Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Совершенствование методов количественного определения кислоты аскорбиновой в фармацевтическом анализе

На правах рукописи Зыкова Екатерина Владимировна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТЫ АСКОРБИНОВОЙ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ

АНАЛИЗЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2013

2 о го;! 2013

005062175

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Островский Олег Владимирович, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, заведующий кафедрой теоретической биохимии с курсом клинической биохимии

Оганесян Эдуард Тоникович, доктор фармацевтических наук, профессор, ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, заведующий кафедрой органической химии

Козлова Виктория Вячеславовна, кандидат фармацевтических наук, ФГБУ Пятигорский ГНИИ курортологии ФМБА России, старший научный сотрудник отдела изучения механизмов действия физических факторов.

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 10 июля 2013 года в Ю00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.09 ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Пятигорск, пр. Калинина, И).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан /9 2013 года.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Учёный секретарь диссертационного Совета

Компанцева Евгения Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из основных задач фармацевтической химии и фармации в целом, является совершенствование методик анализа ЛВ. Оценка качества фармацевтической продукции осуществляется на всех этапах производства ЛП [Арзамасцев А.П., 2006] и в значительной степени, зависит от надежности используемого метода анализа [Беликов В.Г., 2002].

Актуальность исследований, направленных на совершенствование методик анализа ЛВ, связана с введением на фармацевтических предприятиях России правил надлежащей производственной практики (ГОСТ Р 52249-2004) и изменением подхода к контролю качества ЛП и ЛРС. Повышение требований к чувствительности, точности, правильности, воспроизводимости, технологичности анализа, заставляют пересматривать и совершенствовать уже имеющиеся методики, а так же разрабатывать новые.

Объектом настоящей работы была выбрана кислота аскорбиновая, поскольку с одной стороны, она является веществом с хорошо изученными свойствами и для нее разработаны многочисленные методы исследования [ГФ X, ГФ XI, ГОСТ 30627.298], с другой стороны - это компонент многих ЛП и ЛРС, которые применяются для профилактики и терапии широкого спектра заболеваний [Борец В.М., Казимирко В.К., 2004; Корытова Л.И., 2004].

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время, интерес для рутинной фармацевтической практики представляют спектрофотометрические методики, которые характеризуются достаточной для анализа чувствительностью, точностью, простотой выполнения и легко автоматизируются [Арзамасцев А.П., 2000; Беликов В.Г., 2002]. Эти методы включены в Государственную фармакопею, в Международную фармакопею и национальные фармакопеи многих стран. Единственным фармакопейным спектрофотометрическим методом анализа КА, является метод на основе натриевой соли кислоты фосфорномолибденовой (ФМ-Ыа), рекомендованный для экстракта плодов шиповника (ФС 42-32-5-96). Однако, этот метод неудобен для использования в рутинной фармацевтической практике, основной реагент нестабилен и требует ежедневного приготовления.

При анализе сложных многокомпонентных образцов, предпочтение отдается высокоспецифичным хроматографическим или электрофоретическим методам [Каменцев Я. С., 2002; Комарова Н.В., 2008; г.СЫк, 2007]. Так, фармакопеи Британии, Японии, США рекомендуют использовать для анализа растительного сырья содержащего КА, только высокоспецифичные хроматографические методы (ВЭЖХ). В отечественной фармакопейной практике нам не удалось найти такой метод анализа КА, несмотря на то, что активно разрабатываются общие фармакопейные статьи на высокоселективные методы.

Для количественного определения КА в субстанции КА, ЛП и ЛРС ГФ рекомендуется йодатометрическое титрование и титрование с 2,6 -дихлорфенолиндофенолятом натрия. Несомненно, эти методики доступны, просты в исполнении, не требуют специализированного оборудования и подготовки специалистов, характеризуются хорошими аналитическими показателями, но пригодны только для анализа однокомпонентных образцов или образцов с простой матрицей. Недостатками всех титриметрических методов, является предварительная (иногда ежедневная) стандартизации титранта и неавтоматизированное (визуальное) определение конечной точки титрования, что увеличивает погрешность. Часто, необходимо провести анализ окрашенных экстрактов, для этого, пробы необходимо предварительно подвергнуть хроматографической очистке или удалить пигменты экстракцией органическими растворителями, что достаточно трудоемко.

Целью настоящей работы является оценка применимости титриметрических, спектрофотометрических и электрофоретических методик для анализа КА в субстанции, ЛП и ЛРС.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить возможность применения общепринятых методов для количественной оценки КА в лекарственных препаратах и ЛРС, учитывая требования современных стандартов и ГОСТов.

2. Адаптировать спектрофотометрическую методику на основе свободной кислоты фосфорномолибденовой для количественного определения КА.

3. Определить основные метрологические характеристики модифицированной методики и возможность ее использования для количественной оценки КА в лекарственных средствах и препаратах.

4. Изучить влияние сопутствующих и вспомогательных веществ, содержащихся в лекарственных препаратах и растительном сырье, на результаты количественного определения КА.

5. Разработать условия для количественного определения КА с использованием метода капиллярного электрофореза.

6. Оценить валидность методик КЗЭ и МЭХ для анализа КА в ЛП и JIPC. Научная новизна работы. Впервые была проведена сравнительная оценка

общепринятых методов анализа КА в лекарственных препаратах и ЛРС. Показана необходимость проведения процедуры валидации используемых фармакопейных методов анализа и их возможного пересмотра в соответствии с современными нормами и стандартами на примере анализа КА в ЛП и ЛРС.

Впервые изучено влияние моно- и дисахаридов, органических кислот, флавоноидов, дубильных веществ, натрия сульфита и натрия гидросульфита на правильность определения КА двумя спектрофотометрическими методиками.

Впервые предложена модифицированная методика спектрофотометрического анализа КА на основе реакции с фосфорномолибденовой кислотой и показаны ее возможности и ограничения для анализа КА в ЛП и ЛРС.

Обоснована возможность замены методики йодатометрического титрования на спектрофотометрическую методику для анализа КА в растворе для инъекций.

Предложено использование сепарационных методов анализа, которые позволяют получить результаты, удовлетворяющие требования НД на препараты, содержащие КА.

Впервые проведена валидационная оценка спектрофотометрических и электрофоретических методик количественного определения КА в соответствии с требованиями международных документов ISO 5725/ ICH, ГОСТ Р 52249-2004 и ГОСТ Р 52249-2009. Показано, что метрологические характеристики сепарационных методов при использовании сложного лабораторного оборудования, могут удовлетворять всем требованиям для включения их в ФС.

Теоретическая и практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований:

Установлено, что прямые спектрофотометрические методы определения КА характеризуются высокой точностью результатов только при анализе простых

5

лекарственных форм. Изучение влияния компонентов матрицы на результаты определения КА показало, что методы, основанные на окислительно-восстановительных свойствах КА, не могут быть признаны адекватными для количественной оценки КА в многокомпонентных образцах. Тем не менее, для конкретного образца известного состава, может быть подобран метод или способ пробоподготовки, который позволит проводить анализ с минимальной погрешностью.

Разработана методика спектрофотометрического определения КА в субстанции и инъекционных растворах с применением ФМК.

Разработана унифицированная методика капиллярного электрофореза для количественного определения КА в ЛП и ЛРС. Показана возможность использования ФК и ПАБК в качестве внутреннего стандарта.

Доказана эффективность применения электросепарационных методов для анализа КА в многокомпонетных образцах.

Проведена апробация методики спектрофотометрического определения КА в инъекционных формах в аналитической лаборатории Центра контроля качества лекарственных средств ГУЛ «Волгофарм» и ООО «Научно-производственная фирма Фармация». Результаты диссертационного исследования включены в материалы лекций и используются в учебных и научно-исследовательских процессах учебно-производственной аптеки ВолгГМУ и кафедре фармацевтической и токсикологической химии ВолгГМУ.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования явились статьи Европейской, Японской, Американской Фармакопеи и ГФ XI, XII, ОСТ 42-510-98 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств GMP» (раздел «Валидация»), Государственный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, Национальный стандарт России ГОСТ Р 52249-2004, ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств», руководство международной конференции по гармонизации (ICH), труды отечественных и зарубежных ученых [B.JI. Багировой, 2007; Л.Р. Давлетбаева, P.P. Нигматуллина, 2004].

В работе использовалось следующее оборудование: спектрофотометр Helios

Alpha (США), жидкостный хроматограф Shimadzu (30425-05), прибор для

капиллярного электрофореза НРСЕ Agilent Technologies (G1602A), весы

6

аналитические AB 120-01 (Веста®, Россия, 36468-07), термостат воздушный ТС-80 (Россия), термостат водяной ВБ-2 (Россия), автоматические дозаторы фиксированного и переменного объема производства «Ленпипет» (Россия) и "Thermo Labsystems" (Финляндия), мерная стеклянная посуда, бюретки, посуда из пропилена (1, 2 класса точности). Химические реактивы соответствовали квалификации ХЧ (содержание основного вещества более 99%), субстанция КА - требованиям, предъявляемым к PCO.

Для количественного определения КА в ЛП и ЛРС использовали два титриметрических метода: с 2,6-ДХФИФ и КЮ3, как методы, рекомендованные ГФ для анализа ЛП и ЛРС, спектрофотометрический метод с натриевой солью фосфорномолибденовой кислоты (ФС 42-3285-96), модифицированная методика на основе свободной фосфорномолибденовой кислоты, метод ВЭЖХ, высокоспецифичный спектрофотометрический ферментативный метод на основе аскорбатоксидазы и метод КЭ.

На защиту выносятся:

• Результаты разработки методики спектрофотометрического количественного определения КА с использованием ФМК для анализа субстанции КА и инъекционного раствора.

• Результаты исследования влияния сопутствующих веществ на правильность количественного определения КА в многокомпонентных образцах.

• Результаты разработки условий и валидационные характеристики для методики количественного определения КА с помощью капиллярного электрофореза.

• Результаты количественного определения КА в лекарственных препаратах и ЛРС с помощью метода капиллярного электрофореза.

Степень достоверности и апробация работы. Для оценки степени достоверности измерений, показателей точности и характеристик погрешности руководствовались рекомендациями (МИ 1317—2004; РМГ 62—2003; РД 50-453— 84; и ГОСТ Р 52249-2009), неопределенности —ГОСТ Р 54500.3 - 2011. Количество измерений для расчета аналитических характеристик определялось рекомендациями ГФ XI, «Руководством по валидации методик анализа лекарственных средств

7

(Методические рекомендации)» - 2007 и РМГ 76-2004 ГСИ (Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа). Всего было выполнено более 10 тысяч измерений.

Обработка результатов исследования проводилась согласно требованиям ГФ и рекомендациям Международной конференции по гармонизации ICH с использованием встроенных функций программы MC Excel (среднее значение, стандартное отклонение, стандартная ошибка, 95% доверительный интервал, медиана) и программы Stastitica 6,0 (StatSoft).

Работа выполнена в рамках темы НИР ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России «Изучение свободно-радикальных процессов на различных уровнях организации живой материи в норме и при патологии» и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 2 от 14 октября 2009 г.).

Основные теоретические и практические результаты диссертации опубликованы в 11 статьях и докладах, среди которых 3 публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК. Результаты работы защищены рационализаторским предложение на использование спектрофотометрического метода для количественного определения кислоты аскорбиновой с использованием свободной кислоты фосфорномолибденовой (Принято Волгоградским государственным медицинским университетом 22.12.2008).

Основные положения работы докладывались и обсуждались на ежегодных научных конференциях Волгоградского государственного медицинского университета «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» в 2005-2007 гг., XIX Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2007), XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008), «Перспективные разработки науки и техники» (Польша, 2011), «Актуальные проблемы современной науки» (Польша, 2012).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 153 страницах текста и состоит из введения, обзора

литературы, двух разделов посвященных результатам собственных исследований,

заключения, выводов, списков используемых сокращений, литературы и иллюстративного материала. Список используемой литературы включает (180) источников, из них (91) отечественных и (89) иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами и 38 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

Анализ литературных данных, сделанный в первой главе, отражает актуальность и значимость работы.

Второй раздел посвящен собственным исследованиям по разработке и валидации спектрофотометрической методики на основе свободной кислоты фосфорномолибденовой, а также оценке влияния сопутствующих веществ пробы на результаты этой методики. Нами была проведена модификация методики анализа сухого экстракта шиповника (ФС 42-3285-96). Основные изменения заключались в замене натриевых солей ФМК на свободную кислоту для повышения устойчивости реактива и технологичности (безопасности) его приготовления, изменение температурного режима реакции и концентрации кислоты серной в рабочем реактиве, так как на процесс восстановления ФМК большое влияние оказывает кислотность раствора. Рекомендуемый уровень концентрации кислоты серной для создания оптимальной кислотности среды составляет 0,4-0,6 М, более сильная кислотность приводит к растворению «молибденовой сини». В тоже время, более щелочная среда способствует переходу М0О3 —► Мо(0í I)<. Поэтому состав предложенного нами варианта реактива представлял собой 4 мМ раствор ФМК в 0,6 М кислоте серной. Восстановительная активность КА существенно зависела и от температуры инкубации. При кипячении проб в течение Юмин на водяной бане (98°С, метод по ФС), восстановительная способность КА была достоверно выше, чем при 90 минутной инкубации температурах 20°С и 37°С (метод Prieto). Коэффициент вариации (CV, %) для проб, инкубирующихся при 20°С составил 10,9%, что неприемлемо для спектрофотометрической методики количественного определения.

Таким образом, протокол модифицированной методики анализа КА с применением кислоты фосфорномолибденовой выглядел следующим образом:

Таблица 1 - Реагенты и техника проведения исходного и модифицированного метода

Исходный метод (ФМ-Na) Модифицированный метод (ФМК)

Проба

0,5 мл 0,1 мл

0,5 мл Рабочий реагент 1 мл

0,025% раствор На2НР04 0,4% раствор молибдата аммония 0,875М раствор кислоты серной 4 мМ раствор кислоты фосфорномолибденовой 0,6 М раствор кислоты серной

Кипящая водяная баня 10 минут Термостатирование при 37 °С 90 мин

Быстрое охлаждение при 0°С (проба -

помещается в лед)

Фотометрирование проб

Для определения параметров стабильности мы проанализировали один и тот

же рабочий реактив, применяемый в нескольких аналитических сериях. В качестве исследуемого образца использовались растворы КА в концентрациях 0,025-1мМ. Исходя из значений Мит, определяли показатель существенной разницы - критерий Стьюдента (t). На основании величины t и числа наблюдений по таблице показателей существенной разницы (t) определяли вероятность различия (Р). Проведенные расчеты показали, что реактив ФМК стабилен в течение, по крайней мере, 4-х месяцев при хранении его при комнатной температуре. По литературным данным, срок хранения рабочего реактива ФМ-Na составляет от 1 до 5 дней (ФС 42-3285-96).

На следующем этапе работы, согласно рекомендациям руководства ICH (2008) и ГФ XI, были рассчитаны основные валидационные параметры для модифицированного метода с ФМК, которые сравнили с таковыми для спектрофотометрического метода с ФМ-Na (табл.2).

Таблица 2.- Основные валидационные параметры модифицированного и базового методов анализа КА_

Параметр ФМК ФМ-Na

Коэффициент чувствительности 0,42±0,2x10-2 1,575±3,6x10-2

ЭЬ, мМ 0,06 0,06

С>Ь, мМ 0,19 0,19

Линейность, К2 0,9997 0,9934

Воспроизводимость, Критерий Фишера (Б) 1,80 1,36

F-габл. 2,98

Правильность, Критерий Стьюдента (1) 0,82 0,88

Wv 2,26

Повторяемость, СУ(%) 2,08 | 2,28

Установлено, что методика на основе свободной ФМК характеризуется высокой чувствительностью к содержанию КА в пробе и низкой погрешностью определения при работе в широком диапазоне концентраций. Замена фосфомолибдата натрия на свободную кислоту фосфорномолибденовую в составе рабочего раствора позволила значительно повысить стабильность реактива при хранении (рабочий раствор стабилен в течение 4 месяцев и требует однократной калибровки). Исключение из процедуры анализа этапа кипячения проб с кислотой серной, повышает безопасность и простоту предлагаемого метода относительно метода с ФМ-№. Однако, несмотря на хорошие аналитические характеристики модифицированной методики, валидация которой проведена по субстанции КА, применение ее для реальных ЛП или ЛРС может быть затруднительно и приводить к искажению результатов анализа, поскольку последние являются многокомпонентными образцами со сложными матрицами. Поэтому необходимо определить спектр веществ, которые будут оказывать влияние на правильность проводимого анализа. Для этого были созданы модельные системы, содержащие компоненты предполагаемых объектов анализа (углеводы, органические кислоты, дубильные вещества и флавоноиды, как сопутствующие вещества ЛП растительного происхождения и ЛРС, стабилизаторы - как компоненты инъекционных форм КА) в концентрациях, сопоставимых с таковыми в ЛП и сырье.

Установлено, что метод ФМК может применяться в образцах, содержащих в матрице лактозу, органические кислоты и их соли (натрия, калия тартрат, натрия оксалат, натрия цитрат, кислота янтарная, кислота яблочная) и стабилизаторы (натрия гидросульфита и натрия сульфита). Таким ЛП, содержащим компоненты этой группы, может являться раствор КА для инъекций.

Для подтверждения возможности применения методики в анализе раствора КА для инъекций, был проведен анализ полной модельной смеси (состав 5% раствора КА для инъекций). Полученные результаты сравнили с результатами йодатометрического титрования, которое рекомендовано ГФ в качестве метода анализа инъекционной формы КА (табл. 3).

Таблица 3. - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики с ФМК и йодатометрического титрования при анализе КА в модельной системе

Метод Правильность Воспроизводимость, % при Р=0,95 Повторяемость,

1 (табл-) ^ВЫЧ Р (табл.) тг 1 выч СУ%

ФМК 2,26 1,28 2,98 1,24 2,67

КЮ3 2,26 0,98 5,05 1,7 0,75

На следующем этапе работы, проведя анализ КА в ЛП и ЛРС, мы еще раз подтвердили заключение, сделанное при изучении модельных систем, что методы, основанные на окислительно-восстановительных свойствах КА, чувствительны к присутствию дополнительных компонентов матрицы и не могут быть признаны адекватными для количественной оценю! КА в многокомпонентных образцах (таблица 4).

Таблица 4. - Результаты анализа КА в виде % относительно результатов одного из референтных методов (ферментативное определение).

Образец Спектрофотометрические методы Рекомендуемый фармакопейный метод

Ферментативный метод ФМК ФМ-№

2,6-ДХФИФ КЮ3

Плоды шиповника: экстракция кислотой соляной, % 100±5,7 132,5±1,5* 204,1 ±1,3* 106,7±1,8 -

Плоды шиповника: водная экстракция, % 100±4,4 362,5±1,2* 375,0±1,1* 103,5±0,5 -

Сироп плодов шиповника, % 100±2,5 143±2,6* 190±2,6* 122±2,7* ■

Раствор для инъекций, % 100±1,5 102,8±1,7 110±1,2* - 98,9±0,15

Аскорутин, % 100±3,2 122,7±6,4* 121,4±3,5* - 106,9±3,7

*- р<0,01- по отношению к результатам ферментативного метода

Тем не менее, для конкретного объекта можно подобрать метод или провести

пробообработку, которые позволят в конкретных условиях работать с минимальной

погрешностью определения.

Таким образом, универсальными методами для количественного определения

КА в ЛП и ЛРС остаются методы, способные разделять компоненты проб или

проявлять высокую специфичность относительно анализируемого вещества.

12

Традиционно, к таким методам относился метод ВЭЖХ, однако в последнее десятилетие, в фармацевтическую практику активно внедряется метод капиллярного электрофореза. Капиллярный электрофорез, как и ВЭЖХ, позволяет одновременно определять КА в присутствии других компонентов. В то же время преимущества КЭ над хроматографическими методами заключаются в его высокой эффективности, малом расходе реактивов и отсутствии дорогих хроматографических колонок. Кроме того, в составе ГФ XII планируется общая фармакопейная статья на этот метод. Поэтому, в настоящее время, весьма актуальными и перспективными являются работы по развитию использования этого метода для анализа ЛП и ЛРС.

Третий раздел работы содержит результаты разработки и валидации методики капиллярного электрофореза, а так же результаты анализов субстанции КА, лекарственных форм и растительного сырья. Выбор условий для проведения КЭ проводился согласно литературным рекомендациям [ГОСТ 52441 - 2007; Bowry V.W., 1993; Goodman, 2002 и др.] и собственным исследованиям (выбор времени анализа, температуры, параметров ввода пробы, длины капилляра, внутреннего стандарта). Методика КЭ была валидирована согласно рекомендациям ICH по следующим показателям: линейность, прецизионность (повторяемость), специфичность и точность (таблица 5).

Таблица 5. - Валидационные характеристики методики капиллярного электрофореза для количественного определения КА

Характеристики Методика определения КА

КЗЭ МЭКХ

Диапазон линейности, мМ 0,1-1 0,05-1

Коэффициент детерминации, Я2 0,9997 0,9999

Повторяемость, (%) 1,1 1,8

Точность, II (%) 99,5-101,7 98,3-101,9

Специфичность Соответствие электрофоретических подвижностей; UV-VIS Спектр пика

Анализ КА проводился с использованием системы капиллярного электрофореза фирмы Agilent Technologies (G1601A) с кварцевым капилляром диаметром 50мкм и общей длиной 24,5 или 40 см. Мобильная фаза представляла собой раствор 25 мМ раствора тетрабората натрия или смесь 25 мМ раствора тетрабората натрия и 50 мМ раствора SDS (додецилсульфат натрия). Анализ проводили при температуре 25°С и

напряжении +20 кВ. Вещества детектировали спектрофотометрически при длине волны 254 нм.

Линейность результатов и аналитическая область методики устанавливалась путем статистической обработки выборок, полученных в результате количественного анализа 3 модельных проб на 5 уровнях концентрации в диапазоне 0,1-1мМ КА для КЗЭ (рис. 1А) и в диапазоне 0,05-1мМ КА для варианта МЭХ (рис. 1Б).

Рисунок 1. Зависимость площади под пиком и концентрации КА (мМ) А) для КЗЭ, Б) для МЭХ.

Для оценки правильности методик использовали критерий Стыодента. Рассчитанный показатель составлял 0,62 для КЗЭ и 1,5 для МЭХ, что ниже критического значения 2,09 при вероятности Р=0,95. Поэтому, можно говорить об отсутствии систематической ошибки методики.

Для оценки воспроизводимости применяли критерий Фишера (Р-критерий). Для КЗЭ и МЭХ рассчитанные значения Б-критерия были меньше табличного значения (Ртабл = 3,32) и составляли 2,47 и 2,15 соответственно.

Предел количественного обнаружения (ПКО) определялся путем анализа образцов с известной концентрацией аналита. Устанавливался минимальный уровень КА в исследуемой пробе, при котором возможна регистрация и идентификация гшка, для последующей интерпретации количественного содержания с приемлемой правильностью. Для метода капиллярного зонного электрофореза ПКО составил 16,6 мг/л. Эффективным подходом к повышению чувствительности метода стало использование буферного раствора, содержащего додецилсульфат натрия (БОв). Присутствие БЭБ в буфере приводит к образованию мицелл с локально высокой концентрацией аналита. Применение данной методики (мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии) позволило снизить предел обнаружения в два раза (8,8 мг/л). Дальнейшее снижение ПКО возможно при использовании капилляров с высокочувствительными детекторами.

А

и) »1

-сзш

Количественное определение КА

проводили в ЛРС (плоды шиповника и листья

бархатцев), растительных препаратах и их

экстрактах (сироп плодов шиповника, 8 2 '52 ;

витаминный сбор №2), растворе КА для

■ ■ ■ ■ ^ ■ ■ ■ - ——а>' ' ' инъекций и препарате «Аскорутин» с помощью

а 5 одного из вариантов КЭ - МЭХ. Для каждой

Рисунок 2- Электрофореграмма

проб (внутренний стандарт ФК): пробы регистрировали не менее двух а - плоды шиповника, ■

6 - сироп плодов шиповника электрофореграмм в тех же условиях анализа, при которых была проведена градуировка. За результат анализа принимали среднеарифметическое значение двух параллельных измерений. Так, при анализе раствора КА для инъекций и драже КА удалось получить четкие пики со стабильно хорошим разрешением, что позволяет точно идентифицировать и количественно определить КА. Однако, при работе с лекарственными формами растительного происхождения (сироп и экстракт плодов шиповника) были выявлены ограничения рабочей методики, на полученных электрофореграммах пик, соответствующий феруловой кислоте (рис. 2а и рис. 26) имел недостаточно четкую границу с базовой линией. Это может приводить к погрешности при оценке площади пика. Широкие сглаженные границы пика могут свидетельствовать о присутствии феруловой кислоты в самих анализируемых пробах, поскольку она имеет растительное происхождение. Этот факт делает неприемлемым её использование в качестве внутреннего стандарта. В качестве альтернативы феруловой кислоте была предпринята попытка использовать п-аминобензойную (ПАБК) и сульфосалициловую кислоты (ССК).

При работе с кислотой сульфосалициловой в образцах ЛРС, нам не удалось получить ее четкие пики при данных условиях анализа, на пик, принадлежащий ССК, накладывался дополнительный пик, и делало невозможным оценку его площади и использование ССК в качестве внутреннего стандарта. При использовании ПАБК были получены четкие пики со стабильно хорошим разрешением, как при анализе синтетических препаратов КА, так и при анализе лекарственных форм растительного происхождения (рис. 3).

Ж « Я|Я|

Г1~ ---

и

А,— 2 2В Б. 08 «•« 3 «

Рисунок 3. Электрофореграммы: А. плодов шиповника; Б. раствор КА для инъекций (внутренний стандарт ПАБК).

Часто, для разделения веществ, характеризующихся близкими значениями электрофоретической подвижности, следует увеличить длину капилляра, чтобы успели сформироваться зоны этих веществ. При переходе на длинный капилляр (40 см), пики КА и ПАБК хорошо разделялись (Рис.4), однако время анализа увеличилось (более чем в три раза), а эффективность методики снизилась (число теоретических 180000), поэтому пик КА в образцах растительного происхождения, нам идентифицировать не удалось. При работе с синтетическими препаратами (раствор для инъекций) эту проблему можно было исправить за счет уменьшения кратности разведения образца (вносить более концентрированный образец). Для ЛРС, масса навески уже была максимальной и составляла 20 г, согласно рекомендациям ГФ.

тАи| КА

,51

12.5-1

,01 7.5-3

н

2.5-1

о4-•.........

2 4 6 в 10

Рисунок 4. Электрофореграмма совместного определения КА и ПАБК в модельной системе при использовании капилляра 40 см Для повышения чувствительности мы увеличили время ввода пробы, однако это не дало ожидаемого результата. Поэтому, мы изменили оба параметра ввода пробы (время и давление). При введении пробы в течение 10 секунд под давлешгем 30 мбар нам удалось добиться необходимой чувствительности для анализа КА в растительных объектах (Рис. 5).

Рисунок 5. Электрофореграмма пробы сиропа плодов шиповника и спектр пика КА

Для подтверждения и идентификации пика КА в исследуемых образцах, были сняты спектры на вершине пика-претендента. Все спектры исследуемых пиков совпадали со спектром пика стандартного раствора КА.

Оптимальными условиями для анализа КА методом КЭ являются: кварцевый капилляр 50 мкм х 40 см или 50 мкм х 24,5 см, ведущий электролит рН 9,3 (смесь 25мМ раствора тетрабората натрия и 50 мМ раствора 8135), напряжение +20 кВ, температура 25°С. Ввод пробы с длинного конца капилляра в течение 3 сек при давлении 50 мбар или 10 сек * 30 мбар (для капилляра 40 см). Длина волны детекции 254 нм. Внутренний стандарт ПАБК или ФК (для искусственно синтезированных ЛП). Результаты количественного анализа КА в ЛП и ЛРС, полученные с помощью этой методики (капилляр 50 мкм ><40 см) представлены в сводной таблице 6.

Таблица 6 - Результаты анализа КА в ЛП и ЛРС

Анализируемый образец Капиллярный электрофорез Спектрофотометри-ческие методы Рекоменд. Фармакопейный метод

Внутренний стандарт ФМК ФМ-Ыа

ФК ПАБК

Плоды шиповника (мг/100 мг сырья) 4,35±0,09 4,9±0,05 7,63±0,05 4,4=0,08

Сироп плодов шиповника (г/л) - 4,05±0,08 5,57±0,1 7,41±0,1 4,7±0,03

Витаминный сбор №2 (мг/100г сырья) 3,53±0,6 не изучали не изучали 4,23±0,1

Листья бархатцев (мг/100 мг сырья) - 3,7±0,3 не изучали не изучали нет

Раствор для инъекций, мг/мл 49,9± 0,3 51,1±0,9 52,1±0,9 5б,0±0,6 49,9±0,3

Аскорутин, мг 49,4± 0,2 49,1±0,7 60,1±3,1 59,5±1,7 52,4±0,5

Количество КА рассчитывали по градуировочному графику, учитывая внутренний стандарт ПАБК или ФК. Параллельно определяли содержание КА в тех же пробах рекомендуемыми фармакопейными методами и спектрофотометрическими методами с ФМК и ее натриевой солью. Для витаминного сбора №2 и сиропа плодов шиповника рекомендуемым методом являлось титрование с 2,6-ДХФИФ, для остальных объектов - йодатометрическое титрование. Подготовку проб проводили согласно рекомендациям ГФ.

Представленная методика КЭ может использоваться для анализа КА в ЛРС (плодах шиповника, сиропе плодов шиповника, витаминном сборе №2, листьях бархатцев) и ЛП синтетического происхождения, что подтверждается значениями прецизионности (Б1Ш, %): шиповник, плоды - 1,55; шиповник, сироп - 1,89; витаминный сбор - 1,72; «аскорутин» - 1,97 и раствор для инъекций - 1,92.

Таким образом, показана применимость методики капиллярного электрофореза для количественного определения КА в ЛРС и ЛП. При анализе синтетических ЛП в качестве внутреннего стандарта может применяться феруловая кислота или ПАБК, тогда как для лекарственных препаратов растительного происхождения следует использовать только ПАБК. Для снижения длительности анализа (до 3-4 минут) следует использовать короткие капилляры (24,5см), при этом будет наблюдаться и увеличение эффективности. Однако, для разделения и анализа многокомпонентных проб, содержащих вещества с близкими значениями электрофоретических подвижностей, следует использовать более длинные капилляры (40 см), чтобы успели сформироваться зоны этих веществ, но при этом будет наблюдаться снижение чувствительности, которую можно повысить, увеличив объем вводимой пробы (ввод пробы 10 сек*30 мбар).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для количественной оценки КА в многокомпонентных образцах со сложной

матрицей, следует применять только высокоспецифичные или сепарационные методы

анализа. Метод КЭ является дополнением и в то же время, альтернативой ВЭЖХ,

характеризуется высокой эффективностью, малым расходом недорогих реагентов и

простотой эксплуатации, капилляры долговечны и легко регенерируются.

Несомненно, как и любой инструментальный метод, метод КЭ предполагает

материальные затраты на приобретение оборудования, однако такое оборудование

18

является универсальным. Предложенная методика КЭ может быть использована для контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов, содержащих КЛ (плоды и сироп шиповника, витаминный сбор №2, листья бархатцев, растворов КА для инъекций и препарата «Аскорутин»).

Для количественного определения КА в инъекционных растворах можно использовать более дешевый и доступный спектрофотометрический метод с ФМК. На основании результатов работы, сделаны следующие выводы:

1. Сравнительная оценка спектрофотометрических и титриметрических методик для количественного анализа КА в ЛП и ЛРС показала, что для количественного определения КА в многокомпонентных образцах малопригодны методы, основанные на ее окислительно-восстановительных свойствах. Анализ КА в многокомпонентных ЛП и ЛРС требует использования современных сепарационных методов.

2. Разработаны условия для проведения спектрофотометрического анализа КА с использованием ФМК. Рабочий реагент: 4 мМ раствор кислоты фосфорномолибденовой в 0,6 M растворе кислоты серной. Инкубирование проб 90 минут при 37°С.

3. Методика спектрофотометрического определения КА с применением свободной фосфорномолибденовой кислоты характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью, хорошей повторяемостью (2,9% при анализе растворов с концентрацией КА 0,25 мМ; 2,4% - с концентрацией 0,5 мМ и 1,8% при работе с 1 мМ растворов КА). Калибровочный график линеен, значение коэффициента детерминации составило 0,999, предел обнаружения - 0,02 мМ КА в пробе. Стабильность рабочего реактива в 20 раз превышает этот показатель для рабочего реактива метода с натриевой солью форномолибденовой кислоты. Установлено, что методика валидна для анализа КА в растворе для инъекций.

4. Углеводы (глюкоза, сахароза, фруктоза и лактоза), флавоноиды и дубильные вещества снижают правильность результатов анализа КА в ЛРС с использованием спектрофотометрических методик на основе ФМК и ее натриевой соли, что ограничивает области применения этих методик.

5. Показана возможность использования спекгрофотометричсской методики с ФМК для анализа КА в присутствии стабилизаторов (натрия сульфита), входящих в состав инъекционных растворов КА.

6. Разработаны условия и обоснованы параметры пригодности системы для электрофоретического определения КА в ЛП и ЛРС. Кварцевый капилляр 50 мкм х 24,5 см или 50 мкм х 40 см, ведущий электролит pH 9,3 (смесь 25мМ раствора тетрабората натрия и 50 мМ раствора SDS), напряжение +20 кВ, температура 25°С. Ввод пробы с длинного конца капилляра в течение 3 сек при давлении 50 мбар или 10 сек * 30 мбар (для капилляра 40 см). Длина волны детекции 254 нм. Внутренний стандарт ПАБК или ФК (для искусственно синтезированных ЛП).

7. Определены валидационные характеристики методики КЭ для анализа КА. Диапазон линейности составил 0,05-1 мМ, коэффициент регрессии - 0,999, рассчитанные значения критериев Стьюдента и Фишера составили 1,5 и 2,15, соответственно. Предел количественного определения КА - 8 мг/л. Показано, что метод КЭ может быть валидирован для контроля качества ЛРС и лекарственных препаратов, содержащих КА.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оптимизация спектрофотометрического метода для количественного определения аскорбиновой кислоты в лекарственных формах / Е.В. Зыкова, В.Е Веровский., Г.П. Дудченко, О.В. Островский // Химико-фармацевтический журнал. - 2009,-Т43, № 6. - С. 63-65.

2. Определение аскорбиновой кислоты в лекарственных препаратах методами капиллярного зонного электрофореза и мицелллярной электрокинетической хроматографии / Е.В. Зыкова, Н.Г. Сандецкая, В.Е Веровский., О.В. Островский // Химико-фармацевтический журнал. - 2010.- Т.44, №8. - С. 39-41.

3. Влияние химических веществ, содержащихся в биологических пробах и лекарственных препаратах, на результаты количественного определения аскорбиновой кислоты / Е.В. Зыкова, Г.П. Дудченко, В.Г. Зайцев, О.В. Островский//Вестник ВолГМУ,-2009. - №4. - С. 103-106.

4. Оценка правильности количественного определения кислоты аскорбиновой в плодах шиповника тремя колориметрическими методами / Е.В. Зыкова, Г.П. Дудченко, В.Г. Зайцев, Е.В. Денежко, О.В. Островский // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр,-Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 254-255.

5. Зыкова, E.B. Оценка возможности применения спектрофотометрического метода на основе свободной фосфорномолибденовой кислоты для количественного определения аскорбиновой кислоты в инъекционных формах / Е.В. Зыкова, Г.П. Дудченко, В.Г. Зайцев, О.В. Островский // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Вып. 64: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - С. 280-281.

6. Зыкова, Е.В. Использование метода капиллярного электрофореза для количественного анализа аскорбиновой кислоты в витаминных сборах / Е.В. Зыкова, О.В. Островский // Перспективные разработки науки и техники. Материалы 7 международной научно-практической конференции. Вып. 48. -Польша, 2011. - С. 44-46.

7. Зыкова, Е.В. Анализ аскорбиновой кислоты в лекарственных препаратах растительного происхождения с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии / Е.В. Зыкова, Г.П. Дудченко, О.В. Островский О.В. // Актуальные проблемы современной науки. Материалы 8 международной научно-практической конференции. Вып. 44. - Польша, 2012. -С.63-66.

8. Зыкова, Е.В. Влияние органических кислот и фенольных соединений на результаты количественного определения аскорбиновой кислоты / Е.В. Зыкова, JI.B. Самсопова // Материалы 10 региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2005. - С.26-27.

9. Зыкова, Е.В. Оценка влияния сопутствующих веществ пробы на результаты количественного определения аскорбиновой кислоты различными методами) Е.В.Зыкова // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии. Материалы 19 зимней молодежной научной школы. - Москва, 2007.-С. 52-52.

10. Зыкова, Е.В. Влияние органических веществ на результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в пробе / Е.В. Зыкова, A.B. Мекеня, JI.B. Самсонова // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины. Материалы 64-й открытой научной конференции. - Волгоград, 2006. -С. 68-69.

11. Зыкова, Е.В. Влияние стабилизирующих веществ на результаты количественного определения аскорбиновой кислоты / Е.В. Зыкова // Материалы 13 региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград, 2008. - С.36-38

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

КА- кислота аскорбиновая

ЛРС- лекарственное растительное сырье

АОС - антиоксидантная система

ЛВ- лекарственное вещество

ЛП- лекарственный препарат

ФК - феруловая кислота

ПАБК- п-аминобензойная кислота

ДАК- дегидроаскорбиновая кислота

дкгк- дикетогулоновая кислота

мтт- 3-(4,5-диметилтетразолин-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

РМБ - 5-метилфеназиниум метасульфата

ГЖХ- газожидкостная хроматография

вэжх- высокоэффективная жидкостная хроматография

КЗЭ - капиллярный зонный электрофорез

МЭХ - мицеллярная электрокннетическая хроматография

ПАБК - п-аминобензойная кислота

КЧ - коэффициент чувствительности

ДХФИФ - натрия дихлофенолиндофенолят

ФМ^а - натрия фосфорномолибдат

ФМК - кислота фосфорномолибденовая

ЗЫКОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТЫ АСКОРБИНОВОЙ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 29.05 2013 г. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ 197/7 . Отпечатано с готового оригинал-макета заказчика в типографии издательства «Перемена» 400066, г. Волгоград, пр. им. В. И. Ленина, 27