Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Солевые и молекулярные комплексы кристафона с кислотами. Получение и свойства

На правах рукописи

005006941

РЫЖОВА ЕЛЕНА СЕМЕНОВНА

СОЛЕВЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ КРИСТАФОНА С КИСЛОТАМИ. ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 Р^Я 2012

Казань-2012

005006941

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития России»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Мельникова Нина Борисовна

доктор химических наук, профессор Сысоева Мария Александровна

доктор химических наук, профессор Галкина Ирина Васильевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Курский государственный

медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России»

Защита диссертации состоится /¿7срс&раля 2012 года в « Ю » часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г.Казань, ул. К. Маркса, 68

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Автореферат разослан «<^у> д^^а ¿/уг 2011 года

л/

Ученый секретарь у( — Г.Н.Нугуманова

диссертационного совета <г' '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бифункциональные лекарственные вещества (J1B) обладают более широким спектром фармакологического действия и проявляют значительно меньшую токсичность, чем вещества с одной фармакофорной группой. К таким соединениям относится оригинальный отечественный препарат - кристафон (М-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро(4Н)-пиримидин-5-сульфон)-М'-изоникотиноилгидразид), LD50 которого в 10 раз больше по сравнению с изониазидом - фрагментом молекулы кристафона.

Сочетание свойств изониазида и пиримидиновых соединений позволяет успешно применять его при таких заболеваниях как лепра, туберкулёз, хламидиоз, трихомонадная, уреаплазменная и герпетическая инфекция, в качестве эффективного иммономодулятора.

Действие кристафона связывают как с угнетением синтеза миколевых кислот клеточной стенки микобактерий изоникотиноилгидразидами, так и с ингибированием синтеза ДНК под действием пиридинового и пиримидинового фрагментов кристафона за счет снижения концентрации тимидинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата.

С другой стороны, кристафон обладает плохой растворимостью как в воде, так и в липидных средах, а, следовательно, имеет низкую биоусвояемость. При пероральном применении кристафона (капсулы, таблетки) почти 50% препарата выделяется через желудочно-кишечный тракт в неизменном виде. Низкая растворимость кристафона является ограничивающим фактором также для разработки новых лекарственных форм.

Одним из приемов повышения эффективности JIB является доставка его на векторе в виде молекулярного комплекса с глицирризиновой кислотой для улучшения биодоступности (Толстиков Г.А. 1996 - 2006) , а также трансформация JIB в эфиры, комплексы или соли фосфорной кислоты, способствующая коррекции фосфатного обмена

Целью исследования является получение солевых и молекулярных комплексов кристафона с кислотами и изучение их физико-химических и фармакологических свойств.

Задачи исследования:

1. Разработка метода получения и изучение физико-химических свойств молекулярных комплексов кристафона с моноаммонийной солью глицирризиновой кислоты.

2. Разработка метода получения фосфатного солевого комплекса кристафона, изучение его свойств и состава

3. Выбор компонентов лекарственных средств, способствующих созданию лекарственных форм кристафона фосфата в виде истинного или коллоидного раствора.

4. Исследование фармакологических свойств полученных комплексов кристафона с кислотами.

5. Разработка нормативной документации на фармацевтическую субстанцию Кристафона фосфат.

Научная новизна

• Впервые получен молекулярный комплекс кристафона с моноаммонийной солью глицирризиновой кислоты с улучшенной биоусвояемостью (по сравнению с кристафоном). Стехиометрия комплекса в присутствии гидроксида аммония 1:1.

• Впервые получен кристаллический фосфатный гидратный комплекс кристафона, изучены его физико-химические свойства. Доказано образование пирофосфатного комплекса в процессе хранения из первично образующегося фосфатного гидратного комплекса.

• Разработаны нормы качества на фармацевтическую субстанцию «Кристафона фосфат».

• Обоснованы составы жидких лекарственных форм в виде растворов фосфатного комплекса кристафона, выявлены пути стабилизации фармацевтических композиций введением органических биогенных кислот или протогенного димефосфона в смеси с 1М раствором фосфорной кислоты.

• Впервые экспериментально показано улучшение иммунотропной активности фосфатного комплекса по сравнению с кристафоном, проявление туберкулостатической активности при уменьшении острой токсичности.

Практическая значимость, степень внедрения результатов в практику

Жидкие лекарственные формы кристафона фосфата, проявляющие туберкулостатическую и иммуномодулирующую активность, могут быть предложены в качестве лекарственных средств для перорального и инъекциоиного применения.

Результаты исследований использованы при подготовке нормативной документации (проект Фармакопейной статьи предприятия ЗАО «Интелфарм» на фармацевтическую субстанцию «Кристафона фосфат»).

Материалы исследований рекомендованы для использования в научной работе и учебном процессе на кафедрах «Фармацевтической химии и фармакогнозии» и «Управления экономикой фармации и фармацевтической технологии».

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах и научной новизне.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на III Межвузовской научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития пищевой промышленности: производство, наука, подготовка кадров» (Нижний Новгород, 2008); Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии» (Казань, 2010); X Научной сессии «Современные решения актуальных научных проблем в медицине», секция Фармация (Нижний Новгород, 2011).

По результатам исследований опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертаций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав (литературный обзор, экспериментальная часть, результаты работы и их обсуждение), 1 приложения, содержащего проект фармакопейной статьи на субстанцию. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц, 15 рисунков. Список литературы включает 96 работ отечественных и зарубежных авторов.

Автор выражает глубокую признательность ЗАО «Интелфарм» за поддержку исследований и лично Яшновой O.K., а также к.х.н., доценту кафедры «Управления экономикой фармации и фармацевтической технологии» Волкову A.A. за помощь в постановке эксперимента.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Кристафон (К-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро(4Н)-пиримидин-5-

сульфон)->Г-изоникотиноилгидразид), производитель НПП ФГУП «Кристалл», г. Дзержинск Нижегородской области, ФСП 42-0037-4715-03.

Материалы и реактивы: Димефосфон, ООО «Технофос», ФС 42-2993-99, чистота не менее 99%. Моноаммонийная соль глицирризиновой кислоты, Acros organics, New Jersey, USA: I-8OO-ACROS-OI, Code: 213751000, 98%.

Этанол (96%), аскорбиновая, щавелевая, винная, лимонная, янтарная, фосфорная, хлористоводородная кислоты использовали как товарные реагенты без дополнительной очистки.

Приборы: ИК-спектры получены на инфракрасном спектрофотометре с преобразованием Фурье «IRPrestige-21», фирма Shimadzu, Япония. Диапазон измерения 4000-400см"', таблетки КВг. 13С, 'Н, J,P ЯМР спектры регистрировали на спектрометрах «Bruker Advance DPX - 200» и «Bruker DRX SF=500». УФ-спектры кристафона получены на УФ спектрофотометре «SPECORD S 100» фирмы «Analytik jena» (Германия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм. pH растворов измерены на рН-метре «рН-150М» РУП «Гомельский завод измерительных приборов».

Получение фосфатных комплексов кристафона. а) Фосфат кристафона был

получен растворением 9,2 ммоль кристафона (Кри) в 40 мл 1 М фосфорной кислоты при 60-65°С при перемешивании в течение 1 ч. После охлаждения добавляли 50 мл этанола и осадок белого цвета отфильтровывали, промывали этанолом и сушили при 100 С (tn;l=258 С с разложением).

б) Реакция в присутствии димефосфона. Кри смешивали с димефосфоном (ДМФ), смесь растворяли в 0,03 М водном растворе фосфорной кислоты (мольное соотношение Кри:ДМФ:Н3Р04 1:8:1,5) при температуре 30 - 40°С в течение 15 - 20 мин. Выпавшие крупные прозрачные кристаллы отфильтровывали, промывали этанолом, сушили при 100 С.

Количественное определение фосфора. 50 мг субстанции (точная навеска) минерализуют (ГФХ1) при нагревании на песчаной бане при температуре 180-240°С в течение 1 часа. После охлаждения раствор количественно переносят в колбу, нейтрализуют аммиаком до pH 7, доводят до 100 мл водой. 20 мл нейтрализованного раствора помещают в мерную колбу на 100 мл, прибавляют реагент на основе молибдата аммония (ГФХ1). После выдержки в темноте раствор фотометрируют при длине волны 425 нм. В качестве раствора сравнения используют контрольный образец, который готовят аналогично пробе с 2 мл смеси кислот для минерализации.

Медико-биологические исследования Специфическую иммунотропную активность водных растворах КриФос и комплекса Кри с МН4-Гли исследовали с использованием половозрелых белых крыс линии \Vistar массой 185±2,5г и самцов мышей гибридов Г-1 (СВАхС57В16) массой 18-20 г. Опытные и контрольные группы состояли из 10 животных, полученных из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ РАМН.

Оценку влияния на неспецифический иммунитет (фагоцитоз) проводили по показателям метаболитической перестройки клеток, фиксируемой методом люминолзависимой хемилюминесценции. Для изучения влияния предлагаемых композиций на специфический гуморальный иммунитет животным вводили стандартный антиген и контролировали титр сывороточных антител. Влияние препаратов на клеточный иммунитет изучали в реакции гиперчувствительности замедленного типа методом иммунизации эритроцитами барана.

Туберкулостатическое действие КриФос и комплекса Кри с ЫН4-Гли в водных растворах изучали в Свердловском областном ГУ здравоохранения Противотуберкулезный диспансер" СОГУЗ ПТД, г. Екатеринбург.

Острая токсичность КриФос и комплекса Кри с НН4-Гли изучена на половозрелых самцах мышей при внутрибрюшинном введении в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Все выжившие животные в конце исследования подлежали патоморфологическому исследованию.

Результаты работы и их обсуждение 1. Молекулярные комплексы кристафона с моноаммонийной солью глицирризиновой кислоты

Молекулярный комплекс кристафона (Кри) был получен с моноаммонийной солью глицирризиновой кислоты (МН4-Гли), способной образовывать Н-комплексы и комплексы включения с оксопиримидинами (Толстиков Г.А. 1996 - 2006).

УФ-спектры растворов Кри и М14-Гли в водно-спиртовых растворах в присутствии №14ОН имеют четко выраженные полосы поглощения карбонильных групп с максимумами X, = 286 нм и Х2 = 253 нм, соответственно (рис. 1а). Электролиты (перхлорат лития, хлорида аммония), существенного влияния на интенсивность поглощения и положения максимумов не имеют (рис. 1а). Вид спектра реакционной смеси Кри и Тч'Н4-Гли в водно-спиртовой среде, содержащей 12,5% ЫН4ОН, зависит от молярного соотношения компонентов (рис. 16 и 1в, табл. 1).

а) б) в)

Рис. 1: УФ-спектры: а) 5-Ю"5 М кристафона (кривые 1 и 1*), 5-Ю"5 М ЫН4-Гли (кривые 2, 2*); б) реакционной смеси ЫН4-Гли : Кри (кривые 3 и 5) и продукта реакции >1Н4-Гли с Кри (кривые 4 и 6) при молярных соотношениях 1 : 1 (рис. 26) и 1 :4 (рис. 2в), соответственно, в водно-спиртовой среде, содержащей 12,5% ЫН4ОН. * - среда дополнительно содержит 0,12 моль/л ЫН4С1.

В УФ-спектре реакционной смеси ]ЧН4-Гли и Кри состава 1 : 1, а также выделенного из нее твердого продукта, основная полоса карбонильной группы ЫН4-

8

Гли (253 нм) практически исчезает, остается только суммарная полоса в области 284 нм (рис. 16).

Таблица 1

Сравнение УФ-спектральных данных реакционных смесей Кри и КН^-Гли с

выделенными из та продуктами

Система № кривой Молярное соотношение Кри: Ш4-Гли ^тах, нм А-отн ДХ, нм а,/а2

Ш4-Гли 1 253,3 0,5237

ЫН4-Гли** 1** 254,4 0,6489

Кри 2 286,0 0,8337

Кри** 2** 283,0 0,8601

Реакционная 3 216,11 0,6847 -1,0 1,6

смесь 1 :1 284,48 0,4330 0,4

Выделенный 4 217,06 0,7583 - 1,4

продукт 284,10 0,5427 -

Реакционная 5 215,23 0,4546 -1,8 1,0

смесь 1:4 253,50 0,4547 0,7

Выделенный 6 217,02 0,7578 - 0,9

продукт 252,83 0,8386 -

* Среда - водно-спиртовая смесь, содержащая 12,5% И^ОН. ** В присутствии 0,12 моль в КН4С1

При избытке ЫН4-Гли в реакционной смеси состава Кри : ЫН4-Гли = 1 : 4, а также твердого продукта, выделенного из нее, вид УФ-спектра изменяется: основная полоса имеет >-п,а1( = 253нм, а полоса с = 286 нм практически отсутствует (рис. 1в, табл. 1).

Исследование межмолекулярного взаимодействия Кри и ЫН4-Гли было проведено в водно-спиртовой среде (1 : 1), содержащей 12,5% N114011 и соли -перхлорат лития или хлорид аммония, при различных молярных соотношениях Кри и ЮТ4-Гли. На рис. 2 приведено семейство спектральных кривых для реакционных смесей в присутствии хлорида аммония, которое аналогично спектрам смесей в присутствии перхлората лития или в отсутствии каких-либо солей.

б)

г

1 Чти

Рис 2: УФ-спектры: а) реакционных смесей 5'105 М Кри и 5'КГ5 М ИН^Гли в 0,6% растворе ЫН4ОН в водно-спиртовой среде (1 : 1) при различных молярных соотношениях (метод изомолярных серий). Врезка. 1тах ~ /(Укри)- б) Аотя ~/(УКРц). X -мольная доля

№ кривой 1 2

3

4

5

6

КН4-Гли: Кри

0 : 10

1 :9 2:8 3:7 4:6 5:5

№ кривой

7

8

9

10 11

ЫН4-Гли: Кри 6:4 7:3 8 :2 9:1 10:0

Установлено, что положение максимума суммарной полосы поглощения карбонильных групп изменяется Б-образно при изменении молярного соотношения компонентов, достигаемым смешением различных объемов 5«10"5 М растворов компонентов по методу изомолярных серий (рис. 2а). Появление двух общих точек пересечения - аналогов изосбестических точек при )ч=241 нм и А.2=264 нм в серии спектральных кривых, свидетельствует о возможности существования нескольких соединений в изучаемой системе. Наиболее вероятно, вид и характер спектральных кривых реакционных смесей при различных молярных соотношения свидетельствует об образовании комплексов ЫН4-Гли и Кри в растворе.

В соответствии с методом изомолярных серий была изучена зависимость Аотя в точке максимума суммарной полосы поглощения карбонильных групп от мольной доли компонента, выражаемой через объемы 5*10"5 М растворов компонентов (рис. 26). Положение минимума А =ДУкри) =Ххкри) =./1хми-гЛи), позволяет сделать вывод, что комплекс имеет состав 1:1.

Исследования твердых продуктов, выделенных из реакционных смесей состава 1 : 1 и 1 :4, проведено методами ИК-, 13С, 'Н ЯМР-спектроскопии.

В ИК-спектре белого осадка выделенного из реакционной смеси отмечаются существенные изменения в ЫН-группе гидразидного фрагмента Кри, пиримидиновых ЫН- и ОН-группах гликозидной части и в полосах С-0 колебаний (табл. 2).

Таблица 2

Данные ИК спектров продуктов взаимодействия Кри и NHj-Гли

Волновые числа, v см'1

3500-3000 (ЫН-; ОН-) 1800-1600 (С=ОиС=€) 1200-1000 (С-0-; -S02)

Кри 3307 узк. инт., 3190 ср. пер., 3130 ш. пер., 3065 ш. инт. 1745 и 1726 узк. инт., 1693, 1682,1658 и 1662 узк. инт. (Амид I, II) 1165 узк. инт (-S02)

ЫН4-Гли несколько широких полос с основным максимумом 3402 ш. инт. две группы полос с основными максимумами 1720 и 1651 узк. инт. 1171 ср.шир.; две неразреш. полосы 1075 и 1050 шир. инт. (С-0-)

Комплекс КН4-Гли с Кри 3327 узк. инт., 3103 ср. пер., 3049 ср. пер. несколько полос 1745 и 1713 ср. пер., 1690,1681,1664 1167 узк инт., (-S02) 1107 и 1088 узк. пер. (С-0-)

»С ЯМР-данные выявили незначительные изменения в гликозидной части для Ш4-Гли (8.м.д: СГ - с 103,99 до 104,20; С2' - с 81,64 до 81,97; С6' - с 171,60 до 171,25; С5" - с 74,06 до 74,21). Изменения отмечены и в пиримидиновом фрагменте кристафона (8.м.д: метальная группа - с 17,79 до 18,16; карбонил -0=0 - 158,55 до 158,94).

Более существенные изменения отмечены в ПМР-спектрах продукта по изменению протонов в NH-группах (табл. 3).

Таблица 3

ПМР спектры Кри и его продукта взаимодействия с NHf-Гли

Химический сдвиг, 5.м.д.; 7, Гц

о н' W Ч нэс H 0 о ¡1 ' Mi С—NH NH—S----- 1 Л î 7 J. IL N' Дополнительные сигналы

Кри (1): 11,60; 1Нс (2): 11,50; IHc (3): 10,84; 1H д; 1=2 8 (4):'9,26; 1Нд; 7=2,7 (5.7): 8,74; 2Н д; 7=6,0 (6.8): 7,66; 2Нд; 7=6,0

Комплекс Кри с NH4-Гли (1): -(2): - (3): - (4): - (5.7): 8,73; 2Нд; 7=5,9 (6.8): 7,66; 2Нд; 7=6,1 размытый мультиплет в области от 7 до 9 м.д.; дублет в области 5,4 м.д. и дублет в области 4,32 м.д.

Таким образом, данные УФ-, ИК-, 13С, 'Н ЯМР-спектроскопии твердых продуктов и УФ-спектров реакционных смесей доказывают, что при взаимодействии №14-1 ли с Кри в присутствии ЫН4ОН в водно-спиртовой среде могут быть получены молекулярные комплексы различного состава.

Выявлена биологическая активность по отношению к микобактериям туберкулеза водных растворов кристафона на основе комплекса Кри с N1^-]"™, близкая к максимально теоретически рассчитанной по отношению к изониазиду, а также снижение острой токсичности комплекса кристафона (ЛД50 1200 мг/кг) по сравнению с изониазидом (ЛД50 127 мг/кг) при внутрибрюшинном введении.

2. Изучение растворимости кристафона в среде биогенных кислот

Растворимость Кри, оцениваемая по методике ГФ XI, в органических кислотах (уксусная, винная, лимонная, янтарная, аскорбиновая) незначительна, но существенно превышает его растворимость в воде (0,02 мг/мл). Наибольшая растворимость Кри в растворах кислот отмечается для 1М фосфорной кислоты - 48 мг/мл (рис.3).

а) б)

Рис.3. Растворимость Кри (мг/мл) в 1М растворах кислот (а) и его фосфатной соли (КриФос) в органических кислотах и в смеси с фосфорной (б)

Свойства кристафона в кислых и основных средах, вероятно, будут обусловлены как лактим-лактамной таутомерией в пиримидиновом кольце, так и

изменением структуры изониазидного фрагмента (К) (схема 1). Изониазидный фрагмент при рН < 3 проявляет себя как основание (схема 1а). В пиримидиновом фрагменте (Я1) ионизация кристафона обусловлена лактим-лактамной таутомерией, при этом в лактимной (енольной) форме водород гидроксильной группы способен образовывать водородную связь с кислородом сульфогруппы, располагающейся рядом (схема 16, структура 1д). а)

н3с

1 в

Схема I. Прототропные превращения в изоникотингидразидном (К), и сулъфоксопиримидиновом (К1) фрагментах кристафона

Можно предположить, что более эффективная растворимость Кри в фосфорной кислоте обусловлена прототропными превращениями, причем изменения происходят как в пиридиновом, так и в пиримидиновом фрагментах. Образование солевых структур типа 1д в среде фосфорной кислоты создает возможность получения фосфатных комплексов Кри, имеющих преимущества в процессе биотрансформации

и биоусвояемости, как и другие лекарственные вещества с фосфатной группой в своем составе.

3. Получение и свойства фосфатного комплекса крнстафона

После растворения кристафона в 1 М водном растворе фосфорной кислоты при температуре 60-100°С в течение 20-60 мин с последующим осаждением продукта 95% этанолом на холоду получен белый кристаллический осадок, названный условно кристафона фосфат (КриФос).

N

„ О ,Н " о н

Й и Кк/ НзР04 о о

С—Ш—Ш—в—£ >=0 -». С—Ш—Ш—Б-Л >=0 • нгР04

' II У^ Н20 1 *

° £ \ ^ о г \н

Схема 2. Образование солевого фосфатного комплекса (КриФос)

3.1. Структура и свойства фосфатного комплекса

В УФ-спектрах поглощения положение суммарной полосы карбонильных групп для КриФос соответствует для Кри как в водном растворе, так и в 1М растворе Н3Р04, что характеризует аналогичность электронного состояния лактамного и амидного фрагментов в КриФос и Кри (рис. 4). А,.

0.0

Рис. 4. УФ- спектры поглощения: 1- 1,5-1 (У5 М Кри в воде;

Ч • * 2 - 5105М КриФос в воде,

\ // \ 3 -5-1 (Г5М Кри в 0,1Мрастворе

—' ! фосфорной кислоты

\___V1

200 2Я1 300

В 13С ЯМР-спектре кристафона фосфата по сравнению с кристафоном значительных изменений в химических сдвигах не обнаружено (табл. 4).

Таблица 4

ЯМР ,3С - спектры кристафона и его солевого фосфатного комплекса

1"Г

Химический сдвиг 8, м.д.

5 6 7 8 9 10 11

Кри 109,91 164,34 150,29; 149,58 160,12 158,55 139,16 17,79

КриФос 110,37 164,80 150,71; 150,05 160,59 159,03 139,67 18,43

Общее содержание фосфора в КриФос составляло 6,9 - 7%. Потенциометрическим титрованием водного раствора фосфатного комплекса кристафона раствором гидроксида натрия показано, что фосфор в продукте существует в виде фосфат-аниона, причем на 1 молекулу кристафона приходится один фосфат-ион. Методом 3,Р ЯМР-спектроскопии доказано, что в молекуле комплекса 1 атом фосфора (8 = 1,27 м.д.) В ИК-спектрах КриФос по сравнению с Кри появляются новые полосы, обусловленные валентными колебаниями Р-О-связи, см"1: 1355 узк. инт., 1311 узк. инт., 1255 узк. пер. (табл. 6). В ПМР-спектрах КриФос по сравнению с Кри появились широкие сигналы (размытый мультиплет или синглет) с химическими сдвигами 5=7,15 м.д. и 5=6,9 м.д. (табл. 5). Из приведенных результатов был сделан вывод, что осадку соответствует фосфатный гидратный комплекс с общей формулой Кри-Н3Р04-Н20.

Стехиометрия фосфатного комплекса определяется тем фактом, что фосфорная кислота в водном растворе диссоциирует только по первой ступени, образуя КриН^НгРОд". Кроме того, в состав свежеприготовленного комплекса включается молекула воды за счет водородных связей сульфогруппы и карбонила пиримидинового цикла. Об этом свидетельствует количество протонов, равное 16, найденное в ПМР-спектрах этих образцов. 3.2. Изменения кристафона фосфата в процессе хранения.

Растворимость КриФос с течением времени резко снижается с 10 до 1 мг/мл. Изменения в ПМР-спектрах КриФос в процессе хранения в области протонов пиримидинового цикла проявились как размытый синглет или широкий мультиплет в области 5,9 - 6,1 м.д. (табл. 5).

Таблица 5

ПМР-спектры кристафона и кристафона фосфата

Химический сдвиг, 8.м.д.; I, Гц

о „■ / \ 2 Н3С н о о II 4 'II С—Ш—в---- ' 1 N Дополнительные сигналы

Кри (1) (2) 11,61; Шс 11,50; Шс (3): 10,86; 1Нд; 1=2,8 (4): 9,28; Шд; 1=2,7 (5.7) (6.8) 8,75; 2Нд; 1=6,0 7,67; 2Нд; 1=6,0

КриФос свеже-приго-тоален-иый 0) (2) 11,60; 1 Не 11,51; 1Нс (3): 10,86; 1Нд; 1=2,5 (4): 9,28; 1Нд; 1=2,6 (5.7) (6.8) 7,67; 7,57 8,75; 2Н д; Г=5,9 7,68; 2Нд; 1=6,1; 2Нд; 1=2,9; и 7,56 д 1=4,4 7,15; ЗН размытый мультиплет или широкий синглет; [всего 5Н]

КриФос в процессе хранения (1): 11,60;2Нс (2): 11,50; 2Нс (3): 10,85; 2Нд; 1=2,7 (4): 9,27; 2Нд; 1=2,7 (5.7): 8,74; 2Нд; 1=5,9 8,74; 2Нд; 1=3,0 (6.8): 7,67; 2Н д; 1=6,1; 7,67; 2Н д; 1=3,0 размытый синглет или широкий мультиплет в области 5,9-6,1 м.д.

В ИК-спектрах свежеприготовленного образца кристафона фосфата амид I и амид II проявляются как 5-6 полос, которые в спектре образца, хранившегося при 20°С в течение полугода (в дальнейшем - «состаренный»), представлены только двумя узкими интенсивными полосами. Изменения отмечены и для полосы поглощения сульфоксидной группы, Д\' составляет 18 см"1 для свежеприготовленного и 10 см"1 - для «состаренного» образцов (табл. 6).

Таблица 6

Данные ИК спектров кристафона и его фосфата

Волновые числа, V см"1

3500-3000 (ИН-; ОН-) 3000-2500 (СН-) 1800-1600 (Амид I, Амид II) 1360-1240 (Р-О) 1200-1100 (-802)

Кри 3307 узк. инт., 3190 ср. пер., 3130 ш. пер., 3065 ш. инт., несколько полос, основная 2816 инт. 1745 и 1726 узк. инт., 1693,1682, 1658 и 1662 узк. инт. 1165 узк. инт.

КриФос свежеприготовленный 3450 ш. инт., 3237 узк. инт., 3129 ш. пер., 3112 ср. пер., 3049 узк. пер., 2997 ш. пер., 2600-2450 ш. пер. 1740 узк. инт., 1723, узк. инт, 1699 узк. инт., 1680 узк. инт 1634 узк. пер. 1355 узк. инт., 1311 узк. инт. 1255 узк. пер. 1183 узк. инт.

КриФос в процессе хранения 3270 ш. пер., 3179 ш. пер., 3098 ш. пер. - 1726 узк. инт., 1673 узк. инт. 1358 узк. инт., 1255 узк. пер. 1175 узк. инт.

Изменение структуры фосфатных комплексов с течением времени подтверждается различием химических сдвигов в 31Р ЯМР-спектрах для свежеприготовленного и образца после хранения в течение 1 месяца: в спектре «состаренного» КриФос имеется 2 сигнала с 8)=1,65 м.д. и 82=1,66 мл., свидетельствующие о двух атомах фосфора в молекуле фосфатного комплекса кристафона.

В ,3С ЯМР-спектрах свежеприготовленного и «состаренного» образцов -изменения химических сдвигов атома углерода в положении 7, а именно: четыре сигнала (8, м.д.: 150,27 и 149,57; 150,24 и 149,20) вместо двух (8, м.д.: 150,71 и 150,05).

Приведенные выше данные, главным образом, 'Н, 13С, 31Р ЯМР-, УФ- и ИК-спектроскопия, позволяют предположить димерную структуру «состаренного» твердого осадка фосфатного комплекса за счет образования пирофосфатных структур через связь Р - О - Р (схема 3).

кристафона фосфат, хорошо пирофосфат с меньшей

растворимый в воде растворимостью

Схема 3. Образование пирофосфатных структур в процессе хранения кристафона фосфата

Выявлена туберкулостатическая активность по отношению к микобактериям туберкулеза водных растворов КриФос, близкая к теоретически рассчитанной по отношению к изониазиду, а также снижение острой токсичности комплекса кристафона: ЛД50 1800 мг/кг по сравнению с изониазидом (ЛД50 127 мг/кг) при внутрибрюшинном введении.

Таким образом, взаимодействие Кри с 1М раствором фосфорной кислоты с последующим выделением твердого осадка первоначально приводит к образованию растворимого в воде кристафона фосфата Кри-Н3Р04-Н20, с последующей димеризацией в твердом состоянии до образования пирофосфатов с меньшей растворимостью, но с сохранением биологической активности.

3.3. Разработка проекта ФСП на фармацевтическую субстанцию «Кристафона фосфат» Спецификация КриФос (субстанции) приведена в табл. 7.

Таблица 7

Нормы качества фармацевтической субстанции «Кристафона фосфат»

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Белый мелкокристаллический порошок без запаха

Подлинность 1. ИК-спектроскопия 2. УФ- спектроскопия 3. Качественная реакция на фосфаты 1. Совпадение со спектром, приведенным в ФСП. 2.Электронный спектр поглощения должен иметь максимум при длине волны 266±2 нм. 3. Субстанция должна давать качественную реакцию на фосфаты.

Растворимость ГФХП Субстанция мало растворима в воде, практически не растворима в спирте этиловом 95 %, легко растворима в диметилсульфоксиде.

Температура разложения ГФ ХП, метод 1 256 - 259°С

Посторонние примеси 1. Общая зола 2. Тяжелые металлы 1. Содержание общей золы в субстанции не должно превышать 1 %. 2. Субстанция должна выдерживать испытания на содержание примесей тяжелых металлов

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 0,5 %

Микробиологичес кая чистота ГФХП Категория 2.1 г субстанции должен содержать не более 102 аэробных бактерий и грибов (суммарно), не более 101 энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий. Не допускается Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Количественное определение Фотоколориметрия He менее 99 %

Упаковка Упаковка должна быть влагонепроницаемой

Маркировка В соответствии с нтд

Транспортировка В соответствии с РД 9301-006-05749470-93

Хранение В сухом, прохладном, защищенном от света месте, в плотно укупоренной таре

Срок годности 3 года

3.4. Выбор компонентов для создания и стабилизации лекарственных форм кристафона фосфата в виде раствора

Стабилизация водных растворов КриФос проведена с использованием винной, лимонной, аскорбиновой и янтарной органических кислот. Из данных рис.Зб следует, что растворимость КриФос и стабильность растворов в присутствии изучаемых кислот резко возрастает.

Особое место в ряду изучаемых соединений занимает димефосфон -диметиловый эфир 1,1-диметил-З-оксобутилфосфоновой кислоты (ДМФ), проявляющий широкий спектр фармакологического действия (регулятор кислотно-щелочного баланса, метаболик, антиоксидант, ноотроп и др.). ДМФ обладает оптимальным гидрофильно-липофильным соотношением, поэтому его можно рассматривать как специфический вектор доставки лекарственных веществ, трудно растворимых в воде и в липидных средах. Выбор ДМФ обусловлен также его способностью диссоциировать в водном растворе с подкислением среды.

В присутствии фосфорной кислоты и ДМФ растворимость как Кри, так и КриФос возрастает на несколько порядков.

Полученные растворы Кри и КриФос как в смеси органических кислот, так и растворе ДМФ, стабильны с течением времени: 6%-ные растворы Кри и КриФос оставались неизменными в течение года. Это позволяет создавать новые жидкие лекарственные формы на основе Кри и КриФос.

Показано улучшение иммунотропной активности двух растворов КриФос в водном растворе ДМФ (6 мг/мл) и в 1М растворе лимонной кислоты (20 мг/мл) по сравнению с водным раствором КриФос. Количество ^О антител у мышей (титр реакции), иммунизированных эритроцитами барана, изменялось от 1:36 (контроль) до 1:233 (КриФос). Для этой композиции отмечено достоверное увеличение интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа по изменению среднего диаметра отечного участка, а также композиция практически не снижает реактивность (готовность к фагоцитозу) нейтрофилов.

Проведенные исследования по растворимости КриФос и стабилизации жидкой лекарственной формы, показали высокую стабильность растворов и максимальную концентрацию КриФос в эквимолярной смеси ДМФ или органической кислоты (лимонной, аскорбиновой, янтарной) с 1М раствором фосфорной кислоты.

выводы

1. При взаимодействии моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты и кристафона в водной среде получены молекулярные комплексы, структура которых доказана УФ-, ИК-, 13С, !Н ЯМР-спектроскопией твердых продуктов и УФ-спектров реакционных смесей. В присутствии ОТЦОН методом изомолярных серий доказана стехиометрия комплекса 1:1.

2. Комплексы кристафона с моноаммонийной солью глицирризиновой кислоты сохраняют высокую биологическую активность по отношению к микобактериям туберкулеза и имеют более низкую острую токсичность (ЛД50 1200 мг/кг) по сравнению с изониазидом (ЛД50 127 мг/кг) при внутрибрюшинном введении.

3. Разработан метод получения фосфатного комплекса кристафона растворением его в 1 М водном растворе фосфорной кислоты при температуре 60-100°С в течение 20-60 мин с последующим осаждением продукта 95% этанолом на холоду. Состав комплекса доказан фотоколориметрическим и потенциометрическим методами, а также ИК-, 13С, 31Р, !Н ЯМР-спектроскопией и соответствует общей формуле Кри-Н3Р04-Н20.

4. Растворимость фосфатного гидратного комплекса кристафона в процессе хранения уменьшается в 5 - 10 раз вследствие образования пирофосфатного димерного комплекса, структура которого доказана ИК-, 13С, 31Р, 'Н ЯМР-спектроскопией.

5. Иммуномодулирующая и туберкулостатическая активность фосфатного комплекса кристафона выше по сравнению с кристафоном на фоне снижения острой токсичности комплекса кристафона: ЛД50 1800 мг/кг по сравнению с изониазидом (ЛД5о 127 мг/кг) при внутрибрюшинном введении.

6. Разработан проект фармакопейной статьи на фармацевтическую субстанцию «Кристафона фосфат».

7. Предложены составы жидких лекарственных форм в виде растворов кристафона фосфата. Высокая стабильность растворов и максимальная концентрация кристафона фосфата получены в эквимолярной смеси димефосфона или органической кислоты (лимонной, аскорбиновой, янтарной) с 1М раствором фосфорной кислоты.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК для размещения материалов

диссертаций:

1. Рыжова Е.С. Взаимодействие 1\1-(6-метил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидро-5Н-пиримидинсульфон)->Г-изоникотиноилгидразида с кислотами и основаниями в водных средах [Текст] / Е.С.Рыжова, Д.А.Пантелеев, Ю.В.Чудецкая, А.А.Волков, Н.Б.Мельникова, М.В.Гуленова, В.К.Османов, A.B. Борисов // Хим.—фарм. журнал. - 2010. - 4. - том 44. -С.43-50.

2. Волков A.A.. Фосфатные солевые комплексы кристафона. Свойства и получение [Текст] / А.А.Волков, М.В.Гуленова, Н.Б.Мельникова, Л.Н.Нистратова, Д.А.Пантелеев, Е.С.Рыжова, Т.В.Саликова // Известия ВУЗов. Химия и химическая технология-2010. -Т. 53. -№12. -С.98-105.

3. Рыжова Е.С. Возможности повышения биодоступности антимикобактериального иммуномодулятора - кристафона [Текст] / Е.С.Рыжова, Д.А.Пантелеев, Т.В.Саликова, Л.Н.Нистратова, Н.Б.Мельникова // Медицинский альманах. -2011.-№ 1(14).-С. 238-242.

4. Амирсаидова И. Разработка лекарственных форм кристафона в виде водных растворов [Текст] / И.Амирсаидова, Е.С.Рыжова // Медицинский альманах. -2011. - №3. - С. 205.

Материалы конференций

5. Рыжова Е.С. Нанотехнологии в химии биологически активных веществ [Текст] / Н.Б.Мельникова, Е.С.Рыжова // Сб. трудов III Межвузовской научно-практической конференции «Актуальные вопросы развития пищевой промышленности: производство, наука, подготовка кадров», Н.Новгород: Филиал ГОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления» в г.Нижний Новгород, 2008. - С.68-71.

6. Рыжова Е.С. Кислотно-основные свойства производных пиримидина в водных гелях / Пантелеев Д.А., Рыжова Е.С. // Сб. материалов Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии», Казань: КГТУ. -2010. - С. 180.

21

7. Рыжова Е.С. Разработка лекарственных форм кристафона в виде водных растворов. / И.Амирсаидова, Е.С.Рыжова // Сб. материалов X Научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине». Секция Фармация. Н.Новгород: НижГМА, Март 2011. -С.205.

Ф/

Соискатель Рыжова Е.С.

Подписано в печать 19.12.2011 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,00. Заказ № 386. Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нижний Новгород, ул.Трудовая,6 Тея.:436-86-40