Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Состояние противовирусного иммунитета у больных неходжкинскими лимфомами

УДК: 616-006.441:616.9:613.017.1]-07

004616742

,/5» /

Йовдий Анна Васильевна

СОСТОЯНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ НЕХО ДЖКИ НСКИМ И ЛИМФОМАМИ

14.01.21 - гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- з пек 2010

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2 010

004616742

Диссертация выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппонепты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Виктор Иванович Шардаков Тамара Павловна Загоскина

Бубнова Людмила Николаевна Тотолян Арег Артемович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Защита диссертации состоится « 20 » декабря 2010 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д-208.074.01 ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России» по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан « 19 » октября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Противовирусный иммунитет включает в себя комплекс механизмов, направленных на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Реализация защитной реакции происходит при помощи как гуморальных компонентов иммунитета (нейтрализация вирусов антителами, иммунный лизис инфицированных вирусом клеток с участием антител), так и клеточных (презентация вирусного антигена фагоцитами, цитотоксичность Т - лимфоцитов).

Динамическое изучение показателей противовирусного иммунитета у индивидуума позволяет прогнозировать у него развитие инфекционного процесса и проводить целенаправленную коррекцию выявленных отклонений. Надо отметить, что среди пациентов существуют группы людей с высоким риском возникновения клинически значимой вирусной инфекции. К ним относятся больные неходжкинскими лимфомами (НХЛ). Причиной этого является непосредственное вовлечение в опухолевый процесс клеток иммунной системы, что приводит к изменениям количественных и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток и развитию вторичной иммунной недостаточности (Долгополова Е.В., 2005; Schindler R., 2006; Casasnovas R.O., 2007). У больных неходжкинскими лимфомами повышен риск реактивации латентных вирусных инфекций, вызываемых вирусами семейства Herpesviridae, а так же существует вероятность обострения хронических вирусных гепатитов В и С (Волкова М.А., 2007; Liang R., 2009). При этом, наличие инфекционных осложнений может влиять на течение и исход заболевания и в некоторых случаях требует вынужденной отмены противоопухолевой терапии, а так же назначения дополнительных медикаментозных средств (Pérsico М, 2002; O'Brien S., 2008; Drew J., 2008; EnnishiD., 2010).

Высокую репликативную активность вирусов у больных НХЛ связывают с угнетением звеньев иммунитета, принимающих участие в противовирусной защите - снижением количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, нейтрофилов, уменьшением уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови (Özdemir Е., 2002; Güllii G., 2005). Тем не менее, механизмы формирования иммунной недостаточности у больных НХЛ и факторы, предрасполагающие к реактивации вирусной инфекции, в настоящее время остаются до конца не изученными. Совершенно не раскрыта роль регуляторов иммунитета -цитокинов при этой патологии. В частности, не изученным остается вопрос участия цитокинов в регуляции противовирусного иммунитета, а именно, не прослежена связь изменений субпопуляционного состава Т - лимфоцитов с уровнем иммунорегуляторных пептидов.

Не до конца установлена патогенетическая роль иммуносупрессивного действия химиотерапии при НХЛ. Практически отсутствуют сведения о состоянии противовирусного иммунитета и цитокинового профиля у больных

НХЛ, получающих лечение с включением новых противоопухолевых препаратов - моноклональных анти - С020 и анти - С052 антител.

Следовательно, использование современных иммунологических методов исследования позволяет получить дополнительные сведения о роли медиаторов межклеточных взаимодействий в реакциях противовирусного иммунитета у больных НХЛ и определить новые иммунологические критерии, предрасполагающие к развитию у них инфекционных вирусных осложнений. Исходя из этого, проведение многоплановых иммунологических исследований у больных НХЛ, с учетом проводимой современной химиотерапии, следует признать актуальным.

Целью настоящего исследования являлись - оценка состояния противовирусного иммунитета и установление факторов, обусловливающих реактивацию вирусных инфекций у больных НХЛ.

Задачи исследования

1.Оценить показатели Т- клеточного иммунитета, гуморальные и неспецифические факторы защиты у больных неходжкинскими лимфомами.

2. Определить выраженность иммуносупрессивного влияния химиотерапии с включением моноклональных анти - С020 и анти - С052 антител на субпопуляционный состав Т - лимфоцитов.

3. Изучить частоту и структуру вирусных инфекций в зависимости от состояния иммунореактивности организма больных и вида проводимой терапии.

4. Оценить взаимосвязь степени иммуносупрессии у больных неходжкинскими лимфомами и реактивации вирусной инфекции.

Научная новизна

На основе всестороннего анализа полученных результатов выявлены основные звенья формирования вторичной иммунной недостаточности у больных НХЛ. Установлен комбинированный характер изменений иммунитета, связанный не только с депрессией гуморальных и клеточных его компонентов, но и с нарушением цитокинзависимой иммунорегуляции. Дана развернутая характеристика цитокинового профиля больных НХЛ, показана зависимость иммунных нарушений от вида опухолевого роста, стадии патологического процесса и проводимой терапии. Установлена частота вирусных инфекций у первичных больных и пациентов, получавших ранее терапию, и связь проводимого лечения с изменениями иммунологических показателей.

Практическая значимость

Выявлены основные патогенетические звенья формирования иммунодефицитного состояния у больных НХЛ. Установлен высокий иммуносупрессивный эффект химиотерапии с включением алемтузумаба. Расскрыта корреляционная зависимость снижения количества С016+-клеток и возрастания концентрации ИЛ-10 в культуре мононуклеаров с частотой

выявления маркеров герпесвирусной репликации, что может, служить прогностическим иммунологическим параметром, характеризующим вероятность реактивации вирусной инфекции у пациентов с HXJI.

Положения, выносимые на защиту

1. Показатели иммунного статуса у больных HXJI имеют отличия от региональных иммунологических данных здоровых лиц: наблюдается снижение относительного количества CD3+-, CD4+-, С08"-лимфоцитов, значения CD4+/CD8+, концентрации сывороточных IgG, IgA, IgM, ослабление кислородозависимой микробицидной активности нейтрофилов, а также присутствует дисбаланс в системе цитокинов.

2. Степень угнетения Т- клеточного иммунитета ассоциируется с агрессивностью заболевания и стадией патологического процесса,

3. Снижение числа С01б'-клеток и повышение уровня ИЛ-10 в культуре лимфоцитов у больных IIXJ1 коррелируют с возрастанием активности герпесвирусной инфекции.

4. Программы химиотерапии с включением алемтузумаба приводят к снижению относительного количества CD3+-, CD4+-, С08+-лимфоцитов у больных HXJI в 1,2 раза более значимую по сравнению с режимами химиотерапии без моноклональных антител.

Апробация диссертационного материала

Результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения) (Киров, 2008) и на заседании областного общества гематологов -трансфузиологов (Киров, 2009). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получена приоритетная заявка на изобретение «Способ коррекции противовирусного иммунитета у больных хроническим лимфолейкозом» per. № 2010138719.

Реализация работы

Результаты работы используются в работе гематологической клиники ФГУ «КНИИГ и ПК ФМБА России» при определении иммунного статуса и выборе тактики противовирусной терапии. Полученные данные легли в основу учебно - методических пособий на кафедре гематологии и геронтологии ГОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия Росздрава».

Личное участие автора в получении результатов

Автором проведено клиническое обследование пациентов с неходжкинскими лимфомами в гематологической клинике ФГУ «КНИИГ и ПК ФМБА России» (руководитель клиники - к.м.н., доцент Загоскина Т.П.).

Обработаны лабораторные данные историй болезни. В лаборатории иммунологам лейкозов института (руководитель - д.м.н., профессор Шардаков В.И.) лично проводился подсчет субпопуляций лимфоцитов, культивирование мононуклеаров, определение концентрации цитокинов иммуноферментным методом. В лаборатории иммуногематологии (руководитель - д.м.н., профессор Зайцева Г.А.) выполнялась подготовка образцов крови для анализа уровня ИФН-у, вырабатываемого CD3+ -лимфоцитами до и после стимуляции на проточном цитофлуориметре. Проведен анализ и статистическая обработка данных 106 больных неходжкинскими лимфомами.

Объем и структура работы

Диссертация представлена на 119 листах. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, двух глав собственных наблюдений и заключения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя 178 источников литературы, из которых 102 иностранных. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 4 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика обследованных больных

За период с 2007 по 2009 годы в гематологической клинике ФГУ «КНИИГ и ПК ФМБА России» было проведено обследование 106 человек с различными вариантами НХЛ, из них наблюдалось 85 (80%) пациентов с индолентными лимфомами и 21 (20%) больной - с различными вариантами агрессивных НХЛ (табл. 1). Группу пациентов с индолентными НХЛ составили больные лимфомой из малых лимфоцитов. В группу агрессивных НХЛ включены пациенты с диффузной В- крупноклеточной лимфомой и лимфомой из клеток зоны мантии.

Таблица 1 - Характеристика больных НХЛ

Показатели Больные НХЛ

Индолентные НХЛ Агрессивные НХЛ

Число пациентов 85 (80%) 21 (20%)

Возраст (лет) 36-76 32-68

Медиана возраста (лет) 60 57

Пол:

М 60(69,5%) 12 (57,1%)

Ж 25 (30,5%) 9 (42,9%)

Медиана возраста (лет)

М 59 56

Ж 61 57

Стадии

I 9 (10,6%) 0

II 57 (67,1%) 0

Ш-1У 19 (22,3%) 21 (100%)

Как видно из таблицы 1, возраст обследованных больных индолентными лимфомами колебался в пределах от 36 до 76 лет, медиана возраста составила 60 лет. Среди наблюдаемых было 25 (30,5%) женщин и 60 (69,5%) - мужчин. Медиана возраста у мужчин составила 59 лет, у женщин - 61 год.

Возраст больных агрессивными лимфомами, находившихся под наблюдением, варьировал в пределах от 32 до 68 лет, медиана возраста составила 57. В этой группе было 9 (42,9%) женщин и 12 (57,1%) мужчин. Медиана возраста у мужчин составила 56 лет, у женщин - 57 лет. Верификация диагноза НХЛ у всех пациентов основывалась на данных морфологической оценки клеток периферической крови, костного мозга, биоптатов лимфатических узлов и трепанатов подвздошной кости с иммуногистохимическим анализом, иммунофенотипирования клеток с помощью проточной цитофлуориметрии, а также цитогенетических и молекулярно - генетических исследованиях.

В зависимости от особенностей течения заболевания больные индолентными лимфомами были разделены на 3 группы (рис. 1). Первая фуппа пациентов, у которых заболевание находилось в 1 стадии, состояла из 9 (10,6%) человек, вторая группа больных со 11 стадией - из 57 (67,1%) пациентов, в третью группу включены 19 (22,3%) больных с Ш-1У стадиями патологического процесса. Стадирование заболевания проводилось по классификации Анн Арбор (1971 г) и основывалось на распространенности опухолевого роста, который определялся по вовлечению в процесс регионов лимфоузлов и экстранодальных очагов.

Как видно из рисунка 1, большинство обследованных больных имели II стадию заболевания.

В группе больных с агрессивными лимфомами большинство - 16 (76,2%) человек - представляли пациенты с диффузной В - крупноклеточной неходжкинской лимфомой. В данную группу также входили 5 (23,8%) пациентов с лимфомой из клеток зоны мантии.

Из 85 человек с диагнозом лимфома из малых лимфоцитов у 35 (41,2%) обследование иммунного статуса проводилось в момент постановки диагноза до начала химиотерапии. У 50 (58,8%) пациентов иммунологические показатели оценивали в процессе проведения химиотерапии.

22.3%

10.6%

67.1%

□ I стадия □ II стадия □ Ш-1У стадии

Рис.1. Характеристика больных по стадиям

Для выявления изменений иммунитета у больных с индолентными лимфомами в различные периоды химиотерапии были сформированы 3 группы пациентов: у 35 больных показатели иммунного статуса оценивались в момент постановки диагноза (до начала терапии), у 35 пациентов - после 3 курсов химиотерапии и у 12 - после лечения (в стадии ремиссии). У каждого больного проведено не менее 6 курсов химиотерапии.

Химиотерапия пациентов проводилась с использованием современных протоколов (табл. 2). Виды химиотерапии были следующие:

Таблица 2 - Виды химиотерапии

Схемы химиотерапии Количество больных

RFC, R-CHOP 15

FluCam, A-CHOP 16

FC, CHOP 19

Среди больных, получавших RFC, R-CHOP, 12 пациентов были со II стадией заболевания и 3 - с III стадией. 14 больных, проходивших терапию по схемам FC, CHOP, были со II стадией и 5 с III стадией. Среди больных, получавших FluCam, А-СНОР 13 больных были со II стадией заболевания, а 3 пациента с III стадией. Оценка иммунного статуса проводилось после 3 курсов терапии.

У 78 больных выполнены исследования на наличие в крови серологических (ИФА-методом) и молекулярных маркеров (ПЦР-методом) вирусных инфекций. Из них 34 человека были обследованы в момент постановки диагноза.

Методы исследования

В работе у обследованных больных проведен комплекс различных иммунологических исследований, который включал определение процента CD3+, CD4+, CD8+, CD16+ - лимфоцитов, а также экспрессию активационных маркеров, оценку концентрации сывороточных иммуноглобулинов G, А, М. Анализировались спонтанная и стимулированная микробицидная активность нейтрофипов. Определяли в сыворотке крови и культуре мононуклеаров уровень цитокинов ИЛ - lß, -2, -4, -6, -8, -10, ФНО а - 24, ИФН а, ИФН у. Кроме того, у больных проводили исследование уровня ИФН-у, вырабатываемого CD3+ -лимфоцитами до и после стимуляции митогеном. Маркеры вирусных инфекций определяли ИФА и ПЦР методами. Статистический анализ результатов выполняли с использованием программы STATISTICA 6.0. Для статистической обработки данных иммунологических исследований нескольких групп использовали критерий Краскела - Уоллиса. При сравнении двух групп использовался критерий Манна - Уитни. В приведенных таблицах данные представлены в виде медиан и квартилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика иммунологических показателей у больных неходжкиискими лимфомами в зависимости от типа опухоли, стадии заболевания и проводимой терапии

В большей степени изменения иммунитета у больных НХЛ коснулись клеточного звена со снижением числа CD31-, CD4CD8*-лимфоцитов во всех исследуемых группах, а также сдвигом в сторону снижения значения иммунорегуляторного индекса у пациентов с лимфомой из малых лимфоцитов. При этом показатели CD3+-, CD8+, CD16+, С095+-клеток у больных агрессивными лимфомами имели достоверно более значимые отклонения, по сравнении с пациентами индолентными НХЛ.

CD3%

-»-Здоровые лица

-»-Больные

индолентными лимфомами -й- Больные

агрессивными лимфомами

Рис. 2. Содержание субпопуляций лимфоцитов у больных НХЛ

Выраженные изменения Т-звена иммунитета у данной группы пациентов, скорее всего, связаны с высокой степенью злокачественности протекающего у них патологического процесса. Учитывая то, что С08+-, С016+-лимфоциты являются основными клетками противовирусного иммунитета, можно предположить, что больные агрессивными лимфомами имели больший риск развития вирусных инфекций.

В системе цитокинов, вырабатываемых лимфоидными клетками пациентов, наблюдался дисбаланс в их содержании (табл. 3).

Так, у больных индолентными лимфомами отмечалось достоверное снижение спонтанной секреции ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-а и ИФН-у, а также рост концентрации ИЛ-2. У пациентов с агрессивными лимфомами наблюдалось снижение спонтанной продукции ИЛ-1 [3, ИЛ-10, ИФН-а и ИФН-у наряду с повышением содержания ИЛ-2.

Таблица 3 - Сравнительная характеристика показателей спонтанной секреции цитокинов у больных НХЛ

Уровни цитокинов, пг/мл Здоровые лица (п = 50) Больные индолентными лимфомами (п = 85) Больные агрессивными лимфомами (л=21)

ФНО-а 524,0 (509,4;530,9) 239,7 (35,0;502,6)'** 375,0 (162,2;681,6)

ИЛ-1Р 602,3 (532,2;614,7) 263,1 (101,1;566,3)'** 364,9(185,1 ;469,1)' **'2*

ИЛ-2 6,8 (4,3;10,3) 24,8 (12,7;38,6)'** 13,3 (7,3;27,2)'*

ИЛ-4 14,6 (14,4; 15.8) 897,5 (874,2;917,1) 9,4 (4,5;15,0)'** 15,1(9,1;111,6)^

ИЛ-6 767,3 (524,6;1014,6) 795,6 (518,8;941,3)

ИЛ-8 687,6 (671,9;720,6) 508,7 (377,5;760,6)'** 752,7 (523,1 ;807,2)2*

ИЛ-10 558,2 (312,5;1135,4) 68,4 (24,б;194,3)'*** 185,7(45,5;321,9)'**

ИФН-а 18,3 (18,0;19,4) 16,6 (7,2;18,6)1** 4,6 (2,6:8,1) '*

ИФН-у 69,5 (48,3;3511,1) 5,4 (0,5;41,1)'*** 11,0(4,3:42,3)'**

Примечание. Данные представлены в виде медиан и квартилей. Достоверность различий *р<0,05, **р<0,001, ***р<0,0001: )- концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных лимфомами по сравнению с показателями здоровых лиц; 2- концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных агрессивными лимфомами по сравнению с показателями больных индолентными лимфомами

Уровни провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-ф у пациентов с НХЛ оказались снижены по сравнению с аналогичными показателями здоровых лиц. Необходимо отметить, что у больных агрессивными лимфомами уровень данных цитокинов был выше, чем в группе пациентов с индолентными лимфомами. Подавление их синтеза согласуется с нарушением процесса дифференцировки Т-лимфоцитов-хелперов, что наглядно представлено на рис. 2. ИЛ-10 представляет собой ингибитор клеточного иммунитета, способствует дифференцировке ТЬ2-клеток путем ингибирования продукции ИФН-у Т-лимфоцитами.

Особое внимание вызывало снижение продукции ИФН-у и ИФН-а у всех обследованных лиц с НХЛ. Как известно, система интерферонов играет регулирующую роль в поддержании гомеостаза, являясь одной из важнейших составляющих естественного иммунитета, во многом определяя течение и исход вирусных инфекций. Учитывая эти обстоятельства, можно предположить, что снижение продукции ИФН-у и ИФН-а способствовало недостаточности противовирусной резистентности у больных НХЛ.

У больных НХЛ наблюдалось повышение спонтанного уровня ИЛ-2, причем более значимое - у больных с индолентными лимфомами. ИЛ-2 запускает иммунный ответ и активирует факторы, участвующие как в противовирусной и противобактериальной, так и в противоопухолевой защите, что в рассматриваемой ситуации может являться признаком более благоприятного течения опухолевого процесса.

Уровень ИЛ-8 имел достоверно более низкое значение только в первой группе больных по сравнению с показателями второй группы и здоровых лиц.

Возможно, это обусловлено значимо низкими концентрациями ФНО-а и ИЛ-1р, которые являются наиболее сильными индукторами синтеза Ш1-8. Кроме того, в литературе приведены сведения, что концентрация ИЛ-8 зависит от злокачественности течения заболевания (Шерстнева Е.С., 2007), и этим можно объяснять высокий уровень изучаемого цитокина у больных агрессивными лимфомами.

Уровень базальной секреции цитокинов характеризовал функциональную активность мононуклеаров без воздействия на них антигена. После стимуляции лимфоидных клеток ФГА были отмечены некоторые изменения в показателях цитокинового профиля (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительная характеристика показателей стимулированной секреции цитокинов у больных НХЛ

Уровни цитокинов, пг/мл Здоровые лица (п = 50) Больные ипдолентнымии лимфомами (п = 85) Больные агрессивными лимфомами (п=21)

ФНО-а 532,1 (522,7;541,7) 494,1 (308,1;673,0) 739,7 (632,,Ъ761,5)ч*а**

ИЛ-1р 607,3 (485,5;625,5) 258,6 (109,8;575,2)'* 431,3 (31,6;750,8)

ИЛ-2 1283,1 (И46,5;1345,6) 38,6 (26,8;337,6)1*** 27,7 (14,1;34,2)'***;2*

ИЛ-4 15,1 (14,6; 16,2) 11,8 (8,6;16,1)'* 21,2 (10,5;234,if*

ИЛ-6 904,8 (872,5;939,9) 805,8 (552,7;1062,5) 768,9 (532.5;942,3)

ИЛ-8 677,3 (666,8;731,2) 508,7 (379,4;765,8)'* 545,8 (375,4;798,2)

ИЛ-10 1522,9 (790,6;2227,2) 72,5 (24,6; 194,3)1 * * * 191,7 (61,7;486,3)1***'2*

ИФН-а 18,8 (18,3;19,4) 16,6(7,1;18,9)'** 4,6 (3,2;9,4)'**

ИФН-7 3393,9 (1674,7;3538,1) 1977,4 (391,6;3680,6) 1891 (470,5;3297,8)

Примечание. Данные представлены в виде медиан и квартилей. Достоверность различий *р<0,05, **р<0,001, ***р<0,0001: 1- концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных лимфомами по сравнению с показателями здоровых лиц; 2- концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных агрессивными лимфомами по сравнению с показателями больных индолентными лимфомами

Так, у пациентов с индолентными лимфомами отмечено снижение стимулированной концентрации ИЛ-1|3, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФН-а. У больных агрессивными лимфомами наблюдался рост содержания стимулированной продукции ФНО-а, снижение секреции ИЛ-2, ИЛ-10 и ИФН-а. В обеих исследуемых группах больных выявлено снижение уровня ИЛ-2, причем в большей степени эти изменения наблюдались у пациентов с агрессивными лимфомами и сочетались с высоким содержанием у них ИЛ-4 и ИЛ-10. Найденные отклонения в содержании цитокинов, вероятно, связаны с опухолевой прогрессией заболевания. Данный факт свидетельствует о том, что у больных с В-клеточными опухолями повышение концентрации исследуемых цитокинов может рассматриваться в качестве маркеров более агрессивного течения заболевания, что согласуется с данными литературы (Воробьев А.И., 2000). Кроме того, у больных агрессивными лимфомами установлено повышение концентрации ФНО-а после стимуляции мононуклеаров ФГА.

В сыворотке крови выявлено достоверное повышение содержания ИЛ-4, ИЛ-10 у всех больных НХЛ, а также ИЛ-6 у пациентов с агрессивными л им фомами. Выявленные изменения согласуются с данными литературы. свидетельствующими о взаимосвязи уровня сывороточного ИЛ-6 с агрессивностью заболевания (Короткова О.В.. 2002).

При сравнении изучаемых показателей у больных с различными типами лимфом и здоровых лиц установлено, что у пациентов (как при индолентном течении заболевания, так и при агрессивном) наблюдалось ослабление гуморального иммунитета, со снижением уровней всех трех классов иммуноглобулинов (1цС. 1цМ),

$1оровые лица Больные Больные

индоле нтны м и агрессиейы у и лимф омами лимф омами

Рис. 3. Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови больных НХЛ в зависимости от варианта заболевания

ЕЗыявлено угнетение спонтанной и стимулированной микробицидной активности нейтрофилов.

Следовательно, в основе ослабления противовирусного иммунитета у больных НХЛ лежат комбинированные нарушения, затрагивающие как специфические так и неспецифические звенья иммунной защиты. При этом у пациентов с агрессивными формами лимфом дефект Т-клеточного иммунитета был более выраженным и сочетался со значительным отклонением в цитокиновом статусе по сравнению с больными индолентными лимфомами.

Поскольку все больные агрессивными лимфомами находились в IV стадии заболевания, подразделение пациентов на группы было проведено только при индолентных лимфомах. У этих пациентов была прослежена зависимость показателей иммунитета от стадии заболевания. В этой связи среди больных, с впервые установленным диагнозом и не получавших химиотерапию, на основании классификации Ann Arbor выделены три группы пациентов: находящихся к моменту обследования в 1 стадии заболевания (9 человек), во И стадии (19 человек) и в HI-1V стадиях (8 человек) (рис. 4).

CD95%

CD 16%

-«—! стадия —11 стадия Ш-iV стадия

Рис. 4. Сравнительная характеристика числа отдельных субпопуляций лимфоцитов больных индолентными лимфомами на различных стадиях

заболевания

Анализ иммуноло) 'ических показателей у больных индолентными лимфомами в зависимости от стадии патологического процесса выявил, что при прогрессировании лейкозного процесса изменения Т-клеточного звена иммунитета выражены сильнее. Так, у пациен тов с H1-1Y стадиями заболевания отмечались более низкие показатели CD.V- и CD8-лимфоцитов, а также прослеживалась тенденции к уменьшению числа CD4 -клеток.

Таблица 5 - Сравнительная характеристика показателей спонтанной секреции ци токи нов больных индолентными лимфомами при различных стадиях заболевания

Уровни цитокинов. иг/мл 1 | 1 стадия 1! стадия Ш-IV стадии

(л=9) (п=19) (п 8)

ФПО-а i 358 6 (230.3:367.8) 237.(1(43.3:4785) 209.0 (7.1 ;7()8,4)*:*#

ИЛ-5 р 380,6(196.8:388.2) 301.1 (104.8:606,9) 82.2(37.7:416.9)*:« ,

И J1-2 6.1 (3.6:12.4) 13.4 (6.7:21.7) 24.4(14.2:30.2)

ИЛ-4 | 15.3 () 1.7:16.]) 11.1 (8.2:15.1) 3.0(2.7:9.1 )**

ИЛ-6 745,5 (744.9:1823.1) 795.4 (560.2:1117.3) 557.2(227.4:650,9}**

ИЛ-8 | 404,8 (373,5:517.7) 437.9(376.4:746.4) 727.1 (384.6:807.5!

ИЛ-Н! 1 4!,3 (17.6:73.2) 71.2 (30.8:205.1) 37.9(9.5;! 87.5)

ИФН-а 17.3 (16.7:18.6) 16.3 (5.9; 18.5! ¡6.9(13.5:18.0)

1 ИФН-у 1.3 (0.0:20.9) 7.4 (0.9:40.4) 2.4 (0.0:107.9)

Примечание. Данные представлены в виде медиан и квартилей. Достоверность различий р<0.05:* концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных с 111 -3"V стадиями по сравнению с показателями больных со ¡1 стадией: ** концентрация цитокинов в культуре лимфоцитов больных с НМУ стадиями но сравнениюс показателями больных с I стадией

У больных с Ш-1У стадиями заболевания достоверно снижена спонтанная секреция мононуклеарами крови ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-4 и ИЛ-6 (табл. 5). Не исключено, что низкая концентрация ИЛ-4 и ИЛ-6 тормозит созревание В-лимфоцитов в плазмоциты.

При прогрессировании лимфомы из малых лимфоцитов у больных отмечалось достоверное снижение уровня ИЛ-2 и ИЛ-4 в культуре мононуклеаров после их стимуляции ФГА. Это, скорее всего, связано с ослаблением секретирукяцей функции Т-клеток при прогрессировании лимфомы из малых лимфоцитов - основных продуцентов данных цитокинов. Кроме того, сравнение показателей представленных групп выявило, что у больных с Ш-1У стадиями заболевания в сыворотке крови заметно возрастал уровень ФНО-а, ИЛ-1 р, ИЛ-2, ИЛ-8 и ИЛ-10. .

Учитывая дефект Т-звена у пациентов с Ш-1У стадиями заболевания, рост у них уровня ИЛ-2 в сыворотке крови, возможно, носил компенсаторный характер. Уместно заметить, что ИЛ-2 обладает мощным пролиферативным потенциалом и рассматривается некоторыми авторами как аутокринный регулятор роста опухолевых клеток, в частности, клеток генерализованной лимфомы, на которых обнаружены рецепторы к данному цитокину. Следовательно, высокие показатели ИЛ-2 в сыворотке крови у больных индолентными НХЛ в Ш-1У стадиях заболевания также могли свидетельствовать о прогрессировании опухолевого процесса.

Увеличение концентрации ИЛ-10 в П1-1У стадиях ассоциировалось со снижением числа Т-клеток, что указывало на наличие у таких больных дизрегуляторных нарушений в созревании и дифференцировке Т-лимфоцитов.

Таким образом, у больных индолентными лимфомами при прогрессировании заболевания наблюдалось снижение показателей Т-звена иммунитета, а также уменьшение как спонтанной цитокинсинтетической активности мононуклеаров крови, так и стимулированной ФГА. При этом концентрации таких иммунорегуляторных пептидов как ИЛ-2 и ИЛ-10, ФНО-а иИЛ-1р в сыворотке крови повышались.

Анализ иммунологических показателей у больных индолентными лимфомами до начала терапии продемонстрировал не только значительный Т-клеточный дефицит, но и снижение функциональной активности лимфоцитов, в частности, уменьшение числа СБЗ+-клеток:, продуцирующих ИФН-у как спонтанно, так и при стимуляции их иономицином. Уменьшение концентрации данного цитокина дополняет общую картину снижения у больных лимфомой из малых лимфоцитов резистентности к вирусной инфекции.

Следовательно, у больных лимфомой из малых лимфоцитов уже в дебюте заболевания наблюдается не только значительный Т-клеточный дефицит, но и снижение функциональной . активности лимфоцитов, отражающееся в уменьшении концентрации ИФН-у, что в совокупности приводит к повышенной восприимчивости данных пациентов к инфекционным агентам вирусной природы.

Значительные различия выявлены при сравнении показателей иммунитета у больных до лечения, и пациентов, получающих различные схемы химиотерапии. Так, у последних установлены большее снижение относительного числа СОЗ+-, С08+-клеток, а также изменение цитокинового профиля, отражающееся в деплеции показателя ИЛ-2 при стимуляции ФГА. Обозначенные отклонения свидетельствовали о том, что проводимая химиотерапия оказывала супрессивное влияние на иммунную систему организма больных.

Кроме того, противоопухолевые препараты приводили к повышению уровня провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-1(3 и ИЛ-8 в культуральной взвеси мононуклеаров, поскольку часть клеток были анаплазированы и разрушались в процессе культивирования. В тоже время в сыворотке крови обследуемых пациентов, на фоне проводимой химиотерапии, уровни цитокинов не имели достоверных отличий между группами.

Известно, что в зависимости от механизма действия, различные химиопрепараты в разной степени угнетают иммунную систему. Новым препаратом из группы моноклональных антител является алемтузумаб. Действие его основано на связывании моноклональных антител с рецептором СВ52', расположенном на мононуклеарных клетках, и последующей индукцией апоптоза. Существенные различия показателей иммунитета были зарегистрированы при сравнении полученных данных в зависимости от вида проводимой терапии (рис. 5).

соз%

С095%

С04%

С016%

С 08%

-о~А-СНОР, ¡ЧиСат

-®-СНОР, РС

Рис. 5. Содержание субпопуляций лимфоцитов у больных НХЛ на фоне лечения алемтузумабом

Так, химиотерапия, в состав которой входил алемтузумаб, в 1,2 раза больше угнетала Т-клеточный иммунитет по сравнению с другими, не содержащими данный препарат, схемами. В связи с этим, риск развития

инфекционных осложнений вирусной природы у соответствующего контингента больных значительно возрастал.

Отсутствие различий показателей цитокинов в культуре мононуклеаров сравниваемых групп свидетельствовало о том, что подавление Т-звена иммунитета у получающих алемтузумаб больных происходило не за счет колебаний уровней иммунорегуляторных пептидов. При этом у пациентов, проходящих терапию с участием алемтузумаба, было выявлено достоверное повышение ИФН-у в сыворотке крови.

Аналогичные исследования были проведены и в отношении препарата анти-С020 - ритуксимаба. Не выявлено различий показателей субпопуляционного состава лимфоцитов и уровня цитокинов в культуре мононуклеаров и сыворотке крови между группами больных, получавших химиотерапию в сочетании с ритуксимабом, и пациентов, лечение которых не включало моноклональных антител.

Особенности иммунитета у больных неходжкннскими лимфомами с вирусной инфекцией

Для изучения механизмов иммунного ответа у больных НХЛ при активации вирусной инфекции были проанализированы результаты ПНР исследований образцов периферической крови 78 пациентов, из них у 34 больных диагноз был поставлен впервые. Из всех обследованных лиц у 23 (29,5%) больных были обнаружены маркеры активации различных вирусов (рис. 6).

29,5%

Больные с отрицательными результатами ПЦР тестирования

Больные с положительными результатами ПЦР тестирования

Рис. 6. Частота выявления маркеров репликации вирусов у больных НХЛ

Проведенное обследование выявило 27 случаев вирусной репликации (табл. 6). При этом у 4 пациентов было обнаружено сочетание инфекционных маркеров: цитомегаповируса (ЦМВ) + вируса простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типов, вируса гепатита С (ВГС) + вируса Эпштейн - Барр (ВЭБ), вируса гепатита В (ВГВ) + ВПГ. .

Таблица 6 - Частота выявления вирусных инфекций у больных НХЛ

Маркеры вирусной инфекции Число позитивных случаев % от числа обследованных больных (п=78)

Вирусный гепатит В 4 5,1

Вирусный гепатит С 3 3,8

Цитомегаловирус 10 12,8

Вирус простого герпеса 1 и 2 типов 6 7,6

Микст инфекция 4 5,1

Из представленных в таблице данных видно, что чаще выявляли маркеры активации цитомегаловируса. Несколько реже определялись - вирус простого герпеса 1 и 2 типов, вирус гепатита В и С. Вирус Эпштейн - Барр был обнаружен лишь в одном наблюдении. У всех больных HXJI с маркерами репликации вирусов были положительные ИФА тесты на наличие в крови специфических антител lg G (анти-ВПГ, анти-ВЭБ VCA, анти-ВЭБ NA, анти-ЦМВ, анти-HBs Ag и анти-HCV Ag). Между тем, у двоих пациентов выявлялись в крови антитела анти-HBs Ag и анти-HCV Ag при том, что маркеры вирусной репликации были отрицательные.

Поскольку у больных агрессивными лимфомами выявлена значимая депрессия клеточного иммунитета (CD8+, CD16+ - лимфоцитов), было высказано предположение о том, что данные пациенты имели больший риск активации вирусных инфекций. Так, из 12 обследованных больных агрессивными лимфомами у 4 были обнаружены маркеры репликации вирусных инфекций (в 1 случае ДНК цитомегаловируса и РНК ВГС, а в 2 случаях ДНК ВГВ), что составило 33,3%. Из 66 больных индолентными лимфомами у 19 пациентов были обнаружены маркеры репликации вирусных инфекций, что составило 28,8%. Для подтверждения или опровержения достоверности различий данных был вычислен х с поправкой Йетса, который составил 0,01 (р=0,15). Следовательно, относительно большее содержание CD8+, CD16+ у больных индолентными лимфомами по сравнению с больными агрессивными лимфомами не снижает у них риск развития вирусных инфекций.

Анализ частоты выявления молекулярных маркеров у первичных больных индолентными НХЛ с разными стадиями заболевания не выявил между группами больных значимых различий. Так, у пациентов с 1 стадией не было обнаружено в крови репликации вирусов, у больных со II стадией молекулярные маркеры вирусной инфекции наблюдались в 2 случаях, а с 111 стадией - в 1 наблюдении. %2 квадрат составил 0,001 (р=0,87). Следовательно, стадия заболевания не влияла на реактивацию вирусной инфекции.

Среди первичных больных у 4 из 34 пациентов были выявлены молекулярные маркеры вирусных инфекций, что составило 11,8%. Из них у двоих был выявлен ВГВ, у одного пациента ЦМВ и еще в одном случае ВПГ. В

группе предлеченных пациентов (44 человека) молекулярные маркеры вирусных инфекций (ВГВ - 2 эпизода, ВГС - 3 эпизода, ЦМВ - 10 эпизодов, ВПГ - 7 эпизодов, ВЭБ - 1 эпизод) выявлены в 43,1% случаев (19 больных). Проведенный статистический анализ раскрыл достоверную разницу частоты выявления ДНК/РНК вирусов между данными группами пациентов ^-7,66 (р=0,0074). Так как трансфузии компонентов крови данным больным не проводились, то причиной реактивации вирусных инфекций, вероятно, является химиотерапия и связанная с ней депрессия иммунитета.

Учитывая то, что рассмотренные схемы химиотерапии в различной степени угнетали иммунитет обследуемых пациентов, проанализирована частота выявления молекулярных маркеров у больных, получающих разные схемы терапии (табл. 7).

Из представленных в таблице данных видно, что у больных, получавших химиотерапию в комбинации с алемтузумабом, было выявлено наибольшее число молекулярных маркеров вирусной инфекции, по сравнению с пациентами, которым назначались режимы FC, CHOP и RFC, R-CHOP.

Таблица 7 - Частота выявления вирусных инфекций у больных HXJI в

зависимости от программы химиотерапии

число число число число число

позитивных позитивных позитивных позитивных позитивных

случаев ВГВ случаев ВГС случаев ЦМВ случаев ВПГ 1/2 случаев ВЭБ

Больные, получавшие FC, CHOP (п=14) 0 (0%) 0 (0%) 1 (2,3%) 1 (2,3%) 0 (0%)

Больные,

получавшие А-СНОР, FluCam (п=16) 2 (4,5%) 3 (6,8%) 9 (20,5%) 4 (9,0%) 1 (2,3%)

Больные, получавшие RFC., R-CHOP (n=I4) 0(0%) 0(0%) 0 (0%) 2 (4,6%) 0 (0%)

Примечание. В скобках указан % от числа обследованных больных на терапии.

У больных НХЛ в процессе лечения режимами А-СНОР и FluCam выявляли маркеры герпесвирусной инфекции (14 эпизодов герпесвирусов / 5 эпизодов гепатитов В, С). В то же время среди больных, получавших программы RFC, R-CHOP и FC, CHOP, лишь в 4,6% случаях была обнаружена активация герпесвирусной инфекции. Эти данные свидетельствовали о том, что терапия алемтузумабом в большей степени способствует реактивации герпесвирусной инфекции, в частности, цитомегаловируса, чем лечение с помощью других современных схем терапии. При этом, % соответствовал 13,2 (р=0,0003).

Результаты исследования маркеров лимфоцитов свидетельствовали о том, что наблюдалось достоверно более низкое содержание СВ16+ и С095 -клеток в группе больных с активной герпесвирусной инфекцией. При этом число клеток с маркерами СОЗ+, С04 \ СВ8\ С025\ а также величина СБ4+/ СБ8+ не имели существенных различий в группах (рис. 7).

Для определения связи числа СО!6+-лимфоцитов с возможной активацией герпесвирусной инфекции был рассчитан коэффициент корреляции Спирмена, который составил -0,23 (р < 0,05). Следовательно, снижение количества СВ16-лимфоцитов в сочетании с низким процентом СВЗ -, С04-клеток является определяющим признаком дефектности противовирусного иммунитета у больных НХЛ и имеет корреляционную зависимость с реактивацией герпесвирусной инфекции.

=*»Больньыне с маркерами вирусных гепатитов В и С Больные с маркерами герпесвирусной

инфекции Вируснегативны е больные

Рис. 7. Содержание лимфоцитов у больных НХЛ в зависимости от типа вирусных инфекций

В системе цитокинов у больных с маркерами герпесвирусной инфекции наблюдался достоверный рост концентрации ФНО-а и ИЛ-1 р. Кроме того, у больных второй группы был отмечен подъем уровня ИЛ-10 (Коэффициент корреляции Спирмена составил -0,21 (р < 0,05)), что соответствует литературным данным, свидетельствующим о синтезе вирусами герпеса гомологов данного цитокина (РккетЬег Н., 2002). После стимуляции ФГА содержание ИЛ-113 в культуре лимфоцитов сохранялось на высоком уровне.

Уровни интерферонов ИФН-а, ИФН-у и ИЛ-2 в культуре лимфоцитов в группе вирусинфицированных лиц не имели достоверных различий по сравнению с показателями группы вируснегативных пациентов, что свидетельствовало о неадекватном ответе иммунной системы больных НХЛ на вирусный агент.

Таким образом, проведенные исследования иммунного статуса у вирусинфицированных больных НХЛ показали, что у них не наблюдалось

специфической перестройки цитокиновой сети. Снижение содержания СО!6+-клеток являлось доминирующим фактором ослабления противовирусного иммунитета. Отсутствие полноценной иммунной реакции у больных НХЛ приводит к частой контаминации вирусами и их репликации в организме хозяина. Это подтверждалось наличием довольно высокого процента ПЦР положительных результатов (29,5%), полученных при исследовании периферической крови данных пациентов.

ВЫВОДЫ

1. У больных неходжкинскими лимфомами развиваются сочетанные иммунологические нарушения, проявляющиеся в снижении уровней иммуноглобулинов основных классов, относительного количества СЭЗ+, С04', С08+ - клеток, а так же спонтанной и стимулированной микробицидной активности нейтрофилов. Сдвиги иммунологических показателей связаны с ослаблением цитокинсекретирующей функции лимфоцитов и дисбалансом основных регуляторных цитокинов ТЫ/ТЬ2.

2. Для агрессивных форм неходжкинских лимфом характерно снижение относительного количества СОЗ+, СБ8+, С016+, С095+- лимфоцитов на фоне высокой продукции мононуклеарами антагонистов пролиферации и дифференцировки ТЪ-1 типа (ИЛ-4, ИЛ-10), провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1Р, а также повышенного содержания ИЛ-б в сыворотке крови.

3. В процессе химиотерапии при неходжкинских лимфомах наблюдается иммуносупрессия клеточного иммунитета с достоверным уменьшением процента СОЗ+, СБ4+ - лимфоцитов. Программы химиотерапии с включением моноклональных анти-СО 52 антител (алемтузумаб) приводят к снижению относительного количества СОЗ+, СЭ4+, С08+-клеток. Применение моноклональных анти -СО 20 антител (ритуксимаб) не оказывает выраженного влияния на Т- клеточный иммунитет.

4. Частота выявления молекулярных маркеров вирусных инфекций у больных неходжкинскими лимфомами составляет 29,5%. Причиной реактивации вирусной инфекции у больных неходжкинскими лимфомами является иммуносупрессия на фоне полихимиотерапии. Наибольшая частота выявления цитомегаловирусной инфекции наблюдается при химиотерапии в сочетании с моноклональными анти - СБ 52 антителами.

5. Наличие репликации герпесвирусной инфекции у больных неходжкинскими лимфомами коррелирует со снижением числа натуральных киллеров (С0161) и повышением в культуре мононуклеаров уровня ФНО-а, ИЛ-1р и ИЛ-10.

Практические рекомендации

1.У больных неходжкинскими лимфомами рекомендуется проведение

иммунологического мониторинга показателей субпопуляционного состава Т-

лимфоцитов на всех этапах лечения (до лечения, после трех курсов терапии и

по окончании терапии), позволяющего своевременно диагностировать глубину вторичного иммунодефицита и прогнозировать опасность развития инфекционных осложнений.

2. При химиотерапии с включением моноклональных анти-С052 антител необходимо проводить мониторинг маркеров цитомегаловирусной инфекции с периодичностью не реже двух раз в месяц.

3. Рекомендуется проведение динамического наблюдения за количеством С016+-лимфоцитов и уровнем ИЛ-10 в культуре мононуклеаров у больных неходжкинскими лимфомами с целью прогнозирования возможной активации герпесвирусных инфекций.

Список публикаций по теме диссертации Йовдий A.B.

1. Оценка показателей противовирусного иммунитета у больных неходжкинскими лимфомами / A.B. Йовдий, В.Т. Демьянова, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, E.JI. Назарова // Материалы научно -практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». Киров. - 2007. - С.60.

2. Динамика показателей клеточного звена иммунитета и цитокинового профиля у больных неходжкинскими лимфомами на фоне терапии ферровиром / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Е.Л. Назарова И Современные наукоемкие технологии. - 2008. - №6. - С.73.

3. Влияние вирусов на синтез цитокинов лимфоидными клетками больных неходжкинскими лимфомами / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, E.JI. Назарова, Т.П. Загоскина, В.Т. Демьянова // Материалы Всероссийского совещания «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения). Киров. - 2008. - С. 101.

4. Назарова, Е.Л. Выявляемость серологических маркеров вирусов гепатитов В и С у гематологических больных за период с 1992 по 2007 гг. / Е.Л. Назарова, В.И. Шардаков, A.B. Йовдий // Материалы Всероссийского совещания «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения). Киров. - 2008. - С. 116.

5. Йовдий, A.B. Оценка синтеза цитокинов лимфоидными клетками больных неходжкинскими лимфомами / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина // Материалы научно - практического симпозиума «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации». Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №9. - С.ЗЗ.

6. Йовдий, A.B. Особенности цитокинового профиля у больных хроническим лимфолейкозом / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина // Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию профессора A.M. Корепанова «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины». Ижевск. - 2009 - С. 91-93.

7. Иммунный статус у больных хроническим лимфолейкозом на фоне терапии алемтузумабом / М.Н. Хоробрых, Т.П. Загоскина, В.И.

Шардаков, A.B. Йовдий II Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию профессора A.M. Корепанова «Актуальные вопросы терапии и восстановительной медицины». Ижевск. -2009.-С. 137-140.

8. Синтез цитокинов опухолевыми клетками больных хроническим лимфолейкозом с маркерами вирусных инфекций / A.B. Йовдий, Е.Л. Назарова, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина // Материалы Российской научно - практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Вестник гематологии. - 2009. - №2. - С20-21.

9. Назарова, Е.Л. Влияние ферровира на цитокинсекретирующую функцию клона опухолевых клеток больных хроническим лимфолейкозом / Е.Л. Назарова, A.B. Йовдий, В.И. Шардаков // Материалы Российской научно - практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Вестник гематологии. - 2009. - №2. - С26-27.

Ю.Оценка показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета у больных хроническим лимфолейкозом на фоне терапии алемтузумабом / М.Н. Хоробрых, Т.П. Загоскина, В.И. Шардаков, A.B. Йовдий // Материалы Российской научно - практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Вестник гематологии. - 2009. - №2. - С48-49.

11 .Особенности клеточного звена иммунитета и цитокинового профиля у больных хроническим лимфолейкозом на фоне терапии ферровиром / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Е.Л. Назарова И Эффективная фармакотерапия в онкологии, гематологии и радиологии. -2009. - №3. - С.4-8.

^.Распространенность серологических маркеров repпесвирусов у больных хроническим лимфолейкозом / Е.Л. Назарова, В.И. Шардаков, A.B. Йовдий, М.Н. Хоробрых II Материалы Всероссийской научно -практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Вестник гематологии. -2010. -№1. -С.51-52.

13.Иммунная недостаточность у больных опухолями лимфатической системы с вирусной инфекцией / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Е.Л. Назарова, В.Т. Демьянова // Материалы Всероссийской научно - практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии». Вестник гематологии. - 2010. - №1. - С.34-35.

14-Характеристика иммунологических показателей у больных неходжкинскими лимфомами в зависимости от типа опухоли / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Е.Л. Назарова И Материалы Всероссийской научно - практической конференции «Актуарные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». Киров. - 2010. -С.230.

15.Иммунный и цитокиновый статус у больных хроническим лимфолейкозом, получающих терапию алемтузумабом / М.Н. Хоробрых,

Т.П. Загоскина, В.И. Шардаков, A.B. Йовдий // Медицинская иммунология. - 2010. - № 4-5. - С.447-452.

16.Характеристика показателей иммунитета у больных индолентными и агрессивными неходжкинскими лимфомами / A.B. Йовдий, В.И. Шардаков, Т.П. Загоскина, Е.Л. Назарова, М.Н. Хоробрых // Медицинская иммунология (принята к печати).

17.Приоритетная заявка на изобретение «Способ коррекции противовирусного иммунитета у больных хроническим лимфолейкозом» / Е.Л. Назарова, Т.П. Загоскина, В.И. Шардаков, В.Т. Демьянова, A.B. Йовдий. - per. № 2010138719.

Список сокращений

ВГС - вирусный гепатит С

ВГВ - вирусный гепатит В

ВПГ - вирус простого герпеса 1и 2 типов

ВЭБ - вирус Эпштейн - Барр

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ — интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

НХЛ - неходжкинская лимфома

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФГА - фитогемагглютинин

ФНО - фактор некроза опухолей

XT - химиотерапия

ЦМВ - цитомегаловирус

CD - cluster of differentiation

Th - T - хелперы

FC - флударабин, циклофосфан

CHOP - циклофосфан, винкристин, адриамицин, преднизолон RFC ~ ритуксимаб, флударабин, циклофосфан

R-CHOP - - ритуксимаб, циклофосфан, винкристин, адриамицин, преднизолон FluCam - флударабин, кэмпас

А-СНОР - алемтузумаб, циклофосфан, винкристин, адриамицин, преднизолон

Российский НИИГиТ 191024 Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16

Подписано в печать 18.11.2010 г. Бумага офсетная. Формат 60х84\16 Печать ризографическая. Тираж 100 экз.

Изготовлено в ПЦ Кировского ЦНТИ г. Киров, ул. Энгельса, 67; тел. (8332) 64-83-48

Актуальность проблемы

Противовирусный иммунитет включает в себя комплекс механизмов, направленных на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Реализация защитной реакции происходит при помощи как гуморальных компонентов, иммунитета (нейтрализация вирусов антителами, иммунный лизис инфицированных вирусом клеток с участием антител), так и клеточных (презентация вирусного антигена фагоцитами, цитотоксичность Т - лимфоцитов).

Динамическое изучение показателей противовирусного иммунитета у индивидуума позволяет прогнозировать у него развитие инфекционного процесса и проводить прицельную, коррекцию выявленных отклонений. Надо отметить, что существуют группы людей с высоким риском возникновения клинически значимой вирусной инфекции. К ним относятся* больные неходжкинскими лимфомами (НХЛ). Причиной. этого является непосредственное вовлечение в опухолевый процесс клеток иммунной системы, что приводит к изменениям количественных и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток и развитию вторичной иммунной недостаточности [51]. У больных неходжкинскими лимфомами повышен риск реактивации латентных вирусных инфекций, вызываемых вирусами семейства НегреБУтёае, существует вероятность обострения^ хронических вирусных гепатитов В и С [37]. При этом, наличие инфекционных осложнений может влиять на течение и исход заболевания и в некоторых случаях требует вынужденной отмены противоопухолевой терапии и назначения дополнительных медикаментозных средств.

Высокую репликативную активность вирусов у больных НХЛ связывают с угнетением звеньев иммунитета, принимающих участие в противовирусной защите - снижением количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, нейтрофилов, уменьшением уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови [96].

Тем не менее, механизмы формирования иммунной недостаточности у больных 6

НХЛ и факторы, предрасполагающие к реактивации вирусной инфекции, в настоящее время остаются до конца не изученными. Совершенно не раскрыта роль регуляторов иммунитета - цитокинов при этой патологии-. В частности, не изученным, остается' вопрос участия* цитокинов-в регуляции противовирусного иммунитета; а именно, не прослежена связь изменений" субпопуляционного' состава Т - лимфоцитов с уровнем иммунорегуляторных пептидов.

Не до конца установлена патогенетическая роль иммуносупрессивного действия химиотерапии при НХЛ. Практически отсутствуют сведенияг о состоянии противовирусного иммунитета, и цитокинового профиля у больных НХЛ, получающих лечение с включением- новых противоопухолевых препаратов - моноклональных анти - СБ20 и анти - СБ52антител.

Следовательно, использование современных иммунологических методов, исследования позволяет получить дополнительные сведения о. рол и медиаторов межклеточных взаимодействий в. реакциях противовирусного иммунитета у больных НХЛ и определить новые иммунологические критерии, предрасполагающие к,развитию у них инфекционных вирусных осложнений. Исходя из этого, проведение многоплановых иммунологических исследований у больных НХЛ с учетом проводимой современной, химиотерапии, следует признать актуальным.

Цель исследования

Оценить состояние противовирусного иммунитета и установить факторы, обусловливающие реактивацию вирусных инфекций у больных НХЛ.

Задачи исследования

1.Оценить показатели Т- клеточного иммунитета, гуморальные и неспецифические факторы защиты у больных неходжкинскими лимфомами.

2. Определить выраженность иммуносупрессивного влияния химиотерапии с включением моноклональных анти - СБ20 и анти - СВ52 антител на субпопуляционный состав Т - лимфоцитов.

3. Изучить частоту и структуру вирусных инфекций в зависимости от состояния иммунореактивности организма больных и вида проводимой терапии.

4. Оценить взаимосвязь степени иммуносупрессии у больных неходжкинскими лимфомами и реактивации вирусной инфекции.

Научная новизна

На основе всестороннего анализа полученных результатов выявлены основные звенья формирования вторичной иммунной недостаточности у больных НХЛ. Установлен комбинированный характер изменений иммунитета, связанный не только с депрессией гуморальных и клеточных его компонентов, но и с нарушением цитокинзависимо^ иммунорегуляции. Дана развернутая^ характеристика цитокинового профиля больных НХЛ, показана зависимость иммунных нарушений от вида опухолевого роста, стадии патологического процесса и проводимой терапии. Установлена частота вирусных инфекций у первичных больных и- пациентов, получавших ранее терапию, и ее связь с изменениями иммунологических показателей.

Практическая значимость

Выявлены основные патогенетические звенья формирования иммунодефицитного состояния? у больных НХЛ. Установлен высокий иммуносупрессивный эффект ПХТ с включением алемтузумаба. Васскрыта корреляционная зависимость снижения,количества С01б+-клеток и возрастания концентрации ИЛ-10 в культуре мононуклеаров с частотой выявления маркеров герпесвирусной репликации, что может служить прогностическим иммунологическим параметром, характеризующим вероятность реактивации вирусной инфекции у пациентов с НХЛ.

Положения. выносимые на защиту

1. Показатели иммунного статуса у больных НХЛ имеют отличия* от региональных иммунологических данных здоровых лиц: наблюдается снижение относительного количества CD3 CD4 -, CD8-лимфоцитов, значения CD4+/CD8+, концентрации сывороточных IgG, IgA, IgM, ослабление кислородозависимой микробицидной активности нейтрофилов, а также присутствует дисбаланс в системе цитокинов.

2. Степень угнетения Т- клеточного иммунитета ассоциируется с агрессивностью заболевания и стадией патологического процесса.

3. Снижение числа CD 16+-клеток и повышение уровня ИЛ-10 в культуре лимфоцитов у больных НХЛ коррелируют с возрастанием активности герпесвирусной инфекции.

4. Программы химиотерапии с включением алемтузумаба приводят к снижению относительного количества CD3+-, CD4+-, СБ8+-лимфоцитов у больных НХЛ в 1,2 раза более значимую по сравнению с режимами* химиотерапии без моноклональных антител.

Апробация диссертационного материала

Результаты исследований доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения) (Киров, 2008) и на заседании областного общества гематологов -трансфузиологов (Киров, 2009). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ? Получена приоритетная заявка на изобретение «Способ коррекции противовирусного иммунитета у больных хроническим лимфолейкозом» per. № 2010138719.

Реализация работы

Результаты работы используются в работе гематологической клиники ФГУ «КНИИГ и ПК ФМБА России» при определении иммунного статуса и выборе тактики противовирусной терапии. Полученные данные легли в основу 9 учебно - методических пособий на кафедре гематологии и геронтологии ГОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия Росздрава».

Объем и структура работы

Диссертация представлена на 122 листах. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, двух глав собственных наблюдений и заключения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя 178 источников литературы, из которых 102 иностранный.

выводы

1. У больных неходжкинскими лимфомами развиваются сочетанные иммунологические нарушения, проявляющиеся в снижении уровней иммуноглобулинов основных классов, относительного количества СБЗ+, СБ4+, СБ8+ - клеток, а так же спонтанной и стимулированной микробицидной активности- нейтрофилов. Сдвиги иммунологических показателей связаны с ослаблением дитокинсекретирующей функции лимфоцитов и дисбалансом основных регуляторных цитокинов ТЫ/ТЬ2.

2. Для агрессивных форм неходжкинских лимфом характерно снижение относительного количества ОБЗ+, СБ8+, СБ16+, СБ95+- лимфоцитов на фоне высокой продукции мононуклеарами антагонистов пролиферации и дифференцировки ТЬ-1 типа (ИЛ-4, ИЛ-10), провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1 р, а также повышенного содержания ИЛ-6 в сыворотке крови.

3. В процессе химиотерапии при неходжкинских лимфомах наблюдается супрессия* Т-клеточного иммунитета с достоверным уменьшением процента СБЗ+, СБ4+ - лимфоцитов. Программы терапии с включением моноклональных анти — СБ 52 антител (алемтузумаб) приводят к снижению относительного количества СБЗ+, СБ4+, СБ8+- клеток. Применение моноклональных анти - СБ 20 антител (ритуксимаб) не оказывает выраженного влияния на Т- клеточный иммунитет.

4. Частота выявления молекулярных маркеров вирусных инфекций у больных неходжкинскими лимфомами составляет 29,5%. Причиной реактивации вирусной инфекции у больных неходжкинскими лимфомами является иммуносупрессия на фоне полихимиотерапии. Наибольшая частота выявления цитомегаловирусной инфекции наблюдается при терапии моноклональными анти - СБ 52 антителами.

5. Наличие репликации герпесвирусной инфекции у больных неходжкинскими лимфомами коррелирует со снижением числа натуральных киллеров (СБ 16+) и повышением в культуре мононуклеаров уровня ФНО-а, ИЛ-1Р и ИЛ-10.

Практические рекомендации

1.У больных неходжкинскими лимфомами рекомендуется проведение иммунологического мониторинга показателей субпопуляционного состава Т- лимфоцитов на всех этапах лечения (до лечения, после трех курсов терапии и по окончании терапии), позволяющего своевременно диагностировать глубину вторичного иммунодефицита и прогнозировать опасность развития инфекционных осложнений.

2. При химиотерапии с включением моноклональных анти-СБ52 антител необходимо проводить мониторинг маркеров цитомегаловирусной инфекции с периодичностью не реже двух раз в месяц.

3. Рекомендуется проведение динамического наблюдения за количеством СБ 16+-лимфоцитов и уровнем ИЛ-10 в культуре мононуклеаров у больных неходжкинскими лимфомами с целью прогнозирования возможной активации герпесвирусных инфекций.