Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Состояние системы глутатиона в условиях различных стратегий адаптации при множественной скелетной травме

На правах рукописи

КИРПИЧЕНКО Михаил Геннадьевич

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА В УСЛОВИЯХ РАЗЛИЧНЫХ СТРАТЕГИЙ АДАПТАЦИИ ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ СКЕЛЕТНОЙ ТРАВМЕ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

П 3 ДПР 2014

Иркутск — 2014

005546660

005546660

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетом учреждении «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» СО РАМН.

Научный руководитель:

доктор медицинский наук, профессор

Бочаров Сергей Николаевич

Научный консультант:

доктор медицинский наук

Давыдов Сергей Олегович

Официальные оппоненты:

Семинский Игорь Жанович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, заведующий кафедрой патологии с курсами клинической иммунологии и аллергологии

Тумак Владимир Николаевич - доктор медицинских наук, ОГАУЗ «Иркутская городская клиническая больница№ 10», заведующий отделением реанимации и интенсивной терапии

Ведущая организация

ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Томск.

Защита диссертации состоится « » cXe-1M, 2014 года в «

часов на заседании диссертационного совета Д 001.038.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу. 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан « » _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Шолохов Леонид Федорович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Травматизм и смертность от внешних причин, признанные во всем мире предотвратимыми состояниями, продолжают оставаться в числе актуальных проблем здравоохранения. Они характеризуются высокой распространенностью, тенденцией к росту, а также медицинской, социальной и экономической значимостью. В европейском регионе ежегодно регистрируется более 120 млн. травм, из них 220 тыс. - со смертельным исходом, в Российской Федерации -12-15 млн. травм (Кульберг А.Я., 1994; Какорина Е.П., 2004; Щепин О.П., 2006; Dutton R., 2005; Jordan B.D., 2007).

Любая травма, в том числе и костная, вызывает в ответ защитную реакцию организма. До недавнего времени наиболее признанной общей реакцией на костную травму у человека считался стресс - реакция активного противодействия факторам внешней среды. В то же время известна качественно иная защитная стратегия реагирования на внешнее воздействие - стратегия толерантности. В её основе лежит минимизация расхода энергии, ресурсов, а соответственно, и основных физиологических функций организма. Реализация двух стратегий адаптации детерминирована на уровне рецепторов. В настоящее время имеется возможность направленного воздействия и модуляции действия эндогенных регуляторных систем с целью реализации той или иной стратегии адаптации (Беляевский А.Д. с соавт., 2012; Moore F. et al., 2004; Cadet E., 2005; Chong Z.Z. et al., 2005).

Важными звеньями патогенеза вторичного повреждения внутренних органов при травматической болезни являются увеличение образования активных форм кислорода и относительная недостаточность антиоксидантной системы (Сундуков Д.В. с соавт., 2007; Мороз В.В. с соавт., 2010). Накопление активных форм кислорода и других пероксидантов вызывает оксидативный стресс, который повреждает мембраны и клетку в целом. Ключевая роль в защите клетки от оксидативного стресса отводится системе глутатиона, которая, несмотря на проводимые исследования, до настоящего времени остается недостаточно изученной (Куликов В.Ю. с соавт. 1977, 1978, 1980; Кулинский В.И., 2009; Антонеева И.И с соавт., 2011; Бараховская Т.В. с соавт., 2012; Колесникова Л.И. с соавт., 2013; Yamamoto M. et al, 2003; Wright Jr. E. et al., 2006).

Все вышеизложенное позволило сформулировать цель настоящего исследования.

Цель исследования

Выяснение антиоксидантной роли системы глутатионау экспериментальных животных в условиях различных стратегий адаптации при множественной

скелетной травме для патогенетического обоснования оптимизации лечения травматической болезни.

Задачи исследования

1. Определить тип адаптационной реакции организма животных при множественной скелетной травме по уровню основного обмена, потреблению кислорода, выделению углекислого газа и внутренней температуры тела.

2. Установить выраженность оксидативного стресса в организме животных после костной травмы.

3. Изучить динамику состояния системы глутатиона по активности ферментов шутатионредуктазы, глутатионтрансферазы, глутатионпероксидазы и содержанию восстановленного глутатиона во внутренних органах (сердце, легкие, печень и почки) лабораторных животных после множественной скелетной травмы и выявить ее взаимосвязь с адаптационными реакциями организма.

4. Оценить изменения и взаимосвязь морфометрических показателей внутренних органов лабораторных животных с системой глутатиона при множественной скелетной травме в условиях различных стратегий адаптации.

5. Разработать концептуальную схему для патогенетического обоснования оптимизации лечения травматической болезни.

Научная новизна

Разработан «Способ определения типа стратегии адаптации в эксперименте» (Патент РФ № 2460150 от 27 августа 2012 г.), который позволяет оценить характер адаптации организма животных.

Доказано, что динамика концентрации восстановленного глутатиона отражает как направленность адаптационных процессов организма животных, так и тяжесть течения травматической болезни животных после множественной скелетной травмы.

Выявлено, что в условиях резистентной стратегии адаптации изменения системы глутатиона во внутренних органах заключались в повышении содержания восстановленного глутатиона в сердце и легких и снижении активности глутатионпероксидазы в сердце и легких, а в условиях толерантной стратегии адаптации — в снижении активности глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы сердца и легких на фоне нормального содержания восстановленного глутатиона.

Впервые установлено, что в условиях резистентной стратегии адаптации организма при множественной скелетной травме снижение активности глутатионпероксидазы легких сопровождается развитием респираторного повреждения легких и достоверным снижением выживаемости животных.

Морфологическая картина внутренних органов животных в условиях резистентной стратегии адаптации после множественной скелетной

травмы характеризуется: клеточной инфильтрацией, участками некрозов и увеличением просвета сосудов в сердце; достоверным увеличением толщины межальвеолярных септ в легких; дистрофией и некрозом эпителия почечных канальцев и дегенеративно-дистрофическими изменениями в печени.

Установлено, что у кроликов породы Шиншилла в условиях множественной скелетной травмы на фоне стандартного лечения адаптация происходит по толерантному типу, а не по резистентному.

Практическая значимость

Разработана концептуальная схема для патогенетического обоснования оптимизации лечения травматической болезни.

Доказано, что определение типа послеоперационной адаптации организма может служить критерием оценки эффективности послеоперационной интенсивной терапии.

Личное участие автора в получении результатов

Личное участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи, разработке методов ее выполнения, в непосредственном участии при проведении эксперимента, написании статей и оформлении патента.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Динамика восстановленного глутатиона отражает направленность адаптационных реакций в условиях множественно скелетной травмы: в условиях резистентной стратегии адаптации достоверно возрастает, а в условиях толерантной остается в пределах нормальных величин.

2. Концентрация восстановленного глутатиона является критерием тяжести травматической болезни.

Апробация основных положений

Основные результаты исследований доложены на заседаниях ассоциации анестезиологов-реаниматологов Иркутской области (Иркутск, 2006), научно-практической конференции молодых ученых НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, 2009), Второй научно-практической конференции молодых ученых Сибирского и Дальневосточного федеральных округов (Иркутск, 2010), Пятой всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011), Второй международной конференции «Травматология и ортопедия третьего тысячелетия» (Китай, Маньчжурия, 2011), XIII Всероссийском съезде анестезиологов и реаниматологов (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации и внедрение результатов

По теме диссертации опубликовано 12 научных статей, из них 5 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, монография «Защитные

стратегии организма в анестезиологической и реанимационной практике» (2012 г.). Получен патент «Способ определения типа стратегии адаптации в эксперименте» (Патент РФ № 2460150 от 27 августа 2012 г., Бюл. № 24 от 27.08.2012 г.). Материалы диссертационной работы используются в лекционных курсах кафедр травматологии и ортопедии Иркутской государственной медицинской академии последипломного образования, кафедры анестезиологии и реаниматологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедры травматологии, ортопедии и военно-полевой хирургии с курсами нейрохирургии и мануальной терапии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Объем и структура диссертации

Основные экспериментальные и клинические исследования выполнены на базе ФГБУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» СО РАМН (директор - д.м.н., член-корр. РАМН, профессор Е.Г. Григорьев).

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами и 20 рисунками. Включает список используемых сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, а также обсуждение полученных результатов, выводы и список используемой литературы. Список использованной литературы включает 195 источников, из которых 94 на русском и 101 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика экспериментального материала

Объектом исследования были лабораторные животные — кролики породы Шиншилла мужского пола в возрасте от 6 месяцев до 1 года. Все работы с животными были одобрены этическим комитетом ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН и соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Контролю за проведением работ с использованием экспериментальных животных» (Приказы № 742 и № 48 Министерства высшего и среднего специального образования СССР от 13.11.1984 г. и от 23.01.1985 г.) и «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18.03.1986). Исследования выполнены на базе вивария научного отдела экспериментальной хирургии ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН (виварий I категории, ветеринарное удостоверение 238 № 000360 от 30.04.2013 г., служба ветеринарии Иркутской области, заведующая - д.б.н. С.Н. Лепехова). Компоненты системы глутатиона в образцах внутренних

органов определяли на базе кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университета» Минздрава России (заведующий кафедрой - д.м.н., профессор В.И. Кулинский). Морфологические и морфометрические исследования органов животных выполнены на базе ОГАУЗ «Иркутский областной консультативно-диагностический центр» (заведующий лабораторией - к.м.н. С.С. Голубев). Животные содержались в условиях вивария на свободном доступе к пище и воде, согласно нормативам ГОСТа № 10045-73 (6.04.1973). Моделирование множественной скелетной травмы проводили по методу Г.А. Илизарова (1979) под общей анестезией, путём наложения спицевых аппаратов внешней фиксации на правое плечо и левую голень с последующей остеотомией этих костей в аппарате. Стандартное послеоперационное лечение включало внутримышечное обезболивание анальгином 50% в суточной дозе 200 мг/сутки в течение 5 суток после операции, антибиотикопрофилактику линкомицином 10 мг/кг/сутки и инфузионную терапию раствором глюкозы 5% в суточной дозе 60 мл/кг/ сутки в течение 3 суток после операции. Эвтаназию лабораторных животных производили путём внутривенного введения Бо1. КаШ сМог1сИ 4% 10 т1 с барбитуровой седацией 8о1. ТЫореШаИ пШгИ 1% 10 ш1.

В соответствии с поставленной целью были сформированы три группы лабораторных животных (таблица 1).

Таблица 1 - Распределение кроликов на группы

Группа Характер манипуляций, критерии распределения Кол-во животных

1 Интактные животные 10

2 Множественная скелетная травма + стандартное лечение 22

3 Множественная скелетная травма + стандартное лечение с дополнительным послеоперационным введением адреналина и дексаметазона 23

В 1-й группе (контрольной) определяли нормальные показатели системы глутатиона у лабораторных животных. Остальные 45 животных после выполнения моделирования множественной скелетной травмы были распределены в группы № 2 (получавших в послеоперационном периоде стандартное лечение) и № 3 (с дополнительным использованием адреналина 2,5 мкг/кг/сутки и дексаметазона 1 мг/сутки в течение 3 суток после оперативного вмешательства (активация симпатико-адреналовой и надпочечниковой систем)) с целью формирования резистентной стратегии адаптации. Все исследования выполнены до оперативного вмешательства и на 1-е, 3-й и 7-е сутки после операции (период острой реакции на травму) - в период ранних проявлений нарушений функции органов (по классификации С.А. Селезнева и Г.С. Худайберенева, 1984).

Методы исследований

Тип стратегии адаптации определяли оригинальным способом (Патент РФ № 2460150 от 27 августа 2012 г.), активность оксидативного стресса оценивали по ТБК-активным продуктам (спектрофотометрия (Меньшикова В.В., 1987)), состояние системы глутатиона - по содержанию восстановленного тутатиона (Anderson М.Е., 1989) и активности гаутатионпероксидазы (Flohe L., 1989), глута-тионтрансферазы (Haibig W.H., 1974) и глутатионредуктазы (Mannervik В., 1989).

Морфометрические и морфологические исследования выполнены с помощью компьютерной микроскопической видеосистемы «Quantimet 550IW» (Leica Cambridge Ltd., Великобритания) со встроенным пакетом статистических морфометрических программ «Q-win» для цифрового анализа патоморфологического и цитологического материала с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000 х 4000 пикселей.

Статистическая обработка данных

Поскольку распределение полученных результатов отличалось от нормального, то данные представлены в виде медианы (М) с нижним и верхним квартилями (Р25 и Р75). При выполнении сравнительного анализа полученных данных между группами использовали непараметрический критерий Манна - Уитни. Если проведенный анализ не обнаруживал различий, проводилась оценка чувствительности критерия. Для сравнения внутри каждой группы использовали критерий Вилкоксона. Для выявления оценки и зависимостей выполняли корреляционный анализ (коэффициент Спирмена). Уровень статистической значимости принят равным 0,05. Статистический анализ проводили с помощью пакета комплексной обработки данных STATISTICA 6.1 StatSoft Inc. (США) (правообладатель лицензии - ФГБУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии» СО РАМН).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При определении типа стратегии адаптации у животных второй группы установлено, что активность метаболизма достоверно снижается в послеоперационном периоде, по сравнению с исходным уровнем. Это подтверждается динамикой потребления кислорода, выделения углекислого газа и ректальной температурой.

В 1-е сутки после операции потребление кислорода снизилось на 16 (-33; -8) % от исходного уровня (р < 0,001). Далее оно имеет тенденцию к возврату к исходному уровню, но не достигает его. На 3-й сутки оно составило —10 (—18; -4) % (р < 0,001), на 7-е сутки -6 (-24; -3) % (р = 0,005).

Показатели выделения углекислого газа и ректальной температуры согласуются с изменениями показателя потребления кислорода. Концентрация углекислого газа в 1-е сутки после операции достоверно снизилась на 28 (-30; -11) % (р < 0,001), на 7-е сутки - на 19 (-27; -7) % (р = 0,002). В 1-е сутки после травмы ректальная температура снизилась с исходных 39,3 (39,1; 39,4) °С до 38,0 (37,4; 38,6) °С, изменения статистически достоверны (р < 0,001). На 3-й сутки после операции показатель ректальной температуры составил 39,0 (37,9; 39,2) °С и, тем самым, приблизился к исходному уровню, но все-таки был статистически значимо ниже него (р = 0,002). Изменения ректальной температуры к 7-м суткам после операции достоверных отличий от исходной величины не имели (р = 0,567).

При корреляционном анализе полученных результатов установлена прямая связь между показателями выделения углекислого газа и потребления кислорода (коэффициент ранговой корреляции Спирмена =0,84 прир < 0,001), выделения углекислого газа и внутренней температуры (г5 = 0,73 при р < 0,001); прямая связь средней силы между показателями потребления кислорода и внутренней температуры (/■ = 0,66 при р < 0,001). Результаты выполненных исследований позволяют утверждать, что у кроликов породы Шиншилла в условиях множественной скелетной травмы на фоне стандартною лечения реализовывалась толерантная стратегия адаптации, поскольку установлено достоверное снижение потребления кислорода, выделение углекислого газа и ректальной температуры.

При оценке оксидатнвного стресса установлено, что на 3-й сутки достоверно повысилась концентрация ТБК-активных продуктов — с 2,56 (2,15; 2,77) (исходное значение) до 3,69 (2,92; 4,00) мкмоль/л (р < 0,001), на 7-е сутки она составила 3,33 (2,92; 4,38) мкмоль/л (р = 0,01), что свидетельствует о проявлении оксидатнвного стресса. Данное обстоятельство диктовало необходимость исследования состояния системы антиоксидантной защиты организма. С этой целью определяли содержание компонентов системы глутатиона (ГР, ГТ, ГП и восстановленного глутатиона) во внутренних органах лабораторных животных, поскольку она является ключевым звеном антиоксидантной системы защиты организма.

Динамика показателей системы глутатиона у животных группы № 2

Лёгкие

При изучении компонентов системы глутатиона в легких у лабораторных животных группы № 2 выявлены статистические значимые изменения активности двух ферментов - глутатионредуктазы (ГР) и глутатионтрансферазы (ГТ). При сопоставлении с референтными значениями выявили статистически достоверное снижение активности ГР на 26 % (р = 0,023). В группе № I активность глутатионредуктазы составила 25,2 (21,2; 43,0) нмоль/мин х мг белка, в группе № 2 - 18,8 (15,9; 20,8) нмоль/мин х мг белка. Активность ГТ также достоверно

снизилась на39 % (р = 0,013). Содержание восстановленного глутатиона в лёгких у лабораторных животных сравниваемых групп было одинаковым (р = 1).

Сердце

Установлено статистически значимое снижение активности двух ферментов: активность ГР снижалась на 55 % и составила 41,7 (30,3; 50,3) нмоль/мин * мг белка в группе № 1 против 18,6 (15,7; 23,3) нмоль/мин * мг белка в группе № 2 (р <0,001); активность ГТ снижалась на 24%-с 428 (373; 516) нмоль/мин х мг белка в группе № 1 до 324 (208; 339) нмоль/мин * мг белка в группе № 2 (р = 0,005).

Печень и почки

Достоверных различий активности ферментов и содержания восстановленного глутатиона не выявлено (р = 0,871).

Таким образом, у лабораторных животных группы № 2 в условиях множественной скелетной травмы на фоне стандартного лечения формируется толерантная стратегия адаптации с проявлением оксидативного стресса, влияние которого зависело от собственной антиоксидантной защиты каждого органа. При этом выявлены значимые изменения системы глутатиона после множественной скелетной травмы в сердце и лёгких.

Сравнительная характеристика показателей системы глутатнона

у животных групп № 2 и № 3

Назначение лабораторным животным в группе № 3 дополнительно к стандартной терапии адреналина и дексаметазона способствовало активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатикоадреналовой систем для формирования адаптационной стратегии резистентности в ответ на множественную скелетную травму животных.

По результатам исследований установлено, что у лабораторных животных группы № 3 в 1 -е сутки после операции потребление кислорода не изменилось, по сравнению с исходной величиной, и составило 0 (-4; 7) %, что свидетельствовало о сохранении активности метаболизма у данной группы лабораторных животных приблизительно на исходном уровне. При сравнении этого показателя с аналогичным в группе № 2 мы получили статистически значимое отличие (р = 0,004) (рисунок 1). Однако уже на 3-й сутки после травмы потребление кислорода у кроликов группы № 3 снизилось до -13 (-19; -1) % и статистически достоверно (р = 0,98) сравнялось с аналогичным показателем группы № 2.

Изменения концентрации углекислого газа у кроликов группы № 3 были аналогичны изменениям показателя потребления кислорода (рисунок 2). В 1-е сутки после травмы концентрация углекислого газа составила -5 (-20; 3) % и была статистически достоверно выше аналогичного показателя группы № 2 (р = 0,038). На 3-й сутки послеоперационного наблюдения межгрупповые отличия утратили статистическую значимость.

период

до операции 1 сутки 3 сутки ) группа №2 п=22 Рта группа №3

наблюдения

Рисунок 1 - Динамика потребления кислорода в группах № 2 и № 3: между группами.

р < 0,05

8

2

Я. §

до операции ; группа №2 п 22

1 сутки ШШ группа №3 п 23

Рисунок 2 - Динамика выделения углекислого газа в группах № 2 и № 3: * -р < 0,05 между группами.

При сравнении показателей ректальной температуры в сравниваемых группах статистически достоверных отличий не выявлено.

Таким образом, использование в послеоперационном лечении лабораторных животных группы № 3 дексаметазона и адреналина позволило сохранить интенсивность обменных процессов на исходном уровне. Однако уже к 3-м суткам послеоперационного наблюдения у кроликов, получавших и не получавших дексаметазон и адреналин в виде адаптационной терапии, активность метаболизма не отличалась. При этом лабораторные животные,

11

получавшие адреналин и дексаметазон, оказались в более тяжелой клинической ситуации, что связано с достоверно более интенсивным потреблением кислорода и более высоким уровнем метаболизма, требовавшими более активного функционирования эндогенных антиоксидантных систем.

Следствием проведения такой адаптационной терапии, направленной на повышение интенсивности обменных процессов у кроликов группы № 3 в ближайший период после травмы, стало резкое снижение их выживаемости, в сравнении с животными группы № 2 (таблица 2).

Таблица 2 - Выживаемость животных в группах сравнения

Модель Группа № 2 (стандартная терапия) Группа № 3 (стандартная + адаптационная терапия)

Летальность в течение 7 дней после операции 54,5 % 92,3 %

Продолжительность жизни после операции (сут.) 7 (5; 7) 4 (3; 4)

Логранговый критерий с поправкой Йейтса р = 0,05

При исследовании выраженности оксидативного стресса достоверных межгрупповых отличий не установлено (таблица 3).

Таблица 3 - Динамика концентрации ТБК-активных продуктов Ме (Р25; Р75)

Группы ТБК-АП, мкмоль/л

До операции 1-е сутки 3-й сутки 7-е сутки Р

N8 2 (п = 22) 2,56 (2,15; 2,77) 2,62 (2,26; 2,97) 3,69 (2,92; 4,00) 3,33 (2,92; 4,38) 0,05

N4 3 (п = 23) 2,26 (1,95; 2,46) 2,92 (2,36; 3,36) 3,49 (2,74; 3,82) - 0,05

Р2-3 0,172 0,311 0,539 - -

Примечание (здесь и далее): р2_3 - достоверность отличий групп № 2 и № 3.

При изучении функционального состояния системы глутатиопа, результаты которого отражены в таблицах 4-7, выявлены значимые межгрупповые различия.

Таблица 4 - Активность глутатионредуктазы Ме (Р ■ Р75)

Группы Активность глутатионредуктазы, нмоль/мин х мг белка

Печень Почки Сердце Лёгкие

Группа № 1 47,7 (21,8; 79,5) 82,4(48,9; 135,8) 41,7 (30,3; 50,3) 25,2 (21,2; 43)

Группа № 2 25,4 (19,5; 33,9) 50,0 (45; 55,3) 18,6 (15,7; 23,3) 18,8 (15,9; 20,8)

Группа № 3 27,0 (17,9; 36,9) 45,8 (39,1; 63,5) 14,1 (12,8; 19,2) 14,3 (11,1; 17,2)

Р1-3 0,535 0,682 0,235 0,113

рг-г 0,734 0,791 0,507 0,121

Таблица 5 - Активность глутатионтрансферазы Ме (Р25; Р75)

Группы Активность глутатионтрансферазы, нмоль/мин х мг белка

Печень Почки Сердце Лёгкие

Группа № 1 2638(2491:3943) 1216 (924; 1674) 428 (373; 516) 562 (456; 954)

Группа № 2 2105 (1459, 2539) 1075 (986; 1171) 324 (208; 339) 344 (251; 446)

Группа № 3 3724 (2884; 4076) 1296 (1160; 1582) 264(246,311) 309 (264; 390)

Р1-3 0,134 0,105 0,099 0,115

Р2-Э 0,025 0,02 0,894 0,775

Таблица 6 - Активность глутатионпероксидазы Ме (Р25; Р75)

Группы Активность глутатионпероксидазы, нмоль/мин х мг белка

Печень Почки Сердце Лёгкие

Группа № 1 622 (382; 1036) 441 (339; 629) 211 (154,233) 284 (172; 485)

Группа № 2 398 (238; 574) 319 (196; 522) 203 (136; 297) 198 (135; 294)

Группа № 3 269(179; 346) 263 (157; 280) 136 (94; 201) 103 (68; 119)

Р1-3 0,213 0,227 0,042 0,011

Р2-3 0,14 0,326 0,038 0,014

Таблица 7 - Содержание восстановленного глутатиона Ме (Р25; Р73)

Группы СБН, мкмоль/г

Печень Почки Сердце Лёгкие

Группа № 1 2,536 (1,999; 2,686) 1,639 (1,168; 1,987) 1,396 (1,352; 1,411) 1,131 (0,974; 2,183)

Группа № 2 2,528 (1,812; 2,885) 1,617 (1,277; 1,76) 1,249 (1,087; 1,565) 1,323 (0,97; 1,719)

Группа № 3 3,087 (2,205; 3,756) 1,838 (1,701; 2,113) 1,749 (1,514; 1,911) 1,793 (1,433; 2,131)

Р1-3 0,302 0,144 0,035 0,022

Р2-3 0,212 0,112 0,011 0,041

Лёгкие

Тенденция к снижению активности глутатионпероксидазы в образцах внутренних органов у лабораторных животных группы № 3 была особенно выраженной и достигала критических уровней статистической значимости при исследовании образцов ткани лёгких. При межгрупповом сравнении результатов активности глутатионпероксидазы выявлено его достоверное снижение у животных в группе № 3, что свидетельствует о «провале» в системе контроля активности перекисного окисления липидов в органе, через который проходит весь кислородный поток. Показатели активности других

13

исследуемых нами ферментов системы глутатиона (глутатионредуктазы, глутатионтрансферазы) лабораторных животных группы № 3 не имели достоверных отличий с аналогичными показателями группы № 2. Содержание восстановленного глутатиона у лабораторных животных группы № 3 было статистически достоверно выше, чем у лабораторных животных группы №2.

Сердце

Так же, как и в легких, тенденция к снижению активности глутатионпероксидазы в образцах сердца у лабораторных животных группы № 3 была выраженной и достигала критических уровней статистической значимости, межгрупповое сравнение результатов это подтвердило. Показатели активности двух других исследованных нами ферментов системы глутатиона (ГР, ГТ) у кроликов группы № 3 не имели значимых отличий от аналогичных показателей группы № 2, тогда как содержание восстановленного глутатиона у лабораторных животных группы № 3 статистически достоверно было выше не только в сравнении с таковыми в группе № 2, но и в сравнении с аналогичными показателями группы № 1, что свидетельствует о возрастающем функциональном напряжении системы глутатиона, связанном с неблагоприятными условиями послеоперационного периода, характерными для резистентной стратегии адаптации.

Печень и почки

Изменения системы глутатиона в печени и почках кроликов группы № 3 носили идентичный характер. Активность глутатионредуктазы в печени и почках кроликов группы № 2 и№ 3 регистрировалась близко к одному уровню, тогда как активность глутатионтрансферазы в образцах, полученных в группе № 3, была статистически значимо выше таковой в образцах, полученных в группе № 2: на 76,9 % в печени и на 20,6 % - в почках. Тенденция к увеличению содержания восстановленного глутатиона и снижению активности глутатионпероксидазы, наблюдавшаяся при сравнении с группой № 2, не получила статистического подтверждения.

Таким образом, назначение лабораторным животным группы № 3 адаптационной терапии в виде дексаметазона и адреналина в условиях множественной скелетной травмы сопровождалось значимыми изменениями в системе глутатиона во внутренних органах - сердце и легких. Наиболее характерные из этих изменений - это общие тенденции к повышению содержания восстановленного глутатиона и к снижению активности глутатионпероксидазы. Статистически достоверное двукратное снижение активности глутатионпероксидазы у кроликов группы № 3 в лёгких ослабляло контроль над процессами перекисного окисления липидов в этом органе и также способствовало вторичному повреждению органа в условиях множественной скелетной травмы. Данные морфометрического исследования внутренних органов представлены в таблицах 8—10.

Данные морфометрнческого исследования внутренних органов

у животных сравниваемых групп

Печень

Установлено, что относительная площадь некрозов у лабораторных животных, получавших адреналин и дексаметазон, была меньше примерно на 3 %. Клеточный индекс у кроликов группы № 3 был значимо ниже на 1,59 усл. ед. (р = 0,004). Морфологическая картина изменений в печени у животных группы № 3 проявлялась дистрофией и некрозом гепатоцитов, клеточной инфильтрацией. Сравнение полученных в группах № 2 и № 3 результатов морфометрнческого исследования свидетельствует о том, что клеточная инфильтрация и дегенеративно-дистрофические изменения в печени у кроликов группы № 3 носили менее выраженный характер.

Почки

У лабораторных животных группы № 3 изменения исследованных морфо-метрических показателей почек также были менее выражены, по сравнению с результатами группы № 2. Показатели некроза эпителия проксимальных канальцев и сосудистого индекса почек у кроликов группы № 3 были ниже, причём если различие показателей некроза составляло всего 3,25 %, то выраженность гиперемии почек (сосудистого индекса) отличалась значимо: +86,7 % в группе № 2 и +37,8 % в группе № 3 к нормальным значениям группы № 1 (р = 0,006).

Таблица 8 - Результаты морфометрнческого исследования почек Ме (Р25; Р-

Группы Морфометрические показатели, Me (Р25; Pis)

Сосудистый индекс (без клубочков), усл. ед. Абсолютная площадь клеток эпителия проксимальных канальцев почек, мкм* Доля клеток эпителия проксимальных канальцев почек с признаками некроза, %

Группа № 1 0,045 (0,04; 0,051) 202,26 (199,01;209,87) 0 (0; 0)

Группа № 2 0,084 (0,07; 0,094) 193,59 (184,85; 202,76) 15,82 (13,86; 18,24)

Группа № 3 0,062 (0,058; 0,073) 191,75 (174,6; 199,05) 12,57(11,47; 14,07)

Р2-3 0,006 0,246 0,002

Морфологическая картина изменений в почках у животных группы № 3 проявлялась дистрофией и некрозом эпителия почечных канальцев, дистрофией и некрозом клеток эпителия, вакуольной и балонной дистрофией, коллапсом клубочков.

Сердце

По результатам исследования выявлено значимое большее содержание гликогена в кардиомиоцитах кроликов группы № 3, что свидетельствовало о

сохранении более высокого энергетического потенциала сердца и отражало повышение устойчивости организма, направленного на выживание. Показатель площади некрозов и площади кардиомиоцитов у животных группы № 3 был статистически достоверно меньше, чем у животных в группе № 2.

Показатель сосудистого индекса был единственным из 4 изученных нами морфометрических показателей сердца, который не имел достоверного отличия в группах № 2 и № 3 (таблица 9).

Таблица 9 - Результаты морфометрического исследования сердца Ме (Р25; Р75)

Группы Морфометрические показатели, Ме (Р25; Р75)

Содержание ■ гликогена, усл. ед. Сосудистый индекс, усл. ед. Абсолютная площадь кардиомиоцитов, мкм2 Абсолютная площадь некрозов, мкм1

Группа № 1 20,01 (18,57; 22,74) 0,021 (0,019; 0,025) 215,49 (206,83; 227,85) 0 (0; 0)

Группа № 2 4,07 (3,57; 5,28) 0,038 (0,035; 0,045) 286,92 (269,45; 299,87) 218,15 (205,89; 228,61)

Группа № 3 8,75 (7,59; 9,67) 0,035 (0,03; 0,039) 221,74 (208,07; 235,09) 137,09 (122,15; 153,12)

рг-з < 0,001 0,07 <0,001 < 0,001

Морфологическая картина изменений в сердце у животных группы № 3 проявлялась клеточной инфильтрацией, участками некрозов и увеличением просвета сосудов.

Лёгкие

Показатели сосудистого индекса лёгких и площади альвеол в группах № 2 и № 3 не имели достоверных отличий. В то же время у кроликов группы № 3 было выявлено значимое увеличение толщины межальвеолярных септ (+51,7 % к данным группы № 1 против +24,6 % к данным группы № 2), подтверждённое высокой степенью статистической достоверности (р < 0,001) и убедительно доказывающее факт нарастающего интерстициального отёка лёгких у лабораторных животных на фоне введения адреналина и дексаметазона (таблица 10).

Таблица 10 - Результаты морфометрического исследования лёгких Ме (Р25; Р-

Группы Морфометрические показатели, Ме (Р25; Р75)

Абсолютная площадь альвеол, мкм2 Сосудистый индекс, усл. ед. Толщина межальвеолярных септ, мкм

Группа № 1 2605 (2549; 2699) 0,16(0,15; 0,21) 11,1 (9,59; 12,83)

Группа № 2 2634 (2571; 2803) 0,25 (0,23; 0,29) 13,83 (12,93; 14,91)

Группа № 3 2589 (2534; 2769) 0,26 (0,24; 0,28) 16,84 (14,87; 17,63)

рг-з 0,253 0,504 < 0,001

Морфологическая картина изменений в легких проявлялась клеточной инфильтрацией, эмфиземой и сосудистым полнокровием.

Анализ результатов морфометрического исследования внутренних органов у лабораторных животных двух групп свидетельствует о том, что причиной смерти кроликов группы № 3 было вторичное повреждение лёгких, морфологически отразившееся в картине интерстициального отёка лёгких, который в свою очередь является структурным эквивалентом респираторного дистресс-синдрома (рисунок 3).

Рисунок 3 - Взаимосвязь системы глутатиона с адаптационными реакциями организма в условиях множественной скелетной травмы.

По результатам выполненных исследовании разработана концептуальная схема патогенетически обоснованной оптимизации лечения травматической болезни (рисунок 4).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о целесообразности дальнейших исследований по изучению системы глутатиона, поскольку ее роль многогранна: выявление направленности адаптационных реакций организма; оценка эффективности интенсивной терапии послеоперационного лечения; определение тяжести течения патологического процесса, что подтверждается результатами корреляционного анализа. У животных группы № 3 установлена сильная прямая связь показателя содержания восстановленного глутатиона в сердце с показателями абсолютной площади некрозов в сердце и показателем содержания гликогена в кардиомиоцитах (коэффициенты ранговой корреляции Спирмена г5 = 0,85 и г5= 0,9 соответственно, р < 0,001). Также установлена сильная прямая связь

между показателем содержания глутатионпероксидазы легких и показателем толщины межальвеолярных септ (коэффициент ранговой корреляции Спирмена г5= 0,88 прир< 0,001);.

Рисунок 4 - Схема оптимизации лечения травматической болезни.

ВЫВОДЫ

1. Толерантная стратегия адаптации сопровождается снижением потребления кислорода на 16 (-3 3; -8) % от исходного уровня (/'<0,001), выделения углекислого газа на 28 (-30; -11) % (р < 0,001) и ректальной температуры.

2. Резистентная стратегия адаптации характеризуется стабильным потребление кислорода, по сравнению с исходной величиной - 0 (-4; 7) %, и одинаковым выделением углекислого газа, по сравнению с исходным значением -5 (-20; 3) %.

3. Множественная скелетная травма, в условиях толерантной и резистентной стратегий адаптации, сопровождается выраженным оксида-тивным стрессом, без достоверных межгрупповых различий - концентрация ТБК-активных продуктов возросла с 2,56 (2,15; 2,77) (исходное значение) до 3,69 (2,92; 4,00) мкмоль/л (р < 0,001), и на седьмые сутки она составила 3,33 (2,92; 4,38) мкмоль/л (р = 0,01).

4. В условиях резистентной стратегии адаптации изменения системы глутатиона заключались в повышении содержания восстановленного глутатиона с 1,396 (1,352; 1,411) мкмоль/г исходной величины до 1,749 (1,514; 1,911) в сердце и с 1,131 (0.974; 2,183) до 1,793 (1,433; 2,131) мкмоль/г в легких, и снижении активности глутатионпероксидазы в легких с 284 (172; 485) нмоль/

мин х мг белка до 103 (68; 119) и в сердце с 211 (154; 233) нмоль/мин х мг белка до 136 (94; 201).

5. В условиях толерантной стратегии адаптации изменения системы глутатиона проявлялись снижением активности глутатионтрансферазы и глутатионредуктазы сердца и легких на фоне нормального содержания восстановленного глутатиона.

6. Результаты морфометрического исследования легких свидетельствуют о наличии интерстициального отека легких, развившегося в условиях резистентной стратегии адаптации и явившегося непосредственной причиной гибели животных. Толщина межальвеолярных септ возросла на 51,7 % по сравнению с нормальными исходными величинами - с 11,1 (9,59; 12,83) мкм до 16,84 (14,87; 17,63) (р < 0,001).

7. В условиях резистентной стратегии адаптации установлена сильная прямая связь между толщиной межальвеолярных септ и содержанием глутатионпероксидазы легких (коэффициент ранговой корреляции Спирмена г = 0,88 при р < 0,001), так же выявлена сильная прямая связь между концентрацией восстановленного глутатиона в сердце с абсолютной площадью некрозов в сердце и с показателем содержания гликогена в кардиомиоцитах (коэффициенты ранговой корреляции Спирмена rs = 0,85, rs = 0,9 соответсвен-но, при р < 0,001).

8. Разработана концептуальная схема патогенетичнски обоснованной оптимизации лечения травматической болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Поскольку послеоперационный период лечения множественной скелетной травмы в условиях различных стратегий адаптации протекает с проявлениями оксидативного стресса, целесообразность использования экзогенных антиоксидантов представляется очевидной. Можно применять как эндогенные антирадикальные препараты - витамины Е, А, С, так и синтетические - сульфан, дипиридамол, комплекс витаминов В2, РР, янтарной кислоты, инозина.

2. При лечении множественной скелетной травмы целесообразно предотвращать переход толерантной стратегии адаптации в резистентную путем ограничения препаратов, повышающих активность метаболизма.

3. Повышение концентрации восстановленного глутатиона в сердце и легких в условиях множественной скелетной травмы, указывает на формирование резистентной стратегии адаптации организма и является неблагоприятным прогностическим критерием эффективности послеоперационной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Изменения активности метаболизма и гормонального профиля после множественной скелетной травмы в эксперименте / С. Н. Бочаров, В. И. Ку-линский, В. Г. Виноградов, М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - № 2. - С. 90-93.

2. Изменения морфометрических показателей внутренних органов после множественной скелетной травмы в эксперименте / С. Н. Бочаров, В. Г. Виноградов, М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко и др. // Политравма. - 2011. - № 4. -С. 89-93.

3. Гормональный профиль в условиях экспериментальной множественной скелетной травмы / М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко, С. Н. Бочаров, В. В. Гу-маненко и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - № 1. - С. 111-114.

4. Изменение кислородной ёмкости и концентрации лактата крови в условиях экспериментальной множественной скелетной травмы / М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко, В. В. Гуманенко, И. Н. Кинаш и др.// Бюл. ВСНЦ СО РАМН.-2013,-№2, Ч. 1.-С. 124-127.

5. Нарушение выделительной функции почек после множественной скелетной травмы в эксперименте / С. Н. Бочаров, М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко,

B. В. Гуманенко// Сибирский медицинский журнал.-2013.-№ 5. -С. 86-88.

Работы в прочих изданиях:

6. Бочаров, С. Н. Адаптация при множественной скелетной травме в эксперименте / С. Н. Бочаров, М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко // Пятая Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2011. — С. 28-29.

7. Лебедь, М. Л. Адаптация и гормональный ответ в условиях множественной скелетной травмы в эксперименте / М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко,

C. Н. Бочаров // Матер. Второго Китайско-Российского конгресса «Травматология, ортопедия и восстановительная медицина третьего тысячелетия» (Маньчжурия, 22-25 мая 2011 г.). - 2011. - С. 42-43.

8. Кирпиченко, М. Г. Состояние системы глутатиона внутренних органов в условиях множественной скелетной травмы / М. Г. Кирпиченко, М. Л. Лебедь, В. В. Гуманенко // Матер. Всерос. Байкальской науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с межд. участием. - Иркутск, 2012. - С. 22.

9. Лебедь, М. Л. Адаптация организма и возможности ее коррекции при множественной скелетной травме: экспериментальное исследование / М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко // В кн. : Бочаров С. Н., Кулинский В. И.,

Лебедь М. Л. Защитные стратегии организма в анестезиологической и реанимационной практике. - Иркутск: НЦРВХ СО РАМН, 2012. - С. 46-66.

10. Лебедь, М. Л. Механизмы формирования адаптации при множественной скелетной травме в эксперименте / М. Л. Лебедь, М. Г. Кирпиченко, С. Н. Бочаров // Материалы VIII съезда Федерации анестезиологов-реаниматологов. - М., 2012. - С 19.

11. Состояние системы глутатиона внутренних органов в условиях множественной скелетной травмы / М. Г. Кирпиченко, М. Л. Лебедь, В. В. Гума-ненко, С. Н. Бочаров // Первая Всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века»: Матер. конф.-М., 2012.-С, 330-331

Патент

I. Способ определения типа стратегии адаптации в эксперименте: пат. 2460150 Рос. Федерация: МПК G09B23/28 (2006.01) / Кулинский В. И., Бочаров С. Н., Лебедь М. Л., Кирпиченко М. Г., Гуманенко В. В.; заявитель и патентообладатель ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН. - № 2011111927/14, заявл. 29.03.2011; опубл. 27.08.2012, Бюл. № 24. -9 е.: ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АВФ - аппарат внешней фиксации

АОС - антиоксидантная система

АТФ - аденозин-трифосфат

АФК - активные формы кислорода

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатионтрансфераза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РДС - респираторный дистресс-синдром

СОД - супероксиддисмутаза

т - внутренняя температура тела

ТБК - тиобарбитуровая кислота

цАМФ - аденозин-монофосфат

СЭН - глутатион восстановленный

ввБН - глутатион окисленнный

Подписано в печать 13.03.2014. Бумага офсетная. Формат 60x841/16-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 зкз. Заказ № 010-14._

РИО НЦРВХ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)