфотранфэразную (кияазную) активность фермента определяли по включению метки с с»??гз-лтр Е гистон HI CA.Г. Габибов, 1980з.

Содержание щггохрома Р-450 в микросомах пьчени крысы определяв; рх>гистра:$иза дифференциального спектра комплекса 00 с восста-

новленным цитохромом Р-450. Содержать цитохрома Р-450 рассчитывали из разницы оптической плотности при длинах волн 450 и 490 нм, используя молярный коэффициент зкстинции с равный 91 ООО М'^см-1 сА.И.Арчаков, 1975:.

Активность гдагатион-э-трансферазы (Г-з-Т) определяла спект-рофотомэтвйческим методом,используя в качестве субстрата 1-хлор-2,4-данитробензол. Реакцию регистрировали по ослаблению желтой окраски субстрата. Образование продукта реакции находили по падению оптической плотности анализируемой смеси при 340 нм, е = 9800

СВааге А., Вге1таг О., 19803.

Активность амздопириндеметилазы (АПДМ) в микросомной фракции, полученной из печени мышей С57В1/6, определяли по методу Бег-га«у з.е. ^ а1., 1974] по образующемуся в результате реакции фор-глалвдещду. . • _

Активность бензпиренмоБооксигеназы (БПМО) фракции микросом определяли по методу соеЬпеп а1., 13733, основанному на выявлении флуоресценции продукта реакции - з гидроксибензпирена.'

Влияние соединений на длительность гексеналового сна (70 мг/кг внутрибрюшинно) оценивали по времени нахождения животных в боковом положении на беспородных мышах-самцах.

Частоту сестринских хроматадных обменов (СХО) определяли в клетках китайского хомячка линии ви а и гаг28 и лимфоцитах человека. Для получения дифференциально окрашенных хроматид в культу-ральную среду вводили 5-бром-2-дэзоксиуридин (10 мкг/мл). Флаконы с клетками помещали в термостат на 40-42 ч. За 2 ч до фиксации к клеткам добавлял? колхицин (10 гасМ) для накопления клеток на стадии котафазы гаггоза. Посла фиксации в смеси этанол-ледяная уксусная кислота к этки отмывали и препараты &.этафазных хромосом окра-швали по методу А.Н.Чеботарева и соавт. с 19781. Препараты мета-фазных хромосом анализировали в световом микроскопе "Виолам Р-15" с иммерсионным объективом. Для каждой культуры просчитывали по 25 ттафазных клэток (18 - I хромосома, находящихся во 2-м митозе, и 100 клэток в разных митозах - для расчета индекса пролиферации).

Влияние даЗазола на гепатотоксический эффект фуросемида изу-. чали по выходу калия из гепзтоцитов и скорости объемного кровотока в изолированной печени крыс по методу В.И. Са^баша и соавт. с 10871.

Комбинированное действие дибазола и фуросешда изучено у больных ишекической болезнью сердца и артериальной гипертонией, нахо-

дившихся на лечении в ГКБ N 7.

Концентрации фуросемвда и его метаболитов (4-хлор-5-сулъфамо-илантраниловой кислоты - сза и антраниловой кислоты - А) в вддаоо-ти, шрфузлрующей печень животных , а также в крови и моче больных определяли методом тонкослойной хроматографии с денситомвтривй. сЛ.Е. Холодов и соавт., 18843.

. результаты и обсуждение изучение влияния ст на клетки.

мкг/петлю мкг/петлю мг/см

0 0 29

2,5 0 77

2,5 I. 55

2,5 10 39

Для оценки аптидиарейного действия фто^чроизводных бензимида-зола у крыс были выбраны дозы CT, равные 0,5 и 1,0 мкг. В опытах с lt-токсином е.coií были выбраны дозы 1,0 и 2,5 мкг на готло.

На мышах линии С57ВГ/6 изучено влияние субстанции ЮС-15.

Таблица I

Влиянш ЮС-15 на выход жидкости и активность аденилат-циклазы энтероцитов мышей линии C57BI/6

Доза CT, Доза ЮС-15, Индекс дилятации, Активность адзнилатцик-

___лазы.пмолъ/мин/мг бежа

2,8 12,6 9,0

_ _3,0__.

Как вйлно из приведенных данных, CT приводит к увеличению ин- . декса дилятации и повышению активности АС. Стедавь повышения активности АС соответствует выраженности выхода жидкости в просвет кишечника . Введение ЮС-15 приводит к дозозависимому уменьшению- выхода жидкости и снижению активности АС. При этом доза 10 мкг/пэтлю практически снимает действие токсина. Можно полагать, что уменьшение активности АС под влиянием ЮС-15 приводит к уменьшению количества вышедшей жвдгсости. .

На мышах изучено антвдиарейное действие субстанции ЮС-12, посла введения LT-токсина. ЮС-12 вызывал достоверное двукратное снижение выхода кидкости в просвет кишечника. У кроликов ЮС-12 снижал выход жидкости, индуцированный lt-токсином, на 60-70%.

В опытах на мышах субстанция ЮС-15, введенная в просвет тонко-

го кишечника сразу после lt-токсинэ сникала выход жидкости примерно на 90%.

У крыс проведено сравнительное изучение антидиарейного действия соединений ЮС-15 и 05-385 при введении в просвет петель СГ. Выраженность действия (на сколько процентов снижается ответ на СТ в присутствии изучаемых соединений) рассчитывали по формуле: Е = (Д2 - Л1)/Д2 X 100%, где ai - разница между индексами далятации петель, в "которые вводили СТ, и контрольных петель с физраствором у опытных ЖИВОТНЫХ; д2 - то жэ в групгв контрольных животных (табл. 2).

Таблица 2

Влияние ЮС-15 и ФФ-385 на выход жидкости в просвет тонкого кишечника крыс, индуцированный СТ

Соединение Доза, ' мкколь/петлга Выраженность снижения действия -СТ, % СТ 0,5 мкг/пэтлю СТ 1,0 мкг/готлю

ФФ-385 0,01 ... * 79,4 t 14,ü ' 49,5 ± 26,2

ЮС-15 0,30 „ 82,5 ± 22,3 53,0 ± 19,6

ЮС-15 0,10 42,0 ± 16,4 28,0 ± 6,1

Действие высоких доз СТ значительно снижалось при.введении ФФ-385. Эффект ФФ-385 выражен значительно больше, чем ЮС-15, который в дозах в 10 раз больших оказывает примерно вдвое меньший эффект, чем' ФФ-385. Для получения сходного по выраженности с ФФ-385 эффекта нужны примерно в 30 раз более высокие дозы ЮС-15.

Таким образом показана возможность подавлять действие. СТ с помощью фторпроизводных бензимидазола.

Изучена антидиарэйная эффективность фгорпроизводных бензимидазола при внутримышечном введении их лабораторным животным. Масляный раствор ЮС-12 вводили крысам в дозе 0,5 мг/кг (I группа) и 2 мг/кг (2 группа) внутримышечно за 30 мин до начала операции, т.е. примерно за 60 мин до ввадо1-ля СТ (табл.3).

Как видно из приведенных данных, предварительное введение масляного раствора 03-12 приводило к предотвращению действия СТ, введенного в штли в дозе 0,5 мкг; эффект ЮС-12 г дозе 2 мг/кг был более выражен, чем при введении в дозе 0,5 мг/кг.

Таблица 3

Влияние внутримышечного введения масляного раствора ЮС-12 на выход жидкости в просвет тонкого кишечника •крыс, иадуцйрованный СТ

Группа животных Индекс дилягации (мг/см)

Контроль Холерный токсин (мкг/петлю) 0,5 ' 1,0

Контрольная 85 + 1Д 171,5 + 2,1* 177,5 + 0.5*

I группа Г7 + 7,1 106,1 + 6,6* •** 172,1 + 6,3*

2 группа 77 + 4,8 92,1 + 6,7** 169,1 + 19,6*

Примечание. Наличие достоверного (Р < 0,05) различия действия

СТ по сравнению с контрольными петлями, в которые вводился

**

физиологический раствор, - по сравнению с контрольной группой животных

Таким образом полученные даяньга позволяют сделать заключение, что масляный раствор 100-12 оказывает отчетливый аятидиарейный эффект у лабораторных животных в диапазоне доз 0,5 - 2,0 чг/кг.

Аналогичные данные были получены при внутримышечном введении крысам масляного раствора ЮС-15. Предварительное введение ЮС-15 (I мг/кг) приводило к снижению индекса дилятации, вызванного СТ (0,5 мкг на петлю) на 49%. Его действие носило дозо-зависимый характер. Учитывая п; ученные данные, а также технико-экономическую проработку, соединение ЮС-15 было выбрано для создания на его основе анти-диарейного препарата, получившего название фторазол. Были разработаны две •.лекарственные формы фторазола: инъекционный масляный раствор для ветеринарии и таблетки - для клинико фармакологического изучения в качестве потешщальноголекарственного средства. Изучены специфическая фармакологическая активность лекарственных форм фто- ' разола, в полном обЪеме проведены доклинические испытания ого безвредности.

На основании проведенных исследований Фармакологический комитет МЗ СССР разрешил прозодани© дарвоа фазы клинических испытаний фторааола (протокол м '16 от 24 октября 1991 г.), Главны?,1 управлением ветеринарии 23 июля 1991 утверждено временное наставлзнда т

применению фторазола ч ветеринарии.

изучение механизма действия фторпроизводных бензимидазола.

Изучение механизма знтидиарейного действия гржедено на различных клеточных и модельных системах.

В опытах in vitro на мембранных препаратах энтероцюив, полученных от мышей С57В1/6, было установлено, что ЮС-12, ЮС-15, ЮС-20 и ВС-97 концентрационнозависмым образом подавляли активность АЦС, стимулированную СТ. Эти данные согласуются со способностью производных бензимидазола ингибировать АЦС в опытах in vivo, когда СТ и исследуемое соединение вводили непосредственно в просвет изолированного сегмента тонкого кишечника.

В связи с тем, что АЦС в знтероцитах активирается в том числе комплексом Са2+-кальмодулин, на мембранных препаратах было изучено влияние ЮС-12, ЮС-15 и ЮС-37 на активность АЦС в присутствии зкзо-генно добавленного кальмодулша (10 мкг/мл). Исследуемые соединения несколько снижали активированную кз.1тьмодулшом активность АЦС, но не блокировали ее до контрольного уровня, в отличие от известного ингибитора кальмодулина - хлорпромазина (10_5М). Таким образом антвдиарейный эффект указанных соединений не связан с влияндам на кальмодулин. Это было подтверждено также в опытах с добавлением ЮС-15 на фоне возрастающих концентраций кальмодулина (10, 20, 30 и 40 мкг/мл) - величина ингибиторного эффекта ЮС-15'на АЦС не изменялась.

Как известно в состав АЦС входят:рецепторы, g-болки и каталитический компонент аденилатциклазы. При изучении влияния исследуемых соединений на способность в белков связывать етр, на атр-аз-ную активность а субЪэдиниц g белков, a тякже процесс дор-рийози-лирования, катализируемый холерным и коклюшеым токсином, было установлено, что ни одао та соединений ке влияло на свойства различных g белков. Поэтому объяснить анттздиарейный эффект ЮС-12 и ЮС-15 через их действие на е-белки нельзя.

ЮС-12 и ЮС-15 на 15-25;'- снижали базальную активность АС в мембранных препаратах тимоцигов и в мембранных препаратах мозга. При активации аденилатциклазы с помощью nsf и форсколина, а также при добавлении негидролизуемого аналога gdp/js, который подэвляет переход g белков в активное состояние, наблюдьлся ингибиторныа эффект исследуемых соединений, что позволяет сделать заключение'об

их непосредственном влиянии на каталитический компонент АС.

На гомогенном црепарате каталитической субЪедишшы протешки-назы А из мозга свиньи показано, что соединения ЮС-12 и ЮС-15 конкурентно ингибируют этот фермент. Константы ингибирования составляли для ЮС-12 - 1,2 Ю-4М, а для ЮС-15 - 4,7 Ю-5 М.

Таким образом, второй механизм антидиарейного эффекта ЮС-12 и , ЮС-15 может быть связан с их способностью блокировать действие сАМР на уровне протеинкиназь! А.

С помощью ингибитора фосфолипазы - 4 бромфенацил бромида (4БФБ), а также ингибитора липоксигеназ - нордигидрогуаяретовоа кислоты (мо'ЗА) показана важная роль, которую играют арахидоновая кислота и ее липоксигеназные продукты окисления в даарейном зффек- .' те СТ. Установлено, что соединение ФФ-385 действовало подобно N03« и блокировало эффект СТ. Нэ модели лимфоцитов человека и крыс моза (10 мкМ) и ФФ-335 (20 шсМ) лишь незначительно (на 40 -65 нМ) увеличивали сса"тз1 и подавляли Са-о'иет на стандартные'митогены - ФГА и Кон А. При последовательном добавлении ¡-ш^а и ФФ-385 подавляли эффект друг- друга, что, по-ввдимому, свидетельствует об одной и той же точка их приложения. В пользу этого предположения говорят факты, получение при изучении изменения значений рН1 под влиян. эм ФФ-385 и шел: оба агента приводили к снижению рН1. Эти результаты хорошо • согласуются с данными, полученными на изолированных петлях тонкого кишечника, в просвет которых были введены СТ и иойа или СТ и ФФ-385 Они позволяют предположить, что антидиарейноа действие ФФ-385 связано с его ,способностью, подобно ыоей, блокировать образование котриенов из ар хидоновой кислоты.

Механизм действия ФФ-385 отличается от механизма действия ЮС-1 и Ю-15. Так, влияние двух последних соединений и Кон А на с4 в лимфоцитах было аддитивно, в то же время Кои А приводил к увшичэ -нию значений рН4, а ЮС-12 и ЮС-15 не влияли на этот параметр. Очевидно, благодаря разным механизмам влияние на клетки ФФ-385 и проиэ--водных серии ЮС, столь значительно отличаются дозы, оказывающие ан-тцдиарэаный эффект. •

изучение влияния ст и в-ст на клетки

Благодаря присутствию ганглиозида вм1 и АЦС практически во всех клетках млекопитающих, кроме безъядерных эритроцитов, СТ действует универсально на клетки разных видов, стимулируя АЦС., Это

позволяет использовать с одной стороны СТ для изучения роли сАМР в физиологических ответах разнообразных клеток, а с другой - применять клетки разных ввдов для изучения механизма действия СТ. Поэтому были использованы лимфоциты человека и лабораторных животных для того, чтобы разработать систему тестировать биологических эффектов СТ по его влиянию на синтез макромолекул, в пврвух очередь ДНК. Эта модель представляет также интерес в связи с выявленными в последнее время митогенными сиовствами у В-субЪединицы ОТ сSpiegel S. et al., 1Э853.

Установлено, что агенты,тэм или иным способом увеличивающие в цитоплазме лимфоцитов концентрацию сАМР i CT <0,01-1,0 мкг/мл), дибутирил-сАМР (Ю-4!?!), теофиыин <IO_3M), изобутилметшксантш (10_4М), подавляли их пролиферацию, ивдуцированнуг дозами ФГА-Р (15 .мкг/мл), Кон А (5 мкг/мл), A23I87 (0,7 мкг/мл), вызывающими максимальный синтез ДНК.'Комбинированная обработка СТ и теофилином, ди-бугария-сАМР и теофиялином лимфоцитов, активированных ФГА-Р, приводила к выраженному потенциированию эффектов указанных агентов: на фонэ тоофшшша начинали действовать до^ы СТ и дибутирил- сАМР, которые саки не подавляли синтеза ДНК и наблюдаемое ингибиторное дэй- ' ствтсэ было значительно болеэ выражено го сравнению с ингкботорным оффешш одного теофаллина. Эти данные еще раз свздетельстеуют о тонр что подавление низкими дозами СТ пролиферации лимфоцитов обусловлено увеличением сАМР. Однако, деление лимфоцитов интибирова-лось тагс::э холерным анатоксином, который не стимулировал АЦС. Анат токсин оказывал ингийггорное действие в дозах, которые в 10 - 20 раз превосходили дозы СТ. Сометанная обработка активированных мито-геном лимфоцитов анатоксином и теофилдином но приводила к потеяции-рованиа действия этих агентов. Слэдовательно, ингийигорныа эффект анатоксина на связан с наличием в его препаратах примесей СТ. Было предположено, что эффект высоких доз анатоксина обусловлен увели-чопкза проницаемости плазматических кекйран лимфоцжгов для танов. Чтобы убедиться в справедливости этого предположения, было изучено влиянлэ на реакцию бдасттрансформации лимфоцитов человека ионофор-ных антибиотиков. Установлено, что валяномицин, моненсин, нмгери-цин, грамицидин А, осуществляющие соответственно транспорт к+, об- ■ пен ыа+/н+, к+/н+ и Na+/K+, концентрационко зависимым образом подавляли деление лимфоцитов. Наиболее выражение мггкйхтторное действие оказывал валиномицин, который в концентрации 10"% полностью

подавлял включение %-тимидина в ДНК лимфоцитов. Таким образом высокие концентрации СТ и В-СТ, по-видимому, способны изменять проницаемость для одновалентных ионов не только модельных липвдных мембран tTosteson" D.,Tosteson ti., 1331з, но и мембран лимфоцитов. Это объясняет ряд противоречивых данных, полученных при использовании СТ в дозах 20-50 мкг/мл.

В-СТ обладает также митогенными свойствами. В опытах на тимо-цитах крыс линии wistar В-СТ приводила к достоверному увеличению синтеза ДНК по сравнению с контрольными необработанными клетками уже в концентрации 50 нг/мл, а максимальный синтез ДНК через 72 ч наблюдался при 1-2 мкг/мл. Прогревание В-Ст при 30°С в течение 30 мин или предварительная инкубация с десятикратным избытком гангли-озида емj полностью подавляет ее мигогенное действие. Следовательно, для запуска пролиферации требуется взаимодействие В-СТ с плазматической мембраной клеток. Ни CT (I мкг/мл), ни А-СТ не индуцировали синтез ДНК в тимоцигах. Учитывая, что в коммерческие препараты В-СТ помимо белка входят ряд консерзантов, миго генный эффект В-СТ бал изучен до и после диализа. Митогенный эффект В-СТ после диализа не изменялся или даже был несколько выше по -сравнению с синтезом ДНК, вызываемым препаратом В-СТ до диализа. По сило миго-генного действия В-СТ была сравнима или несколько уступалз эффектам Кон А.

В-СТ оказывала слабое стимулирующее влияние на синтез ДНК в лимфоцитах,' полученных из крови человека в дозах, совпадающих с митогенными концентрациями В-СТ для тимоцитов. Индекс стимуляции варьировал для клеток разных доноров от 2 до 4. Возможно, что причиной этого является митогенное действие В-СТ на В-лимфоцшы человека, которые составляют 10-20■/. от мононуклеарных клеток, выделяемых из донорской крови.

В-СТ (1-5 мкг/мл) оказывала ингибиторное действие на синтез ДНК в лимфоцитах, активированных с помощ о ФГА или анти-соз ионо- • клональных антител.

Тагам образом ,в зависимости от исходного состояния лимфоцитов (стадии клеточного цикла) В-СТ способна запускать или подавлять индуцированный синтез ДНК в лимфоцитах человека и животных.

Изучено влияние на синтез ДНК в Т-лимфоцитах агентов, уменьшающих уровень сАМР - иммдазола и лввамизола. Установлено, что на фоне оптимальных концзнтравдй мигогенов (ФГА и A23I87) имидазол

(0,5-1,0 мМ) и левамизол (0,1-0,5 мМ) приводили к усилению пролиферации клеток, т.е. оказывали комитогенный эффект. Очевидно, что эти эффекты связаны со способностью этих соединения снижать внутриклеточную концентрацию сАМР за счет активации фосфодиэстеразы сАМР. Левамизол (I мМ) в контрольна лимфоцитах и лимфоцитах, обработанных разными дозами СГ (0,01 и 0,1 мкг/мл).снижал не только баззльный уровень сAMP в контрольных клетках (с 3,8 - 0,1 до 1,0 - ОД пмоль сАМР/60 мин/3 10® клеток), но и подавляя увеличение сАМР, индуцированное 0,1 мкг/мл СТ (с 8,0 ±0,2 до 3,8 - ОД пмоль сАМР/60 мин/2 10® клеток. Влияние имидазола (10~3 М) на содержание сАМР в лимфоцитах напоминало эффекты левамизола, однако было менее выраженным. Эти данные позволяют предположить, что имидазол и его производные, в том числе бензимидазолы, могут оказывать аналогичные эффекты на энтероцигах, обработанных СТ.

В последние года появились сообщения о том, что СТ и его В-субЪзданица могут увеличивать в различных птах клеток с Са2+';, с чем связывают отчасти даарейныя аффект СТ и митоганное действие

В-СТ CMaer.; D.D. .Forsyth G.W., 1'Э87; Dixon S.J. et al., 198ЕЗЭ . ПО~

дробное изучение этих вопросов с помощью флуоресцентных индикаторов ионов Са2+ было предпринято в нашей работе.

Обработка тимоцитов СТ или В-СТ приводила к увеличению флуоресценции квина 2, причем интенсивность флуоресценеции достигала максимальных значений через 1,5-2 мин. Добавление митогенз Т-лим-фоцитов - Кон А вслед за токсином или В-СТ дополнительно увеличивало флуоресценцию. Адцшивный эффект наблюдался и в случае добавления СГ или В-СТ после воздействия на тимоциты высоких концентраций Кон А (25 мкг/мл). Подобный характер влияния СТ, В-СТ и Кон А, независимо от последовательности их добавления, означает, что механизм действия этих агентов различен. Влияние токсина на интенсивность флуоресценции не связано со стимуляцией АС, поскольку .увеличение концентрации сАМР в клетке под действием СТ обнаруживается после инкубационного периода, составляющего не менее 20 мин. Инкубация тилоцитов с токсином (I мкг/шг) в течение I ч лри 37°0 снижали последующий эффект Кон А на сСа^+г от 141 - II нМ до 40 ± 15 нМ. Обработка тимоцитов форсколином (2 мкМ, 10 мин) - прямым активатором каталитического компонента АС, также сопровождалась уменьшением ответной реакции на Кон А до 79 - 35 нМ. При этом под влиянием форсколина и базалъный уровень tCa2*^ не только не увэличи-

вался, но снижался за 10 мин на 25 - 5 нМ.

Аналогичные аффекты ОТ и В-СТ по увеличению флуоресценции квина 2 были получены и на других типах клеток (сшеноциты мышей» перевиваемые клетки макрофагов линии Р-388).

Обработка мшноцигов Кон А приводила к увеличению с Са2+: . на 152 - 38 нМ. Добавление В-СГ до чля после Кон А также солравовда-лось ростом флуоресценции квина Z на величину, которая практически не отличалась от эффектов В-СТ на тимоцитах. Аддитивный эффект Кон А и В-СТ, независимый от последовательности добавления, таюкэ указывает на различные механизмы действия Кон А и В-СТ. Эффект В-СТ воспроизведется в суспензиях клеток разных типов. Добавление 2 мм ЭПА полностью устраняло влияние В-СТ на флуоресценцию клеток. Однако ингибиторное действие ЭГТА было зарегистрировано в среда, содержащей 1,3 ММ СаС12 и только 0,1 НМ ЭГТА. При ТЕГОМ с00те0шэнии . комплвксон мог связать не болое В% ионов Са2*, содержащихся в инкубационной среда. Было предположено', что кнгиЗигорныа еффакт ЭГТА мог быть следствием нарушения взаимодействия В-СТ с ганглиозидом ем1 клеточной мембраны. Исследование связывания В-СТ с в растворе, о чем судали по коротковолновому сдвигу сшктра флуорзсцзн-ции белка, показали, что добавление ЭГТА до концентрации 0,5 мМ не влияло на характер связывания В-СТ с ем^ Поэтому маловероятно, чтобы присутствие в инкубационной среде 0,1 мМ ЭПА препятствовало связыванию В-СТ с клеткой. Не исключено, однако, что 0,1 мМ ЭГТА

Ол.

мешает образованию В-субЪедкницей структуры,проводящей ионы Са внутрь клвтки. Для провераси возможности образования такой структуры было исследовано влияние В-СТ на флуоресценцию квина 2 в присутствии ионов мп2*. Добавка ипС12 сопровождалась тушением флуорэсцзн-цим, что свидетельствовало о поступлении этих ионов в клетки,

Для выявления ионофорных свойств В-СТ были проведены эксперименты в условиях, цри которых В-ОТ не мог связаться с цитоплазма-тической мембраной. Для этого В-СТ (I мг/ыл) инкубировали 10 шн с .пятикратным избытком ем1. Однако и в этом случае при добавлэнии к клеткам комшасов В-СТ - ем1 наблюдалось увеличена© флуоресценции квина 2, причем такое ш, как 11ри воздействии равной аликвоты кн-тактного В-СТ, не инкубированного о Таким образоа,набдэдзэмоо увеличение интенсивности флуоресцэнции в первые 2-3 мин посла добавления к сусшнзш клеток В-СТ или СТ связано не с белковым, а каким-то иным компонентом препаратов токсина. •

В состав коммерческих препаратов СТ и В-СТ помимо солей входит ЭДТА. При добавлении к суспензии тимоцигов В-СТ, прэдв^ритель-но подвергнутого диализу дня удаления ЭДТА, интенсивность флуоресценции квина 2 не меняется. Последующее введение недиализованяого В-СТ приводило к увеличению интенсивности флуоресценции. Диализ не влиял на структуру В-СТ, по крайней мере участка связывания ганг-лиозида, и на способность холерогвноида взаимодействовать с циго-плазматической мембраной.

Подтверждение того, что компонентом, ответственным за эффект СТ и В-СТ, является ЭДТА, было также получено при измерениях интенсивности флуорэсцэнции квина 2 в среде Хенксз, не содержащей клеток. При добавление 5 мкМ ЭДТА интенсивность флуоресценции возрастала так же, как и при введении 5 мкг/мл В-СТ. Аддитивности эффектов В-СТ и ЭДТА не наблюдается. Очевидно, количества ЭДТА, содержащегося в растворе В-СТ, достаточно для полного вытеснения ионов-тушителей из комплекса с квином 2. Аналогичным образом влияет на флуорэсданцию квина 2 в среде и СТ.

Получонныэ данные позволяют заключить, что наблюдаемое при добавлении к клеткам СТ или В-СТ возрастание интенсивности флуоресценции квина 2 обусловлено не поступлением ионов Са2+ из среды в цитоплазму, а связано с изменением свечения индикатора, находящегося во внеклеточной среде.

Таким образом полученные данные свидетельствуют о том, что СТ и В-СТ не увеличивают проницаемости цитоплазматической мембраны для конов Са2+. •

изучение влияния фторпроизродных вензимиддзодд на токсические эффекты ксенобиотиков

.Известно, что метаболическому превращению ксенобиотиков предшествует их связывание с цитохромом Р-450.

Методом дифференциальной спектрофотометрий изучены параметры связывания производных шидззола и бензимадазолэ. Производное фе-нилшвдазолз - нтрофеншшщцазол является субстратом II типа связывания и обладает очень высоким сродством к цитохрому Р-450 (константа спектрального связывания «з= 2,0 ± 0,5 мкМ). Производные бензимидазола - бензилбензимидазол <ББИ) и фторпроизводные являются субстратами обращенного I типа. Их сродство к цитохрому Р-450 существенно разнится. Так, наименьшим сродством обладает соедияе-

ние ФФ-64 (Ks= 8I2S - 215 мкМ), а наибольшим - ЮС-98 (>'s= 43-9 мкМ), но и его константа спектрального связывания в 20 раз превы- ' шает константу связывания производного имидазола. Остальные фтор-производные и ББИ имеют близкие значения кз: ББИ - 700 - 50; ЮС-12

- 222 ± 21; ЮС-15 - 835 - 43; ЮС-63 - 34б"± 25 мкМ.

Изменение продолжительности гексеналового сна является моделью действия различных препаратов на систему цитохрома Р-450 в ОПЫТаХ in vivo.

ББИ увеличивал продолжительность гексеналового сна в 2-4 раза. Эффект зависел от дозы препарата. Так, при введении 25 мг/кг продолжительность сна увеличивалась в 1,4 раза, при дозе 50 мг/кг

- 2,7 раза, при 100 мг/кг - в 6,6 раза. Все фторпроизводные бенз-имидазола удлиняли гексеналовый сон у мышей, причем наиболее выраженный дозозависимый эффект, сравнимый с действием ББИ отмечался у соединений ЮС-12 и ЮС-15. ЮС-20 вызывал достоверное (примерно в 2 раза) увеличение продолжительности сна , начиная с дозы 50 мг/кг. дальнейшее повышение дозы не меняло выраженности эффекта. Соединение ЮС-87 увеличивало продолжительность сна незначительно (примерно в 1,5 раза) и выраженность его эффекта от дозы не зависела. До-зозависимо увеличивалась продолжительность сна при введении КХЗ-98, однако лишь в дозе 100 мг/кг • сон удлинялся в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Очевидно, что наблюдаемый эффект обусловлен блокированием системы метаболизма гексеьала при однократном введении изученных соединений в результате прямого взаимодействия с системой цитохрома Р-450.

Изучены изменения содержания цтггохрома Р-450 и активности глютатион-з-трансферазы (по образованию конЪюгата 2,4-диншрохлор-бензола) в микросомах крыс при трехкратном введении ББИ в дозе 20 мг/кг и ЮС-15 в дозе 40 мг/кг.

Под влиянием ББИ содержание цитохрома Р-450 достоверно увеличивалось (от 0,63 - 0,05 до 0,97 - 0,06 пмоль/мг белка) в среднем • на 53% по сравнению с контролем. Эффект ЮС-15 был также достоверен, но менее выражен: содержание цитохрома Р-450 увеличивалось примерно на ?Л% (до 0,78 - 0,05 пмоль/мг белка).

Следовательно, трехкратное введение указанных производных бензимидазола вызывает индукцию ключевого фермента I фазы метаболизма ксенобиотиков - цитохрома Р-450. Эти данные подтверждают.

что уменьшение длительности гексеналсвого сна под влиянием многократных введений производных бензимадазола связано с индукцией цитохрома Р-450.

Величина активности Г-з-Т в препаратах различных тканей, например печени, где активность наиболее высока, служит одним из существенных показателей детоксицирующей способности организма.

Активность Г-з-Т под влиянием ЮС-15 достоверно увеличивается (от 147 - в до 183 ± 4 нмоль/кин/мг бэлкэ) примерно на 35Ж, а ББИ оказывает ингибирующее влияние на этот фермент, снижая достоверно активность Г-з-Т до 96 ^ II нмоль/мин/мг белка.

Таким образом несмотря на то, что оба соединения относятся к производным бензимвдззола и при трехкратном введении одаонаправле-но влияют на ферменты первой фазы метаболизма, влияние на ферменты II фазы противоположно.

Амшюшриндвштаяазная (АГЩР активность связана с теми изо-форма'ми цитохрома Р-450. которые индуцируются фенобарбиталом. Индукторы второго типа - 3-металхолантрен(3-МХ) и бензпирен - увеличивают содержание в зндоплазматаческом ретикулуме цитохрома Р-448, катализирующего бенз(а)пиронмонооксигеназную (БШО) активность.

ББИ в значительной степени'тормозит АЭДМ, а также бэзалънуга и индуцированную 3-МХ БШО активности в микросомах печени мышей. Примерно 50% шгкбированш ББИ оказывал в концентрации 5хЮ-4М. Фторпрокзводнке бензимидазола ЮО-12, ЮС-15, ЮС-20, ЮС-37, ЮС-98, ЮС-101, ФФ-74 и ФФ-75 обладают сходным с ББИ действием в отношении АПДМ И снижают ее активность примерно на 50% в концентрации 5хЮ~4 М. Наибольшим шгибиторным эффектом обладает производное ФФ-74. Активность АЦЦМ подавляется им в той же концентрации почти на 80%. Возможно, что ингибиторное действие этого соединения связано с влиянием трехфггоруглеродного заместителя. Это прэдгологазнка тем более вероятно, что на втором по силе икгибирования месте расположено соединение ФФ-75, которое имеет двуХфторуглеродную цепь по второму положению. Последующее место занимают соединения с одним фторугле-родным фрагментом. Увеличение числа атомов фтора усиливает иш-иби-рующие свойства (сравнение ЮС-37 и ФФ-75), а замена атомов фтора на хлор приводит к снижению влияния на моноооксигеназиую активность мигфосом печени. Можно полагать, что важная роль принадлежит гидрофобным свойствам молекулы и фторирование, увеличивающее гидрофоб-ность молекулы, ведет к усилению шгибиторного действия. Для подг-

верждения проведено сравнительное изучение. эффектов двух фторпроиз-зодных бензимидазола с замещением по шестому положению бензольного кольца (соединения ЮС-98 и ЮС-101). Как указывалось, ЮС-88 имел наи меньшую величину к^, что свидетельствует о более сильном его связывании с цитохромом Р-450 по сравнению с другими соединениями и позволяет предположить, что подобные вещества будут эффективными ингибиторами опосредуемой гемопротеицом монооксигеназной активности. Действительно для этих соединений выявлен существенный ишибигорньш эффект, примерно равный по силе эффекту ФФ-74.

Характерно, что БПМО активность оказывается менее чувствительной к действию ингибиторов, чем деметилазная. Причина этого явления не ясна, однако можно предположить существенное влияние стерических свойств лолзкул на их большее сродство к активному центру цитохрома Р-450.

Наряду с 2-замещенныки фторпроизводными бензигдазола изучено влияние на активность микросомных монооксигеназ соединений, имеющих замещение также и по I положению имидазольного цикла (соединения Ф^-90, ФФ-96, ФФ-97 и ЮС-91), Наиболее сильно ингкбировали цитохрсй Р-448 опосредуемую активность соединения ФФ-97 и ФФ-90. Введение одного дополнительного атома г в метальный заместитель по второму положению вызывает резкое увеличение ингибируадей способности в отношении БПМО (соединение ФФ-97 по сравнении* с ФФ-96). Сладуат отметить, что ФФ-96 ¡фактически не влиял на активность БПМО и слабее других ингибировэл АПДМ.

Многие ксенобиотики в организме животных-и человека в процессе биотрансформации превращаются в активные или токсические метаболиты. Изменение активности микросомалъвых ферментов, ответственных за биотрансформацию, может изменять выраженность и длительность действия ксенобиотиков, а также выраженность побочных или токсических эффектов.

Изучено действие фторпроизводаых бензимвдазола на гено- и да-тотоксические эффекты афлатоксша В|.

В отсутствии метаболической активации афлатоксин В^ в 2,5 раза увеличивал частоту сестринских хроматвдных .обменов (СХО) в клетках китайского хоМячка. При метаболической активации афлатоксина Вт в присутствии микросомной фракции печени 1фысы частота СХО возрастала примерно в 4 - 5 раз. Мутагенные эффекта афлатоксина Выявляются слэдствием его превращения под влиянием цигохрома Р-450 в

активныа метаболит - 2,3-эпоксвд афлатоксина Вр который образует аддукты с нуклвиновыми кислотами и оказывзют генотоксическкэ, ге-латотоксическиз и канцерогенные аффекты св.А. Тутельян, Л.В. Кравченко, 1985 з.

- Предварительная обработка культуры клеток соединениями ЮС-15 и ЮС-98 даже в высоких концентрациях не влияла ка частоту СХО по ■ сравнению с контролем, но в два - три раза снижала мутагенный эффект, .активированного микросомами афлатоксина Вр

Генотоксическое действие афлатоксина В-^ выявляется также на клетках человека - лимфоцитах крови. Афлатоксин В1 в концентрации 30 нМ в присутствии микросомной фракции печени крысы достоверно (примерно в 3 - 3,5 раза) увеличивал частоту СХО по сравнению с контролем. Предварительная инкубация микросом в течение 10 мин с 10С-88 (10-4М> приводила к достоверному снижению СХО. Эти данные также свидетельствуют о подавление генотокскческого эффекта афлатоксина Вр

Получешше результаты позволяют рекомендовать изученные соединения для создания на их основе препаратов, уменьшающих гэноток-сическиа эффект микотоксипов типа афлатоксина Можно полагать, что защигноэ действие фторпроизводаых бензимвдззола гложет осуществляться двумя путями:

1. В результате подавления образования активного метаболита афлатоксина В-^ (зпоксида) на Цигохроме Р-450, что находат свое отражение в снижении активности АМДП и Б1Ш0.

2. Благодаря конкуренции с гуанином ДНК за связывание с эпокси-дом афлатоксина Вр т..к. фторпроизводные бензимидазола в какой-то степени имигарут" пуриновые основания.

В условиях активации афяатоксин В| в концентрации 0,5 мкг/мл достоверно (на 78%) подавлял реакцию бластрансформации в лимфоцитах человека, активированных ФГА. Предварительная обработка микро-сомноа фракции ЮС-15 и ЮС-98 (конечная.концентрация Ю_4М) приводила к подавлению ингибиторного эффекта активированного афлатоксина В]- на бластрансформацию лимфоцитов.

Таким образом ЮС-15 и ЮС-98 уменьшают циготоксическое дзйст-вш афлатоксина Вр Можно предположить, что защитный эффект ЮС-15 и ЮС-98, также как в случае антигенотоксического действия, обусловлен подавлением образования активных метаболитов афлатоксина В£ микросомными монооксигеназами.

йзучено влияние бензилбензимидазола на гепатотоксическиа эффект фуросемвда и усиление его диуретического действия в эксперименте и в клинике.

Исследование действия фуросемвда и дибазола на функцию печени в эксперименте проведены на изолированной печени беспородных крыс-самцов массой 180-200 г. Нормотермическую перфузию полированной печени проводили при постоянном портальном давлении 20 см вода.ст. и автоматически поддерживаемом значении pH перфузата 7,4 - 0,05 в условиях нормоксии и частичной гипоксии. Гепатотоксическоэ действие препаратов оценивали по изменению объемной скорости кровотока (о), по величине потребления кислорода <дрО^) и изменению концентрации внеклеточного калия. Показатели регистрировали непрерывно в течение 90 мин перфузии. Прь.параты вводили непосредственно в гор-фузионную среду.

В экспериментах с печенью интактных крыс в условиях нормоксш ^уросемвд (6 мг/кг) значительно снижал величину о (на 402).Выхода К+ и увеличения ¿pOg, свидетельствующих о гепатотоксическом эффекте фуросемида, при этом не наблюдалось. В условиях частичной анок-сии (21% 0%) фуросемид не только резко уменьшал величины о, но и существенно увеличивал выход К+ из гепатоцитов в перфузат.

При индукции фенобарбиталом, фуросемид даже в условиях нормоксии значительно снижал о, увеличивал внеклеточное содержание К+. Монотонное снижение вел:гпшы о характерно для препаратов, гелзто-токсичоский аффект которых обусловлен токсичностью их штаболкгов (В.И.Сарбаш и соавт., 1988). Эти данные согласуются с результата®» Mitchell и соавт,с 19853, которые описали морфологическую карггину некроза печени при введении высоких доз фуросемвда мышам. Известно, что фенобарбитал увеличивает эшксидгидрирование, -чем, го-аидимому, можно объяснить более отчетливое гепатотоксическое действие фуросемвда, наблюдавшееся у крыс, индуцированных фенобарбиталом.

Некроз печени, вызываемый фуросвмидом, и степень ковааэнтного . связывания последнего с тканями зависят, от пороговой дозы и лишь при ее достижении (в эксперименте - 100 мг/кг) начинается существенно© накопление метаболитов и появляется гепатотоксическиа эффект. Полагают, что токсическая пороговая доза для фуросемида зависит от концентрации нкзкомолэкуляркых компонентов в цитоплазме клетки, связывание с которыми инактивирует его активные метаболиты.

Анализ динамики содержания фуросемида и его стабильных метаболитов в горфузируемой жидкости показал, что в случаях, где в шрфузат добавляли фуросемид и пропускали его черзз печень интакт-ных животных, в перфузате определялись концентрации самого фуросемвда (6,0 - 2,0 мкг/мл), его метаболита 4-хлор-5-сульфамоил антра-ниловой кислоты, сел, (0,7 - 0,4 мкг/мл) и антраниловой кислоты, А, (0,4 - 0,6 мкг/мл). В случаях, когда использовали печень крыс, индуцированных фенобарбиталом, уровень фуросемвда и метаболита А оставался таким же, а метаболит сза в перфузате не определялся.

Введение дибазола (70 мг/кг) в шрфузат через 30 мин после изоляции дачени крыс (ингакпшх и индуцированных фенобарбиталом) не изменяло величину а р02 и не вызывало выхода К+ из клеток, что свидетельствует об отсутствии у дибазола гепаттоксическаго эффекта. Наблюдаемая при этом некоторое увеличение о (от 5,0 до 5,8 мл/мин/г), по-видимому, обусловлено сосудорасширяющим действием дибазола.

Предварительное введение (за 10 мин до добавления фуросемвда) дибазола в шрфузат снижало гепатотоксический эффект фуросемида, причем наиболее отчетливо это действие было на печени индуцированных крыс,- в этом случав величины о и выход К+ из клеток существенно не отличались от контрольных уровней. Эти данные позволяют предположить, что дибазол подавляет образование токсических метаболитов фуросемида и предупревдает его гепатотоксические эффекты.

Исследование влияния фуросемида и его комбинации с дибазолом на выделительную функцию почек проводили у 18 больных с ИБС и умеренной артериальной гипертензией, недостаточностью кровообращения I стадией, без выраженных нарушений функции почек и печени. Фуросемид назначали в дозе 20 мг (9 человек) или 40 мг (9 человек) нзто-щак за I час до еда. Через 4-5 даей больные получали внутрь 50 мг дабазола за 30 мин до приема фуросемида в соответствующей дозе. Эффект оценивали по разнице в обЪэмах мочи, выделившейся через I, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после комбинированного приема препаратов и после приема одного фуросемида. Рассчитывали величину минутного диуреза а кумулятивного диуреза.

Комбинированное применение фуросемвда и дибазола достоверно (Р<0,05) увеличивало суточный диурез от 1229,4 ^ 131,3 мл до 1499,4 ± 152,4 мл (на 40,7$) при дозе фуросемида 20 мг и от 1582 ± 217 мл до 2079 - 176 мл (на 37,5%) при дозе 40 мг. Анализ динамики

диуретического эффекта шказал, что достоверное (примерно двукратное ) увеличение объема мочи ча фоне комбинированного приема происходил' в период от 6- до 24 ч после приема мочегонного средства.

Анализ динамики концентраций фуросемида и его метаболитов в моче свидетельствует об ингибировании метаболизма фуросемида под влиянием дибазола. > ■ • .

Комбинированное назначение дибазола и фуросемида позволяет снизить используемые дозы фуросемида при сохранении величины диуретического эффекта, характерного для более высоких доз фуросемида. Это снижает риск возникновения гепатотоксического действия метаболитов фуросемида у больных, особенно при необходимости назначения им высоких доз фуросемида

выводы

1. С помощью ингибигорного анализа установлено, что метаболиты арахидсновой кислоты, образующиеся под влиянием лигоксигеназ, играют,- важную роль в диарейном действии холерного токсина. Ингибитор липоксигеназ - нордигидрогуаяретовая кислота (N00«), а также фтор-производное бензимидазола ФФ-385 подавляют эффект холерного токсина.. На модели лимфоцитов показано, что моеа и Ф5-385 имеет сходный механизм действия.

2. Установлено, что механизм мигогенного Действия В-субЪеданицы холерного токгапа на тимоцитах крыс отличается от механизма действия стандарнтых лектиноЕых митогенов конканавалина А и фигогеяаг-глютинина, и на связан с изменением внутриклеточной концентрации ионов Са2+, значений рЩ и изменением трансмембранной разности потенциалов.

3. Среди фгорпроизводных Оензимидазола отобрано соединение ЮС-15 эффективно подавляющее действие холерного токсина на моделях экспериментальной диареи. На основа субстанции ЮС-15 разработаны две готовые лекарственные формы (таблетки и.масляный раствор) антнтоксин-ного, антидиаренного лекарственного средства получившего название фгоразол.

4. Антидиарейные эффекты соединений ЮС-12 % ЮС-15 связаны с их способностью ингибироватъ активность каталитического компонента аде нилатциклазной системы и подавлять активность протеинкинаэы А.

5. Обнаружено, что ЮС-12 и ЮС-15 оказывают аддитивное влияние на |Ха"-'т]. в лимфоцитах в присутствии конканавалина А, .т.е. оказывает

иммуностимулфукадев комитогенное действие. ФФ-385 и ndga полностью блокируют кальциевый ответ на конканавалин А, т.е. вызывают имчуко-депрессивное действие.

6. Установлено, что фторпроизводные бензимвдазола ЮС-12, ЮС-15, ЮС-98, а также бензшбензкмвдазол концентрационно зависимым образом годавлякгг ферментативную активность, связанную с различными изофор-мами цигохрома Р-450 в микросомах печени мышей и крыс в опытах in vitro. В опытах in vivo в тесте гексеналового сна у мышей C57BI/6 показано,- что эти соединения при однократном введении подавляют активность цигохрома Р-450.

7. С помоидао ЮС-15 и ЮС-98 на лимфоцитах человека и перевиваемой линии клеток китайского хомячка удалось подавить цито- и генотокси-ческое действие афлатоксина Bj.

8. Бензилбензимвдазол на печени крыс in situ подавляет цитоток-сическую активность фуросемидз'. При комбинированной терапии бензил-бензимидазолом и фуросемвдом оп-ечено увеличение диуретического эффекта, что позволяет снизить применяемые дозы мочегонного.

список работ. опубликсэанных по теме диссертации

1. Асташкш Е.И., Ковалева В.Л., Ковалев И.Е., Влияние ионофор-ного антибиотика валиномипина на реакцию бласттрансформации лимфоцитов, индуцированную ФГА //Цитология.-1977.- n з. - с. 361-366.

2. Асташкин Е.И., Николаева И.С., Ковалев И.Е. Использовании ионофорных антибиотиков дяя выяснения роли одновалентных катионов в реакции бласттрансформации лимфоцитов человека //ДАН СССР. -1877. - Т. 237, N 5.- С. 1238-1240.

3. Николаева И.О., Гайлонская И.Н., Ферапонтов Г.К., Ковалев И.Е., Асташкин Е.И. Влияние веществ, изменя-.дих уровень внутри-клэточного цАМФ на реакцию бласттрансформации лимфоцитов человека //ЦИТОЛОГИЯ. - 1978. - Т.20, n 12. - С. I407-I4I2.

4. Асташкин Е.И., Николаева И.С., Ковалев И.Е. Использование ионофорных антибиотиков для изучения неспецифической реакции бласт . трансформации лимфоцитов человека.//I-ыа Есесоюзн. сЪезд гематологов, трансфузиологов. Тез. докл. - Баку, 1979. - С. 98.

5. Николаева И.О., Гайлонская И.Н., Ковалев И.Е., Асташкин Е.И. Выяснение роли циклических нуклетидов в пролиферации лимфоцитов человека с помощью веществ изменяющих их внутриклеточный уровень

// Там же. - С. 100.

6. Асташкин Е.И..Николаева И.О., Гайлонская И.Н., Ферапонтов

Г.К., Ковалев И.Е., Марчук Л.М. Изменение функциональной активности лимфоцитов человека под действием факторов, влияющих на внутриклеточную концентрацию цАМФ.//Криоконсервирование иммунокомш-тентных тканей.- Наукова Д^мка, Киев, 1979. - С. 108.

7. Асташкин Е.И., Николаева И.О., Ковалев И.Е., Ряииченко В.В. Влияние теофиллина и имвдазола на митогенное действие A23I87 и ФГА в культуре лкмфоцитов человека //Циклические нуклаотида. - Тез, докл. III Всесоюзн. симпоз. М., 1980. - С.7. .

8. Николаева И.О., Асташкин Е.И., Головлэва Л.А., Бэрцэва Р.Н. Ковалев И.Е., Рябиченко В.В. Комитогенное и кммунодепроссивноо действие ДДТ и его производных на лимфоциты человека, стимулира-ваНЕЫе ФГА //ДАН СССР. - 1980. - Т. 256, N 2. - G. 503-505.

9. Деревицкая В.А., Лихошерстов Л.М., Асташкин Е.И., Пискарев В.Е., Сенченкова И.Н., Николаева И.С., Кочетков Н.К. Гликопротеин из мембран тимоцитов теленка, обладающий комитогенным действием // Там m. - 1981. - Т.257, N 4. - С. 1003-1006.

10. Асташкин Е.И.-, Николаева И.С., Гайлонская И.Н., Ковалев И.Е. Связь между митогенным эффектом A23I87 и системами циклических вук-леотидов в лимфоцитах.//4-ый Международный крнгресс иммунологов. Тез. докл. Париж. - 1980. - N 6.4.09.

11. Николаева И.С..Гайлонская И.Н..Ферапонтов Г.К..Асташкин Е.И. Применение реакции блаытрансформации лимфоцитов человека для обнаружения биологачески активного холерного токсина в культуральных фильтратах холерных вибрионов //Вестник АМН СССР. - 1981. - Т. 12. - С. 62-67.

12. Асташкин Е.И., Рябиченко В.В., Николаева И.С. Влияние ФГА па активность аденилатциклазы и гуанилатциклазы лимфоцитов человека //Циклические нуклеотвды. Тез. докл. 4-ого Всесоюзн. симпоз. Минск, 1982. - С. 123.

13. Гуковская A.C..Зинченко В.П..Евтодивнко Ю.В..Асташкин Е.И. •Перэраспределениа мембраносвязанного Са2+ при. активации лимфоцитов периферической крови //Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. M., 1982. - С. 88.

14. Гуковская A.C., Зинченко В.П., Асташкин Е.И. Факторы, определяющие мембранный потенциал лимфоцитов //Тезисы III Советско-Швэгцарского симпозиума "Биологические мембраны. Структура и функ-

ттии" Ташкент, 1983. - С. 151.

15. Гуковская A.C. .Зшгченко В.П., Рябиченко В.В., Асташкин Е.И. Перераспределение внутриклеточного Ca в митогенстимулированных жл-фоцитах человека//ееп. Physiol. aiophys.- 1983.-T. 2. -С. 335-412.

16. Гуковская A.C. .Зинченхо В.П., Рябиченко В.В., Асташкин Е.И. Мембранный потенциал лимфоцитов человека. Факторы, определяющие мембранный потенциал //Биол. мембраны. - 1984. - T. I. - С. 191-200.

17. Гуковская A.C..Зинченко В.П., Николаева И.С., Асташкин Е.И. Мембранный потенциал лимфоцитов периферической крови человека. Влияние A23I87 И Кон А//Там же. - С. 317-323.

18. Гуковская A.C..Зинченко В.П. .Асташкин Е.И. Влияние блокато-ров кальмодулина на мембранный потенциал, калие.,ую проницаемость и митогенез лимфоцитов //Биохимия. - 1985. - Т. 50. - С. 788-794.

19. Николаева И.С. .Гайлонская И.Н'. .Астаппшн Е.И.,Тарасенко O.A., Ферапонтов Г.К.,.Рябиченко В.В. Изменение водно-электролитного го-меостаза при действии на тонкий кишечник лабораторных животных некоторых энтеротоксинов //Молекулярная структура бактериальных токсинов. Тез. докл. 1-ой Всесоюзн.- конф. M., 1985. - С. 7-8.

20. Николаева И;С..Гайлонская И.Н..Асташкин Е.И..Тарасенко O.A. Действие термолабильного токсина е. coli на разные линии мышей // Гам же. - С. 12-13.

21. Гайлонская И.Н..Николаева И.С..Асташкин Е.И..Тарасенко O.A., Рябиченко В.В., Ферапонтов Г.К. Сравнительное изучение действия энтеротоксина Vibrio cholerae, ТерМОЛЭбИЛЬНОГО Т0КСИНЭ Е .coli и фильтрата Salmonella typhimurium НЭ ТОНКУЮ КИШКУ ЛЭбОраТОрЯЫХ ЖИВОТНЫХ //ЖМЭИ. - IS85-. - N II. - С. 10-14.

22. Фокин A.B., Асташкин Е.И., Приходько А.З., Рябиченко В.В., Николаева И.С., Славич Ю.В., Коломиец А.Ф. Антидаарейное действие ингибитора микросомальных ферментов 2-(о»-гидротетрафторзтая)бенз-имидазола //ДАН СССР.- 1885. - Т. 284, N 6. - С. 1492-1494.

23. Асташкин Е.И., Приходько А.З..Коиелэва H.A.»Паутова И.Г., Коломиец А.Ф.,Славич Ю.В.,Фокин A.B. Влияние 2-Го-педротвтрафтор-зтилзбензимидазола на активность микросомальных монооксигеназ печени мышей //Хим.-фарм. журнал. - IS87. - N 3. - С. 265-269.

24. Асташкин Е.И., Приходько А.З., Кошелева H.A., Паутова И.Г., Николаева И.С. Изучение влияния лекарственных препаратов дибазола и лввамизола на систему микросомальных ферментов //Фармакол.токсикол. - 1987.-N 6.-С. 75-76.

25. Асташкин Е.И., Сарбаш В.И., Глезер М.Г., Кошэлевз H.A., Ти-щенкова И.Ф., Николаева И.О., Симонов В.И. Клинико-эксперментальное. изучение сочетанного применения дибазола и фуросемида //Гам же. -1988. - N.I. - С. 60-82.

26. Асташкш Е.И., Гуковская A.C., Сурин A.M., Николаева И.С., Славич ¡Q.B., Коломиец А.Ф., Фокин A.B. Изучение влияния 2-(<=<-пщро-тетрафторзтил)бензимидазола на внутриклеточный уровень свободных ионов Ca и величину мембранного потенциала в тимоцигах крыс //ДАН АН СССР. - 1988. - Т.300, Ni.- С.249-252.

27. Nikolaeva М. Va., Sur in А. М. , Ni hol aeva I. S., Astashkin Ye. I. Role of Ca'" and с АКР in regulation of transplasma-membrane oxsido — reductase in human granulocytes //14 th Inter.Congress of Biochemibtry.-Prague , 1983.-Mo:283.

28. Асташкш Е.И., Сурин A.M., Гуковская A.C., Николаева И.О., Лазарев A.B. Изучение влияния хзолерного токсина и его В-субЪеди-ницы на концентрацию свободных ионов кальция в клетках //Биол. мембрана.- 1989. - 1.6, N4. - С.395-403.

29. Гуковская A.C., Асташкин Е.И., Гуреева A.A..Николаева И.О., Сурин A.M., Зинченко В.П., Вертиева Ю.В. Влияние бактериальных токсинов на индуцированное мигогеном повышение концентрации Са2+ в цитоплазме тимоцитов крысы. Роль n-белков //Бюлл. эксперимент, биологии и медицины. - 1989, n 5. - С. 598-600.' •

30. Асташкин Е.И., Сурин A.M., Николаева И.С., Гуковская A.C., Лазарев A.B. Изучение влияния холерного токсина и его В-субЪедини-цы на концентрацию свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток //Тез. докл. 1У Всесоюз. сЪезда патофизиологов. Кишинев,1989.-Т.2.-С.520.

31. Моиковская Е.Ю., Гуковская A.C., Борин М.Л., Асташкин Е.И., Сурин A.M., Николаева И.С. Изменение внутриклеточной концентрации Ca в митогенстимулирозаяных лимфоцитах периферической крови человека. Влияние блокаторз кальциевых каналов - верапамила //Там же.

- С. 547.

32. Асташкин Е.И., Николаева И.О., Глезер М.Г., Паутова И.Г., .Ратпикова Л.А. Изучение эффективности и механизмов действия новых аьтидиарейных препаратов //Актуальные проблемы создания лекарственных форм с-заданными биофармацевтичоскими свойствами. Тез. докл. Всзсоюзьой конференции.. Харьков, 1989. - С. 143.

33. Глезер М.Г., Тищенкова И.Ф., Асташкин Е.И.г Козлов С.Т., Агапитова И.В., Дорохов В.В., Паутова И.Г. Экпериментальнсе изу-

чение кинетики антиднарейного средства ЮС—12//Таи же.— С. 177.

34. Асташкин Е. И., Сурин A. M., Гуковская А. С., Николаева И. С., Лазарев А. В. Лектпноподобное действие холерного токсина // Изучение и применение лсктинов. Т. 2. «Лектины в биологии и медицине», Тарту, 1989.—С. 199—205.

35. Асташкин Е. И., Паутова И. Г., Крупнова Е. П. Сравнительное изучение антидиарейной эффективности различных масляных форм препарата фторазол//Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фотохимических препаратов. Тез. докл. Всесоюз. конф., Харьков, 1990,—С 204—205.

36. Умнова Н. В., Порошенко Г. Г., Приходько А. 3., Асташкин Е. И. Антимутагенная активность ЮС—15//Биотехнология— медицине и народному хозяйству, т. 1 «Медицинские аспекты биотехнологии», ВНИИСЭНТИ М„ 1990,—С. 92—95.

37. Асташкин Е. ÍÍ., Сурин А. М., Ходсровл Л. Б , Николаева И. С. Исследование влияния лектинов и фторпроц.¡водных «Ниграс» на концентрацию свободных попов Са2+ в лимфоцитах /'/ Там же.— С. 95—100.

38. Astashkin Е. I., Surin А. М„ Mikhna M. G.. Nikoiaeva I. S., Laza-rev A. V., Gukovskaya A. S. Cholera ioxin and its В subunit do not change cytosoiic free calcium concentration//Cell calcium.— 1990.— V. 11.— P. 419—423.

39. Асташкин E. И., Паутова И. Г., Крупнова Е. П., Николаева И. С., Дяченко В. П., Коломисц А. Ф., Фокин А. В. Вщянне ингибиторов .метаболизма арахидоновой кислоты на экспериментальную диарею, индуцированную холерным токсином//ДАН СССР.— 1991.— Т. 316, № 5.— Г.. 126Я—1270.

40. Асташкин Е. И., Сурин А. М, Ходорова А. Б., Николаева I-Í С., Дяченко В. И., Коломиец А. Ф., Фокин А. В. Исследование влияния фсио-фторазола на концентрацию ионов Са2+ в цитоплазме тьмоцнтов крысы и на изменение этого параметра, индуцированные конкапа:>алшюм А// ДАН СССР.—1991,—Т. 317, № 2,—С. 499—502.

41. Асташкин Е. И., Николаева Н. С. Паутова И. Г., Крупнова Е. П. Изучение антидиарейной эффективности нового препарата фторазол// Проблемы качества лекарственных средств, Сб. науч. трудов, НПО «Бпо-тч-хшг^гия» М., 1991,— С. 0—9.

42. Асташкин Е. И., Сурин Л. М., Ходорова А. Б. Сравнительное исследование влияния фенофторазола и ингибитора липоксигеназ NDGA на концентрацию ионов кьлыиш в цитоплазме тимоцитов крыс//Там ж«.— С \ 1 16.

Подшк-аио в IK-I.MI. IS. 12.91. Зак;;;; 611. Формат 60X90/16. Тираж 100

Мое*™ Тияпгр- ;ти В\С\НИЛ