Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Современные возможности цитологического метода в исследовании плевральных и перитонеальных экссудатов

На правах рукописи

Борисова Олеся Владимировна

Современные возможности цитологического метода в исследовании плевральных и перитонеальных экссудатов

14.01.12 - онкология 14.03.10. - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010

003494103

Диссертационная работа выполнена в ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий» (директор - академик РАМН, профессор В.И.Чиссов)

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Волченко Надежда Николаевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Шабанова Ирина Петровна, РМАПО

доктор медицинских наук, профессор Трахтенберг Александр Хуиович, МНИОИ им. П.А. Герцена

Ведущее учреждение: ФГУ «Российский научный центр

рентгенорадиологии Росмедтехнологий».

Защита состоится 20 апреля 2010 года в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.047.01 при ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий» по адресу: 125284, Москва, 2-ой Боткинский проезд, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий» по адресу: 125284, Москва, 2-ой Боткинский проезд, д. 3.

Автореферат разослан « »марта 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Седых С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Злокачественные заболевания довольно часто сопровождаются выпотом в плевральную и брюшную полости. У мужчин но частоте обнаружения опухолевых клеток в экссудатах первое место занимает рак легкого (49%), затем лейкозы н злокачественные лимфомы, включая лимфогранулематоз (21%), рак органов пищеварительного тракта (7%) и мочеполовой системы (6%). У женщин плевральные и перптопеальные экссудаты встречаются в 2 раза чаще, особенно при прогрссснровашш рака молочной железы (37-50%) и яичников (20%), реже при злокачественных лимфомах (8%) и раке органов пищеварительного тракта (4%).

С учетом гистологической структуры первичной опухоли выпоты в плевральную и брюшную полости диагностируют, главным образом, при метастазах железистого рака: у мужчин - в 66% и у женщин - в 82% наблюдений. При плоскоклсточном раке достаточно редко возникают метастатические экссудаты: при раке легкого - у 4% мужчин и у 2% женщин; при опухолях неэпителиальной природы - в 22% и 14% наблюдений соответственно (Глузман Д.Ф., 2003).

Цитологическое исследование является единственным методом диагностики злокачественной природы экссудата, достоверность которого составляет от 64 до 96% (Климанова З.Ф., 1965; Долгов В.В., Шабалова И.П. и соавт., 2006; Shidham V.B., Atkinson B.F., 2006).

Первым аспектом проблемы при исследовании экссудатов является трудность дифференциальной диагностики реактивно-воспалительных, метастатических выпотов и мезотелиомы. Причиной затруднений трактовки клеток как злокачественных является, главным образом, наличие в жидкости реактивно измененных мезотелиальных клеток. При поздних стадиях онкологического заболевания опухолевые клетки в экссудате не удается обнаружить у всех пациентов, что обусловлено особенностями опухолевого

процесса в каждом конкретном случае и пределом цитологического метода при использовании рутинных окрасок.

На ранних этапах метастазирования трудно обнаружить клетки рака в экссудатах, вместе с тем установление распространенности опухолевого процесса до появления его клинических признаков имеет большое значение для правильного выбора тактики лечения. До последнего времени выявление опухолевых клеток осуществлялось только традиционными методами световой микроскопии, которые часто оказываются малоэффективными.

Другим аспектом проблемы при исследовании экссудатов является установление первичного источника метастазирования. По данным ряда исследователей, при использовании только цитоморфологических критериев адекватная диагностика возможна при раке молочной железы - у 78%, при аденокарциноме легкого - у 42% и при раке яичников - у 46% больных (Глузман Д.Ф. и соавт., 2003). От решения всех поставленных проблем во многом зависит правильный выбор метода лечения больного и благоприятный исход заболевания.

Перечисленные сложности удается преодолеть с помощью современных иммуноморфологических методик: иммуноцитохимии иммунопероксидазной (ИЦХ) и иммунофлуоресцентной (ФИЦХ), а также лазерной проточной цитофлуориметрии (ПЦФ).

Цель исследования

Цель исследования - совершенствование цитологической диагностики плевральных и перитонеальных экссудатов с использованием современных иммуноморфологических методик для установления характера экссудата, выявления единичных опухолевых комплексов и определения первичной локализации опухоли.

Задачи исследования

1. Разработать дифференциально-диагностические цитологические и иммуноцитохимические критерии реактивного экссудата с пролиферацией клеток мезотелия и специфического метастатического экссудата.

2. Выявить морфологические и иммуноцитохимические особенности экссудатов при различной локализации первичной опухоли.

3. Уточнить возможности цитологического и иммуноцитохимического методов в определении гистогенеза первичной опухоли при нсвыявленном первичном очаге.

4. Изучить возможности иммуноцитохимического исследования в определении малочисленных опухолевых комплексов в экссудатах.

5. Определить значимость методик лазерной проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной иммуноцитохимии при исследовании экссудатов.

Научная шпиона

Впервые в результате комплексного исследования экссудатов из серозных полостей с применением таких современных методик цитологической диагностики, как иммуноцитохимия и лазерная проточная цитофлуориметрия, стало возможным объективно охарактеризовать клеточный состав выпота, определить роль и значение в уточнении характера жидкости. Современные высокотехнологичные методики обнаруживают малочисленные опухолевые комплексы в экссудате на ранних этапах метастазирования, не выявляемые рутинным цитологическим исследованием, а также снижают гипердиагностику опухолевого процесса. Использование комплекса иммуноцитохимических маркеров позволяет уточнить источник метастазирования при неустановленном первичном опухолевом очаге. Показана высокая эффективность и быстрота флуоресцентной иммуноцитохимии экссудатов при срочных интраоперационных исследованиях с целью уточнения распространенности опухолевого процесса.

Практическая значимость

Проведенное исследование позволило разработать и внедрить в клиническую практику иммуноморфологические методы исследования экссудатов, в том числе иммуноцитохимию иммунопероксидазным методом и флуоресцентную иммуноцитохимию, уточнить значимость лазерной проточной цитофлуориметрии при исследовании плевральных и перитонеальных эксудатов.

Выявление малочисленных опухолевых комплексов с помощью применяемых современных методов увеличивает на 15% число наблюдений с доказанной диссеминацией опухоли по серозным оболочкам, следовательно, более точно определяет истинную распространенность опухолевого процесса.

ИЦХ исследование экссудатов с целью выявления локализации первичной опухоли устанавливает ее гистогенез с достоверностью 92,6%, что предопределяет дальнейшее обследование и целенаправленное лечение пациентов.

Внедрение в практику

Разработанные методики исследования экссудатов (ИЦХ, ФИЦХ и ПЦФ) используют в отделении онкоцитологии ФГУ «МНИОИ им П.А. Герцена Росмедтехнологий»

Апробация работы

Апробация проведена на заседании межотделенческой конференции ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий» 05 ноября 2009г. Результаты исследования доложены на VI Всероссийской конференции молодых ученых в Москве (2007г.), на научно-практической конференции «Лабораторная диагностика при специализированной и экстренной медицинской помощи» в Москве (2008г.), на Расширенном Пленуме Центрального Совета Ассоциации клинических цитологов в г. Черноголовка Московской области (2008г.).

Структура и объем работы Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследовании, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 53 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 148 источников (42 отечественных и 106 зарубежных работ).

Содержание работы Материал и методы исследования Изучение и разработка вопросов цитологическом диагностики экссудатов из серозных полостей в нашей работе основывалась на анализе цитологических и ИЦХ данных у 320 больных, обследованных и леченных в МНИОИ имени П.А. Герцена в 2005- 2009 годах: исследовано 223 экссудата и 97 смывов. Проведено 1250 ИЦХ исследований.

При анализе полученных цитологических и ИЦХ данных изучены истории болезни и результаты гистологического исследования. Критерием достоверности цитологического и ИЦХ исследования служили гистологическая характеристика, степень распространенности опухолевого процесса и результаты клинического обследования пациентов.

Характеристика материала в зависимости от первичной локализации процесса представлена в табл. 1.

Таблица 1.

Характеристика материала в зависимости от локализации процесса.

Первичная локализация опухоли Число больных

Толстая кишка 1(17

Желудок 52

Яичники 47

Легкое 2')

Молпчпич желая 27

Мезотслиома плевры 6

Ипчка 4

Псевяпмиксом;» брюшины 4

Меланома кожи, хонлросаркома ребра 2

Так эндометрия. тпепкп матки 2

Неопухолевые заболевания (сердечно-сосудистая недостаточность, цирроз печени, пневмония) 40

Всего 320

ИЦХ исследование выполнялось непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB методом, с применением декстрановой технологии LSAB 2 System - HRP и EnVision фирмы «DAKO» (Дания), а также Ultra Vision LP (USA). Выявление пероксидазной активности осуществляли с помощью 3,3-диаминобензидина (ДАБ). Цитопрепараты докрашивали гематоксилином Майера. Оценку ИЦХ реакции проводили на микроскопе DM LS2 («Leica», Germany).

С целью определения характера экссудата или смыва ИЦХ исследование выполняли у 75 и 97 больных соответственно. Для выявления опухолевых клеток нами использованы следующие антитела: эпителиальный маркер Вег-ЕР4, ЭМА и РЭА, которые маркируют клетки эпителиального происхождения. Обнаружение положительно реагирующих клеток при правильно проведенной ИЦХ реакции и соответствующих контрольных исследованиях, а также изучении морфологии клеточных элементов, свидетельствует о наличии метастазов рака. Для установления гистогенеза опухоли в экссудате при известной локализации первичного очага в 123 наблюдениях выявлялась частота экспрессии органно- и тканеспецифических маркеров опухолевыми клетками. При невыявленном первичном очаге в 25 наблюдениях определяли источник метастазировапия опухоли.

Оценка результатов ИЦХ исследования.

ИЦХ реакции оценивали как качественно, когда речь шла об уточнении гистогенеза опухоли, так и количественно. Ядерная реакция проявляется интенсивным окрашиванием ядра, например, при определении экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, WT1, cdx2. Цитоплазмепная реакция характеризуется диффузным окрашиванием цитоплазмы или отложением гранул в виде грубых пятен и зерен, например, при определении экспрессии виментина, цитокератинов, СА125, РЭА. Мембранное окрашивание наблюдается при проведении реакции с эпителиальным маркером Вег-ЕР4 и ЭМА. При оценке нммунофермеитной

реакции принимают во внимание интенсивность и полноту окрашивания тех или иных структур.

Методом ФИЦХ исследовано 35 экссудатов. Исследования осуществляли на флуоресцентном микроскопе ImagerMl фирмы «Karl Zeiss» с целью определения характера экссудата. Для этого использовали эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS. С целью визуализации ядер всех клеточных элементов, присутствующих в препарате, проводили окрашивание их ядерным красителем DAPI.

Методом лазерной ПЦФ исследовано 26 экссудатов. Измерения методом ПЦФ проводились на проточном цитофлуориметре FASC Callibur фирмы «Bacton Dickinson». Жидкости обрабатывали по стандартной схеме. В качестве метки опухолевых клеток адспогсниого рака использовали эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS. Сначала изучали цитологические препараты, приготовленные рутинным способом, параллельно проводили ИЦХ исследование иммунопероксидазным методом с использованием моноклонального антитела Вег-ЕР4.

Характеристика используемых в работе первичных ан тител.

Использовали моноклональные мышиные антитела фирмы («DAKO»): к рецептору эстрогена а (РЭ) (клон 1D5, разведение 1:35), к рецепторам прогестерона (РП) (клон 636, 1:50), общим цитокератинам (CK) (клон MNF 116, 1:50 - 1:100), CK 18 (клон RCK108, 1:50), эпителиальному мембранному антигену ЭМА (клон Е29, 1:50-1:100), десмину (клон ДЗЗ, 1:50-1:100), виментину (клон V9, 1:50-1:100), тиреоглобулипу (клон DAK-Tg6, 1:50-100), кальцитонину (1:150-1:300), общему лейкоцитарному антигену CD45 (клон 2В11+РД7/26, 1:50-1:100), CD3 (Т Cell, клон UCHT1, 1:50-1:200), CD15 (клон СЗД-1, 1:25-1:50), CD20 (В Cell, клон B-Lyl, 1:50), CD30 (клон Вег-Н2, 1:20-1:40), меланосомному антигену НМВ-45 (1:50), белку S-100 (NP 020), мелану A (Clone А 103, 1:25- 1:50), мезотелиальному антигену НВМЕ-1 (клон НВМЕ-1, 1:50), хромогранину А (клон DAK-A3, 1:50-1:100), синаптофизину (клон SY38, 1:10-1:20), специфическому

антигену предстательной железы PSA (клон ER-PR8, 1:25-1:50) СК7 (Clone OV-TL 12/30, 1:50- 1:100), СК20 (Clone Ks 20.8, 1:25 - 1:50), маркеру клеток макрофагально-гистиоцитарной природы CD68 (клон КР1, 1:50-1:100), а-антитрипсину (1:800-1:1600), a-1-фетопротеину, тиреоидному фактору транскрипции TTF1 (клон 8G7G3/1, 1:50), СА125(клон МП, 1:20), белку рбЗ (клон 4АИ, 1:25-1:50) эпителиальному маркеру (клон Вег-ЕР4, 1:200-1:400), маркеру опухоли Вильмса WT1 (клон 6F-H2, 1:50), ингибину а (клон R1, 1:25-1:50) и моноклональные мышиные антитела фирмы «Novocasta»: NCL-a-GCDFP-15 (клон 23A3, 1:20-1:40) и NCL-cdx2 (клон АМТ 28, 1:50-1:100). Для проведения ГГЦФ и флуоресцентной микроскопии использовали эпителиальный маркер Ber-EP4 FITC (клон Вег-ЕР4) фирмы «DAKO».

Обсуждение полученных результатов Цитологическое н ИЦХ исследование специфических экссудатов. Цитологическое и ИТДХ исследование экссудатов при раке яичников.

Выпоты при серозном раке яичников исследовали у 30 больных: у 26 - асцитическую жидкость, у 4 - плевральную. В 24 наблюдениях исследование проводили с целью установления ИЦХ профиля опухолевых клеток, в 6 - для установления характера экссудата.

Для серозного рака яичников типичным является обилие клеточных элементов опухоли, в большинстве случаев клетки образуют папиллярные структуры. Наряду с ними, встречаются железистоподобные структуры с формированием железистых пузырьков. Характерным, особенно при более дифференцированных формах опухоли, является присутствие секретирующих клеток с расположением слизистых масс по поверхности клеток: апокриновый тип секреции.

13 22 наблюдениях ИЦХ профиль экссудатов практически одинаковый: экспрессия СК7 выраженная, экспрессия СК20 отсутствует или отмечается слабая в единичных клетках, РЭА - отрицательная, СА125 -активно экспрессируется в клетках опухоли. В одном наблюдении отмечалась слабая экспрессия СК7 и СА125, что, возможно, связано с низкой

диффереицировкой опухоли. \УТ1 экспрсссировался в 16 наблюдениях, РЭ и РП - в 2 наблюдениях (табл. 2).

Таблица 2.

ПЦХ нрофи.'п. опухолевых клеток и экссудате при серозном раке ничиикон.

СК7 СК20 РЭЛ СЛ125 \\Т1 РЭ РП

22/23 0/23 0/23 22/23 16/23 2/23 2/23

(96%) (0%) (0%) (96%) (70%) (9%) (9%)

числитель - число наблюдений с экспрессией маркера знаменатель - общее число наблюдений

При диссеминации рака яичников по серозному покрову его клеточные элементы в экссудате обнаруживаются в подавляющем большинстве наблюдений и диагноз рака, как правило, не вызывает затруднений. В 6 наблюдениях при малом количестве опухолевых клеток в жидкости возникли трудности в их выявлении. У 4 больных отмечалась экспрессия опухолевыми клетками эпителиального маркера Всг-ЕР4 и ЭМА, что позволило диагностировать специфический его характер, причем у одного изначально экссудат был расценен как реактивный. Экспрессия РЭА не характерна для эпителиальных опухолей яичников, поэтому для выявления клеток рака яичников в экссудате он не пригоден. У 2 больных с серозным раком и гранулезоклеточной опухолью яичников (использовали ингибин - маркер гранулезоклеточной опухоли) удалось избежать гипердиагностики опухолевого процесса (табл. 3).

Таблица 3.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и _метастатических эксеудятпп при раке яичникоч._

Локализация Всего Цитологическое Иммуноцитохпмнчсскос

первичном исследование нсслсдопаннс

опухоли Специфический Гиио- Гнпер- Неуверенное Специфический Реактшшми

экссудат зиагностика лиагностика заключение экссудат экссудат

Яичники 30 24 1 2 3 28 2

Цитологическое и И11Х исследование экссудатов при пограничных опухолях яичников.

Особую группу при исследовании экссудатов составляют пограничные опухоли яичников. Верификация опухолевых клеток в асцитической жидкости представляет значительные сложности, так как признаки атипии клеток отсутствуют. Наиболее достоверным признаком является наличие в жидкости достаточно плотных сосочковых структур из довольно мелких мономорфных клеток с равномерным нежным рисунком хроматина. Клетки имеют тенденцию плотно прилежать друг к другу, из-за чего разрозненно расположенные эпителиальные клетки в мазках практически отсутствуют, что отражает гистологическую структуру пограничной опухоли: сосочки с поверхности опухоли яичника отрываются и свободно плавают в жидкости. Исследование асцитической жидкости при пограничных опухолях яичников обязательно должно быть дополнено ИЦХ. При исследовании 17 экссудатов специфический характер экссудата ИЦХ подтвержден в 7 случаях экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4 в клетках опухоли, причем, в 4 - экссудаты изначально были расценены как реактивные. Оценка ИЦХ реакций при исследовании экссудатов в послеоперационном периоде должна проводиться очень осторожно, так как неопухолевые эпителиальные клетки яичника, попавшие в экссудат во время операции, могут сохраняться до 3-х месяцев и отдифференцировать их цитологически и ИЦХ от клеток опухоли крайне сложно (табл. 4).

Таблица 4.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и метастатических экссудатом при пограничных опухолях яичников._

Локализация 1И|>Г, ИЧ1ШП опухоли Всего Цитологическое исследование Мммупоцитохимнческое исследование

Гшю-'шапшстика Гшк'р-/шигпосгнка 11 суверен мое •{ЩчМИНЧСМИС Специфическим ■жссудат Рсактинный экссудат

Пограничные опухоли яичников 17 4 13 7 10

Цитологическое и ИЦХ исследование экссудатов при раке желудка.

Специфические экссудаты при аденогенном раке желудка исследовали у 43 больных, из них 18 с целью установления ИЦХ профиля опухолевых клеток, и 25 - характера экссудата.

При диссеминации но серозному покрову аденокарциномы желудка клетки опухоли обнаруживаются в подавляющем большинстве наблюдений. Клетки располагаются разрозненно, образуя жслсзистоподобиые структуры и небольшие скопления округлой и неправильной формы. Клеточный полиморфизм выражен: клетки имеют разные размеры от небольших до больших и гигантских. Цитоплазма по своей структуре и окраске весьма разнообразная: насыщенно синяя, грубозернистая, иногда пенистая, мелко-или крупновакуолизированная. Как правило, по цитологической картине предположить первичный очаг в желудке очень сложно, так как специфические морфологические признаки отсутствуют. Для перстневидноклеточного рака характерным является крупная секреторная вакуоль, занимающая практически всю клетку и оттесняющая ядро к периферии, клетки имеют вид перстня.

По морфологическим характеристикам псрстнсвидноклсточный рак можно разделить на две разновидности. В одних наблюдениях опухолевые клетки имеют выраженные признаки полиморфизма, что соответствует гистологически типичному варианту перстневидноклеточного рака. В других - опухолевые клетки мелкие с пенистой цитоплазмой, некрупными ядрами, оттесненными к периферии цитоплазмы или небольшими серповидными ядрами, которые весьма трудно или подчас невозможно отличить от дистрофичного мезотелия или макрофагов, что соответствует гистиоцитарному, эозинофильному, мелкоклеточному и анапластическим вариантам перстневидноклеточного рака.

При ИЦХ исследовании опухолевых клеток в экссудате у 18 больных раком желудка отмечали положительную экспрессию СК7 и РЭА в 100% наблюдений, а экспрессию СК20 - в 11 (61%) (табл. 5). Экспрессия а-

антитрипсина является характерным для рака желудка, однако использование этого антитела при проведении дифференциальной диагностики ограничено из-за его выраженной экспрессии в лимфогистиоцитарных элементах, которые всегда в значительном количестве присутствуют в выпотах.

Таблица 5. ИЦХ профиль опухолевых клеток

и экссудате и »и раке желудка.

СК7 CIC20 РЭА

18/18 11/18 18/18

(100%) (61%) (100%)

В нашем исследовании у 25 пациентов, страдающих раком желудка, при цитологическом исследовании возникли сложности в оценке характера экссудата: у 12 метастатический характер экссудата подтвержден ИЦХ экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4, РЭА и ЭМА, причем, у 4-х из них экссудат изначально был расценен как реактивный. У двух больных с помощью ИЦХ исследования удалось избежать гипердиагностики опухолевого процесса. Выявление малочисленных опухолевых комплексов при раке желудка, пропущенных при рутинном цитологическом исследовании, составило 16% (табл. 6).

Таблица 6.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и

__,метает'цтнчсскнх экссудатов при раке желудка._

Локализации Всего Цитологическое Пммуноцитохкмическое

неркичмои исследование исследование

онуХОЛИ Специфическим Гпни- Гинер- Неуверенное Специфический 1'еиктнвный

'л»чч'удат чмагностика 'МШГНОСТИКИ заключение лсссуда г экч'судат

Желудок 43 18 4 2 19 30(3) 13

В скобках указано число наблюдений с выявлением малочисленных опухолевых комплексов

Из 9 исследованных смывов при раке желудка опухолевые клетки ИЦХ выявлены в 3 (33.3%) наблюдениях, что диктует целесообразность продолжения исследования.

Цитологическое и ИЦХ исследование экссудатов при колорсктаныюм

раке.

Исследованы экссудаты у 19 больных: для определения ИЦХ профиля опухолевых клеток - у 6 (3 - из брюшном и 3 из плевральной полости) и установления характера экссудата - у 13 пациентов.

В высоко- и умереннодифференцированной аденокарциноме кишечного типа сохраняется морфология клеток кишечного эпителия: клеточные элементы имеют вытянутую форму с удлиненными по большой оси ядрами, полиморфными ядрышками, клетки образуют железистые структуры. При низкодифференцировашюй аденокарциноме кишечного типа морфологически предположить органопринадлежность практически невозможно. Патогномоничным для аденокарциномы толстой кишки является коэкспрессия СК20 (100%) и сс!х2, без сопутствующей экспрессии СК7, всегда отмечается выраженная экспрессия РЭА (табл. 7).

Таблица 7.

ИЦХ профиль опухолепмх клеток п экссудате при

колореьталыюм раке.

СК7 СК20 ГЭА С(1.\2

0/6 (0%) 6/6 (100%) 6/6 (100%) 3/3

При раке толстой кишки из 13 исследованных экссудатов в 3 случаях ИЦХ подтвержден метастатический характер экссудата. Выявленные опухолевые клетки были единичными, причем, в двух наблюдениях экссудаты изначально расценены как реактивные. В одном наблюдении с помощью ИЦХ исследования удалось избежать гипердиагностики (табл. 8).

При раке ободочной кишки опухолевые клетки в смыве ИЦХ обнаружены в 16%, при раке прямой кишки - 10%. Такой низкий процент связан, возможно, с локализацией первичной опухоли. В большинстве наблюдений был рак средне- и нижнеампулярного отделов прямой кишки, редко распространяеющийся на брюшину малого таза (табл. 9).

Таблица 8.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и _метастатических экссудатов при колоректалыюм раке._

Локализации первичной опухоли Мсего Цитологическое исследование Пммуноцитохимическое исследование

Специфическим экссудат Гшш-!(иагиостика Гипердиагностика Неуверенное заключение Специфический экссудат Реактивный экссудат

Толстая кишка 19 6 2 1 10 9(2) 10

Таблица 9.

Результаты ИЦХ исследования смывов при раке толстой кишки.

Локализации рака Всего ИЦХ + ИЦХ -

Прямая кишка 51 5(10%) 46

Ооодочпая кишка 37 6(16%) 31

Цитологическое и ИЦХ исследование экссудатов при раке молочной железы (РМЖ).

Плевральные экссудаты при РМЖ исследовали у 17, перитоиеальиые - у 10 больных. В 22 наблюдениях исследование проводили с целью установления ИЦХ профиля опухолевых клеток, в 5 - характера экссудата.

При диссеминации протокового РМЖ по плевре и брюшине типичным является присутствие в экссудате шаровидных скоплений из опухолевых клеток правильной округлой формы. Однако такие типичные скопления встречаются нечасто - в 6 - 10% наблюдений. ИЦХ исследование позволяет уточнить прогрессирование протокового и долькового РМЖ: характерна экспрессия СК7 (100%), иногда РЭА (82%), РЭ (23%) и РП (9%), отсутствует экспрессия СК20. Маркер ССЭРР15 является специфичным для рака молочной железы, но экспрессия его отмечается очень редко (9% наблюдений) и более характерна для цистаденокарциномы молочной железы (табл. 10).

При установлении характера экссудата при цитологическом исследовании в 2 из 5 наблюдений не удалось выявить клетки рака из-за их

малого количества. ИЦХ исследование позволило скорректировать результат исследования (табл. 11).

Таблица 10.

ИЦХ профиль опухолевых клеток в экссудате при раке молочной железы.

СК7

СК20

РЭА

ССЭРР15

РЭ

РП

22/22 (100%)

0/22

18/22 (82%)

2/22 (9%)

5/22 (23%)

2/22 (9%)

Таблица 11.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и метастатических экссудатов при РМЖ. _

Локализации первичном опухоли Всего Цитологическое исследование Иммуноцитохимическое исследование

Специфический экссудат Гипи-Чиагностнка Гипер-зиагпостика Неуверенное заключение Специфический экссудат Реактивный экссудат

Молочная железа 27 22 - - 5 24 (2) 3

Цитологическое и ИЦХ исследование экссудатов при раке легкого.

Специфические экссудаты из плевральной полости при раке легкого исследовали у 28 больных, преимущественно аденогенном (26 наблюдений), реже при плоскоклеточном и мелкоклеточном раках (по одному). У 19 больных исследование проводили с целью установления ИЦХ профиля опухолевых клеток, у 9 - характера экссудата.

Аденогенный рак легкого наиболее часто диссеминирует по плевре. Клетки аденокарциномы легкого в жидкости располагаются в виде железистоподобных и округлых структур, комплексов и разрозненно, нередко клетки складываются в ряды и образуют симпласты, папиллярные структуры встречаются редко. Диагноз аденогенного рака по клеткам опухоли в экссудате не представляет затруднений, поскольку имеется типичная для железистого рака цитологическая картина с выраженной атипией и полиморфизмом клеток и ядер в большинстве наблюдений. Специфичных для аденокарциномы легкого цитологических черт нет. Только при бронхиолоальвеолярном раке (БАР) можно выделить

характерные черты, по которым можно предположить прогрессирование БАР. БАР представляет собой высокодифференцированную аденокарциному из эпнтелиоцитов с минимальной атипией. В жидкости мелкие опухолевые клетки БАР образуют компактные железистые комплексы, ядра характерной бобовидной формы с выраженными ядрышками. При ИЦХ исследовании выраженная экспрессия СК7 (100%) и РЭА (94%). Специфичным для аденокарциномы, плоскоклеточного и мелкоклеточного рака легкого является экспрессия фактора ПЛ (65%) (таблица 12).

Таблица 12

СК7 СК20 РЭА TTF 1

17/17 (100%) 3/17 (18%) 16/17 (94%) 11/17 (65%)

Плоскоклеточный рак редко метастазирует по серозной оболочке. Полигональная и вытянутая форма клеток плоскоклеточного рака сохраняется в экссудате, при ИЦХ исследовании отмечается экспрессия белка рбЗ.

Клетки мелкоклеточного рака при расположении их небольшими группами, бывает нелегко обнаружить из-за обилия мезотелиальных клеток. При ИЦХ опухолевые клетки экспрессируют нейроэндокринные маркеры: хромагранин А, синаптофизин и CD57.

ИЦХ исследовано 9 плевральных экссудатов у пациентов с аденокарциномой легкого, при рутинном цитологическом исследовании которых возникли сложности в установлении их характера. Необходимо отметить, что экссудат при раке легкого не всегда является результатом обсеменения плевры опухолью. Он может возникнуть в результате обтурации бронха опухолью и воспалительных процессов в легочной ткани. Пневмонит является одним из ведущих симптомов заболевания. В 8 наблюдениях экссудат имел реактивный характер, а в одном наблюдении удалось избежать гипердиагностики опухолевого процесса (табл. 13).

Таблица 13.

Цитологическая и ИЦХ дифференциальная диагностика реактивных и ___метастатических экссудатов при раке легкого._

Локализация Всего Цитологическое Иммуноцитохимическое

первичной исследование исследование

опухоли Специфический Гнпо- Гипер- Неуверенное Специфический Реактивный

экссудат '(иагностнка диагностика заключение экссудат экссудат

Легкое 28 19 - 1 8 19 9

Исследование экссудатов при невыявленном первичном опухолевом очаге.

При изучении экссудатов в 25 наблюдениях потребовалось уточнить локализацию первичного опухолевого процесса. При рутинном цитологическом исследовании во всех случаях выявлены комплексы низкодифференцированной аденокарциномы без каких-либо признаков органоспецифичности.

Наиболее часто при исследовании асцитической жидкости у женщин дифференциальную диагностику необходимо проводить между раком желудка с метастазом в яичник и первично-множественным опухолевым процессом — раком желудка и раком яичников (4 больных). Во всех наблюдениях при ИЦХ исследовании отмечена положительная экспрессия РЭА, СК7 и отсутствие экспрессии СА125 и \\НГ1 в опухолевых клетках, что позволило диагностировать аденогенный рак желудка с диссеминацией по брюшине и метастазами в яичники.

У 2 пациентов установлен специфический асцит с наличием клеток аденокарциномы без выявленного первичного очага. Положительная экспрессия СК7, СК20 и РЭА, отсутствие экспрессии с<1х2, позволили диагностировать первичный рак желудка.

Диссеминация РМЖ установлена в 5 наблюдениях на основании экспрессии РЭ, СК7, РЭА и отсутствии экспрессии СА125, \УП, ПЛ, СК20, а в одном наблюдении отмечалась положительная экспрессия ССЕ)РР15.

Специфический плеврит с наличием комплексов аденокарциномы легкого выявлен в 5 наблюдениях на основании выраженной экспрессии органоспецифического маркера легкого - ТТР1 в комплексе с СК7 и РЭА.

Серозный рак яичников с диссеминацией по серозным оболочкам диагностирован в 4 наблюдениях. ИЦХ исследование выявило положительную экспрессию СК7, СА125, \\ГГ1 и отсутствие экспрессии СК20, сс1х2, ПТ1, слабую экспрессию РЭА. В одном наблюдении установлен муцинозный рак яичников при коэкспрессии СК7 и СК20, отсутствии экспрессии СА125, РЭА, сс1х2, ШТ1, РЭ и РП.

Для подтверждения прогрессирования аденокарциномы толстой кишки проведено ИЦХ исследование в 2 наблюдениях, при которых отмечался соответствующий ИЦХ профиль: положительная экспрессия СК20, сс1х2, отсутствие экспрессии СК7.

Практически во всех наблюдениях первичная опухоль, диагностированная на основании ИЦХ профиля опухолевых клеток в экссудате, подтверждена в дальнейшем гистологическим исследованием. В двух наблюдениях не удалось определить первичную локализацию опухоли: в одном не диагностирован гепатоцеллюлярный рак вследствие использования неполной панели антител, в другом из-за неправильной оценки ИЦХ реакции не верифицирована эпителиоидная мезотелиома.

Для установления первичной локализации опухолевого процесса ИЦХ исследование экссудатов, на наш взгляд, необходимо проводить обязательно, поскольку морфологические признаки опухолей различных локализаций не обладают абсолютной специфичностью. Например, перстневидноклеточный рак может быть как в желудке, так и в молочной железе, опухоли с выраженной секреторной активностью и структурами по типу железистых пузырьков могут быть при любом железистом раке, а не только при серозном раке яичников. С целью определения вероятной органной принадлежности при исследовании экссудатов необходимо использовать широкую панель антител. В первую очередь, это изучение одновременной экспрессии СК7 и

20, затем применение широкого спектра специфических транскрипционных факторов, ассоциированных с определенным направлением клеточной дифференцировки: ПТ1, РЭ, РП, ОСОРР15, \\ГТ1, cdx2, рбЗ. Кроме того, существуют ИЦХ маркеры «условно-специфические», например СА125, РЭА. Непременным условием успеха ИЦХ исследования является достаточное количество опухолевых клеток в жидкости, оптимально не менее 300. При этом необходимо понимать, что о первичной локализации опухоли не всегда можно высказаться категорично и однозначно, поскольку, антитела, как правило, не обладают абсолютной специфичностью. Кроме того, опухолевые клетки могут утрачивать органоспецифические черты ИЦХ профиля, в опухолевых клетках в ряде случаев происходит извращенная экспрессия неприсущих ей маркеров. Окончательное заключение производится после комплексного изучения цитологических и ИЦХ препаратов.

ИЦХ исследование экссудатов с использованием широкой панели антител для выявления первичной локализации опухолевого процесса позволяет повысить достоверность цитологического исследования до 93% и значительно помочь клиницистам в дальнейшем обследовании и лечении пациентов.

Метод флуоресцентной нммуноцитохнмин при исследовании экссудатов.

Методом ФИЦХ исследовано 35 экссудатов: при РМЖ - 6, перстневидноклеточном раке желудка - 6, аденокарциноме толстой кишки -4, серозном раке яичников - 4, пограничных опухолях яичников - 3, аденокарциноме легкого - 2 и неопухолевых заболеваниях -10. Во всех наблюдениях при цитологическом исследовании возникли сложности в установлении характера экссудата.

При ФИЦХ экспрессия эпителиального маркера Вег-ЕР4 отмечена в двух наблюдениях при РМЖ, из них в одном опухолевые клетки были единичные. Необходимо отметить, что в одном наблюдении при РМЖ в явно

специфическом экссудате с наличием клеток недифференцированного рака экспрессии эпителиального маркера Вег-ЕР4 не отмечено, вследствие потери клетками молекулы адгезии Вег-ЕР4. Из 6 исследованных экссудатов при перстневидноклеточном раке желудка опухолевые клетки выявлены в 3, причем в одном наблюдении экссудат изначально расценен как реактивный и выявленные при ФИЦХ опухолевые клетки были немногочисленные. При аденокарциноме толстой кишки специфический характер экссудата с помощью ФИЦХ установлен в 2 наблюдениях, в одном при цитологическом исследовании высказывалось предположение о реактивном характере экссудата и обнаруженные опухолевые клетки были малочисленными. У одного больного мелкоклеточным раком легкого также ФИЦХ подтвержден специфический характер экссудата. Специфический характер экссудата с наличием клеток серозного рака яичников установлен в одном наблюдении, изначально экссудат расценен как реактивный и опухолевые клетки были немногочисленными. Асцитическая жидкость при пограничных опухолях яичников исследовалась в 3 наблюдениях, в одном при ФИЦХ исследовании экссудат имел реактивных характер. В остальных 2 наблюдениях экссудат исследовался при повторной операции и обнаружены единичные клетки без признаков принадлежности к опухоли с экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4. Вероятно, это нормальные клетки яичников, попавшие в экссудат при предыдущей операции. Тем не менее, необходимо наблюдение за этими пациентами (табл. 14).

При плановом гистологическом исследовании во всех 9 наблюдениях подтверждена диссеминация опухоли по серозным оболочкам.

В специфических экссудатах с наличием клеток аденогенного рака в спектре Green хорошо видна четко мембранная экспрессия эпителиального антигена Вег-ЕР4. Нами отмечены некоторые особенности экспрессии эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемые при флуоресцентной микроскопии. Характерной особенностью является хорошо выраженная четкая мембранная реакция в виде секреторных вакуолей, которые

располагаются на поверхности клетки в виде своеобразного кружева, иногда наблюдается отрыв цитоплазмы в виде секреторных вакуолей. Наличие таких клеток не вызывает сомнений в их эпителиальной природе.

Таблица 14.

Сравнительный анализ цитологического и <1)11 ЦХ исследования в установлении характера экссудата.

Локализация первичного опухолевого процесса Всего Цитологическое исследование ФИЦХ

Гипо- пиагпостика Гипердиагностика Неуверенное заключение Специфический экссудат Реактивный экссудат

Молочная -келеза 5 - - 5 2(1) 3

Желудок 6 1 - 5 3(1) 3

Легкие 2 - - 2 1 1

Яичники 4 1 - 3 1(1) 3

Толстая кишки 4 1 - 3 2(1) 2

Всего 22 3 - 19 т 12

В скобках указано количество исследований с выявлением единичных опухолевых

комплексов.

Для предотвращения гипердиагностики опухолевого процесса необходимо учитывать, что макрофагальные элементы, присутствующие в экссудате в большом количестве, захватывают частицы красителя, которые выглядят как светящиеся включения в цитоплазме.

Наше исследование показало, что ФИЦХ экссудатов является новым надежным и быстрым методом диагностики характера экссудата. Особенно перспективно его применение при срочных интраоперационных исследованиях экссудатов, так как не требует сложной предподготовки материала и значительных временных затрат: исследование занимает до 20 минут. Это возможно благодаря тому, что клеточные элементы в жидкости находятся в благоприятной для них среде, жидкость доставляется в лабораторию сразу после взятия, поэтому высушивания, переохлаждения, а, следовательно, и изменения конформации белков не происходит. Эпителиальный антиген Вег-ЕР4 является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. ИЦХ реакция прямая: флуорохром

непосредственно конътогирован с антителом. Все это способствует сокращению времени инкубации антитела с антигеном и применению эпителиального маркера Вег-ЕР4 в срочной интраоперационной диагностике.

Метод лазерной проточпой цитофлуоримстрии при исследовании экссудатов.

Методом лазерной ПЦФ исследовано 26 экссудатов, из них 17 реактивных и 9 специфических. Сначала изучались цитологические препараты, приготовленные рутинным способом, и параллельно проводили ИЦХ исследование иммунопероксидазным методом с использованием моноклонального антитела Ber-EP4 FITS.

При цитологическом исследовании у 9 больных высказывали подозрение о наличии комплексов аденогенного рака. ИЦХ исследование с эпителиальным маркером Вег-ЕР4 подтвердило у всех наличие в экссудате клеток рака. Метод ПЦФ также выявил клон опухолевых клеток с высокой экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4 FITS. В 15 наблюдениях реактивный характер экссудата подтвержден ИЦХ методом и ПЦФ -экспрессии эпителиального маркера Вег-ЕР4 не отмечено. В 2 наблюдениях при исследовании реактивных экссудатов методом ПЦФ выявлены немногочисленные клетки с экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4. При ИЦХ исследовании визуализировались единичные клетки с неяркой цитоплазматической окраской. Данная реакция не является истинной, так как определялась в цитоплазме, а необходимо учитывать только мембранное окрашивание. Клетки макрофагальной природы способны поглощать частицы красителя. При исследовании методом ПЦФ оценить морфологию клеточных элементов, в которых прошла ИЦХ реакция, невозможно, что является существенным ограничением применения этого метода. В одном наблюдении при цитологическом исследовании небольшого количества жидкости из малого таза у пациентки, получавшей лечение по поводу долькового рака молочной железы, высказывалось подозрение на наличие

единичных опухолевых комплексов. Методами ПЦФ и ИЦХ подтверждено их наличие.

Таким образом, лазерная ПЦФ может быть использована для диффренциальной диагностики между реактивным и метастатическим экссудатом. Однако, при обнаружении методом ПЦФ единичных клеток с экспрессией эпителиального маркера Вег-ЕР4, необходимо тщательное комплексное изучение цитологических препаратов и гистограмм, а также дополнительное проведение ИЦХ исследования иммунопероксидазным методом для предотвращения гипердиагностики опухолевого процесса.

Важно также отметить, что иммунофенотипирование экссудата методом ПЦФ с большим количеством лимфоидных элементов позволяет отдифференцировать реактивный экссудат с выраженной лимфоидной инфильтрацией от злокачественной лимфомы с поражением серозных оболочек. На основании иммунофенотипирования клеток экссудата методом ПЦФ установлен иммунологический вариант лимфомы в двух наблюдениях: болезнь Ходжкина с единичными клетками экспрессирующими CD30 и Т-клеточная периферическая лимфома с популяцией опухолевых клеток CD3, CD4, CD5 положительных и не экспрессирующих CD20 и CD30.

Выводы:

1. Иммуноцитохимическое исследование плевральных и перитонеальных экссудатов в сложных диагностических случаях повышает результативность цитологического метода: чувствительность с 62% до 93% и специфичность с 95% до 97%. Методика в 79% подтверждает диссеминацию опухоли, заподозренную рутинным цитологическим исследованием, и в 7% позволяет избежать гипердиагностики опухолевого процесса.

2. Дифференциальная диагностика реактивных и метастатических экссудатов при аденогенном раке осуществляется надежным и

чувствительным маркером - эпителиальным антигеном Вег-ЕР4: чувствительность его составляет 96%, специфичность - 99%.

3. При раке основных локализаций определена панель маркеров и частота их экспрессии в метастатических экссудатах: рак молочной железы -СК7 (100%), РЭА (82%), РЭ (23%); аденогенный рак легкого - СК7 (100%) и ПТ1 (65%); аденокарцинома желудка - СК7 (100%), РЭА (100%), СК20 (61%); серозный рак яичников - СК7 (96%), СА125 (96%), \УТ1 (70%); аденокарцинома толстой кишки - СК20 (100%), РЭА (100%).

4. При невыявленном первичном опухолевом очаге сочетание цитологического и иммуноцитохимического исследований с использованием широкой панели моноклональных антител в 93% устанавливает локализацию опухоли.

5. Иммуноцитохимическое исследование позволяет у 15% больных обнаружить малочисленные опухолевые комплексы, не выявленные при рутинном цитологическом исследовании.

6. Флуоресцентное иммуноцитохимическое исследование экссудатов с эпителиальным маркером Вег-ЕР4 высоко эффективно при срочной интраоперационной диагностике распространенности опухолевого процесса.

Практические рекомендации:

1. Достоверность цитологического исследования зависит, прежде всего, от правильной техники забора исследуемого материала. Вся эвакуированная жидкость используется для приготовления препаратов, при большом ее объеме - последняя порция не менее одного литра. Для предотвращения свертывания жидкости в нее необходимо добавить 5% цитрат натрия из расчета 5 мл на 100 мл жидкости. Перед приготовлением цитологических препаратов жидкость должна отстояться не менее часа.

2. В сложных диагностических наблюдениях для определения характера экссудата необходимо проведение иммуноцитохимического исследования с эпителиальным маркером Вег-ЕР4.

3. При невыявленном первичном очаге иммуноцитохимичеекое исследование с использованием широкой панели антител (7-10 маркеров) и достаточном количестве опухолевых клеток в жидкости (не менее 300) позволяет достоверно в 93% определить первичную локализацию опухоли.

4. Метод лазерной проточной цитофлуориметрии эффективен для диагностики в экссудатах аденогенного рака. Для корректной оценки результатов необходимо сочетать его с рутинным цитологическим и иммуноцитохимическими методами. Лазерная проточная цитофлуориметрия помогает дифференциальной диагностике реактивного экссудата с выраженной лимфоидной инфильтрацией и злокачественной лимфомы, а также установлению ее морфологического варианта.

5. При срочном интраоперационном исследовании экссудатов с целью исключения диссеминации аденогенного рака по серозным оболочкам показан высокоэффективный метод флуоресцентной иммуноцитохимии, не требующий значительных временных затрат.

б. При перстневидноклеточном раке желудка или пограничной опухоли яичников отсутствие при рутинном цитологическом исследовании экссудатов опухолевых клеток является показанием к проведению иммуноцитохимии флуоресцентным или иммунопероксидазным методами.

7. Иммуноцитохимичеекое исследование смывов из брюшной полости необходимо проводить, несмотря на относительно небольшой процент выявления единичных опухолевых комплексов: при раке желудка 33%, при раке ободочной кишки 16%, при раке прямой кишки 10%, потому что наличие свободных опухолевых клеток является признаком латентной перитоиеальной диссеминации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

I. Публикации в изданиях по перечню ВАК РФ:

1. Иммуноцитохимическое исследование экссудатов из серозных полостей. // «Российский онкологический журнал» - 2008 - №4 - с. 22-26 (Н.Н. Волченко, О.В. Борисова).

2. Первичная локализация опухолевого процесса при иммуноцитохимическом исследовании экссудатов из серозных полостей. // «Российский онкологический журнал». - 2010 - №2 - с. 7-11 (Н.Н. Волченко, О.В. Борисова).

II. В других изданиях:

3. Иммуноцитохимическое исследование экссудатов из серозных полостей. // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии. Мат-лы VI Всероссийской конференции молодых ученых. -М. - 2007 - с. 32 (О.В. Борисова).

4. Immunocytochemical reseach of exsudations from serous cavités. // Тезисы XII Центрально-Европейского конгресса колопроктологов. - M. -2008 - с. 243 (N.N.Volchenco, O.V. Borisova).

5. Цитологическое исследование экссудатов из серозных полостей с применением иммуноцитохимического метода и метода проточной цитофлуориметрии. // Мат-лы расширенного Пленума Центрального Совета Ассоциации клинических цитологов - г. Черноголовка, Московской области. - 2008. - с. 10 (Н.Н. Волченко, О.В. Борисова).

6. Определение перитонеальной диссеминации рака желудка и толстой кишки при цитологическом и иммуноцитохимическом исследовании. // «Онкохирургия» - 2009 - т. 1- №3 - с. 21 - 25 (Н.Н. Волченко, О.В. Борисова).

7. «Оптимизация исследования экссудатов из серозных полостей». Мат-лы Расширенного Пленума Центрального Совета Ассоциации клинических цитологов. - Уфа - 2009 - с. 30 (Н.Н. Волченко, О.В. Борисова).

Принято к исполнению 17/03/2010 Исполнено 18/03/2010

Заказ №3478 Тираж: 100 экз.

ООО «Эрфольг-А» ИНН 7707283363 Москва, ул. Новослободская, 18 (495)649-62-16 (495)787-65-51 (499) 972-30-55 info@printdcsign.ru www.printdcsign.ru

Злокачественные заболевания довольно часто сопровождаются выпотом в плевральную и брюшную полости. У мужчин по частоте обнаружения опухолевых клеток в экссудатах первое место занимает рак легкого (49%), затем лейкозы и злокачественные лимфомы, включая лимфогранулематоз (21%), рак органов пищеварительного тракта (7%) и мочеполовой системы (6%). У женщин плевральные и перитонеальные экссудаты встречаются в 2 раза чаще, особенно при прогрессировании рака молочной железы (37-50%) и рака яичников (20%), у 8% больных развитие экссудата связано со злокачественными лимфомами и у 4% - с опухолями пищеварительного тракта.

С учетом гистологической структуры первичной опухоли выпоты в плевральную и брюшную полости диагностируют, главным образом, при метастазах железистого рака: у мужчин - в 66% и у женщин - в 82% наблюдений. При плоскоклеточном раке достаточно редко возникают метастатические экссудаты: при раке легкого - у 4% мужчин и у 2% женщин; при опухолях неэпителиальной природы - в 22% и 14% наблюдений соответственно (Глузман Д.Ф. и соавт., 2003).

Цитологическое исследование является единственным методом диагностики злокачественной природы экссудата. Достоверность цитологического исследования экссудатов по данным литературы составляет от 64 до 96% (Климанова З.Ф., 1965г., Долгов В.В., Шабалова И.П. и соавт.,

2006, Shidham V.B., Atkinson B.F., 2006). При диссеминации рака по серозному покрову клетки рака обнаруживаются в 95% наблюдений (Климанова З.Ф., 1965г.). Отсутствие клеток опухоли в экссудативной жидкости при тщательном исследовании многочисленных препаратов (10-15) при неоднократных исследованиях с наибольшей долей вероятности позволяет отрицать диссеминацию опухоли.

Однако, несмотря на высокую достоверность в некоторых случаях существуют объективные трудности дифференциальной диагностики реактивно-воспалительных выпотов, метастатических поражений серозных оболочек и мезотелиомы. Многие авторы указывают, что причиной затруднений трактовки клеток как злокачественных являются, главным образом, мезотелиальные клетки. Пролиферирующие мезотелиальные клетки, подвергшиеся изменениям регенеративного или дегенеративного характера, располагаясь в виде пластов, симпластов, железисто-подобных структур и изредка в виде образований подобных сосочкам, весьма сходны со структурами, образующимися при раке. В жидкой среде все клетки, как опухолевые, так и не опухолевые, имеют тенденцию округляться, их специфические черты сглаживаются, и они становятся похожими друг на друга. Кроме того, можно ошибочно принять гистиоцит за клетку рака. Даже в крупных онкологических центрах частота ложноположительных результатов о наличии специфического экссудата составляет 3-5% (Глузман Д.Ф. и соавт., 2003).

Вместе с тем, даже при поздних стадиях заболевания опухолевые клетки удается обнаружить при исследовании экссудатов не у всех пациентов. Возможно, это связано с особенностями опухолевого процесса в каждом конкретном случае, или пределом цитологического метода с использованием обычных рутинных окрасок.

Трудно обнаружить клетки рака в экссудатах на ранних этапах метастазирования, а установление распространенности опухолевого процесса до появления его клинических признаков имеет большое значение для правильного выбора тактики лечения. Наличие единичных изолированных опухолевых клеток в экссудатах существенно ограничивает перспективу дальнейшего увеличения показателей выживаемости. До последнего времени поиск этих клеток осуществляли только традиционными методами световой микроскопии, которые в большинстве случаев оказываются малоэффективными.

Другим аспектом проблемы при исследовании экссудатов является установление первичного источника метастазирования опухоли. По данным ряда исследователей при использовании только цитоморфологических критериев на основании большого опыта это можно осуществить при раке молочной железы у 78% больных, при аденокарциноме легкого у 42% больных и при раке яичника - у 46% больных (Глузман Д.Ф. и соавт., 2003).

От решения этих вопросов во многом зависит выбор правильного лечения больного со злокачественной опухолью и благоприятный исход заболевания.

Эти сложности удается преодолеть с помощью современных иммуноморфологических методов, основанных на высокоспецифичной реакции антиген-антитело, которые позволяют установить локализацию в клетках разнообразных молекулярных структур и выяснить природу клеточных элементов. К ним относятся иммуноцитохимия (ИЦХ) с использованием в качестве метки пероксидазы хрена, лазерная проточная цитофлуориметрия (ПЦФ), флуоресцентная и конфокальной микроскопии с использованием в качестве метки флуоресцирующих красителей.

ИЦХ метод получил широкое распространение во всем мире. Благодаря достижениям ИЦХ, а также молекулярно-биологической техники сегодня можно выявлять так называемые микрометастазы или оккультные метастазы в лимфатических узлах, в крови и костном мозге. Появляющиеся в литературе данные указывают на то, что применение моноклональных антител (мкАТ) к белкам цитоскелета, органоспецифическим и опухолеассоциированным антигенам позволяет диагностировать опухолевые клетки в лимфоузлах и других биологических объектах с высокой степенью точности, а также при метастазировании без первичного очага при исследовании клеток метастаза предположить первичную локализацию опухолевого процесса.

Современная диагностика опухолей предусматривает обязательное применение наряду с классическими морфологическими методами ИЦХ метода.

Однако развитие его продолжается и сейчас. Постоянно появляются новые маркеры, применяемые для диагностики опухолей. Все это обуславливает все возрастающее внедрение их в практику. Вместе с тем, исследование экссудатов из серозных полостей с использованием ИЦХ является малоизученной областью. Выявление единичных опухолевых клеток и первичной локализации опухолевого процесса по ИЦХ исследовани разработано мало. При исследовании экссудатов практически не применяется метод лазерной ПЦФ, преимуществом которой является исследование большого количества клеток (более 10 ООО клеток в секунду), возможность их сортировки, одновременное изучение нескольких антигенных структур на одной клетке.

Недостаточная разрешенность и важная практическая значимость изложенных вопросов побудила нас посвятить настоящую работу изучению клеточных элементов в экссудатах из серозных полостей с применением, главным образом, ИЦХ метода. Работа построена на изучении и трактовке цитологической картины, результатов ИЦХ исследования, данных, полученных при использовании современных методов диагностики, таких как ПЦФ и флуоресцентной' микроскопии, а также анализе ошибок цитологической диагностики.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - совершенствование цитологической диагностики плевральных и перитонеальных экссудатов с использованием современных иммуноморфологических методик для установления характера экссудата, выявления единичных опухолевых комплексов и определения первичной локализации опухоли.

В соответствии с поставленной целью предполагается решить следующие задачи:

1. Разработать дифференциально-диагностические цитологические и иммуноцитохимические критерии реактивного экссудата с пролиферацией клеток мезотелия и специфического метастатического экссудата.

2. Выявить морфологические и иммуноцитохимические особенности экссудатов при различной локализации первичной опухоли.

3. Уточнить возможности цитологического и иммуноцитохимического методов в определении гистогенеза первичной опухоли при невыявленном первичном очаге.

4. Изучить возможности иммуноцитохимического исследования в определении малочисленных опухолевых комплексов в экссудатах.

5. Определить значимость методик лазерной проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной иммуноцитохимии при исследовании экссудатов. и

Научная новизна исследования

Впервые в результате комплексного исследования экссудатов из серозных полостей с применением таких современных методик цитологической диагностики, как иммуноцитохимия и лазерная проточная цитофлуориметрия, стало возможным объективно охарактеризовать клеточный состав выпота, определить их роль и значение в уточнении характера жидкости. Современные высокотехнологичные методики обнаруживают малочисленные опухолевые комплексы в экссудате на ранних этапах метастазирования, не выявляемые рутинным цитологическим исследованием, а также снижают гипердиагностику опухолевого процесса. Использование комплекса иммуноцитохимических маркеров позволяет уточнить источник метастазирования при неустановленном первичном опухолевом очаге. Показана высокая эффективность и быстрота флуоресцентной иммуноцитохимии экссудатов при срочных интраоперационных исследованиях с целью уточнения распространенности опухолевого процесса.

Практическая значимость

Проведенное исследование позволило разработать и внедрить в клиническую практику иммуноморфологические методы исследования экссудатов, в том числе иммуноцитохимию иммунопероксидазным методом и флуоресцентную иммуноцитохимию, уточнить значимость лазерной проточной цитофлуориметрии при исследовании плевральных и перитонеальных эксудатов.

Выявление малочисленных опухолевых комплексов с помощью применяемых современных методов увеличивает на 15% число наблюдений с доказанной диссеминацией опухоли по серозным оболочкам, следовательно, более точно определяет истинную распространенность опухолевого процесса.

ИЦХ исследование экссудатов с целью выявления локализации первичной опухоли устанавливает ее гистогенез с достоверностью 93%, что предопределяет дальнейшее обследование и целенаправленное лечение пациентов.

Выводы:

1. Иммуноцитохимическое исследование плевральных и перитонеальных экссудатов в сложных диагностических случаях повышает результативность цитологического метода: чувствительность с 62% до 93% и специфичность с 95% до 99%. Методика в 79% подтверждает диссеминацию опухоли, заподозренную рутинным цитологическим исследованием, и в 7% позволяет избежать гипердиагностики опухолевого процесса.

2. Дифференциальная диагностика реактивных и метастатических экссудатов при аденогенном раке осуществляется надежным и чувствительным маркером - эпителиальным антигеном Вег-ЕР4: чувствительность его составляет 96%), специфичность - 99%.

3. При раке основных локализаций определена панель маркеров и частота их экспрессии в метастатических экссудатах: рак молочной железы -СК7 (100%) , РЭА (82%), РЭ (23%); аденогенный рак легкого - СК7 (100%) и TTF1 (65%); аденокарцинома желудка - СК7 (100%), РЭА (100%), СК20 (61%); серозный рак яичников - СК7 (96%), СА125 (96%), WT1 (70%); аденокарцинома толстой кишки - СК20 (100%), РЭА (100%).

4. При невыявленном первичном опухолевом очаге сочетание цитологического и иммуноцитохимического исследований с использованием широкой панели моноклональных антител в 93% устанавливает локализацию опухоли.

5. Иммуноцитохимическое исследование позволяет у 15% больных обнаружить малочисленные опухолевые комплексы, не выявленные при рутинном цитологическом исследовании.

6. Флуоресцентное иммуноцитохимическое исследование экссудатов с эпителиальным маркером Вег-ЕР4 высоко эффективно при срочной интраоперационной диагностике распространенности опухолевого процесса.

Практические рекомендации:

1. Достоверность цитологического исследования зависит, прежде всего, от правильной техники забора исследуемого материала. Вся эвакуированная жидкость используется для приготовления препаратов, при большом ее объеме - последняя порция не менее одного литра. Для предотвращения свертывания жидкости в нее необходимо добавить 5% цитрат натрия из расчета 5 мл на 100 мл жидкости. Перед приготовлением цитологических препаратов жидкость должна отстояться не менее часа.

2. В сложных диагностических наблюдениях для определения характера экссудата необходимо проведение иммуноцитохимического исследования с эпителиальным маркером Вег-ЕР4.

3. При невыявленном первичном очаге иммуноцитохимическое исследование с использованием широкой панели антител (7-10 маркеров) и достаточном количестве опухолевых клеток в жидкости (не менее 300) позволяет достоверно в 93% определить первичную локализацию опухоли.

4. Метод лазерной проточной цитофлуориметрии эффективен для диагностики в экссудатах аденогенного рака. Для корректной оценки результатов необходимо сочетать его с рутинным цитологическим и иммуноцитохимическими методами. Лазерная проточная цитофлуориметрия помогает дифференциальной диагностике реактивного экссудата с выраженной лимфоидной инфильтрацией и злокачественной лимфомы, а также установлению ее морфологического варианта.

5. При срочном интраоперационном исследовании экссудатов с целью исключения диссеминации аденогенного рака по серозным оболочкам показан высокоэффективный метод флуоресцентной иммуноцитохимии, не требующий значительных временных затрат.

6. При перстневидноклеточном раке желудка или пограничной опухоли яичников отсутствие при рутинном цитологическом исследовании экссудатов опухолевых клеток является показанием к проведению иммуноцитохимии флуоресцентным или иммунопероксидазным методами.

7. Иммуноцитохимическое исследование смывов из брюшной полости необходимо проводить, несмотря на относительно небольшой процент выявления единичных опухолевых комплексов: при раке желудка 33%, при раке ободочной кишки 16%, при раке прямой кишки 10%), потому что наличие свободных опухолевых клеток является признаком латентной перитонеальной диссеминации.

173