Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Совершенствование методов лабораторной диагностики описторхоза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Р > • 0 дНОВОСИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ. ИНСТИТУТ

■: ". ]9Г'Ь На правах рукописи

УДК 616.995.122.21 - 076

X О X Л О В А НАТАЛЬЯ ИГОРЕВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СШЮТ0РХ03А

14.00.10. - инфекционные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в Новосибирском медицинском институте

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор Г.®. Белов

Научный консультант - кандидат биологических наук В. В. Глупев

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор А.Ф.Колесникова

кандидат медицинских наук В.А.Наумов

Ведущее учреждение - Ллтайский государственный медицинский университет.

Защита состоится 1996г. в УО час на

заседании специализированного совета к 084.52.01 при Новосибирском медицинском институте (630091, г.Новосибирск, Красный проспект, 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского медицинского института.

Автореферат разослан 71996г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук^г?-, И.Г.Патурина

Актуальность проблемы. Обь-Иртышский бассейн является самым большим очагом описторхова в мире (Д.Д.Яблоков, 1979). В последние годы наблюдается повсеместное снижение интенсивности инвазии (И.А.Павлюков и соавт., 1989), причина которого остается неясной. В связи с полиморфизмом клинических проявлений выявление бальных описторхозом, проживающих в эндемичном очаге, сопряжено с большими трудностями, и поэтому лабораторная диагностика описторхоза играет ведущую роль в его распознавании. Снижением интенсивности инвазии определяются трудности гельминтоовосгсопической диагностики. В связи с этим, разработка методов иммунодиагностики описторхоза приобретает исключительно важное значение.

Реакции иммунитета, используемые для диагностики описторхоза, могут быть подразделены на 2 группы. Одна группа реакции обеспечивает выявление антител в сыворотке крови больных описторхозом. К их числу относятся РИГА и ИФА с описторхозным антигеном. Апробация РИГА в клинике показала ее несомненную диагностическую ценность при распознавании острых форм описторхоза. По данным H.A. Клебаиовской я В.В. Горчакова (1981), реакция положительна у 98,1 % больных острым описторхозом, а в случаях хронических форм описторхоза ее диагностическая значимость бывает существенно ниже.

С 70-х годов для диагностики описторхоза стал широко применяться ИФА для выявления прогивоописторхозных антител. Общая картина диагностической ценности ИФА не отличается от диагностической значимости РИГА. Высокие титры антител в реакции ИФА отмечаются у больных острым описторхозом (Г.А.Гицу и соавт., 1987; Клебановская л соавт.,1990). Роль ИФА в распознавании хронического описторхоза существенно ниже. И. А. Клебановская и О.Ю.Старостина (1987) при одномоментном ис-

пользовании 2-х реакций иммунитета (РИГА и ИФА) смогли подтвердить диагноз только у 52,7 X больных хроническим опистор-хозом.

Трудности распознавания хронического описторхоза с применением РИГА и ИФА определяются еще и тем, что у исследователей нет единства мнений в отношении так называемого "диагностического" титра реакции. Так, по мнению И.А.Кдебановской и О.Ю.Старостиной (1987), диагноз хронического описторхоза может быть поставлен при титре реакции ША 1:50, а согласно инструктивным указаниям фирмы "Вектор" - при титре 1:200. А.Я.Лысенко (1978) считает ва диагностический титр разведение сыворотки 1:400.

С нашей точки зрения, более перспективными для диагностики описторхоза являются реакции, направленные на выявление антигенов описторхисов в фекалиях. Ю.В.Теплухин и соавт. (1986) разработали РИГА с антительным диагностикумом, при использовании которой антигены описторхисов в фекалиях могут быть выявлены у 65-70Х больных описторхозом. Трудность внедрения этой реакции в широкую клиническую практику определяется отсутствием промышленного производства антительного зритроцигарного диагностикума.

В 1987 году В.Г.Кузнецова и соавт. использовали принцип тонкослойного иммунного анализа (Н.Е1и1пв а1,, 1975) для диагностики описторхоза.. В отличие от оригинального метода, для выявления антигенов описторхисов в фекалиях В.Г.Кузнецова и соавт. в качестве источника антител использовали сыворотку крови обследуемого больного. По их данным, при применении ТИА с аутосывороткой диагноз хронического описторхоза может быть верифицирован у 87,5 % больных. Однако к недостаткам этой реакции следует отнести то, что при оценке ее

к

результатов в водяных парах мажет вноситься вначктелъный элемент субъективизма.

Поэтому дальнейшее совершенствование методов иммунодиагностики описторхоза является актуальной задачей клинической медицины.

Цель исследования - совершенствование лабораторной диагностики описторхоза с применением реакций иммунитета.

Задачи исследования:

1. Изучить диагностическую ценность ИФА в распознавании острого и хронического описторхоза в условиях нивкой интенсивности инвазии.

2. Изучить диагностическую ценность ТИА и его иммуно-ферментной модификации (мТИА) в распознавании острого и хронического описторхоза в условиях нивкой интенсивности инвазии.

3. Изучить специфичность реакций ТИА и МТИА.

4. Исследовать в иммуноблоттинге антигенные компоненты секреторно-экскреторных продуктов, тегумента и экстракта ма-рит описторхисов.

Научная новизна:

1. Впервые для выявления антигенов описторхисов в фекалиях больных использована иммуноферментная модификация ТИА с аутосывороткой.

2. Впервые установлено, что сыворотки крови больных описторхозом в реакциях ТИА и мТИА могут положительно реагировать с антигенами аскариды человека, широкого лентеца, однокамерного эхинококка и Methorchis bills (albidus).

3. Впервые в экстракте марит описторхисов выявлен антиген с молекулярной массол 100 кДа, который специфически реагирует с сыворотками крови больных описторхозом и не реаги-

S

рует с сыворотками крови неинвазированных лиц.

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

С применением ТИА и мТИА с аутосывороткой представляется возможным диагностировать наличие инвазии описторхисами не только в случаях клинически выраженных форм, но и при инаппарантных и латентных формах.

Учитывая, что реакция ТИА для своей постановки не требует специального оборудования и реактивов, она может быть использована при проведении массового обследования населения.

Установлена возможность постановки 2-го этапа раакции мТИА после экспонирования чашек в водяных парах при сомнительных или отрицательных результатах ТИА.

Результаты исследований внедрены в 1-й МИКБ г.Новосибирска и поликлинике N 1 г.Новосибирска.

Положения, выносимые на заплту.

1. Диагностическая ценность реакции ИФА со стандартными реагентами приближается к 100% только у больных острым опис-торхозом.

2. С применением ША диагноз хронического описторхоза может быть установлен не более чем у 50% больных.

3. Для диагностики описторхоза в период хронической фазы целесообразнее использование реакций иммунитета для выявления антигенов описторхисов в фекалиях (ТИА и мТИА).

4. С применением мТИА диагноз описторхоза может быть установлен у всех больных острым опис-торхозом и у 87,5%. -хроническим.

5. В экстракте марит описторхисов выявлен антиген с молекулярной массой 100 кЦа, который дает полосы преципитации с сыворотками крови больных описторхозом и не реагирует с сыворотками крови неинвазированных лиц.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на 53, 54, 56 и 57-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых НМИ (апрель 1992, 1993, 1995 и март 1996г.), на заседании ассоциации инфекционистов Новосибирской области (декабрь 1991г.), на научной сессии НМИ, посвященной 100-летию Новосибирска (октябрь 1994г.), на 1-й научной конференции Новосибирского отделения паразитологического общества РАН (февраль 1996г.), на 6-й научно-практической конференции врачей г.Новосибирска (апрель 1996г.).

Диссертация апробирована на совместном совещении кафедр инфекционных болезней лечебного и педиатрического факультетов Новосибирского медицинского института.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, оформлено рационализаторское предложение "Способ диагностики описторхоза", разработаны и внедрены методические рекомендации "Диагностика и лечение больных описторхозом".

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на /21 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций.

Библиографический указатель содержит 188 источников литературы (104 отечественных и 84 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 14 таблицами, 3 рисунками, 2 фотографиями, 4 выписками из историй болезни.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

Под наблюдением находилось 136 больных описторхозом в воврасте от 15 до 58 лет (мужчин - 43 и женщин - 93), из которых у 20 была диагностирована острая форма заболевания и у 116 хроническая; а также 11 больных дифиллоботриозом и 7 больных аскаридозом, лечившихся в 1-й муниципальной клинической инфекционной больнице г.Новосибирска.

Диагноз у всех обследованных больных был подтвержден обнаружением яиц описторхисов в дуоденальном содержимом иди в фекалиях: у больных острым описторхозом - на 4-5-й неделях болезни, у 89 больных хроническим описторховом - до начала лечения и у 27 больных - на 2-10-й день после проведенной этиотропной терапии. Исследование фекалий на яйца описторхисов осуществлялось с применением метода К. Като (1954) и эфир-уксусного метода (И.А.Павлшов и Ю.А.Березанцев, 1991). Для оценки интенсивности инвазии использовали модифицированный метод Като (А.М.Бронштейн и Е.А.Котова, 1983).

Диагноз дифиллоботриова был подтвержден обнаружением яиц или члеников широкого лентеца в фекалиях больных, аскаридоза - выявлением яиц аскариды человека в фекалиях.

У всех больных определялись -состав крови, мочи, содержание в сыворотке крови билирубина, АЛТ, ACT и тимоловая проба.

В качестве группы контроля были обследованы 23 человека, у которых на основании анамнестических, клинических данных и результатов копроовоскопии методом Като исключалась инваэия описторхисами: 16 взрослых в возрасте 18 - 19 лет, клинически здоровых доноров Окружного госпиталя СибВО. ранее

Л

проживавших в незндемичных по опмсторхоау местностях, и 7 детей в воерасте от 9 месяцев до 2,5 дет, находившихся на лечении в дорожной клинической больнице г.Новосибирска по поводу соматических и неврологических заболеваний.

Больные острым и хроническим описторхозом и лица группы контроля были обследованы с применением 3-х реакций иммунитета: ИФА, тонкослойного иммунного анализа с аутосывороткой (ГИА) и иммунофе рме нткой модификации ГИД с аутосывороткой (мТИА).

Для выявления антител к антигенам описторхисов использовалась тест-система ИФА производства Омского НИИПИ. Постаг новка реакции осуществлялась в соответствии с инструкцией. Реакция считалась положительной при титре антител 1:100 и более.

ТИА с аутосывороткой для определения антигенов описторхисов в фекалиях выполнялась в модификации В.Г.Кузнецовой и соавт. (1987): допускалось, что в сыворотке крови больного содержатся специфические антитела, а в фекалиях - секретор-но-экскреторные антигены описторхисов, которые в реакции ТИА образуют комплексы антиген-антитело на полистироловой поверхности. Контроль на специфичность антител осуществлялся внесением в сыворотку крови исследуемого больного лиофшиги-рованного антигена описторхисов (производства Тюменского НИИ краевой инфекционной патологии). Реакция расценивалась как положительная, если образовывался крупнокапелышй конденсат в месте контакта сыворотки и с над осадочной жидкостью фекалий, и с описторхозным антигеном.

При постановке иммуноферментной модификации ТИА с аутосывороткой (мТИА) первый этап реакции (внесение исследуемой сыворотки, антигена описторхисов, супернанта фекалий) осу-

ществлялся как оригинальная реакция ТИА с аутосывороткой, однако на 2-м этапе (визуализация комплексов "антиген-антитело") использовались не водяные пары, а антитела к иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой (принцип предложен H.Elwing et al, 1980).

Оценка результатов реакции проводилась по изменению цвета полистироловой поверхности, что исключало элемент субъективизма, возможный при трактовке результатов ТИА.

Иммуноферментная модификация ТИА была использована нами для диагностики описторхоза впервые.

Сыворотки крови больных описторхозом исследовали также в реакциях ТИА и мТИА с применением соматических антигенов широкого лентеца и аскариды человека, жидкости эхинококкового пузыря печени и метаболического антигена Methorchis bilis.

Иммуноблоттинг для изучения антигенов Opisthorchis feli-neus выполнялся согласно рекомендациям H.Towbin et al.(1979) с применением сывороток крови 10 больных описторхозом и 10 неинвазированных лиц.

Из марит описторхисов, полученных из печени экспериментально зараженных золотистых хомячков, были приготовлены 3, антигена описторхисов: метаболический (секреторно-экскреторные продукты описторхисов), соматический (экстракт марит описторхисов) и антиген тегумента. После проведения электрофореза 3-х антигенов описторхисов и маркеров молекулярной массы белков в геле и последующего их электропереноса на нитроцеллюлозу, полоски нитроцеллюлозы инкубировали в сыворотках крови больных описторхозом и неинвазированных лиц (в разведении 1:10), а затем в козьей сыворотке против иммуноглобулинов G человека, меченой пероксидазой. Проявление реакции осуществили добавлением субстратной смеси.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

С применением 3-х реакций иммунитета: ИФА с антигенным диагностикумом, ТИА с аутосывороткой и мТИА, который был использован для диагностики описторхоза впервые,было обследовано 20 больных острым описторхозом и 80 - хроническим.

Из 20 больных острым описторхозом тифоподобный вариант болезни был. диагностирован у 8, гепатохолангитический - у 11 и инаппарантный - у 1. Из числа 80 больных хроническим описторхозом синдром холангиохолецистита был выявлен у 63 (78,8%), гепатохолангита - у 4 (5,8%) и латентный описторхоз (больные не предъявляли жалоб) - у 13 (16,3%). Сопутствующий синдром гастродуоденита был выявлен у 16 больных (20%) и синдром энтероколита - у 4 (5%). Интенсивность инвазии у исследованных больных была низкой и составляла 8,8 ± 7,3 яиц в 1 г фекалий.

Результаты обследования больных острым описторхозом показали, что титр антител в реакции ИФА у них, как правило, бывает высоким (1:400, 1:800). До 3-й недели заболевания титр антител бывает наиболее высоким (1:800), а с 3-й недели от снижается и чаще составляет 1:400 и ниже. В целом, в острую фазу болезни реакция ИФА был положительной у 17 из 20 больных (85%).

При обследовании этих же 20 больных с применением ТИА с аутосывороткой диагноз описторхоза удалось подтвердить у 15 больных (75%), у которых одновременно выявлялись антигены описторхисов в фекалиях и антитела в сыворотке крови. У 1 больного реакция была расценена как сомнительная, у 3 были выявлены только специфические антитела в сыворотке крови и у 1 больного сыворотка крови дала положительную реакцию с су-

У/

пернатая том фекалий, но антитела в крови не выявлялись.

При обследовании больных острый описторхоэом с помощью модифицированного ТИА (мТИА) сомнительные и отрицательные результаты устранялись, и у всех 20 больных результаты реакции были расценены как положительные.

При обследовании 60 больных хроническим описторхозом с применением реакции ИФА титр антител 1:800 был варегистриро-ван у 7 человек, 1:400 - у 13, 1:200 - у 23, 1:100 - у 9, и отрицательной реакция была у 28 больных. Таким образом, у больных хроническим описторховом антитела чаще выявлялись в низких титрах или вообще не обнаруживались.

Касаясь случаев высоких титров у больных хроническим описторхоаом, следует отметить, что все больные проживали в эндемичном по описторхоэу очаге и систематически употребляли в поду вяленую и малосоленую рыбу. Поэтому нельзя исключить у больных с высокими титрами антител суперинвазии. В пользу этого свидетельствует и тот факт, что эовинофилия периферической крови у обследованных больных хроническим описторхо-80м с высокими титрами антител отмечалась в 2 раза чаще, чем у больных с низкими их титрами (р<0,05).

Несмотря на широкое применение тест-систем ИФА для диагностики описторхоза, у исследователей нет единого мнения относительно величины "диагностических титров" антител в этой реакции, что очень затрудняет интерпретацию результатов обследования больных хроническим описторхозом с использованием ИФА и делает возможным как гипер-, так и гиподиагности-ку этого заболевания. Так, И.А.Клебановская и О.Ю.Старостина (1987) за диагностический в реакции ИФА принимали титр антител 1:50, а Л.Я.Лысенко и соавт. (1978) - 1:400. Если следовать последней рекомендации, с применением ИФА, по нашим

данным, диагноз может быть верифицирован лишь у 20 из 80 (25Х) больных хроническим описторхозом.

Обследование этих же 80 больных в реакции ТИА показало, что у 58 (72,52) больных выявлялись противоописторхогные антитела в сыворотке крови и антигены описторхисов в фекалиях (т.е. реакция расценена как положительная). У 9 человек реакция была расценена как сомнительная, а у 13 - как отрицательная.

Диагностическая ценность реакции ТИА в распознавании хронического описторхоза была подтверждена и исследованием специально отобранной группы больных (27 человек), имевших в анамнезе указания на употребление в пищу рыбы семейства карповых, с наличием симптомов поражения гепатобилиарной системы и желудочнокишечного тракта, отрицательными результатами многократного овоскопического исследования фекалий и желчи, но положительной реакцией ТИА с аутосывороткой. На 2-10-й день проведения этиотропного лечения в фекалиях 26 из 27 больных были обнаружены яйца описторхисов в количестве от 5 до ЭО яиц в 1 г.

При применении мТИА у 80 больных хроническим описторхозом, обследованных ранее и в ТИА, устранялись сомнительные результаты и положительная реакция мТИА была зарегистрирована у 70 больных (87,5%). Из числа больных с отрицательной реакцией ТИА в количестве 13 человек при постановке мТИА у 8 человек реакция была расценена как положительная. Таким образом, с применением реакции мТИА значительно увеличивается частота положительных результатов (на 152) по сравнению с оригинальным методом ТИА с аутосывороткой. ф<0,05).

Анализ отрицательных результатов реакции мТИА у 10 больных хроническим описторхозом показал, что у 5 человек не

выявлялись антитела в крови и антигены описторхисов в фекалиях, у 3 не выявлялись антигены в фекалиях, и у 2 сыворотка крови не реагировала с антигеном описторхисов, но реакция была положительной с супернатантом фекалий.

Результаты выполненных исследований свидетельствуют о преимуществе реакций ТИА и мТИА в диагностике описторхоза, т.к. с их помощью можно одновременно определить и наличие антител в сыворотке крови, и антигенов описторхисов в фекалиях. При этом устраняется вопрос о величине так называемых "диагностических титров" в распознавании острого и хронического описторхоза. При клинически выраженных и субклинических формах острого й хронического описторхоза достоверных различий диагностической ценности как реакций ТИА, так и мТИА не выявлено (р>0,05),

Реакция мТИА отличается большей сложностью и требует для своего выполнения не только лиофилизированного опистор-хозного антигена и кроличьей сыворотки против иммуноглобулинов человека, меченой пероксидазой, но и большей затраты времени на ее постановку. Учитывая двухэтапный характер мТИА, нами были проведены наблюдения за возможностью постановки 2-го этапа мТИА после экспонирования чашки Петри в водяных парах. Поскольку при положительных результатах ТИА реакция мТИА в наших наблюдениях у подавляющего числа больных .также была .положительной, представляется целесообразным прибегать к постановке мТИА на той же чашке только в тех случаях, если при оценке ТИА в водяных парах были получены сомнительные или отрицательные результаты. Этим приемом экономится время при выполнении обследования больного и реактивы.

Особый интерес представляет анализ возможных причин отрицательных результатов использованных в работе реакций им-

мунитета. Отрицательные результаты реакций ТИА и мТИА у больных описторхозом могут быть обусловлены или низкими титрами специфических антител в сыворотке крови, или отсутствием или крайне незначительным содержанием антигенов опистор-хисов в фекалиях.

Из числа исследованных 100 больных острым и хроническим описторхозом, у которых диагноз был подтвержден овоскопичес-ки, специфические антитела в сыворотке крови не были выявлены в реакции ИФА у 31 человека, в реакции ТИА - у 17 и в реакции мТИА- у 8 , что возможно, является отражением феномена гомологичной иммуносупрессии. Наиболее важным механизмом тормозящего действия гельминтов на защитные реакции хозяина признана иммунологическая толерантность (Е.С.Лейкина, 1978; Н.Н.Озерецковская и С.П.Сергиев, 1993; С.Б.Парфенов и со-авт., 1991; A.Schweitzer et al., 1992; J.Suzuki et al., 1988). По мнению Н.Н.Озерецковской и С.П.Сергиева (1993), С.Б.Парфенова и соавт.(1991), у жителей эндемичных по опис-торхозу очагов развивается иммунологическая толерантность супрессорного типа еще в период внутриутробного развития вследствие трансплацетарной передачи антигенов описторхисов от инвазированной матери плоду при пероральном поступлении антигенов описторхисов в период раннего детского возраста (в иммуноадаптивный период).

Низкий уровень антител может быть связан и с ограниченным поступлением в кровь антигенного материала гельминтов вследствие их просветного паразитирования (С.Б.Парфенов и Т.Ф.Постникова, 1988) и возможного связывания антигенов гельминтов с секреторными иммуноглобулинами (Е.Г.Сергеева и соавт., 1988).

Очень низкое содержание антигенов" описторхисов в фека-

/л

лиях может быть обусловлено крайне незначительной интенсивностью инвавии. W. Chai cumpa et al. (1981,1892) связывают незначительное содержание антигенов Opisthorchis viverrlnl в фекалиях с недостаточной экскрецией их гельминтами иди наличием в фекалиях каких-то веществ, вызывающих денатурацию иди протеолиэ антигенов (Е. Oreen, 1986; М. Hanvanich etal., 1985; T.Hovi etal., 1982; R.Yiscldi et al., 1984). W.Chai-cumpa et al. (1991, 1992) для выявления антигенов описторхи-сов в фекалиях использовали поли- и моноклонадьные антитела к соматическим антигенам Opisthorchis viverrini, полученные от иммунизированных животных, однако положительные результаты были отмечены авторами лишь у 31% больных. В наших исследованиях антигены в фекалиях не бьии выявлены в реакции ТИА у 12 ив 100 больных описторхозом, а в реакции мТИА - лишь у 8. Можно предполагать, что более частое выявление антигенов O.felineus в фекалиях в реакция* ТИА и мТИА обусловлено использованием в них аутосыворотки, антитела которой обладают большей авидностью по отношению к искомым антигенам.

Помимо изучения чувствительности используемых реакций иммунитета, немаловажным является анализ их специфичности. В качестве группы контроля с применением ИФА, ТИА и мТИА были обследованы 23 человека (16 взрослых и 7 детей в возрасте до 2,5 лет), у которых на основании анамнестических, клинических и овоскопических данных исключалась инвазия описторхиса-ми. Из числа обследованных лишь у 1 ребенка была зарегистрирована положительная реакция мТИА, что позволяет в целом заключить, что у неин газированных людей изученные реакции иммунитета бывают отрицатель ньми.

В литературе имеются указания, что при применении тест-систем ИФА и РИГА, используемых для диагностики описторхоза,

в ряде случаев наблюдаются положительные реакции у больных эхинококковом, трихинеллевом, кдонорховом и фасциолеэом (Н.Е.Баллад и соавг., 1982; Я.А. Клебановская и соавт., 1981, А.Я.Лысенко и соавт., 1982; Ю.В.Теплухин и соавт., 1989; 5.31г1з1пЬа еЬ а1.,1990), что исследователи свяэывают с наличием перекрестнореагирующих антигенов у этих гельминтов и описторхисов.

Сыворотки крови 55 больных острым и хроническим опис-торхозом были исследованы в реакции ТИА и мТИА с применением антигенов широкого лентеца, аскариды человека и однокамерного эхинококка, - видов гельминтов, наиболее значимых для взрослого населения России. В реакции ТИА сыворотки крови больных описторхозом далеко нередко реагировали с антигенами других видов гельминтов: в 23,6% случаев - с антигеном эхинококка, в 10,9% - с антигеном широкого лентеца, в 25,5% - с антигеном аскариды. Более того, нередко реакция ТИА была положительной одновременно с антигенами нескольких видов гельминтов (эхинококка и аскариды,эхинококка и широкого лентеца и т.д.). В то же время, по данным В.Е.Мартыненко и соавт., 1983, П.Л.Смирнова и соавт., 1988, заболеваемость населения Новосибирской области зхинококкозом и дифиллоботриозом весьма низкая, ввиду чего полученные результаты реакций ТИА и мТИА можно расценивать как ложноположительные.

С применением антигенов описторхисов и широкого лентеца было обследовано 11 больных дифиллоботриозом, у которых на основании многократных копроовоскопических исследований описторхоз исключался. У всех больных реакция ТИА с антигеном широкого лентеца была положительной, но у 3 сыворотки крови одновременно прореагировали и с ог.:;сторхозным антигеном. Из 7 больных аскаридозом реакция ТИА с антигеном аска-

//

риды была положительной у всех больных, но у 5 человек она была положительной и с описторхозным антигеном.

Таким образом, можно предполагать наличие перекрестно-реагирующих антигенов у описторхисов, широкого лентеца, аскариды человека и однокамерного эхинококка. В свете этих данных возникает вопрос о специфичности реакции ТИА и мТИА в случаях положительной реакции сыворотки с надосадочной жидкостью фекалий, но при отсутствии специфических антител в крови.

Новосибирская область является ареалом не только O.fe-lineus, но и Methorchis bilis и. Methorchis intermedios. (Д.А.Размашкин, 1978; С.М.Соусь, 1976). Меторхисами поражаются карась и другие рыбы семейства карповых, являющиеся дополнительными хозяевами. По данным К.П.Федорова (1993), в рыбах семейства карповых с одинаковой частотой встречаются метацеркарии и описторхисов, и меторхисов. Вопрос о возможности инвазирования человека меторхисами давно обсуждается в литературе. Как указывает В.А.Гефтер (1968), население Канады, Аляски и Гренландии широко поражено Methorchis conjunc-tus.

Учитывая эти данные, в реакции ТИА были исследованы сыворотки крови 20 больных острым описторхозом и 44 - хроническим с применением антигенов O.felineus и М.bilis. Реакция ТИА с меторхозным антигеном была положительной у 9 из 20 больных острым описторхозом и у 1Е из 44 - хроническим. Однако с описторхозным антигеном сыворотки крови реагировали чаще и в больших разведениях, чем с меторхозным антигеном. У 9 больных острым описторхозом и у 9 больных хроническим сыворотки крови реагировали с двумя антигенами. Эти данные, возможно, свидетельствуют о наличии перекрестнореагирующих

антигенов у описторхисов и меторхисов или о приобретении сывороткой крови больных описторхозом способности неспецифически реагировать с антигенами других видов гельминтов.

Очевидно, что наличие перекрестнореагирующих антигенов у различных видов гельминтов, а также у гельминтов и их хозяев может быть причиной ложноположительных результатов при использовании в иммунодиагностике гельминтозов многокомпонентных (цельных) экстрактов паразитов. Поэтому очень актуальным представляется изучение антигенной структуры гельминтов с целью выделения их видоспецифичных антигенных компонентов.

Описторхоз виверры (возбудитель - 0.у1уегг1Ш) широко распространен в Таиланде. С применением иммуноблоттинга таи-ладскими учеными был проведен анализ антигенов 0.у1уегг1п1 и был выделен строго специфичный компонент соматического антигена с молекулярной массой 16 кДа.

В реакции иммуноблоттинга с применением сывороток крови 10 больных описторхозом и 10 неинвазированных лиц были изучены 3 антигена ОрХзМогсЬйз ГеПпеиэ: соматический (экстракт из марит описторхисов), метаболический (секретор-но-экскреторные продукты жизнедеятельности описторхисов) и антиген тегумента. Из нескольких антигенных компонентов О. ГеНпеиэ (с молекулярной массой 50 , 60, 70 и 100 кДа), реагировавших с сыворотками крови больных описторхозом, лишь соматический компонент с молекулярной массой 100 кЦа никогда не реагировал с сыворотками крови неинвазированных людей, ввиду чего он может представлять определенный интерес при разработке строго специфичных методов диагностики описторхо-за.

выводи

1. Недостаточная эффективность гельминтоовоскопических методов диагностики описторхоза в условиях малой интенсивности инвазии определяет целесообразность разработки реакций иммунитета для его распознавания.

2. Реакция ИФА отличается высокой диагностической ценностью лишь в период острой фазы описторхоза, в период же хронической фазы диагног может быть установлен менее, чем у 50% больных.

3. Для диагностики хронической фазы описторхоза предпочтительнее применение реакций иммунитета, обеспечивающих выявление антигенов описторхисов в фекалиях: ТИА с аутосы-вороткой и его иммуноферментной модицикации (мТИА).

4. При применении мТИА частота положительных реакций по сравнению с ТИА увеличивается на 15Z при хроническом описторхозе (р<0,05), и диагноз может быть верифицирован у всех больных острым описторхоэом и у 87,5Х - хроническим.

5. Двухэтапный характер постановки реакции мТИА определяет возможность ^выполнения 2-го этапа реакции на тех же чашках при сомнительных иди отрицательных результатах ТИА.

6. ТИА и мТИА могут быть использованы для диагностики как клинически выраженных, так и субклинических форм заболевания.

ч

7. Сыворотки крови больных описторхозом в реакциях ТИА и мТИА могут положительно реагировать с антигенами широкого лентеца, аскариды человека, однокамерного эхинококка и Methorchis bilis.

ZO

8. В иммуноблоттинге выявлен антигенный компонент 0р1э1Ьогс-Мз ГеНпеиэ с молекулярной массой 100 кДа, который с исключительным постоянством реагировал с сыворотками крови больных описторховом и не реагировал с сыворотками крови неинваэированных людей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В эндемичных по описторхозу очагах для диагностики описторхоза целесообразно применение реакций иммунитета, обеспечивающих возможность выявления секреторно-экскреторных антигенов описторхисов в фекалиях больных.

Из числа реакций иммунитета, используемых для диагностики описторхоза, предпочтение должно быть отдано реакциям ТИА и мТИА с аутосывороткой. 1-й этап лабораторной диагностики должен состоять в постановке ТИА, а при сомнительных или отрицательных ее результатах необходимо ставить мТИА на той же чашке.

2i

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Прокудина Н.И. Дохлова Н.И./ Клиника описторхоза и вопросы его диагностики.// Актуальные проблемы современной медицины. Тезисы докладов 53-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. Новосибирск, 1992. - С. 89.

2. Прокудина Н.И. Дохлова Н.И./ Диагностическая ценность тонкослойного иммунного анализа в диагностике описторхоза.// Тезисы докладов 54-й итоговой научной конференции студентов к молодых ученых. Новосибирск, 1993. - С. 81.

3. Прокудина Н.И. Дохлова Н.И./, Курдуков Г.П., Сердюков А.Е. Эффективность некоторых серологических методов диагностики хронического описторхоза. //Актуальные вопросы инфекционной патологии. Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 70-летив организации кафедры инфекционных заболеваний Иркутского МИ. - Иркутск, 1993. - С. 198-200.

4. НаумоеВ.А., Жевачевсхий Н.Г., Кузнецова В.Г., Покровская И.В., Хохлова Н.И., Белов Г.®. Применение тонкослойного иммунного анализа для выявления антигенов возбудителей вирусных, бактериальных и паразитарных заболеваний. //Актуальные вопросы развития военно-медицинской службы Сиб. Военного округа на современном этапе. - Новосибирск, 1994. - С. 90-91.

5. Прокудина Н.И. Дохлова Н.И./ Модифицированный метод тонкослойного иммунного анализа для диагностики описторхоза. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 1994. -№ 1. - С. 59-60.

6. Прокудина Н.И. Дохлова Н.И./ К вопросу о наличии перек-рестнореагирутеих антигенов у описторхисов и некоторых других гельминтов. // Научная сессия НИИ, посвященная 100-летию г. Новосибирска. - Новосибирск, 1994. - С. 174.

ЛЛ

7. Хохлова Н.И.,Худоногова Н.Г. Изменение клиники опис-торхоза и совершенствование лабораторных методов его диагностики. // Тевисы докладов 56-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 1995. - С.38.

8. Федоров К.П., Белов Г.Ф., Наумов В.А., Хохлова Н.И. Проблема трематодозов в Западной Сибири. //Паразиты и паразитарные болезни в Западной Сибири: Тезисы докл. 1-й научной конференции Новосибирского отделения паразитологического общества РАН. - Новосибирск, 1996, С. 95-96.

9. Хохлова Н.И., Хвощевская М.Ф., Водяницкая С.Н. Имму-ноанализ антигенов С^б^огсМб ГеПпеиэ.// Паразиты и паразитарные болезни в Западной Сибири. Тевисы докладов 1-й научной конференции Новосибирского отделения паразитологического общества РАН. - Новосибирск, 1996, С. 100.

10. Хохлова Н.И., Солопова Т;Б"., Баландина Е.Ю. Эффективность некоторых серологических методов в диагностике острого описторхоза. // Актуальные вопросы современной медицины. Тезисы докладов 6-й научно-практической конференции врачей 24-26 апреля 1996г. - Новосибирск,1996. - С. 439.

И. Хохлова Н.И. О специфичности реакций иммунитета у больных описторхозом.// Тезисы докладов 57-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. - Новосибирск, 1996. - С.

12. Глупов В.В., Хохлова Н.И., Хвощевская М.Ф., Водяницкая С.Н., ЮрдоваН.И. Применение имвдуноблоттинга для изучения антигенов ОрпШгсЛй Медицинская паразитология и паразитарные болезни / в печати /.

ЛЗ