Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Современные пути диагностики и профилактики наследственной недостаточности 21-гидроксилазы

1

1

с 1и\г 1805

На правах рукописи

ДЗЕННС Ирина Генриховна

СОВРЕМЕННЫЕ ПиТИ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 21-ГИДРОКСИЛАЗН

14.00.01 - акуаерство и гинекология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена в Научном центре акушерства,гинекологии и перинатологии РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук В.А.Бахарев

Официальные оппоненты:

чл.-корр.РАМН.профессор СЕРОВ В.Н.

доктор мед.наук.профессор КИРЩЕНКОВ А.П.

доктор мед.наук.профессор КЗЛЕ10ВН.П.

Ведуцая организация:

Московский' областной научно-исследовательский институт акумерства и гинекологии.

Зацита состоится "..................1995 г. в

"......." часов на заседании Специализированного Совета

Д.174.06.01 при Научном центре акумерства. гинекологии и перинатологии РАМН (117815 Москва, улица Опарина.дом 4) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра акумерства.гинекологии и перинатологии РАМН.

/Р

Автореферат разослан ____".../.¡у.......1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета.

доктор биологических наук.профессор Н.М.Ткаченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В структуре перинатальной заболеваемости и смертности большой удельный вес имеет наследственные ферментопатии.Одна из них - недостаточность 21-гидроксилазы (21-ОН) возникает в результате снижения активности фермента, участвующего в процессе синтеза кортизола корой надпочечников, и является в 952 причиной врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), или адрено-генитального синдроаа.

Недостаточность 21-ОН - иироко распространенная аутосои-но-рецессивная ферментопатня.так как высокая частота гетерозиготного носительства мутантных генов 21-ОН 1/30-1/100 сопровождается и высокой частотой рождения больных детей 1/50001/15000 (Иен Н.,1.еи1пе Ь.5..1984). Риск рождения больного ребенка в семье, где оба родителя - носители мутантного гена, составляет 25У..

Кора надпочечников,являясь составной частьв системы,которая обеспечивает защитно-приспособительные реакции на стресс и регулирует гестационные процессы,у женщин играет важную роль в становлений и функции репродуктивной системы. Дисфункция коры надпочечников у них сопровождается нарушением половой диффе-ренцировки, дисфункцией яичников, невынашиванием беременности, бесплодием (Либерм'ан Л.Л., 1966;Соффер Л.С.соавт. 1956,Чуковский И.А.,1971;Гаспаров А.С.,1985;ЛяшкоЕ.С.,1985;Раисова А.Г.,1990) Главной особенностью этой ферментопатии является выраженный клинический полиморфизм и сходство симптоматики с большим количеством заболеваний из-за чего своевременная диагностика крайне затруднена. Заболевание проявляется как тяжелыми,

классическими формами, так и мягким, и даае бессимптомным течением. Тяаелые формы заболевания, сольтерявчая и вирильная, развивавтся уае во внутриутробном периоде. Они сопровоадавтся расстройствами минерального обмена,и у девочек нарувениями половой дифференцировкн . Главная особенность мягких форм заболевания - это расстройства функции репродуктивной системы у венцин,время появления которых строго не фиксировано.

Несмотря на болыую истории изучения в нааей стране ВГКН, обусловленной недостаточностью 21-ОН, и раннею манифестации этого заболевания у девочек (неправильное строение наруаных половых органов), диагностика его у новоровденных крайне низка „ и несвоевременна.В результате нааих предварительных исследований установлено.что пренатальная смертность при сольтерявцей форме ВГКН очень высока и составляет 75%. Поздняя диагностика вирильной формы среди девочек нладвего возраста 4-5 лет составляет 40.0Z. 3 девочек пубертатного и вновеского возраста - 16.6% (Дзенис И.Г. с соавт.1990). Использование старых методов определения метаболитов стероидных гормонов в моче оказывается малоэффективным для диагностики мягких форм заболевания (Neu И.,Leuine L.S.,1984),поэтому клиническая картина этих форм недостаточно изучена.Отсутствуют данные о влиянии гетерозиготного носительства мутаций на функции репродуктивной системы аенвины.

Профилактика ВГКН в навей стране, по существу,отсутствует. Медико-генетическое консультирование ограничивается линь констатацией факта наличия высокого генетического риска повторного роадения больного ребенка у супругов, в семье которых уае имеется больной с ВГКН.

Благодаря изучении биосинтеза гормонов надпочечников было установлено,что основная роль фермента 21-гидрпксилазы постоит в окислении предшественника нортигшла 17 оксипрогестсрона (17 01!) (¡Одаев ll.fi.. 1901 ;Р1пкс1з1е1п Н.с соавт. 1979 и др.) Снижение активности фермента сопровождалось повышением концентрации гормона в крови,благодаря чему 17-0П стали рассматривать как патогенетический маркер недостаточности 21-ОН (Ней Н.ЛеУ1пе 1.5., 1984).Однако использовать его для диагностики БГК11 стало возможно только с внедрением в практику унифицированных радиоиммунологических методов.Практическое применение этого маркера натолкнулось на трудности при диагностике недостаточности 21-ОН у женщин (Кайзер Я.5.с соавт.1980).

Установление факта сцепления гена 21-ОН с генами болыого комплекса гистосовместимости НЬЙ (Вирроп1,'В.с соавт. 1977),позволило продукты генов НЬА - антигены HI.fi рассматривать как им-муногенетические маркеры гена 21-ОН и его мутантных аллелей. Эти маркеры обладают рядом специфических свойств .которые следует учитывать при их применении. Основным условием для их клиник» генеалогического использования является наличие больного I! семье .фенотип Ш.й которого является ключом,так как обе хромосомы содержат мутаитные гены. Успех популяционного поиска мутантных аллелей гена 2!-ОН нри использовании этих маркеров зависит пт этнической однородности популяции.так как каждая популяция имеет свой специфический набор антигенов Hl.il (Зарец кая Ю.М..19ВЗ:Минаев Н.,1983 ).

Применение колекулярнп-генетических методов обнаружило различие и длине фрагментов ДНК у больных и здоровых индивидов.что позволило рассматривать эти фрагменты.как генетичес

кие маркеры.Исследования обнаружили специфику распространения мутаций гена 21-ОН среди больных с ВГКН,принадлежащих к разным этническим группам (Hhite Р.С.с соавт.,1992;Раг1епеп J..19893.

Внедрение инвазивннх методов способствовало осуществлении пренатальной диагностики (Pang S.c соавт.1980;Sippell N.,1981).

ЦЕЛЫ! настоящей работы являлась разработка современной системы диагностики недостаточности 21-ОН с использованием фе-нотипических маркеров.поиск и выявление частоты и структуры мутантных аллелей гена 21-ОН.определение путей профилактики.

ЗАДАЧАМИ исследования являлись:

1. Изучение особенностей функции репродуктивной системы ■енцин-гетерозиготных носительниц мутантных аллелей 21- гид-роксилазы.

2. Изучение функционального состояния коры надпочечников у женщин с различным уровнем недостаточности 21-гидроксилазы в различные периоды ее физиологической активности.

.3. Поиск мутантных аллелей гена 21-гидроксилазы в семьях с классическими формами ВГКН путем исследования фенотипов HLA.

4. Изучение структуры мутантных аллелей гена 21-гидрокси-лазы в семьях с ВГКН.

5. Изучение возможностей пренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы с помощью гормональных,иммуноге -нетических и генетических маркеров в семьях с ВГКН.

НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Исследование уровней 17-ОП в крови - патогенетического маркера недостаточности 21-ОН показало, что измерение базаль-ных концентраций дает возможность диагностировать все клини-

чески выраженные формы ВГКН.

Диагностика субклинических форм заболевания возможна только с помощью пробы с ЙКТГ для чего разработан оригинальный метод пробы.Установлена частота латентной формы ВГКН среди гетерозиготных носителей (8%) и частота гетерозиготного носи-тельства и ВГКН с поздним началом среди девочек с ранним адре-нархе (64% и 5% соответственно).

Остановлено, что гетерозиготное носительство мутантного гена 21-ОН влияет на репродуктивную функция женщины, вызывая функциональные расстройства при различных ситуациях, связанных с активизацией надпочечников.

Установлена возможность диагностики недостаточности 21-ОН у плода в I триместре беременности с помощью патогенетического маркера - 17-ОП.Эффективность гормональнрго метода диагностики составила 97,8'/.. Результаты пренатальной диагностики заболевания в I и II триместрах совпали в 100%.

На основании исследования концентраций 17-ОП в крови женщин,в семьях которых рождались дети с ВГКН, беременных здоровым или больным плодом, предложено использовать этот маркер для скрининга беременных с целью проспективного выявления недостаточности 21-ОН у плода.

Изучение характеристики мутаций обнаружило новую, ранее неизвестную мутацию, вызывающую летальные формы ВГКН и сцепленную с гаплотипом Н1.Д В14. Эта мутация встречается с высокой частотой (45.77.) среди славянского населения СНГ. Второй по частоте мутацией (37.2/!), вызывающей также летальные формы заболевания, является европейская мутация Н1.А АЗ В47.

На основании изучения мутаций, характера их сцепления с'

антигенами HI.fi разработаны показания для пренатальной диагностики недостаточности 21-ОН методами исследования ДНК в беспробандных семьях.

На основании комплексного изучения недостаточности 21-ОН с помощью маркеров разработан алгоритм диагностики этой патологии, включающий премиальный и селективный скрининг. Применение его в акушерско-гинекологической практике позволит обнару-яить лиц с различной степенью недостаточности 21-ОН среди женщин с расстройствами репродуктивной системы, новорожденных и плодов.

Разработано в полном об'еме медико-генетическое консультирование недостаточности 21-ОН, включающее диагностику носи-тельства мутантных аллелей гена 21-ОН и пренатальную диагностику,что является основой целенаправленной профилактики этой патологии.

ПОЛОЖЕНИЯ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Наличие в генотипе индивида мутантных аллелей гена 21-ОН всегда сопровождается дисфункцией кщш н.ишччичникпн. которая у женщин фенотиничсски проявляется в ¡;идс нарушений репродуктивной функции. Поэтому венщин-гетерозиготных носителей мутантных аллелей гена 21-ОН следует относить к группе высокого риска по возникновении осложнений в системе репродукции, особенно в период ее становления и при беременности. Осложнения течения беременности и повышение концентрации 17-ОП в крови у гетерозиготных носителей является.прогностическим признаком наличия ВГКН у плода.

2. В семьях- славянского происхождения с классическими

формами ВГКН наряду с общеизвестными мутациями, обнаруженными в Европе, широко распространена ранее неизвестная мутация, сцепленная с геном HLA В14. Использование метода количественной амплификации позволяет обнаружить эти мутации как в гомо-. так и в гетерозиготном состоянии, а также производить прената-льную диагностику в беспробандных семьях.

3. Возможность определения 17-ОП в 1)1 в 1-ом триместре, концентрации которого отражавт активность фермента 21-ОН, позволяет диагностировать ВГКН у плода в ранние сроки беременности. Надежность диагностики при использовании 17-ОП прямо пропорциональна тяжести заболевания.

ВНЕДРЕНИЕ

Результаты исследования внедрены в работу отделений и лабораторий Научного центра акужерства,гинекологии и перинатологии РАМН;основные положения изложены в методических рекомендациях "Пренатальная диагностика врожденной и наследственной патологии плода" ИЗ РФ.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Основные положения работы доложены на 6-ом Европейском Конгрессе по акужерству и гинекологии, Москва, иаль 1991; на 24-ом Съезде Европейского общества по генетике человека,Дания,Зльсинор. иай 1992; на 25-ом Съезде Европейского общества по генетике человека, Испания, Барселона, май 1993; на Научной конференции по эндокринологии, посвященной памяти академика А.Н.Пдаева, Москва, декабрь 1993; на конференциях "Геном чело-века-93" и "Геном человека-94", Черноголовка,март 1993,1994;на на Первом (третьем) Российском Съезде медицинских генетиков.

Москва,декабрь 1994;на межклинической конференции НЦАГиП РАНН.

Диссертация обсуждена на заседании апробационной комиссии при Ученом Совете НЦАГиП РАНН 19 декабря 1994 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 201 страницах машинописного текста,состоит из введения,обзора литературы,4-х глав собственных исследований,обсуждения,выводов,практических рекомендаций, списка используемых источников, приложения, содержит 12 рисунков и 27 таблиц.Указатель литературы включает 31 отечественных и 110 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы Для разработки современной системы диагностики недостаточности 21-гидроксилазы (21-ОН) и поиска путей профилактики были исследованы семьи с классическими формами врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) и девочки с наружениями становления репродуктивной функции и подозрением на наличие у них мягкой недостаточности 21-ОН.

Было обследовано 193 семьи,из которых 154 (80Z) составляли семьи с сольтеряюцей формой и 39 (20?) - с вирильной формой ВГКН. В 692 семей с сольтеряющей формой больные дети.рано погибли из-за чего эти семьи были названы беспробандными.

175 семей (91Z) имели славянское происхождение и состояли из русских,украинцев и белоруссов.Остальные были смешанные,но один из супругов имел славянские корни

Только в 57. семей был выяснен наследственный характер за-

болевания.Однако семейный анамнез выявил две характерные особенности семей с ВГКН,которые расценили как косвенные признаки заболевания:высокая младенческая смертность у родственников, обнаруженная в 262.и высокая частота нарушений репродуктивной функции у женщин I и II степени родства.отмеченная у 24% семей.

У 123 женщин изучен анамнез функции репродуктивной системы. 110 женщинам была проведена пренатальная диагностика ВГКН,причем 19 в повторных беременностях.Из-за высокого процента беспробандности,который у этих женщин составил 74,Т/.,основным методом пренатальной диагностики был гормональный.Фенотип НЬА плода был исследован в 14 наблюдениях,с целью пренатальной диагностики только в 8.В 8 наблюдениях для диагностики заболевания плода использован ДНК-метод.

й 494 индивидов из семей с классическими формами ВГКН,из которых 370 принадлежали к семьям с сольтеряпцей и 124 - к семьям с вирильной формами ВГКН,исследовали НШ фенотип с целью поиска мутантных аллелей гена 21-ОН.

В 45 семьях у 90 индивидов изучена структура 3-х фрагментов гена и псевдогена 21-0Н:промоторной области,3-его и 8-го зкзонов.

Для разработки гормональной диагностики различной степени недостаточности 21-гидроксилазы исследовали функцию надпочечников у разнообразного контингента индивидов и плодов.Выяснение характера нарушения функции надпочечников проводили на фоне искусственного стимулирования коры (проба с АКТГ) и при фи-чиологической активности во время беременности,а у плодов в 1.1! и УI! триместрах.Контингент обследуемых и количество наб- ■ лядр"ий пррдстанпенн п таблице !.

Таблица 1.

Контингент обследованных и количество исследований функции надпочечников при недостаточности 21-ОН.

Контингент обследованных Колич.исслед.

Исследование функции надпочечников. 772

в том числе:

гетерозиготных носителей 76

лиц контрольной группы 32

больных с нарушением становления репродук-

тивной функции 49

беременных-гетерозиготных носителей в I

и II триместрах 52

беременных контрольной группы в 1-й II

триместрах 109

новорожденных 80 .

плодов от хенцин из группы риска по рож-

дению больных с ВГКН 179

плодов контрольной группы 195

Иммуногенетическое исследование.

НЮ типирование производили на лимфоцитах периферической крови, путем использования стандартного метода "комплементза- • висимой цитотоксичности" (М1Иа1 К.К.с соавт.1986).

Для постановки реакции использовали панели антисывороток, приготовленные в Санкт-Петербургском институте гематологии и

переливания крови. НЬА А локус типировался по антигенам: А1, А2, ЯЗ. А9 (А23.А24), А10 (А25.А26), Д11, А19 (fl29.fl30.fl3i), А28; Ш.А В локус типировался по антигенам: В5, В7, В8. В12 (В44), В13, В14. В15, В16 (В38, В39), В17, В18, В21. В22 (В55), В27, В35, В40, В41. Из-за отсутствия моноспецифической сыворотки В47 аллель В47, определяли по наличип одновременной положительной кроссреакции исследуемых лимфоцитов с антисыворотками ¿27. В13 и В40 (БопоЬоиуе Р.А.с соавт.1987).

Обработка полученных результатов Ю исследования семей с ВГКН включала: определение частоты антигенов и гаплотипов среди носителей недостаточности 21-гидроксилазы, вычицление ассоциативных связей Н1.А и классических форм заболевания и вычисление риска заболевания. Частоту антигенов рассчитывали как процентное соотношение индивидов, несущих антиген, к общему числу обследованных.

Частоту гаплотипов рассчитывали по формулам Р. Ма1Миз (1970) (Зарецкая Ю.И.,1983):

Д АВ

где п - число обследованных в выборке,

Ь - число индивидов, несущих антиген А и не имеющих В, с - число индивидов, несущих В и не имеющих А, Л - число обследованных, не имеющих ни'А. ни В, Д АВ - гаиетная ассоциация, Рш -- (Р„ * Р6 ) +ДАВ. |"де Р, и Р^ частоты соответствующих генов, Р/16 ~ частота гаплотипа в популяции.

(Ь+<1) (с+й) '

Частоту гена HLfl рассчитывали по формуле: Рх = 1 - 1-flx .

где Рх - частота гена,

Ах - частота антигена.

Вычисление ассоциативных связей HLfl и классических форм

2 Z

ВГКН осуществляли с помощьв критерия X (р<0.05 при значении X = 3.845.

Риск возникновения заболевания у носителей антигена по

сравнению с неносителями вычисляли по формуле Hoolf В.( 1955)(3арецкая В.Н., 1983).

VI - *к>

R = - , где

fK(l - f„)

fn - фракция носителей антигена среди пациентов, f^ - фракция носителей антигена в контрольной группе. Показатели относительного риска больие 2-х считались значимыми.

Гормональное исследование. Гормоны исследовали в крови и аыниотической гидкости радиоиммунологическими методами: 17-ОП - с помощью наборов фирмы Cis Bio International, кортизол - с помощью наборов ИБОХ АН РФ с использованием кортизола, меченного йодом 125, и преципити-рувщего реагента (стерон - К - I - Ю, ДГЭА - наборами "Hien Laboratories, YNC." DHEft TestSet.

Статистическуи обработку результатов проводили с помоцьв модели логнорыального распределения на компьютере Hang 2200.

Оункцию коры надпочечников у пациентов исследовали с .помощью гормональных проб с ОКТГ. Использовали простую и комбинированную пробу с АКТГ и дексаметазоном.

Простую пробу с-ЙКТГ проводили в течение 2-х дней. В первый день исследовали базальный уровень гормонов, для чего из локтевой венн отбирали 2 пробы крови в 9 и 18 часов. Исследование 2-гп дня начинали в 9 часов, когда отбирали 1-й пробу крови, затем вводили ЙКТГ и последовательно через 3,6 и 9 часов после введения препарата отбирали следующие порции. В качестве ЙКТГ использовали препарат Синактен-депо Сфириа Си-ба-Гейги, Швейцария). длительность действия которого составляла "¿В часов,пик действия наступал через 9 часов после введения.

Комбинированную пробу ЙКТГ с дексаметазоном проводили также в течение 2-х дней. Лексаметазон_назначали в первый день проведения пробы после получения 2-го образца крови в 22-24 часа. Второй день комбинированной пробы проводили такзе, как и при выполнении простой пробИ.ЙКТГ взрослым вводили в дозе 1 мг/мл,детяа дозы ЙКТГ и дексамотазона рассчитывались в зависимости от возраста.

Проступ пробу с ЙКТГ использовали при исследований гетерозиготных носителей недостаточности 21-ОН. Комбинированную пробу применяли у больных для проведения дифференциальной диагностики и исключения опухоли надпочечников у них.

Результаты обрабатывали с помоцьи программы Р7И из пакета прикладных программ ПКПР, представлявшей собой поваговый диск-риминантннй анализ, который заключается в определении достоверности различия между несколькими, в данном случае 2-мя, группами (контролем и пациентами).

ДНК-исследование.

Для молекулярко-генетического исследования из венозной крови пациентов или из клеток амниотичеекпй жидкости выделяли

ДНК. Венознуп кровь смешивали с консервантом, чтобы предотвратить ее свертывание. В качестве консерванта использовали раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. 1мл консерванта смешивали с 6 мл цельной крови. Клетки AI обычно осаждали с помощью центрифугирования 15 минут при 4000 оборотах в минуту, надосадочную жидкость сливали.

ДНК выделали методом, предложенным Линдблумом и Хольмлун-дом (1988) . Наличие соответствующих фрагментов промоторной области,3 и 8 экзонов гена CYP21B и псевдогена CYP21A у обследуемых определяли с помощью полимеразной цепной реакции, для чего использовали пары праймеров, предложенные Рамсби и Хона-уэром для 3 экзона (1990) и Коллиером с соавт.(1989) - для 8 экзона. Пара праймеров для промоторной области 5'-AAA£CTGACTCTGGATGCAGG. 5'-GCGCCAGCCAGCCAGCAGGGGCA была предложена лабораторией ДНК диагностики МГНЦ РАМН.В случае амплификации фрагментов промоторной области и 8 экзона после ПЦР образцы обрабатывали эндонуклеазой RSAI и PstI соответственно. Полимеразную цепную реакцию проводили при помощи программируемого термоциклера Biothe™ с использованием термофильной ДНК-полимеразы Therius aquaticus. В качестве буфера для ПЦР использовали раствор следующего состава: 50 iM KCl: Ю вН Tris-HCl, рН=8.4: 1.5 жМ HßCl ; 0.01% tween-20. Условиями амплификации были: 94 С - 45 сек., 50 С (для промоторной области и 3 экзона) и 65 С (для 8 экзона) - 45 сек. и 72 С - 120 сек. Общее число циклов - 32-35.

Определение результатов проводили с помощью электрофореза в 6 и 8% ПААГ с последующим прокрашиванием в растворе бро-

мистого зтидия с концентрацией 1 мг/мл, в качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмиды рВР 322, рестрици-рованнуп НаеШ.

Инвазивнне методы исследования.

У всех беременных с целы) определения срока беременности, а такхе для контроля во время проведения абдоминального амнио-центеза и кордоцентеза применяли УЗ исследование. Использовали аппарат АЮКА-630 с линейным и секторным датчиком.

Все исследования осуществляли в амбулаторных условиях, в малой операционной, и проводили после премедикации женщины внутримышечным введением смеси седативных и спазмолитических препаратов Среланиум 1.0 и но-впа 2.0). Трансабдоминальный ам-ниоцентез производили после обработки коси передней бршной стенки 12-м раствором хлорамина и спирта гепаринизированной иглой номером 20С или 226. А1 или кровь аспирировали 10-милли-литровым шприцом. Кровь плода получали путем пункции пуповины в месте ее отхохдения от плаценты или пункции свободной петли В тех случаях, когда требовалось прерывание беременности, интраамниально вводили гипертонический раствор хлористого натрия. Техническое осуществление амниоцентеза в I и II триместрах беременности принципиальных отличий не имело.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Для диагностики недостаточности 21—ОН чаще всего использовали 17-оксипрогестерон (17-ОП),который является универсальным патогенетическим маркером,так как быстро реагирует на процессы изменения синтеза кортизола.Уровень 17-ОП обратно пропорционален активности фермента.

Дла оценки диагностической значимости базальных концентраций при недостаточности 21—ОН были исследованы 125 пациентов с разной степенью недостаточности фермента 21-0Н.76 пациентов били гетерозиготные носители мутантных аллелей гена 21-0Н,ко-торме в гомозиготном состоянии вызывали сольтеряющую форму ВГКН,4 нелеченные девочки с вирильной формой ВГКН и 45 девочек с преждевременным адренархе.32 обследуемых составили контрольную группу.

Вирильная форма ВГНК у двух больных имела необычное течение,что требовало подтверждения у них недостаточности 21—ОН.Наряду с нарушением половой дифференцировки и наличием гирсутизма.отсутствовали задержка роста и гетеросексуальное развитие вторичных половых признаков.Обследование установило,что у девочек.кроме недостаточности 21-0Н,была недостаточность фермента 17-20 лиазы, участвующего в синтезе андрогенов надпочечниками.

Выбор детей с преждевременным адренархе был основан на том,что этот симптом является первым проявлением недостаточности 21—ОН при мягких формах ВГКН (Бодяжина В.И. с соавт. ,1973,Ки1т1е и.с соавт.1981).

Повышенный базальнмй уровень 17 0П в крови был обнаружен у 8% гетерозиготных носителей,у всех больных с вирильной фор мой ВГКН и у 5% детей с преждевременным адренархе. Повышенный базальный уровень 17-ОП у индивидов,считающих себя здоровы ми,свидетельствовал о наличии у них латентной формн заболепа ния.А высокий уровень 17-ОП у девочек с преждевременным адре нархе -■ о ВГКН с поздним началом.которая в нашей литературе называется постпубертатной формой ВГКН.Достоверных различий

концентраций в крови гетерозиготных носителей и лиц контрольной группы не было.(рис.1)

ннон/л я»Г

1» ю зо

300

(нмакь/п)

50

Рис.1 Назальные уровни 17-011 в крови при различных

вариантах ВГКН-21-0Н:1-здоровые и гетерозиготные носители мутаций гена 21-0Н;2-латентная форма: З-ВГКН с поздним началом;4-классические формы ВГКН.

Для повышения диагностической чувствительности 17-ОП при-незначительной недостаточности 21-ОН,которая наблюдалась у гетерозиготных- носителей,была предложена проба с ЙКТГ (БиЬа! З.Р. с соавт.19?7;Маизе1.Ь Р.5.с соавт. 1980,Нем М.с со-авт.1981).Однако применяемая за рубежом проба с ЙКТГ короткого

действия оказалась несовершенной.так как на результаты концентраций 17-ОП в крови влияли пол пациента.а у женщин возраст и «аза цикла.

Рассматривая пробу как модель.активизирующую деятельность надпочечников.использовали ЙКТГ 36 часового действия,который создавал условия близкие к физиологическим.Функция надпочечников постепенно активизировалась,достигала пика через 9 часов после введения препарата и постепенно возвращалась к первоначальному уровни.Определяли концентрации 17-ОП.кортизола и ДГЭА в крови.Результаты исследования были получены отдельно для мужчин.женщин в 1-ой Фазе цикла и женщин во П-ой фазе цикла.

Как и ожидали,на Фоне стимуляции ЙКТГ концентрации 17-ОП у носителей оказались достоверно выже.чем в контрольной группе.Важннм результатом использования ЙКТГ длительного действия являлось исчезновение различий в концентрациях 17-ОП менду мужчинами и женщинами в разных Фазах цикла.Это позволило использовать пробу при диагностике ноеительства мутаций.не обращая внимания на пол или фазу цикла обследуемого.Кроме того было выявлено,что у 15% гетерозиготных носителей динамика концентраций 17-ОП была атипичной.У них наблпдали подъем уровней через • 3 часа после введения ЙКТГ и падение на пике воздействия.Это позволило предположить .что проба имеет биологическое ограничение и эффективность ее не может превышать 85%.

Для успежного использования пробы на практике обработку полученных результатов производили с.помощью пошагового диск-риминантного анализа. Логика дискриминантного анализа состояла в том, что определяли переменную, для которой средние значения в двух группах (носителей мутаций и неносителей) наиболее раз-

личны. Различия для каждой переменной измеряли при помощи Р-статистики однофакторного дисперсионного анализа, выбирали ту переменную, которая соответствовала наибольшему значение Р. Величина Р представляет собой минимальный показатель достоверности, который при а=0.95 достаточен для того, чтобы считать положительным влияние исследуемого фактора.Использованный способ обработки результатов позволял определить, какое влияние оказывает носительство мутантного аллеля на изменение гормональных показателей. В качестве переменных величин анализировали концентрации гормонов 17-011, ДГЗА,кортизола: базальные уровни и значения, полученные на фоне стимуляции АКТГ через 3,6 и 9 часов, а также производные параметры, представлявщие собой отношение концентрации кортизола к концентрации 17-ОП в соответствующие промежутки времени. По достоверности различия переменных в соответствии с Р-критерием было установлено, что достоверными показателями в разделении двух групп является только показатели 17-ОП и производные параметры - отножения кортизола к 17-ОП.

Дальнейший анализ отобранных переменных показал, что итоговую дискриминантнуп функцию составляют только три из них:

1.показатель концентрации 17-ОП через 9 часов после начала стимуляции АКТГ (XI);

2. отношение базальной концентрации кортизола к базальному уровню 17-ОП (Х2):

3. отношение концентрации кортизола через 9 часов после начала стимуляции АКТГ к соответственному уровню 17-ОП (ХЗ).

Эти переменные были выбраны на основании наибольшего значения Р-критерия на соответствующем маге.

В результате проведенного анализа была получена оптимальная дискриминантная функция, которая выражалась следующей формулой:

Б=0.052*1X11+0.05*1X21-0.018*1X3 к=0.069.

Для проверки носительства мутантных аллелей гена недостаточности 21-гидроксилаза следует подставить значения концентраций гормонов в неравенство. Носителем является тот пациент, чьи показатели в результате вычисления превышают 0.069. На основании проведенного анализа клиническая чувствительность выявления гетерозиготных носителей из популяции составила 85%.

Использование данной дискриминантной Функции резко упрощает проведение пробы, позволяя использовать значения концентраций гормонов 17-ОП и кортизола только в 2-х пробах крови, полученных непосредственно перед исследованием и через 9 часов после введения ЙКТГ длительного действия.Клиническая чувствительность пробы,как и предполагали.составила 85%.

Для выяснения причин преждевременного адренархе у 20 девочек 5-9 летнего возрасте была исследована функция надпочечников с помощью пробы с ЙКТГ.Результаты индивидуальных проб были проанализированы с помощью дискриминантной Функции.Анализ показал,что 65% девочек с преждевременным адренархе были носителями мутаций гена 21—ОН.Результаты исследования гормонов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Исследование гормонов (нмоль/л) на фоне пробы с АКТГ у девочек с преждевременный адренархе.

Гормоны Проба Девочки с адренархе п=20

неносители носители п=7 п=13

17-ОП баз.конц. после АКТГ через:3ч. 9ч. 2.2(0.9-5.2) 3.4(2.5-4.8) 6.3(3.8-10.3) 19.1(14.6-24.9) 7.4(4.5-12.3) 25.6(19.9-33.1)

кор-тизол баз.конц. после АКТГ через:3ч. 9ч. 482 (361-645) 388 (304-497) 1406(1088-1816) 1257(1026-1538) 1463(1089-1965) 1445(1234-1693)

ДГЭА баз.конц. после АКТГ через Зч. 9ч. 24(15.8-36.3) 13.4(6.4-28.2) 31(22.1-43.6) 19.5(8.3-45.5) 32.3(22-47.4) 21.9(10.3-46.3)

При сравнении показателей ДГЭА в крови девочек с преждевременным адренархе носителей и неносителей было обнаружено по-вымение базальных и стимулированных концентраций ДГЭА у не-

носителей. По мнении Kcrth-Sehuts S.c соавт.С1976),повышение этого гормона у таких детей может быть связано с преждевременным созреванием надпочечниковых андрогенов в ранней пубертатной стадии до начала созревания гонад.которое может быть причиной поликистоза яичников в дальнейшем.

Б связи с отсутствием сведений об особенностях состояния репродуктивной системы женщин-носительниц мутантных аллелей был проведен ретроспективный анализ функции репродуктивной системы у 123 женщин.две из которых имели латентнув форму ВГКН.Возраст женщин соответствовал 26,9±3.6 годам.Все считали себя здоровыми и вели активный образ шизни.Средний возраст менархе соответствовал 13.Щ.О годам.Регулярный цикл с менархе отмечали 82.82 женщин.длительность цикла составляла 28.7ii.9 дней. Однако регулярный цикл после 23-25 лет был сохранен только у 74.62.У 4,92 женщин на фоне регулярных менструаций наблвдались периоды нарушения цикла в виде длительных задержек, связанных с эмоциональным или физическим напряжением. 9 3,32 было отмечено становление цикла после 20 лет.ФертильносТь была нарушена у 2.52 женщин.

Обследуемые женщины имели 323 беременности.из которых 111 (34.42) окончились искусственным прерыванием,29 (13,72) -самопроизвольным выкидыжем.183 (56,72) - родами.Нормальное течение отмечали только в 202 беременностей.остальные протекали с угрозой прерывания и токсикозом 11-ой половины,которые часто сочетались. Отечный синдром был наиболее частым проявлением токсикоза.Перенаживание беременности выявили у 14,62,а преждевременные роды у 7,32 женщин.

Анализ здоровья 183 новорожденных обнаружил,что у этих

женщин фенотипически здоровыми родилось только 25 (13.7%) детей, 158 имели классические форма ВГКН,среди которых перинатальная смертность составила 74.7%.Высокий процент осложнения течения беременности у гетерозиготных носителей совпал с высоким процентом вынашивания больного плода.

Отклонения Функции репродуктивной системы у носителей мутаций гена 21-ОН в основном наблидались при беременности.Однако в периоде становления системы репродукции у них также выявлялись отклонения,а именно¡запаздывание сроков менархе по сравнению с популяцибнным на один год (по данным Богдановой Е.й. с соавт..1980,срок менархе в популяции составляет 12+1 год);позднее становление цикла;нарумения регулярности цикла на Фоне стресса,которые после 23-25 лет становились хроническими.

Для выяснения причины влияния незначительного снижения активности фермента 21-ОН на функцию репродуктивной системы исследование функции надпочечников осуществляли на фоне пробы

. „_,„ п. Гера данности

с ЙКТГ в течение 24 часов вне>и во время беременности в 1-ом и П-ом триместрах.Содержание гормонов у «енмин вне беременности в течение длительной стимуляции ЙКТГ приведено в таблице 3.

Результаты исследования выявили важную особенность функции надпочечников носителей мутантных генов,которая заключалась в замедлении процесса восстановления первоначальной Функции. На фоне уменьшения действия АКТГ через 24 часа концентрации 17-ОП и особенно ДГЭЙ в крови продолжали сохраняться у них на высоком уровне по сравнению с женщинами контрольной группы. .Следовательно у женщин-носителей при повышенной активности надпочечников создаются условия для развития гиперандроге-нии.которая может влиять на функцию репродуктивной системы.

Таблица 3.

Содержание гормонов у женщин на фоне длительной стимуляции ЙКТГ.

Время 17-0П,нмоль/л неносители носители п=13 п=26 Кортизол.нмоль/л неносители носители п=13 п=26 ДГЗЙ.нмоль/л неносители носители п=13 п=26

Оч. 2.7 2.7 (1.8- (2.0-4.1) -3.8) 312 311 (255- (257-382) -378) 19.0 21.3 (12.0- (18.0-30.4) 25.0)

9ч., 13.1 30.4 (10.1- (24.3-17.0) -38.1) 1343 1295 (1151- (1124-1567) -1493) 44.0 61.0 (31.5- (53.0-61.2) -70.0)

24ч. 6.2 16.1 (3.7- (11.3-10.8) -23.0) 1070 1198 (853- (915 --1344) -1568) . 30.0 53.0 (20.0- (44.0- • -48.8) -65.0)

Таблица 4.

Содержание 17-оксипрогестерона и кортизола в крови женщин в 1-ом и Н-ом триместрах беременности.

Гормон Триместр Контроль Носительницы мутантного аллёля

беремен- беремен.здор. г беремен.пораж.

ности плодом плодом

17-ОП, I 3.5(2.8-4.3) 7.1(5.5-9.0) 15.1(6.0-39.5)

нмоль/л п=90 п=17 п-5

II 9.3(6.1-14.1) 10.7(8.9-12.8) 22.0(18.0-27.1)

п=10 п=24 п=8

Корти - I 501(453-555) 331(271 -403) 489(335- 716 )

зол. II 456(285-729) 514(433-611 ) 6П0С 365—1193 5

н^оль/л <

Исследования концентраций 17-ОП и кортизола в крови беременных- носителей мутаций и женщин контрольной группы в I и II триместрах.так же обнаружили отклонения функции надпочечников у носителей (таблица 4).

Результаты исследования показали,что во время беременности.которую,по мнению ряда авторов (Теодореску И.,1981),можно рассматривать как состояние повывающее функцию надпочечников,у носителей наблвдали отклонения этой функции как в 1-ом так и во 11-ом триместрах. Причем у носителей,вынаживающих здоровый плод.эти отклонения исчезали во П-ом триместре по сравнению с женщинами,вынавивающими больной плод.

По данным Захаровой 0.И.(1987) физиологическое течение беременности и своевременное наступление родов возможно только при определенных взаимоотновениях между содержанием глюкокор-тикоидов и 17-ОП в крови матери и плода.Исследование показало.что эти взаимоотноиения даже при незначительной недостаточности 21-ОН нарушены,и при вынашивании больного плода с течением беременности не компенсируются.

Новыиение уровня 17-ОП в крови беременных-носителей мутаций явилось важным обстоятельством,так как позволяло использовать этот маркер для пренатального скрининга.Скрининг беременных - более прогрессивен по сравнению с неонатальным.который используют в настоящее время,так как способствует активному выявлению супружеских пар.нуждающихся в медико-генетическом консультировании и пренатальной диагностике.

Патогенетический маркер 17-011 оказался наиболее удобным для диагностики ЙГКН у плода.Универсальность 17-ОП позволяла

широко использовать его в беспробандных семьях,которые составляли абсолютное большинство.

Разноречивые данные о динамике этого гормона в амниоти-ческой шидкости (AI) в течение беременности и споры о влиянии на его уровни пола плода,отсутствие нормативных показателей -потребовали провести специальное исследование функции надпочечников здорового плода.

Результаты этого исследования показали.что на концентрации 17-ОП пол плода влияния не оказывает;уровень его на протяжении всего срока беременности сохраняется почти на одном уровне .Динамика концентраций кортизола в AI на протяжении беременности значительно менялась.Концентрации его достоверно увеличивались по мере пролонгирования беременности (1-ом.П-ом триместрах),достигая наивысшего уровня перед родами.Полученные данные совпадали с результатами исследования Murphy В. (1975).

Пренатальная диагностика ВГКН была произведена в 129 беременностях.Для выяснения возможности обнаружить дефект гена 21-ОН у плода в 1-ом триместре и выяснить.как меняется концентрация гормонов на протяшении 11-го триместра при наличии заболевания у плода.36 беременным - гетерозиготным носителям исследовали гормоны в динамике:у 24 в 1-ом и 11-ом триместрах.у 16 в 17-18 и 21-25 недель беременности ( таблица 5).

Таблица 5.

Содержание гормонов в А1 у беременных из группы риска по рождению детей с ВГКН (нмоль/л).

Гормон Здоровые плоды Больные плоды

1-ый п=19 П-ой триместр до 20н. >21н. п=65 п=51 1-ый п=5 П-ой триместр до 20н. >21н. п=18 п=21

17- -оп 5.7 (4.3-7.7) 6.9 (6.1-7.7) 8.9 (7.9-10.0) 34.0 (20.1-57.3) 44.5 (35-57) 33.3 (30-46.5)

кор- ти- зол 39.0 (30.5-51.0) 60 (51.2-70.0) 74 • (64.0-86.3) 29.0 (4.0-71.0) 77.7 (62.7-96.0) 92.5 (72.0-118.7)

Результаты исследования обнаружили четкую закономерность повышения уровней 17-ОП в А1 при вынашивании • больного плода,начиная с 1-го триместра беременности.которое сохранялось и во [[-ом триместре. Совпадение результатов 1-го и 11-го триместров было 100%. Уровни 17-ОП в 01 при вынашивании здорового плода женщинами из семей с ВГКН были несколько выше контрольных: в 1-ом триместре - 5,7 (4,3-7,7) и 4,7 (3,1-7.1) нмоль/л и во11-ом триместре до 20 недель - 6,9 (6.1-7.7) и 4,8 (3.1-7.9).после 21 недели - 8.9 (7.9-10.0) и 6,1 (4,8-8.0) соответственно. Повышение маркера в А! у женщин.родивших детей с ВГКН,но вынашивающих в период обследования здоровых детей,

по-видимому.связано с тем,что большинство плодов являются гетерозиготными носителями мутации.По закону Менделя при ау-тосомно- рецессивном заболевании 50% здоровых являются носителями мутаций. Это следует учитывать при диагностике ВГКН у плода.так как мо1ет вызвать затруднение в оценке показате-леА.Такая ситуация наблюдалась в 5 случаях,из-за чего было проведено повторное исследование 17-ОП в Й8.

Верификация пренатального диагноза проводили путем исследования функции надпочечников у новорожденных,патологоанатоми-ческого исследования плода после прерывания беременности или по сведениям.полученным от родителей.если роды происходили вне Центра.

9 новорожденных функция надпочечников исследовали дважды.определяли концентрации 17-ОП и кортизол в пуповинной крови и на 3-5-тый дни жизни.Общей закономерностью для фенотипически * здоровых новорожденных было падение уровней обоих гормонов после рождения. Показатели гормонов имели следующие значения концентраций: 17-ОП в пуповинной крови 105,3(77,0-144,5) и на 3-5 день жизни 7,1(5,2-9,6) н*оль/л;кортизола - 420(350-504) и 286(214-383) нмоль/л соответственно.!! новорожденных с ВГКН высокий уровень гормонов либо сохранялся на 3-5-ый день жизни либо повышался.

Общим для плодов с недостаточностью 21-гидроксилазы являлось увеличение массы надпочечников, которое возникало из-за гиперплазии клеток коры. Характерным' морфологическим признаком являлась выраженная складчатость поверхности коры надпочечников., которая напоминала кору головного мозга .

Анализ результатов пренатальной диагностики установил.что

эффективность гормонального метода составила 97,82.Ошибочный диагноз был поставлен в 3-х случаях.Разбор диагностических ошибок показал.что в двух наблюдениях новорожденные имели мягкую форму ВГКН.и в одном наблюдении беременность ошибочно была прервана,плод был носителем мутаций из-за чего показатели 17-ОП в А1 имели верхнюю границу нормы.

Таким образом.исследование показало.что гормональный метод высокоэффективен.надежность его возрастает соответственно тяжести заболевания плода,он может использоваться на протяжении всей беременности .начиная с 1-го триместра.

Иммуногенетические маркеры г антигены Н1.А использовались для популяционного и клинико-генеалогиче'ского исследований. Популяционное исследование производили с целью поиска гаплоти-пов,сцепленных с мутантными аллелями гена 21—ОН среди жителей нажей страны.Успех данного исследования зависел от этнической однородности обследованных,так как в разных этнических группах 'наблюдается разная частота антигенов НЬА (Зарецкая М.М.,1983). Абсолютное число обследованных составили лица русской,украинской и белорусской национальностей.Больжинство из них имело смешанное происхождение русско-украинское.русско-белорусское, реже украинско-белорусское.Преобладали • жители европейской части. - Центральной и Северо-западной.проживающие в городах (912),причем в Москве 22,12.Учитывая это в качестве контроля использовали данные Серовой Л.Д., с соавт.,1981,которые обсАе-довали 854 жителя Ленинграда,и Тананова О.Г. с соавт;,1979.обследовавших 800 жителей Москвы.

Сравнение частоты НЬА аллелей в 3-х группах(лиц из семей с классическими формами ВГКН и двух контрольных) с помйщьш кри-

терия X в группе лиц.принадлежащих к семьям с ВГКН были выявлены антигены НЬА А2.АЗ,В5.В8,В14 и В16.частота которых достоверно отличалась от частоты этих антигенов контрольных групп (таблица 6).

Таблица 6.

Частота НЬА аллелей в семьях с классической недостаточность«) 21-гидроксилазы и в контрольных группах.

НЬА Носители Контроль Контроль Р

нед-ти 21-011 Москва Ленинград

п=494 п=600 п=854

1 2 3 1-2 1 -3 2-3

А2 37.4 50.8 51.83 0.000.. . 0 .000.. . нет р.

АЗ 37.2 24.1 26.98 0.000.. . 0 .000. . нет р.

В5 9.9 14.1 21.65 0.03 0 .000.. . 0.0003.

В8 6.5 16.1 14.9 0.000.. . 0 .000. . нет р.

В14 27.5 8.3 7.33 0.000.. . 0 .000. . нет р.

В16 9.5 5.7 5.91 0.01 0 .01 нет р.

нет р. - нет различия

Частота антигенов НЬА А2.В5.В8 понижалась (отрицательная ассоциация).а частота антигенов НЬА АЗ.В16.В14 повышалась (положительная ассоциация).

Определение силы ассоциации или критерия относительного риска носительства недостаточности 21—ОН маркеров с положительной ассоциацией обнаружило.что она для антигенов НЬА АЗ

равна 1.9,для HLft В16 - 1.7.для HLA В14 - 4,2.Анализ показал,что из всех этих маркеров положительное значение имел только антиген HLA В14.Следовательно наличие его в фенотипе предполагало высокий риск носительства мутантнсго аллеля гена 21-ОН.

Среди антигенов, отрицательно ассоциациирующихся с недостаточностью 21-гидроксилаэы, присутствовал антиген HLA В8. Снижение его частоты среди носителей является характерной чертой, присущей всем европейцам с этой патологией (Coullin Р.с соавт.,1980 и др). Определение частоты гаплотипа А1В8, который у европейцев встречается чаще всего и имеет высокую генетическую ассоциацию (Зарецкая D..M..1983), был снижен в изучаемой группе и имел значение 277 по сравнению с контролем - 572.

Маркером аллеля гена 21-011,в гомозиготном состоянии вызывающего сольтеряющуи форму ВГКН, у европейцев является.гапло-тип HLA A3 В47 DR7,поэтому была сделана попытка выяснить, имеется ли в наией популяции эта мутация. Из 494 обследованных было выделено 25 человек с подозрением на наличие у них антигена HI.A В47. что соответствовало 5.1Z частоты 'этого аллеля в изучаемой группе. 9 кавказоидов этот антиген встречался с частотой 0.8Z (Tissue Antigen;;, 1980.16,161-168). Я всех лиц с подозрением на присутствие HLA В47 в фенотипе обнаруживался и антиген HLA A3. В тех случаях, когда у этих лиц удавалось определить генотип путем генеалогического исследования (отца.матери.детей). как правило, определялся гаплотип A3 В47 .

Таким образом. Н1.А скрининг позволил обнаружить специфический состав гаплотипов среди семей с классическими формами ВГКН.Нысикая ассоциация HLA ВИ и HLA (13Н47 указывала на то.

что именно эти гаплотипн сцеплены с мутантными аллелями гена 21-ОН. которые широко представлены среди славянского населения нажей страны.Присутствие гаплотипа HLfl ЙЗВ47 свидетельствовало о том.что одна из этих мутаций европейского происхождения..

Необычной находкой оказалась высокая ассоциация HLft 614. обнаруженная среди обследуемых. Известно, что ген HLfl В14 сцеплен с мутантным аллелем гена 21-ОН. который вызывает только мягкие формы заболевания С White P.C. с соавт.1992). В отличие от описанного в литературе, обнаруженный нами мутантный аллель гена 21-ОН, также сцепленный с гаплотипои HLfl В14, в гомозиготном состоянии вызывал тяжелую сольтеряющуи форму ВГКН. Данная мутация новая, ранее не описанная, жирокое распространение ее среди обследуемых свидетельствовало о том, что она специфична для лиц славянского происхождения, проживающих на территории СНГ.

Одновременно с HLft скринингом проводили клинико-генеало-гическое исследование для обнаружения больного сибса, гетерозиготного носительства мутантного аллеля гена 21-ОН у родственников больного и с целью пренатальной диагностики.

Клинико-генеалогическое исследование заключалось в сравнении HLfl фенотипа больного с HLfl фенотипом исследуемого индивида в семье.

У всех пораженных в семье фенотипы HLfl должны быть одинаковыми. Гетерозиготные носители должны иметь только один гап-лотип. общий с больным. Пренатальная диагностика с помощью антигенов HLfl из-за высокой беспробандности семей имела ограниченное применение и была осуществлена только в 8 случаях. При мером Moryt служить семья М-вых и семья Х-внх (|ihc.,!j.

Семья й Семья.2

Рис.2 Примеры генеалогического обследования семей с цельи пренатальной диагностики:1 - плод болен,2 - плод -гетерозиготный носитель мутации.

Внедрение в практику кордоцентеза создает условия для исследования фенотипа ША плода.что является крайне необходимым в беспробандпих семьях .когда беременность предполагается прервать из-за болезни плода. Имыуногенетический метод надевен для диагностики мутаций гена 21—ОН как у гомо- так и у гетерозиготных носителей .что позволяет избеяать гипердиагностики заболевания у плода.

Уолекцлярно-генетическое исследование было проведено в 45 семьях. В 39 семьях роадались дети с сольтерявцей формой ВГКН, п 6 - с вирильной. Было обследовано 37 полных семей (в этих семьях имелся пробанд) и 8 неполных (пробанды умерли к моменту

исследования).

При разработке системы прямой ДНК-диагностики учитывали особенности строения области генома, ответственной за синтез 21-гидроксилаэы. которая состоит из гена и псевдогена, на 98% гомологичных друг другу (НЫЬе Р.С.с соавт,1993). Исследовали фрагменты ДНК промоторной области. 3-го и 8-го экзонов, которые в гене и псевдогене различны по строении. Результаты электрофореза фрагментов ДНК гена и псевдогена после амплификации и рестрикции в норме и при наличии мутаций в гене изоб-

V

ражены на рис.3.

5 5

Рис.3 Схема регистрации мутацийга - промоторной области, б - 3-его экзона, в-- 8-го экзона;н - нормальная последовательность гена и псевдогена.м - мутация последовательности гена и псевдогена в гомозиготном состоянии.

Для получения фрагментов ДНК промоторной области. 3-го и 8-го зкзонов использовали праймеры. последовательности которых были общими как для гена, так и для псевдогена. Однако при сравнении фрагментов ДНК гена и псевдогена обнаружили четкое количественное различие между ними, которое выражалось 1:1, 1:2, 1:3. Это было связано с тем. что с матрицы ДНК (гена или псевдогена) синтезировалось большее число копий, что распозна--валось в полиакриламидном геле. Наиболее четко это различие фиксировалось в 3-ем экзоне. Отножение синтезированных Фрагментов ген/псевдоген 1:2. 1:3 зависело от механизма возникновения мутации (1:3 в случае генной конверсии. 1:2 в случае делении или дополнительной дупликации гена или псевдогена)(Евграфов 0.В..1992).

В МГНЦ РАМН был разработан.метод количественной амплификации. при котором возможно дифференцировать мутации в гомо- и гетерозиготном состоянии. Контроль результатов количественной амплификации осуществляли путем повторения исследования не- менее двух раз и с помощью семейного анализа.

Наиболее результативным в плане выявления мутаций оказалось исследование 3-го экзона, которое выявило мутации в 35 хромосомах из 78 обследованных (44.92) (таблица 7)'.

Было обнаружено, что 45.72 мутаций в 3-ем экзоне сцеплено с аллелем Н1А В14, и 34.22 - с гаплотипом Н1.А АЗ В47.

Исследование ДНК гомозигот по НЬА В14 и НЬА АЗ В47 обнаружило различия этих мутаций.

Таблица 7.

Результаты ДНК исследования пробандов с недостаточностью 21—ОН.

N НЬА Форма заболевания Промоторная область 3 экзон 8 экзон

1. 628 В14/А19 В14 соль» <1В <1В А***=В**

2. А9 В14/А28 В14 соль с1В dB А=В

3. АЗ В40/А11 В14 соль - ав А=В

4. А32 В14/А1 В14 соль - ёВ А=В

5. АЗ В47/А? В14 соль ав (1В А<В

6. АЗ В7 /АЗ В47 соль ¿В (1В 4А

7. А2 В15/А11 В35 соль с1В г1В А<В

8. АН В5 ,/АЗ В47 соль _ <1В А<В

9. АЗ В47/АЗ В47 соль с1В с1В dA

10.А28 В13/А2 В14 соль _ dB _

11.АЮ В7 /АЗ В40 соль _ А>В А<В

12.fi? В7 /АЗ В47 соль - А>В А=В

13.fi? В12/А23 В14 соль _ А>В А=В

14.032 В35/А3 В47 соль А=В А>В А=В

15.АЮ В40/А19 В14 соль А=В А>В А=В

16.Й2 В5 /А19 В35 соль А>В А>В А>В

17.А2 В27/АЗ В47 СОЛЬ- dB А>В А=В

18. А2 В18/А? В14 • соль _ А>В

19.А23 В21/АЗ В47 соль А=В А>В А<В

20.А2 В12/АЗ В47 соль _ А>В

21.А9 В18/А32 В14 соль _ А>В _

22.А2 В5 /А2 В40 соль _ А=В А=В

23.АЗ' В16/А1 В18 соль А=В А=В А=В

24.fi! В35/А3 В12 соль _ А=В А=В

25.А1 В35/А2 В40 соль _ А=В А=В

25аА1 В35/А2 •В40 соль _ А=В А=В

26.А9 В16/АЗ В47 соль _ ПН) П - В

27.А26 В16/АЗ В47 соль А-В А В

28.А2.3В13.22 соль _ А=В

29.А2.3В7 ,17 соль _ А=В _

30.АЗ В7 /А26 В41 соль _ А=В А=В

31.АЗ В7 /А2 В15 вир.ф-ма _ А<В А<В

32.А1 В5 /А28 В35 вир.ф-ма - А-В А=В

ЗЗ.А19 В35/А2 В51 вир.ф-ма - й >0 _

34.АЗ В35/А3 В40 вир.ф-ма _ А=В

35. А1 В5 /АЗ В35 вир.ф-ма _ А=В

36.А9 В7 /АЗ В35 вир.ф-ма _ П-В _

37. А2 В13.14 мягкая ф- ма А=В А<В А=В

38.А28.19 В14. 14 мягкая ф- ма - А=В А=В

* -сольтеряющая форма 25 и 25а - сибсы ** -ген СУР 21В »»»-псевдоген СУР 21А (1 -делеция

Пане предположение о том.что мутация,сцепленная с гапло-типом HLA АЗВ47,является известной европейской мутацией,которая представляет собой химерный ген.состоящий из двух частей:1-8 экзонов псевдогена и 8-10 экзона гена (Hhite P.C. с соавт.,1992).полностью подтвердилось.Молекулярно-генетическое исследование больного,гомозиготного по гаплотипу HLA АЗВ47Л наблюдение 9) обнарущило отсутствие последовательности гена промоторной области и 3-его экзона и последовательности псевдогена 8-го экзона.

Вновь выявленная мутация, сцепленная с ,Н1.А В14, в гомозиготном состоянии характеризовалась делецией промоторной области и 8 пар нуклеотидов в 3-ем экзоне гена, 8-ой экзон гена и псевдогена всегда присутствовали (наблюдения 1,2,4 в таблице 7).В гетерозиготном состоянии эта мутация обнаруживалась в 100Z случаев. Было высказано предположение, что механизмом образования данной мутации является конверсия,в результате которой последовательности промоторной области и части 3-го экзона гена были заменены на последовательности псевдогена. Стабильная выявляемость этой мутации в гетерозиготном состоянии тесно связана с механизмом ее возникновения,так как соотновение синтезируемых фрагментов ген/псевдоген в 3-ем экзоне должно быть 1:3.

В наяем исследовании было обнаружено 2 различные мутации, сцепленные с Н1.А В14. Одна из них представляла дупликацию гена и сопровождалась возникновением мягких форм заболевания. Эта мутация была выявлена у двух пациентов - наблюдения 37,38. Однако пациент 38 являлся компаундом, так как одна хромосома с HLfl Iii4 несла общеизвестную мутацию, а другая с HLA В14 - ранее неизвестную мутацию, в гомозиготном состоянии вызывающую

- 38 -

л

сольтерявщув Форму заболевания. Этот пациент имел дочь с соль-терявщей формой ВГКН, результаты обследования которой представлены в таблице 7. наблюдение 2.

Таким образом. ДНК исследование больных с классическими и мягкими формами недостаточности 21-гидроксилазы обнаружило среди славянского населения СНГ разнообразные мутации. Тяжелые 'классические формы заболевания чаще всего были обусловлены двумя мутациями: одна из них вновь обнаруженная, сцепленная с НЬЙ В14, и вторая, известная среди европейцев, сцепленная с Ш.А ЙЗВ47. Кроме того, у больных с мягкими формами заболевания была обнаружена известная мутация, сцепленная с Н1.А В14.

Изучение характеристики мутаций гена 21-гидроксилазы, распространенных среди населения навей страны, разработка.метода количественной амплификации позволили успешно использовать ДНК-диагностику для обнаружения заболевания у плода.На основании этих исследований были разработаны показания к использованию ДНК-метода, которые позволяли осуществить диагностику даже в беспробандных семьях.

Основными показаниями являлись следующие.

1. Обнаружение в фенотипе Н1.А родителей гаплотипов. которые позволяли предположить наличие у них мутаций, обнаруженных среди семей с классическими формами ВГКН. Прежде всего к ним относятся широко распространенные мутации, сцепленные с гапло-типами Hl.fi В14 и НЬА АЗ В47, вызывающие тяжелую форму ВГКН.

2. Обнаружение гетерозиготности у родителей в одном из изучаемых фрагментов ДНК гена 21-гидроксилазы с помощью-метода количественной амплификации.

Результаты пренатальной диагностики ВГКН приведены в таблице 8.

Таблица 8. Пренатальная ДНК-диагностика в семьях с сольтерящей формой ВГКН.

Семья Шй ДНК-исследование 17-ОП в Й1 (моль/л) Рез-тат исследования

промотор- 3 8 ная область зкзон экзон

1.мать 02 В55.14 отец Й9 В17.14 плод не определяли А>В А>В А>В А>В Й>В Й>В В.6 здоров

2.мать й В21.14 отец Й3.9 В13.40 плод не определяли А>В А>В А>В 9.0 здоров

З.мать Й10.11В27.14 отец ЙЗ В13.14 плод не определяли А=В А>В А=В А=В А>В А<В Й=В А>В А<В 9.1 здоров

4.мать Й2.3 В12.47 отец Й2.3 В12.14 плод ЙЗВ47/Й2В12 не определяли не определяли А>В 2.2 здоров

5.мать Й2.3 В15.21 сибс Й2.3 В15.12 плод не определяли Й=В Й>В А=В А=В Й>В А=В А=В А=В 14.9 здоров

6.мать Й2.10 В5.16 отец А10,25В18.14 плод не определяли Й=В А>В Й=В Й>В А>В Й=В Й=В Й=В 10.8 здоров

7.мать АЗ.10 В50.47 отец А1.23 В21.8 плод АЗВ47/А23В21 А=В Й>В Й<В Й=В Й<В А=В Й=В Й>В 24.0. болен

8.мать ЙЗ.З В7.47 отец АЗ,11 В5.27 плод ЙЗВ47/Й11В5 , А>В Й=В не определяли dB Й<В 124.0 болен

(1 псевдоген В - ген

сШ-делеция гена

В наблвдениях 1. 3 и 4 (таблица 8) оба супруга имели мутации. которые в гомозиготном состоянии регистрировались как делеция гена 21-ОН в 3-ем экзоне. Исследование ДНК клеток ам-ниотической жидкости плодов из этих семей обнаружило присутствие ДНК гена 21-ОН. Соотновение фрагментов ген/псевдоген свидетельствовало о гетерозиготном состоянии. Фенотипически плоды были здоровы, хотя и являлись носителями мутации. Исследование концентрации 17—0П подтвердило заключение о состоянии плодов, сделанное после ДНК диагностики.

Следует заметить, что при внвеописанной ситуации а супругов достаточно производить исследование только плода, что значительно снижает затраты. Во всех остальных случаях необходимо проводить семейный ДНК анализ.

В наблюдениях 2. 6 и 7 только один из супругов был носителей известных мутаций. Иетод количественной амплификации позволил обнаружить носительство иутантних аллелей гена 21-гидроксилазы в наблюдениях 2 и 6 у обоих супругов. Фрагменты ДНК 3-его экзона ген/псевдоген различались меЕДу собой, что свидетельствовало о гетерозиготнон состоянии. Это давало возможность предположить, что при заболевании у плода должна регистрироваться делеция фрагмента гена в 3-ем экзоне. Результаты исследования в обеих семьях отвергли заболевание у плода, что совпало с данными гормонального исследования. Кроне того, результаты количественной амплификации позволили заключить, что плод в наблюдении 2 является гетерозиготным носителем, а плод в наблюдении 6 - неноситель мутантных аллелей.

В наблюдении 7 один из супругов был носителем известной мутации, сцепленной с гаплотипом HL.fi 03 В47. которая в гетеро-

зиготном состоянии при исследовании фрагментов ДНК псевдо-ген/ген имеет соотноиение 2:1. Другой родитель (отец) являлся компаундом, то есть у него в генотипе имелось две мутации: одна, сцепленная с гаплотипом fil В8, другая - мутация в гомозиготном состоянии, приводящая к сольтерявцей форме заболевания. Нутация Al В8 известна как делеция псевдогена и C4fl. Присутствие этой мутации в генотипе защищает носителя от заболевания (Knorr D.c соавт.1986). Поэтому.исследование фрагментов ДНК 3-его экзона псевдоген/ген имели обратное соотновенне 1:2. Исследование Фрагментов ДНК 3-его экзона у родителей позволило предположить. что только при соотноиениях ДНК фрагментов псевдоген/ген 1:1 или 1:2 плод был бы здоров. Ситуация, обнаруаен-ная при исследовании ДНК плода, установила соотнопенне Фрагментов псевдоген/ген 2:1. что свидетельствовало о наличия у него заболевания. Это било подтверадено исследованием HLA фенотипа плода и определенней высокой концентрации 17-ОП в амни-отической жидкости.

Изучение характеристик наиболее пироко распространенных мутаций среди наяего населения обнаруаило. что все они иаевт обауа составнув часть - изменение последовательности гена или псевдогена в 3-еи.экзоне. йолекулярно-генетический анализ 3-го экзона прост и надежен, так как не требует дополнительной процедуры обработки полученных после амплификации фрагментов ДНК эндонуклеазами. Поэтому в ряде случаев пренатальнуз диагностику недостаточности 21-гидроксилазы можно осуществлять. исследуя только Фрагменты ДНК 3-го экзона. Это позволит получить больпую экономию при высокой себестоимости ДНК диагностики.

Проведенное комплексное исследование семей с

ВГКН.обусловленное недостаточностью 21-ОН.с помощью фенотипи-ческих маркеров позволило разработать систему диагностики данной патологии и выявить спектр мутаций,«ироко распространенных среди жителей навей страны.Благодаря этому стало возмоиным составлять полный генетический прогноз для, каадой отдельной семьи, не ограничиваясь констатацией степени генетического риска. В связи с.этим чрезвычайно возросла профилактическая роль медико-генетического консультирования в снижении заболеваемости и смертности новоровденных с недостаточностью 21-гид-роксилазы.

В результате исследования был составлен алгоритм диагностики недостаточности 21-ОН, применение которого позволит осуществлять целенаправленный отбор из общей популяции лиц -гетерозиготных носителей мутаций гена 21-ОН.а также больных с ВГКН среди новоровденных,детей и женщин.имеющих сходные клинические проявления, но страдающие другой патологией.Алгоритм состоит из двух частей - пренатального скрининга и селективного скрининга (рис.4).

Алгоритм пренатального скрининга строится на первоначальном отборе беременных женщин с помощью маркера 17-ОП из общей популяции для дальнейвего медико-генетического исследования и пренатальной диагностики.

Использование пренатрчьного скрининга позволяет осуществить проспективное выявле1...е супружеских пар, имеюцих высокий риск рождения больного ребенка даже в тех случаях, если этот ребенок является первнм в семье.

с ьлсп гионыи скрининг

&се5еременные • 1ик триместр

У

ю-опЬкро&и

//

/

>У 1

Фенотип НШ

АНК

±

ПренатальнаяЗиагнйтщ

£

■17- ОП В ЙК, (реитлШйМ

Плодз,

Плен

|одолен

НобоаохЗшые Прерывание | ' аеременност

НоВорОждеи/шс 3>етс Зетис Женщшше Супруги- Заноры интерсексы, ВГКН ранним гцперанара- гетера- спермы

"ниейц; . '¡¡еицям репродукции

ранним гиперондро- гетера- спермы сгипокортициз- ■ адренар- гениейцна- мгаты мам ршешрми / /

17-011 баэаяьныйуроЕень

Мили ¿У >У

Проба с ДКТГ

У\ А А

У >// М >М М >р

Фенотип НЬА

17-ОП 3 "деньхшц

<о&арахВенные с(гт

I

а

V3

-/Р-ОЛЗ"дйНб^изни фенотип ИМ, ДНК

^ НМВА,ВЧ7 донорами йытъненяшг

Рис. к. Алгоритм диагностики недостаточнощ -ОН

■ирокое применение инвазивных методов сделало возможным получить все необходимые данные о фенотипе и генотипе плода.что оказалось важным в случаях,когда принималось реиение о прерывании беременности из-за болезни плода. Это имело больное значение для беспробандных семей, так как. больной плод был источником необходимых сведений для составления генетического прогноза всех членов семьи и последующей беременности.

Возмошость использования маркеров для диагностики заболевания у плода позволяла успеино планировать детороадение в семьях с недостаточностью 21-гидроксилазы. Применение различных методов для пренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы делало возмоаным осуществлять диагностику на протяаении всего периода беременности, начиная с 1-го триместра с высокой эффективностью. Зто имело больное социальное значение для цаией страны, так как позволяло семье принять взве-ненное ренение, определить наиболее удачное время проведения диагностики для каадой женщины, учитывая состояние ее здоровья и социальные возмоаности. При неудачной попытке диагностики в 1-ом триместре диагностику осуществляли повторно с использованием всех возмданых методов во П-ом триместре.

Селективный скрининг следует использовать для диагностики различных форм ВГКН или поиска гетерозиготных носителей му-тантных генов 21—ОН среди различных групп индивидов. Основную группу составляли больные с нарушениями сексуального фенотипа и отклонениями функции репродуктивной системы,а у новорожденных и явлениями гипокортицизма. Поиск женщин с недостаточностью 21-ОН среди больных.которым делаются попытки восстановить фертильность. важен, так как в случае выявления у них ге-

нетического дефекта требуется выяснить прогноз потомства и в случае необходимости осуществить пренатальную диагностику.

Особое значение селективный скрининг играет для диагностики гетерозиготного носительства мутаций гена 21—ОН.кото-руп возможно произвести либо с помощью пробы с АКТГ.либо путем выявления иироко распространенных мутаций среди нажего населения по фенотипам НЬА.

Прежде всего это относится к супругам.считающих себя фено-типически здоровыми людьми, в семье которых у ближайших' родственников отмечалась неоднократная гибель новорожденных,а у женщин отклонения в системе репродукции. Как показали нажи

исследования.гибель новорожденных и нарушения репродукции у

\

женщин в семьях супругов являлись косвенными признаками наличия мутаций гена 21-ОН.которые были обнаружены у 1/4 семей с ВГКН.Подтверждение гетерозиготного носительства у супругов из таких семей являлось показанием к проведению пренатальной диагностики при каждой последующей беременности.

Нирокое использование в настоящее время процедуры искусственного осеменения требует целенаправленного генетического обследования доноров ¿йермы на выявления у них наиболее иироко распространенных мутаций в генотипе.Исследование фенотипа НЬА и выявление гаплотипов НЮ В14 и 1ИА АЗВ47.присутствие которых свидетельствует о высоком риске носительства мутаций гена 21-ОН у мужчин,не позволяет использовать их сперму.

Нсестороннее изучение данной патологии и разработка алго ритма • диагностики недостаточности 21-ОН позволили каждой семье, обратившейся за консультацией, получить исчерпыпающий

ответ о генетических особенностях, патогенезе, клинических . формах, терапии и прогнозе жизни потомства.

выводы.

1. Использование фенотипических маркеров: 17-ОП и антигенов НЬА позволяет с успехом диагностировать недостаточность 21-ОН не- только при индивидуальном или клинико-генеалогическом

'обследовании, но и осуществлять популяционный поиск мутантных аллелей.

2. Недостаточность 21-ОН всегда сопровождается наружением процесса синтеза гормонов надпочечниками, что можно с высокой достоверностью обнаружить уже в I .триместре пренатального развития индивида путем измерения концентраций 17-ОН в Й1 и крови. Степень недостаточности 21-ОН обратно пропорциональна концентрации 17-ОП. что отражает глубину наружения синтеза гормонов надпочечниками. Признаком заболевания является повышение базальных концентраций 17-ОП.

3. Гетерозиготное носительство недостаточности 21-ОН, несмотря .на клиническую компенсацию, сопровождается функциональной надпочечниковой нестабильностью, которая является причиной функциональных расстройств репродуктивной системы у женщин-носительниц. Этих женщин надо относить в разряд групп высокого риска, так как нарушения репродуктивной системы могут возникнуть вне и на фоне беременности. Недостаточность 21-ОН при гетерозиготном носительстве выявляется пробой с ЙКТГ.

4. Осложнения течения беременности и высокий уровень 17-ОП в крови беременной гетерозиготной носительницы мутантно-Г» гена 21-ОН являются косвенными признаками наличия заболева-

ния у плода.

5. Популяционный поиск мутантных аллелей гена 21—ОН среди семей с классическими формами ВГКН. на 982 состоящих из лиц славянского происхождения, обнаружил положительную ассоциацию заболевания с гаплотипами HL.fi В14 и HLA A3 В47 и отрицательную ассоциацию с гаплотипом ill ВЯ.

fi. Мплекулярно генетическое исследование ДНК больных с гаплотипами ULI) Н14 и lll.fl A3 В47 установило, что мутация, сцепленная с HLA В14. является новой, ранее не описанной в литературе, частота которой среди славянского населения равна 45.7%. Мутация, сцепленная с HLA A3 В47, является известной европейской мутацией, частота которой среди славянского населения СНГ 37.2'/..

7. Одним из основных методов профилактики недостаточности 21—ОН является пренатальная диагностика. В популяции с больмим числом беспробандных семей оптимальным методом пренатальной диагностики является биохимический метод. Этот метод универсален. обладает высокой эффективностью (97.8%) и может применяться yse n i триместре беременности. Определение фенотипа III.А плода является вспомогательным методом, позволяющим пополнить Панк генетических данных о семье. Иолекулярно-генети-чпский метод может Пить использован преимущественно для получения характеристики мутаций.

1!. В качестве мдипй из профилактических мер предлагается скрининг беременных па определение уровня 17-011 в крови, повы-исннне концентрации которого предполагает наличие заболевания у плода. Это исследование можно проводить ив I. и во !1 триместрам беременности.

8. Комплексное исследование семей с ВГКН. обусловленной недостаточностью 21-ОН позволило разработать алгоритм диагностики этой патологии для целенаправленного отбора гетерозиготных носителей мутаций гена 21-ОН из общей популяции и больных с разными формами ВГКН (новорожденных,детей и женщин) среди патологии, имеющей сходную клиническую картину с ВГКН: определить пути профилактики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Диагностика всех форм, недостаточности 21-ОН должна осуществляться с помощью фенотипических маркеров - 17-ОП и антигенов Н1А. а также с помощью генетических маркеров путем измерения длины Фрагментов ДНК гена и псевдогена 21-ОН.

2. При выборе маркера для диагностики недостаточности 21-ОН следует учитывать специфические особенности маркера и усдв^ия, при которых его использование обеспечит максимальный диагностический эффект.

3. Диагностика недостаточности 21-ОН должна проводиться у ■ новорожденных с нарушением половой дифференцировки и гипокор-

тицизмом, у детей с преждевременным адренархе и отклонениями сексуального фенотипа.у женщин с гиперандрогенией путем исследования базального уровня 17-ОП, а при необходимости и пробы с АКТГ.

4. Диагностика гетерозиготного носительства мутаций гена 21-ОН должна производиться у фенотипически здоровых лиц:супружеских пар,у которых в родословной отмечается высокая частота гибели новорожденных и нарушения репродукции у женщин; у мужчин-доноров спермы.

5. 1енщин-гетерозиготных носителей следует выделить в группу высокого риска по развитие осложнений при беременности для динамического наблюдения за ними в этот период.

6. Пренатальнуи диагностику ВГКН следует проводить с помощью фенотипических и генетических маркеров и в 1-ом, и во П-ом триместрах в зависимости от сроков обращения женщины в ыедико-генетическуп консультации.

7. Проспективная диагностика ВГКН у плода должна осуществляться с помощью пренатального скрининга беременных путем определения уровня 17-ОП в крови в I и II триместрах.повыженная концентрация которого указывает на заболевание плода.

8. Медико-генетическое консультирование семей с ВГКН должно включать исследование фенотипа Н1А для поиска гаплоти-пов,сцепленных с мутантными аллелями гена 21—ОН.

9. В беспробандных семьях необходимо исследовать НЬА фенотип плода при наличии заболевания у плода и предстоящем прерывании беременности.

СПИСОК РАБОТ.ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1.НЬО типирование и диагностика носительства гена недостаточности 21-гидроксилазы // Сб.'Иммуногенетические методы диагностики и терапии различных патологических состояний".-Ленинград. 1986.с.60-63/соавт.Брыкова Е.К./

2.Уровни 170Н-прогестерона в аиниотической жидкости во П-ом триместре беременности.//Проблемы эндокринологии. 1987.3.с.20-22 /соавт.Брыкова Е.К..Колесникова Г.А.,По-лестеров Ю.А./

3.Содержаний 170Н-прогестерона и кортизола в амниоти-

ческой жидкости во Ii-ом триместре беременности здоровым плодом. //Сб. "Методы оценки эндокринной функции женщины".-М.1987.с.120-122 /соавт.Бахарев В.А..Брыкова Е.К.,Фанчен-ко Н.Д./

4.Пренатальная диагностика врожденной гиперплазии коры надпочечников.//Советская медицина.1988.7.с.11-I4/соавт.Наха-рев В.А.,Брыкова Е.К..Бронштейн М.И..Фанченко Н.Д./

5.Уровни 17а-оксилрогестерона и кортизола в амниотической жидкости при беременности нормальным плодом и при некоторых заболеваниях плода.//Акушерство и гинекология. 1989. 1 .с,63-65/соавт.Бахарев В.ft..Брыкпва К.К..Фанченко Н.Л./

В.Морфофункциональные особенности надпочечников плодов при врожденной дисфункции коры надпочечников с недистаточ нистью 21-гидрокпиллзы.//Труди III Ri Г'сию:<шич съезда эндокри ■ нологов.-Ташкент.1989.с.404./соавт.Бахарев П.П..Бронштейн М.И./

7.Варианты врожденной гиперплазии коры надпочечников с недостаточностью 21-гидроксилазн.//Труды И! Иееетознмгп п.ег; да эндикринологов. Ташкент. 1989. с. 44Í1. /«;павт. Н<»хс1рпв li.il..Бри kobíi Е.К./

8.Clinical" polynorphiяш and HI.A phenotype in patients with congenital adrenocortical hyperplasia due t,u 21-hydrocxylase defiticiPnc.y.//Absl . I Polish-Soviet пуицюпнп» un: "Selected ргиЫсш:; иГ pathology of reproduction and early human development". Warpawa.XI1 -I'.IHI! .p. ti4 ..li-i*'*!1»'1' H.A. .Ннигтм I'.1;./

I1.! í.'Lí l.:: - м. • t ■ I Hi. ■ .11 II!'!.I I ............. "HM-t * -lilis-H :1 ¡¡ i' [;1' '!■ i .:n u

мири iiii;;nu4i:'liinifoi; с недш г,tти'нмк.> i.m гидрпкг.илачи. '/Тезисы

докл.ХиВсесоюзного съезда акумеров и гинекологов.-Донецк. 1989.с.186-187./соавт.Брыкова Е.К./

10.Клинический полиморфизм ВГКН,обусловленный недостаточностью 21-гидроксилазы и фенотип Н1.А.//Акуиерство и гинекология.1990.I.e.10-14./соавт.Бахарев В.А.,Брыкова Е.К./

11.Клинические варианты вирильной формы ВГКН.//Акуиерство и гинекология.1990.4.с.25-28./соавт.Кузнецова М.Н..Латыпова НХ/

12.Клиника и диагностика мягких форм ВГКН.//2-Я Всесовзная конференция по гинекологии детей и подростков. -й.IU-1990.с.82/соавт.Латыпова Н.Х..Брыкова Е.К..Бахарев В.А./

13.Особенности функции репродуктивной системы яенщин-гете-розиготных носительниц недостаточности 21-гидроксилазы.//Аку-яерство и гинекология.1990.9.с.45-48./соавт.Брыкова Е.К..Баха-рев В.А..Фанченко Н.Д./

14.HLA in fani1ies uith classic fro® of СОН caused by 21-hydroxylase

deficiency.//Endocrynol.Polska.v.41.3.1990.c.357-363./соавт. Малиновская M..Ромер.Вановская.Бахарев В.А..Бокианин Я./

15.Пренатальная диагностика ВГКН.//Тезисы Всесоюзной научно -практической конф.-Харьков.1990.с.18-19./соавт.Бахарев В.А..Брыкова Е.К..Фанченко Н.Д..Зарецкая Н.В./

1В.Современные аспекты профилактики наследственной патологии. //2 ой Всесоюзный съезд мед.генетиков. -М. 1990.с.43-44./соавт.Бахарер В.А..Каретникова H.A./

17.Identification of disturbance of ' hereditory steroidogenesis in 21-hydroxylase

insufficiency.//Eur.assoclat.of Gynaec.and Obstetr.6-th

■eeting.1991.c.127./соавт.Бахарев В.А..Брнкова E.K..Фанченко Н.Д./

lB.PCR-Based detection of «utatuon causing 21-hydroxylase deficiency.//24 Annal «eeting of

ESHG.abstract.1992.N232.с.127/соавт Евграфов 0.В..Поляков Й.В..Бахдрев В.А./

* 19.Detection of lutatlon causing 21-hydroxylase deficiency.//China Congress on improving birth quality and child upbringing.abs.1992.c.307./соавт.Поляков А.В..Евграфов О.В.,Бахарев В.А./

20.Мцтации гена 21-гидроксила_зы при сольтеряпщей форме врожденной гиперплазии коры •надпочечников среди славянского населения СНГ.//Тезисы 3-ей конференции "Геном челове-' ка-93".Черноголовка.II1-1993.с.67./соавт.Бахарев В.А..Евграфов 0.В..Поляков А.В./

21.The investigation of fetalblood for prenatal diagnosis

of congenital and hereditary diseases.//Europian Society Huaan

i

genet.25th Annal Meeting.-Barselona.1993.c.123./соавт.Бахарев . В.А..Каретникова H.A./

22.Способы получения крови плода и их особенности.//Аку-■ерство и гинекология.1994.1.с.21-25./соавт.Бахарев В.А.,Каретникова Н.А..Литовский В.Р./

23.ДНК-диагностика недостаточности 21-гидроксилазн.//Тезисы 4-ой конф. "Геном человека-94".-Черноголовка.1994.с.32./соавт.Бахарев В.А..Юдина Т.Н..Евграфов О.В./

24.Характер мутаций и пренатальная диагностика при недостаточности 21-гидроксилазы.//1 Российский съезд мед.генети-

ков.-Москва.1994.с.20./соавт.Бахарев В.А.,Вдина Т.Н..Евграфов О.В./

25.Биохимическая генетика наследственных эндокрннопатий.// I Российский съезд мед.генетиков.-Москва.1994.с.59./соавт.Бахарев В.й..Каретникова Н.А..Фанченко Н.Д./

26.Диагностика гетерозиготного носительства мдтантного гена 21-гидроксилазы.//Акдмерство и гинекология.1995.I.e. ./ соавт.Бахарев В.А..Фанченко Н.Д..1дина Т.Н./

27.Содержание стероидов в амниотической видкости в I и II триместрах беременности при недостаточности 21-гидроксилазы'и пороках ЦНС.//Акд«врство и гинекология.2.с. ../соавт.Бахарев В.А.,Брыкова Е.К..Полестеров В.А..Фанченко /Н.Д..Зарецкая Н.В./