Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Состав и резистентность к окислению субфракций липопротеинов низкой плотности у больных ишемической болезнью сердца и дислипопротеинемиями

о а

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СИБИРСКОЕ ИНСТИТУТ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОТДЕЛЕНИЕ

ТЕРАПИИ

На правах рукописи

РАГИНО ЮЛИЯ ИГОРЕВНА

СОСТАВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ СУБФРАКЦИЙ ЛИПОПРОТЕИНОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА И ДИСЛИПОПРОТЕИНЕМИЯМИ

14.00.06 - кардиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте терапии Сибирского отделения РАМК Научный руководитель:

академик РАМН Никитин Ю. П.

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Душкин М.И.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Верещагина Г. Н.

доктор медицинских наук, академик РАМН Панин Л.Е.

Ведущая организация: НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН

Защита диссертации состоится "_"_1997 года

в _часов на заседании специализированного совета Д 001.31.01

в Институте терапии Сибирского отделения РАМН (630003, г. Ново-сибирск-3, ул. Владимировский спуск 2а). С диссертацией можно ознакомиться в оиблиотеке Института.

Автореферат разослан "_"__1997 года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

Курилович С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ишемическая болезнь сердца (ИБС), основой которой является атеросклероз коронарных артерий, по-прежнему остается основной причиной инвалидности и смертнбсти среди наиболее трудоспособной части населения во всех индустриально развитых странах, в том числе в России.

Согласно данным экспериментальных и эпидемиологических исследований обнаружена выражейная связь между высоким уровнем холестерина (ХС) сыворотки крови, особенно ХС липопротеинов низкой плотности (ЛНП), и развитием атеросклероза и ИБС (Орехов А.Н. и соавт., 1995; Константинов В. В. и соавт., 1996; Климов А.Н., Ни-кульчева Н.Г., 1984). ЛНП представляют собой гетерогенный класс липопротеинов. по-скольку внутри их плотностного градиента (1,019-1,063 г/мл) обнаружены субпопуляции частиц, различных как по физикохимическим свойствам, так и по биологическим функциям (Chapman M.J. et al., 1988; Krauss R.M., 1991; Campos H. et al.. 1992).

В последние годы интенсивно проводятся исследования, выясняющие роль отдельных субфракций ЛНП в обмене липопротеинов как в норме (Krauss R.M.. 1982; Campos Н. et al.. 1992; Esterbauer H., Jürgens G., 1993), так и при атеросклерозе и ИБС (De Graaf J. et al., 1992; Chapman'м.J. et al., 1995, 1996). Было обнаружено, что с увеличением плотности субфракций ЛНП увеличивается содержание в них свободного ХС и его эфиров. Мелкие плотные субфракции ЛНП слабо связываются с В/Е рецепторами In vitro (N1-gon F. et al.. 1991; Chappey В. et al.. 1995). длительное время присутствуют в плазме in vivo (Caslake M.J. et al.. 1993) и вызывают накопление ХС в культивируемых гладкомышечных клетках (Austin М.A. et al.. 1990). Таким образом, мелкие плотные частицы ЛНП являются наиболее атерогенными, поэтому исследование субфракционного состава ЛНП имеет определенное значение для понимания патогенетических механизмов развития атеросклероза и предшествующих ему дислипопротеинемий (ДЛП).

Недавно были получены доказательства, что наряду с повышенным содержанием ХС в ЛНП, ключевую роль в инициации и развитии атеросклероза играет окислительная модификация ЛНП (Steinbrecher U.Р., 1990; Esterbauer Н. et al.. 1990. 1992; Климов А.Н.. Ни-кульчева Н.Г.. 1995). Эта концепция базируется на следующих экспериментальных результатах: 1) ЛНП, экстрагируемые из атероскле-

- 3 -

ротических бляшек человека и животных имею'т физические и биологические свойства, подобные свойствам окисленных in vitro ЛНП. и проявляют способность к повышенному взаимодействию ср скэвенд-жер-рецепторами макрофагов, которые трансформируются ^ пенистые клетки ( Via D. P. étal., 1985; Haberland М.Е. et al.. 1988; Sparrow С. P. et al., 1989; Steinberg D.. 1992; Keldar S. et al., 1994); 2) обнаружено, что некоторая часть ЛНП в русле крови больных атеросклерозом прявляет свойства окисленных ЛНП (Palins-kl W. et al., 1989); окисленные ЛНП являются иммуногенными частицами и антитела против полученных in vitro окисленных ЛНП взаимодействуют с эпитопами ЛНП, полученных из атеросклеротичес-ких бляшек (но не из нормальной сосудистой ткани) (Shaikh M. et al., 1988); 4) некоторые антиоксиданты, такие как пробукол. препятствуя окислительной модификации ЛНП, оказывают положительный эффект, по крайней мере при экспериментальном атеросклерозе (Климов А.Н., Никульчева Н.Г.. 1995).

Однако даже у больных с выраженным атеросклерозом не удается обнаружить значительной окислительной модификации ЛНП, циркулирующих в крови, так как существует целый комплекс антиокси-дантных систем (Меньшикова Е.Б. и соавт., 1994). Тем не менее. По некоторым данным. ЛНП. выделенные из крови больных коронарным атеросклерозом более чувствительны к окислению, чем ЛНП здоровых лиц (Орехов А.Н. и соавт., 1995). Детальных исследований резистентности к окислению отдельных субфракций ЛНП у больных ИБС проводилось мало.

Настоящая работа посвящена изучению субфракционного состава и. резистентности к окислению ЛНП у больных ИБС и атерогенныт ДЛП и разработке простого способа исследования резистентности к окислению ЛНП сыворотки крови.

Целью настоящей работы являлось исследование состава и резистентности к окислению отдельных субфракций ЛНП. а также ЛОНП у больных ИБС.

Задачи исследования.

1. Исследовать состав и резистентность к окислению отдельных субфракций ЛНП .у здоровых людей.

2. Исследовать состав и резистентность к окислению отдельных субфракций ЛНП у больных ИБС с ДЛП 116 типа.

3. Исследовать состав и резистентность к окислению отдельных субфракций ЛНП у больных йнсулиннезависимым сахарным диабетом с таким же типом ДЛП, как и больных ИБС.

- 4 -

4. Разработать простой способ исследования резистентности к окислению ЛНП сыворотки крови.

Научная новизна. Наряду с исследованиями, которые нашли свое отражение в научной литературе, большинство данных было получено нами впервые. Изучены особенности субфракционнего состава и резистентности к окислению ЛНП у больных ИБС с дислипопротеи-немией 116 типа.

Впервые была показана связь между изменениями содержания холестерина, белка, исходного уровня продуктов ПОЛ и резистентности к окислению ЛОНП и отдельных субфракций ЛНП со степенью тяжести ИНЗСД.

С целью внедрения в клиническую практику был разработан оригинальный способ определения резистентности к окислению ЛНП сыворотки крови, который позволяет сравнительно быстро оценивать предрасположенность ЛНП к окислительной модификации.

Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое значение данной работы состоит в выяснении особенностей во-первых, липидно-белкового состава отдельных субфракций ЛНП и, во-вторых, их резистентности к окислению у больных ИБС, а также у больных ИНЗСД. Полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ИБС с ДЛП Нб типа вероятно в результате нарушения нормального процесса трансформации ЛОНП в субфракции ЛНП, а также снижения скорости их метаболизма, наблюдается повышенное количество ХС-нагруженных ЛОНП, более легких и более плотных субфракций ЛНП. Кроме того, подобные изменения холестерин-белкового спектра ЛОНП и отдельных субфракций ЛНП обнаружены и у больных ИНЗСД. особенно его тяжелой формой. Установлено, что ЛОНП и все исследованные субфракции ЛНП, как у больных ИБС с ДЛП Пб типа, так и у больных тяжелой формой ИНЗСД обладают сниженной резистентностью к окислению по сравнению со здоровыми людьми. Причем снижение резистентности к окислению наиболее выражено у более плотных субфракций ЛНП. Полученные результаты позволили заключить, что»у больных ИБС с дислипопротеинемией 116 типа и у больных тяжелой формой ИНЗСД наблюдаются сходные изменения в ЛОНП и во всех субфракциях ЛНП, в частности, повышение содержания холестерина и снижение резистентности к окислению.

Практическое значение настоящей работы заключается в том, что с целью внедрения в клиническую практику разработан методически простой способ исследования резистентности к окислению ге-парин-осажденных ЛНП сыворотки крови. Разработанный способ явля-

- 5 -

ется достаточно информативным и позволяет быстро оценить предрасположенность ЛНП к окислительной модификации, являющейся одним из риск-факторов развития атеросклероза.

На защиту выносятся следующие положения:

У больных ИБС с ДЛП 116 типа содержание холестерина повышено в основном в более плотных субфракциях ЛНП.

У больных ИБС наиболее плотные субфракции ЛНП обладают повышенным исходным уровнем продуктов ПОЛ и сниженной резистентностью к окислению.

У больных ИБС с ДЛП 116 типа и у больных тяжелой формой ин-сулиннезависимого сахарного диабета в субфракциях ЛНП наблюдаются сходные изменения холестерин-белкового состава и резистентности к окислению.

Апробация работы. Основные положения и выводы данной диссертационной работы были доложены на Сибирской кардиологической конференции "Диагностика, лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний" (Новосибирск. 1996), конференции "Современные лечебные и диагностические технологии в медицине" (Новосибирск, 1997) и I Конгрессе Ассоциации кардиологов стран СНГ (Москва, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Данная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц. 22 рисунка и состоит из введения, литературного обзора, описания собственных исследований, включающего материалы и методы, 4 главы собственных результатов и их обсуждение, а также выводов и списка литературы, состоящего из 211 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 159 человек. В качестве обследуемых выступали пациенты, проходящие курс лечения в клинике Института терапии СО РАМН и практически здоровые люди (контрольная группа лиц). Все обследованные - мужчины (табл. 1).

Среди обследованных - 58 мужчин с ИБС. Диагноз устанавливался на основании клинической картины, результатов биохимических исследований, электрокардиографического исследования, данных велоэргометрии и коронароангиографии. У 5 мужчин в анамнезе был перенесенный инфаркт миокарда. У 36 обследованных мужчин была

- 6 -

стабильная стенокардия напряжения II функционального класса и у 22 - III функционального класса (по классификации ВОЗ. 1979). Длительность заболевания колебалась от 3 до 22 лет. Согласно данным, представленным в таблице 2. все больные с ИБС были подобраны с ДЛП Нб типа (концентрация ХС в крови регистрировалась на уровне 6,59 ммоль/л или выше, а содержание ТГ находилось в пределах 1,98-3,73 ммоль/л) для сравнения с группой больных ИНЗСД у которых также наблюдалась ДЛП 116 типа.

С целью сравнения с данными при ИБС с ДЛП Нб типа была обследована группа из 26 больных инсулиннезависимым сахарным диабетом тоже с ДЛП того же типа - Нб. Диагноз ставился на основании данных клинических, лабораторных и биохимических методов исследования. Длительность заболевания колебалась от 1 до И лет. По степени тяжести заболевания пациенты были разделены на 3 группы. Первую составили 9 мужчин, больных ИНЗСД тяжелой степени тяжести (гликемия натощак до лечения заболевания превышала 14 ммоль/л, лабильное течение заболевания, склонность к кетоацидо-зу. потребность в инсулинотерапии, наличие осложнений), вторую группу составили 10 мужчин, больных ИНЗСД средней степени тяжести (гликемия натощак до начала лечения 7.8-14 ммоль/л. прием пе-роральных сахаропонижающих препаратов или инсулина до 60 ед/сут-ки. отсутствие кетоацидоза). Третью группу составили 7 мужчин, больных ИНЗСД легкой степеш? тяжести (гликемия натощак от 6,0 до 7,8 ммоль/л, отсутствие кетоацидоза, диетотерапия).

Кроме больных ИБС и ИНЗСД, было обследовано 170 практически здоровых мужчин. Для формирования группы сравнения были отобраны 75 человек, у которых не было ДЛП и которые по возрасту были близкими ("парными") возрасту больных ИБС. У отобранных мужчин группы сравнения не было признаков сердечно-сосудистых заболеваний согласно документированным данным клинических, электрокардиографических и эхокардиографических исследований, а также отрицательным результатам велоэргометрической пробы. В группу сравнения не включались мужчины с признаками эндокринных заболеваний (по данным клинических, лабораторных и биохимических методов исследования), а также заболеваний печени, почек, дыхательной и желудочно-кишечной систем. Согласно данным, представленным в таблице 2, у всех отобранных мужчин контрольной группы наблюдались нормолипидемия и нормальные показатели биохимического и лабораторного исследований крови и мочи.

У всех пациентов обследование проводилось при поступлении в

- 7 -

Таблица 1.

Общие сведения об обследованных

Возрастые Средний Количество

Группы обследованных границы возраст обследован-

(годы) (М + ш) ных

Практически здоровые люди 35 - 48 41,2 + 2,2 75

Больше ИБС

стенокардия напряж-я ФК II 45 - 57 52,3 +1.9 36

стенокардия напряж-я ФК III 51 - 64 59,0 +1.6 22

общая группа 45 - 64 56,1 + 2,4 58

Больные ИНЗСД 40 - 60 51,4 + 2,4 26

Таблица 2.

Содержание холестерина, триглицеридов и холестерина ЛВП сыворотки крови у обследованных групп лиц

Группы обследованных Общий холестерин, ммоль/л Холестерин ЛВП, ммоль/л Триглицериды. ммоль/л

Границы (М + Ш) Границы (М + Ш) Границы (М + Ш)

Здоровые лица 4,1- 5,9 4.7+ 0.4 0,9-2,2 1.1+0.1 0,4-1,2 0,8+0,1

Больные ИБС стенокардия нап-я ФК II стенокардия нап-я ФК III общая группа 6,6-11,9 7,2-11,9 6,6-11.9 7,9+ 0.5 8.6+ 0.6 8,1+ 0,6 1,0-4,5 1.0-2,6 1,0-4,5 1.6+0,3 1,4+0,2 1,5+0,3 2.0-3.4 2.1-3.7 2.0-3,7 2.4+0.2 2,7+0.2 2,5+0,3

Больные ИЦЗСД общая группа тяж. ст. тяж. сред.ст.тяж. легк. ст. тяж. 4,8- 8,1 5.7- 8,1 4.8- 6,0 4.8- 5,9 6.2+ 0, 3 6,9+ 0.4 5,3+ 0.3 5,1+ 0.3 0, 8-2, 5 0.8-1,5 0, 8-1.3 1,2-2,5 1,2+0,1 1.2+0.1 1.0+0.1 1.4+0,1 0, 6-2,9 1.9-2,9 1,3-2,9 0,6-1.9 2,0+0,3 2.2+0.2 1.9+0,2 1,4+0,2

клинику (не позже 3-го дня после поступления). Кровь для исследования брали утром натощак из локтевой вены не ранее чем через 12 часов после последнего приема пищи. Содержание общего ХС. ТГ и ХС-ЛВП сыворотки крови определялось ферментативным методом с использованием стандартных реактивов "Boehrlnger Mannhelm" (Германия) (совместно с научным сотрудником лаборатории клинической биохимии Института терапии СО РАМН М.В. Ивановой).

Нативные ЛОНП (плавучая плотность - 1,019 г/мл), нативные ЛНП (плавучая плотность - 1,019-1,063 г/мл) и субфракции ЛНП (ЛНП-1 - 1,019-1,028 Г/мл; ЛНП-2 - 1.028-1.037 Г/мл; ЛНП-3 -1,037-1,046 Г/мл; ЛНП-4 - 1,046-1,055 Г/мл; ЛНП-5 - 1,055-1.063 г/мл) выделяли методом последовательного ультрацентрифугирования (Llndgren F.Т. et al., 1972) из плазмы крови.

Осажденные ЛНП получали из сыворотки крови методом осаждения (Burstein М.. Scholnlk H.R., 1973; Llndgren F.Т. et al.. 1977) в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки), промывали 0.9 % раствором хлорида натрия с 50 мМ раствором фосфатного буфера. pH 7,4 и растворяли в 1 М растворе хлорида натрия.

В полученных липопротеинах определяли общий ХС ферментативным методом, используя стандартные реактивы "Boehrlnger Mannhelm" (Германия), а также содержание белка по методу Лоури (Lowry Н. et al., 1951).

Окислительную модификацию ЛНП проводили в среде Дульбекко без кальция и магния, содержащей 10 мкмоль CuS04 (для нативных ЛНП) и 50 мкмоль CuSO« (для осажденных ЛНП) в присутствии 0,2 мг/мл ЛНП. Пробы инкубировали при 37°С на водяной бане. Через определенные промежутки времени (Оч, 1ч, 2ч) оценивали степень окислительной модификации ЛНП с помощью определения ТБК-реактив-ных продуктов флуориметрическим методом (Schuh J. et al.. 1978). Результаты выражали в нмоль МДА/мг ЛНП.

Статистическая обработка результатов

Результаты представлены в виде М + т. где М - среднее арифметическое, а га - ошибка среднего. Статистически значимые различия определяли, используя t-критерий Стьюдента для средних арифметических (Р<0,05). Корреляционный анализ проводился с использованием программы STATGRAFICS на PC IBM АТ-286.

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СОСТАВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ СУБФРАКЦИЙ ЛНП У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ При исследовании белка в ЛОНП и субфракциях ЛНП у здоровых людей было обнаружено, что этот показатель повышался с увеличением плотности субфракций ЛНП, причем концентрация белка в ЛНП-4 была в 2.8 раза больше, а в ЛНП-5 - в 3,8 раза больше по сравнению с ЛНП-1 (рис. 1). Содержание ХС в ЛОНП было в 2 раза больше по сравнению с ЛНП-1. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение концентрации ХС в ЛНП-4 и ЛНП-5 в сравнении с ЛНП-1, в 4,1 и 5,2 раза, соответственно (рис. 2). Величина, отношения ХС/белок повышалась от ЛОНП к ЛНП-3 и. далее снижалась к ЛНП-5. Однако, величина отношения ХС/белок в ЛНП-5 была в 1,4 раза больше, чем в ЛНП-1 (рис. 3).

Исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) повышался от ЛОНП к ЛНП-5, причем, содержание продуктов ПОЛ в ЛНП-5 было в 1,8 раза больше, чем в ЛНП-1 и в 2 раза больше. чем в ЛОНП (рис. 4). При исследовании резистентности ЛОНП и субфракций ЛНП к окислению было выявлено, что количество МДА в исследуемых липопопротеинах после 1 часа инкубации повышалось с увеличением их плотности (рис. 5). Однако после 2 часов инкубации обнаружено значительное снижение резистентности к окислению ЛНП-3, ЛНП-4 и ЛНП-5 (более плотных субфракций ЛНП) по сравнению с ЛНП-2 и ЛНП-1 (более легкими субфракциями ЛНП). Резистентность к окислению ЛОНП была в 4 раза выше по сравнению с ЛНП-5 и составляла 4,6 + 0,6 и 16,7 + 1.2 нмоль МДА/мг белка ЛП, соответственно (рис. 6).

Таким образом, у здоровых людей, с увеличением плотности субфракций ЛНП. в них возрастает содержание белка. ХС и исходный уровень продуктов ПОЛ. а резистентность к окислению снижается и более плотные субфракции ЛНП являются менее устойчивыми к окислению.

СОСТАВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ СУБФРАКЦИЙ ЛНП У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА У всех больных ИБС с ДЛП Нб типа было обнаружено достоверное увеличение концентрации белка в ЛОНП, ЛНП-1 и ЛНП-5 (в 1.7, в 1,6 и 1,3 раза, соответственно) в сравнении со здоровыми людьми (рис. 1). Концентрация ХС была достоверно повышена в ЛОНП в 2.4 раза, в ЛНП-1 - в 3,1 раза, а в более плотных (ЛНП-З, ЛНП-4,

- 10 -

лонп

Зооршые яю»и

10( 309 А

АНП3"о'

9 «V

9

АНП5 10<-

О !

Диабет

Рисунок 1. Содержание белка в ЛОНП и субфракциях ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми.

По оси абсцисс: 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжения ФК II и ФК III; 4, 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести. По оси ординат: мг/л. * - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - Р<0,01 в сравнении со здоровыми людьми.

ЛОНП 4

Q:

ЛНП. 4

Ф!

Ш2 4

3555515 иве

Пнци

flUMIT

i-дь Ш шш ^Ai1

, ** ** ** * »

'г~ I Ш\ ГД1ГТП I

1 2

Рисунок 2. Содержание холестерина в ЛОНП и субфракциях ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми.

По оси абсцисс': 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжения ФК II и ФК III; 4. 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести. По оси ординат: ммоль/л. » - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - Р<0.01 в сравнении со здоровыми людьми.

Рисунок 3. Величина отношения холестерин/белок в ЛОНП и субфракциях ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми.

По оси абсцисс: 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжений ФК II и ФК III; 4, 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести.

* - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - р<о,01 в сравнении со здоровыми людьми.

ЛОНП 6

9:

ЛНП

Рисунок 4. Исходный уровень продуктов ПОЛ в ЛОНП и субфракциях ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми.

По оси абсцисс: 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжения ФК II и ФК III; 4, 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести. По оси ординат: нмоль МДА/мг белка ЛП. * - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - Р<0,01 в сравнении со здоровыми людьми.

лнп5

о

Рисунок 5. Резистентность к окислению после 1 часа инкубации ЛОНП и субфракций ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми. По оси абсцисс: 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжения ФК II и ФК III; 4-, 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести. По оси ординат: нмоль МДА/мг белка ЛП. * - р<о,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - PCO.01 в сравнении со здоровыми людьми.

АОНП

Здоровые ^пови

КТ^З

ИБС -* *

Ли*бет

ВЙИ КЙЧЩ

лнп5

О 10

Рисунок 6. Резистентность к окислению после 2 часов инкубации ЛОНП и субфракций ЛНП у больных ИБС и у больных ИНЗСД по сравнению со здоровыми людьми. По оси абсцисс: 1 - общая группа больных ИБС; 2 и 3 - стенокардия напряжения ® II и ФК III; 4, 5 и 6 -больные ИНЗСД легкой, средней и тяжелой степени тяжести. По оси ординат: нмоль МДА/мг белка ЛП. * - Р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми; ** - Р<0,01 в сравнении со здоровыми людьми.

ЛНП-5) субфракциях ЛНП - в 2 раза по сравнению с контрольной группой лиц (рис. 2). Величина отношения ХС/белок возрастала о увеличением плотности субфракций ЛНП у больных ИБС и была досто--верно повышена в ЛОНП, ЛНП-1, ЛНП-4 и ЛНП-5 у всех больных ИБС с ДЛП 116 типа (в 1.7. в 1,7, в 1,4 и 1.8 раз, соответственно) в сравнении с контрольной группой лиц (рис. 3). Достоверных различий между содержаниями белка, ХС и величинами отношений ХС/белок в ЛОНП и субфракциях ЛНП у больных ИБС со стенокардией напряжения II и III функциональных классов обнаружено не было.

Исходный уровень МДА повышался с увеличением плотности субфракций ЛНП у всех больных ИБС с ДЛП Нб типа. Кроме того, этот показатель был достоверно повышен в ЛОНП в 2,9 раз, во всех пяти субфракциях ЛНП, но особенно, в ЛНП-3, ЛНП-4 и ЛНП-5 (в 3,5, 3.1 и 3.2 раза, соответственно) у больных ИБС в сравнении с контрольной группой лиц (рис. 4). С увеличением плотности субфракций ЛНП. их резистентность к окислению незначительно снижалась у больных ИБС с ДЛП 116 типа. В то же время у всех больных ИБС ЛОНП и все субфракции ЛНП обладали достоверно сниженной резистентностью к окислению после 1. и 2 часов инкубации в сравнении со здоровыми людьми (рис. 5 и 6). Достоверных различий между содержанием исходного уровня продуктов ПОЛ и резистентностью к окислению ЛОНП и субфракций ЛНП у больных ИБС со стенокардией напряжения II и III функциональных классов обнаружено не было.

Таким образом, у больных ИБС с ДЛП Пб типа наблюдается увеличенное количество ХС-богатых. имеющих повышенный показатель ХС/белок, ЛОНП, а также легких (ЛНП-1) и плотных (ЛНП-4 и ЛНП-5) субфракций ЛНП. По мере увеличения плотности субфракций ЛНП. исходный уровень содержания продуктов ПОЛ в них возрастает, а резистентность к окислению снижается. Кроме того, у больных ИБС с ДЛП Пб типа. ЛОНП и все субфракции ЛНП обладают достоверно повышенным исходным уровнем продуктов ПОЛ и сниженной резистентностью к окислению в сравнении с контрольной группой лиц.

СОСТАВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ СУБФРАКЦИЙ ЛНП У БОЛЬНЫХ ИНСУЛИННЕЗАВИСИМЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ Были выявлены достоверно повышенные концентрации белка в ЛОНП и в ЛНП-5 (в 1.6 и в 1.4 раза, соответственно) у больных тяжелой формой, а также в ЛНП-5 (в 1,3 раза) у больных средней степени тяжести ИНЗСД в сравнении со здоровыми людьми (рис. 1). Содержание ХС было достоверно повышено в ЛОНП и ЛНП-1 у больных

- 17 -

тяжелой формой (в 2.2 и в 2,5 раза, соответственно) и, в меньшей мере у больных средней степени тяжести ИНЗСД (в 1,7 раза). Кроме того, этот показатель также был достоверно увеличен в ЛНП-4 и ЛНП-5 у всех больных ИНЗСД по сравнению с контрольной группой лиц, причем по степени этого увеличения больные ИНЗСД располагались в следующем порядке: больные тяжелой степени тяжести > больные средней степени тяжести > больные легкой формой заболевания (рис. 2). Повышенная величина отношения ХС/белок наблюдалась только у больных тяжелой формой ИНЗСД в ЛОНП. ЛНП-1, ЛНП-4 и ЛНП-5 (в 1,7, 1.4, 1,4 и 1,2 раза, соответственно) по сравнению со здоровыми людьми (рис. 3). Были обнаружены сходные показатели содержания белка и ХС в ЛОНП и субфракциях ЛНП, особенно в ЛНП-4 и ЛНП-5, у больных тяжелой формой ИНЗСД по сравнению с больными ИБС.

У всех больных ИНЗСД, с увеличением плотности субфракций ЛНП, в них повышался исходный уровень продуктов ПОЛ. Кроме того, было обнаружено достоверное увеличение этого показателя в ЛОНП и во всех субфракциях ЛНП у больных средней и, особенно, тяжелой степени тяжести заболевания (в 2,6 раза) в сравнении со здоровыми людьми (рис.. 4). Резистентность ЛОНП к окислению после 1 и 2 часов инкубации была достоверно 2-кратно снижена только у больных тяжелой формой ИНЗСД (рис. 5 и 6). С увеличением плотности субфракций ЛНП, их резистентность к окислению снижалась у всех больных ИНЗСД и более плотные субфракции ЛНП (ЛНП-3, ЛНП-4, ЛНП-5) отличались наиболее сниженной резистентностью к окислению в течении 1 и 2 часов инкубации. Резистентность к окислению всех субфракций ЛНП после 1 часа инкубации у больных средней степени тяжести сахарного диабета была достоверно снижена, но в меньшей мере, чем у больных тяжелой формой заболевания по сравнению с контрольной группой лиц (рис. 5). Однако, после 2-х часов инкубации, различий между сниженной резистентностью к окислению всех субфракций ЛНП у больных тяжелой и средней степени тяжести ИНЗСД обнаружено не было (рис. 6). У больных легкой степени тяжести ИНЗСД также наблюдалось достоверное снижение резистентности к окислению ЛНП-3, ЛНП-4 и ЛНП-5 (в 1,7, 1,9 и 1,8 раз, соответственно) в сравнении со здоровыми людьми (рис. 6). Не выявлено различий между сниженной резистентностью к окислению ЛОНП и всех субфракций ЛНП после 1 и 2 часов инкубации у больных тяжелой формой ИНЗСД по сравнению с больными ИБС.

Таким образом, у больных тяжелой и, в меньшей мере, средней

- 18 .-

степени тяжести ИНЗСД наблюдается увеличение количества ХС-бога-тых и имеющих повышенный показатель ХС/белок, ЛОНП, более легких (ЛНП-1) и более плотных (ЛНП-4 и ЛНП-5) субфракций ЛНП по сравнению со здоровыми людьми. Увеличение количества ХС в ЛНП-4 и ЛНП-5 обнаружено и при легкой форме ИНЗСД. У всех больных ИНЗСД. с увеличением плотности субфракций ЛНП, исходный уровень продуктов ПОЛ повышается, а резистентность к окислению снижается. У больных тяжелой формой ИНЗСД ЛОНП и все субфракции ЛНП обладают повышенным исходным уровнем продуктов ПОЛ и сниженной резистентностью к окислению по сравнению с контрольной группой лиц, а также одинаково сниженной резистентностью к окислению по сравнению с больными ИБС. Наблюдается снижение резистентности к окислению ЛНП-3. ЛНП-4, ЛНП-5 даже при легкой степени тяжести ИНЗСД.

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ ГЕПАРИН-ОСАЖДЕННЫХ ЛНП В настоящей работе разработан способ определения резистентности к окислению гепарин-осажденных ЛНП сыворотки крови (способ подробно описан во 2 главе диссертации).

Была обнаружена сильная положительная корреляция (г=+0,98 + 0,04, р<0,0001) между классическим способом определения резистентности к окислению ЛНП, выделенных методом ультрацентрифугирования, в присутствии 10 мкМ ионов меди и разработанным способом определения резистентности к окислению осажденных ЛНП в присутствии 50 мкМ ионов меди.

С целью оценки воспроизводимости разработанного способа было проведено слепое исследование резистентности к окислению ге-парин-осажденных ЛНП сыворотки крови у пациентов, находящихся на лечении в клинике Института терапии СО РАМН. Проведенный корреляционный анализ показал наличие сильной положительной корреляции между парными значениями как исходного уровня продуктов ПОЛ (в среднем 5,8+1,2 и 5,3+1,3 нмоль МДА/мг белка ЛНП; г= +0,72 + 0,16, при Р < 0,009), так и резистентности к окислению гепарин-осажденных ЛНП сыворотки крови (в среднем 15,8+2,1 и 15,2+2,2 нмоль МДА/мг белка ЛНП; г= +0,85 + 0,13, при Р < 0,001).

РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ОКИСЛЕНИЮ ОСАЖДЕННЫХ ЛНП У БОЛЬНЫХ ИБС В СРАВНЕНИИ СО ЗДОРОВЫМИ ЛЮДЬМИ — Было проведено сравнительное исследование резистентности к окислению гепарин-осажденных ЛНП разработанным способом у ' 48 здоровых людей и у 37 больных ИБС с ДЛП Иб типа. Согласно дан- 19 -

ным, представленным в таблице 3. не выявлено статистически достоверных различий между исходными уровнями продуктов ПОЛ в осажденных ЛНП, а также между резистентностью осажденных ЛНП к окислению в течение 2 часов инкубации у здоровых людей 2-х различных возрастных групп. Осажденные ЛНП сыворотки крови у всех обследованных групп больных ИБС содержали достоверно 2-кратно повышенный исходный уровень продуктов ПОЛ по сравнению с осажденными ЛНП у здоровых людей. Достоверных различий этого показателя между ЛНП у больных II и III функционального класса стенокардии напряжения выявлено не было. Также не было обнаружено достоверных изменений исходного уровня продуктов ПОЛ в осажденных ЛНП в зависимости от возраста, а также от уровней ХС и ТГ крови больных ИБС.

Таблица 3.

Исходный уровень продуктов ПОЛ и резистентность к окислению осажденных ЛНП у больных ИБС и здоровых людей (М + ш)

Группы обследованных Число обследованных нмоль МДА/мг белка ЛНП

Исходный уровень После 2 часов инкубации

ЗДОРОВЫЕ ЛЮДИ

общая группа 48 2,1 + 0.1 13,2 + 0.9

в возрасте 35-41 года 31 2.0 + 0.1 12,5 + 1.1

в возрасте 42-48 лет 17 2,3 + 0.2 15,0 1 1.2

БОЛЬНЫЕ ИБС

общая группа 37 4,6 + 0,3* 22,5 + 1,0**

в возрасте 45-54 лет 17 4,3 + 0.4* 22,1 + 0,8**

в возрасте 55-64 лет 20 4,8 + 0.2* 23.0 + 0,7**

стенокардия нап-я ФК II 23 4,6 + 0.2* 22,7 + 0. 4**

стенокардия нап-я ФК III 14 4,8 + 0,2* 22,4 + 0, 8**

ХС крови 6,6 - 9,2 ммоль/л 26 4,2 + 0. 4* 22,0 + 0. 6**

ХС крови 9,3 - 11,9 ммоль/л И 5.2 + 0,5* 23,2 + 0, 7**

ТГ крови 2,0 - 2,8 ммоль/л 19 4,5 + 0,3* 23,0 + 0, 7**

ТГ крови 2,9 - 3,7 ммоль/л 18 4.6 + 0.2* 22,2 + 1,0**

Примечание. * - различия в сравнении со здоровыми людьми достоверны при Р<0,05; #* - различия в сравнении со здоровыми людьми достоверны при Р<0,01.

Здоровые люди

Больные ИБС

ю-

987" 654-

з-21-

-ЩГ 1

10 12 14 16 18 20 22 24 26

ниоль МДА/мг ЛНП

Рисунок 7. Распределение резистентности к окислению осажденных ЛНП у здоровых людей и у больных ИБС с ДЛП 116 типа. По оси абсцисс: количество МДА после 2 часов инкубации: по оси ординат: количество человек.

Выявлено достоверное 2-кратное снижение резистентности осажденных ЛНП сыворотки крови к окислению у всех обследованных, групп больных ИБС по сравнению со здоровыми людьми (табл. 3).

Достоверных различий этого показателя между ЛНП у больных II и III функционального класса стенокардии напряжения обнаружено не было. Не было выявлено и достоверных изменений резистентности осажденных ЛНП к окислению в зависимости от возраста, а также от уровней ХС и ТГ крови больных ИБС.

При проведении сравнительного анализа распределения резистентности ЛНП к окислению было обнаружено, что у здоровых людей количество МДА после 2 часов инкубации осажденных ЛНП находилось в пределах значений от 8,4 до 17.5 нмоль МДА/мг ЛНП (рис. 7). В то же время, у больных ИБС с ДЛП 116 типа резистентность к окислению осажденных ЛНП распределялась в пределах от 19,8 до 25,2 нмоль МДА/мг ЛНП. Общих значений резистентности к окислению осажденных ЛНП у больных ИБС с ДЛП 116 типа и у здоровых людей обнаружено не было.

Таким образом, исследование резистентности к окислению ге-парин-осажденных ЛНП разработанным способом выявило' снижение этого показателя у больных ИБС с ДЛП 116 типа в сравнении со здоровыми людьми. Мы полагаем, что разработанный способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет оценить предрасположенность ЛНП к окислительной модификации, которая представляет собой риск-фактор развития атеросклероза.

ВЫВОДЫ:

1. У здоровых людей с увеличением плотности субфракций ЛНП содержание холестерина в них увеличивается, а резистентность к окислению снижается.

2. У больных ИБС с ДЛП Пб типа все субфракции ЛНП характеризуются повышенным содержанием холестерина и сниженной резистентностью к окислению, однако эти две особенности наиболее выражены в более плотных субфракциях ЛНП (ЛНП-4 и ЛНП-5).

3. У больных ИНЗСД изменения в субфракциях ЛНП подобны таковым у больных ИБС: повышено содержание холестерина и снижена резистентность к окислению. По мере нарастания степени тяжести заболевания, содержание холестерина в более плотных субфракциях ЛНП возрастает, а резистентность к окислению снижается.

4. Разработанный способ определения резистентности ЛНП к окислению характеризуется высокой воспроизводимостью! Обнаружена сильная положительная корреляция между классическим и разработанным способами определения резистентности ЛНП к окислению.

- 22 -

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. РагиноЮ.И., Душкин М. И. Исследование резистентности к окислению субфракций ЛНП.//В сб.: "Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых СО РАМН". -Новосибирск. -1996. -С. 99.

2. Рагино Ю. И.. Душкин М.И., Никитин О. П. Резистентность к окислению субфракции ЛНП у здоровых доноров.//В сб. тезисов докладов Сибирской кардиологической конференции: "Диагностика, лечение и профилактика сердечно-сосудистых заболеваний". -Новосибирск. -1996. -С. 172.

3. Рагино Ю.И., Душкин М.И. Субфракционный состав липопро-теинов низкой плотности у больных сахарным диабетом // Труды I Российского Конгресса по патофизиологии. -Москва. -1996. -С.179.

4. Рагино Ю. И., Душкин М. И.. Иванова М. В., Слепченко Н.В. Исследование субфракционного состава и резистентности к окислению отдельных субфракций липопротеинов низкой плотности у больных ишемической болезнью сердца //В .сб. трудов конференции "Современные лечебные и диагностические технологии в специализированной медицинской помощи" -Новосибирск. -1997. -С. 86-89.

5. Рагино Ю.И. Снижение резистентности к окислению отдельных субфраквдй липопротеинов низкой плотности у больных инсулин-независимым сахарным диабетом как информативный диагностический критерий риск-фактора развития атеросклероза // Тезисы доклада на конкурсе молодых ученых на I Конгрессе Ассоциации Кардиологов стран СНГ (Москва). -Кардиология. -1997. (принято в печать).

6. РагиноЮ.И., Душкин м. И., Никитин Ю. П. Снижение резистентности к окислению липопротеинов очень низкой плотности и отдельных субфракций липопротеинов низкой плотности у больных ин-сулиннезависимым сахарным диабетом // Терапевтический архив. -1997. (принято в печать).

7. Рагино Ю.И., Душкин М.И. Простой метод исследования резистентности к окислению гепарин-осажденных р-липопротеинов сыворотки крови // Клиническая лабораторная диагностика. -1997. (принято в печать).

Подана заявка на изобретение: Рагино Ю.И., Душкин М.И., Никитин Ю.П. "Способ определения резистентности к окислению липопротеинов низкой плотности сыворотки крови".

Соискатель ЛЬ Рагино Ю. И.

Формат 60х841Лб. Печ. л. ftQ Заказ SB ТиР-

Типография СО РАМН. Новосибирск, ул. Ак. Тимакова, 9.