Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Белковые протективные антигены Р. aeruginosa

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК им. И.И.МЕЧНИКОВА

На правах рукописи УДК 576.8.097.2:851.132

Макаренко Татьяна Александровна

БЕЛКОВЫЕ ПРОТЕКТИВНЫЕ АНТИГЕНЫ P. aeruginosa

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа вшюлнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медецинских наук, профессор Е.С.Станиславский

ОФИЦАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук В.С.Кувакина доктор медицинских наук Н-Б.Егорова ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт хирургии им. А.В.Вишневского

РАМН.

Защита состоится 26 мая 1994 г. на заседании специализированного ученого совета (Д 001.38.01) при НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064 г. Москва, пер. Мечникова, Ба.

Автореферат разослан 26 апреля 1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ¡Актуальность проблемы.Поверхностные антигены бактериальной клетки лмеют исключительно важное значение в стимуляции специфического и юспецифического иммунитета против инфекции. Среди поверхностных антигенов велика иммунологическая значимость белков клеточной :тенки грамотрицательных бактерий. Белки клеточной стенки [редставляют значительный интерес для создания новых ¡актериальных вакцин. Иммунологическое изучение белковых омпонентов клеточной стенки P. aeruginosa было проведено Homma с оавтором (1976), а также Чеканом Л.В. (1980) в лаборатории ротективных антигенов НИИВС им. Мечникова.

По данным Homma, белок, выделенный из эндотоксина Р. 3ruginosa, обладает свойствами общего протективного антигена, ^следованиями, проведенными Чеканом Л.В., было показано, что зтодами двумерного иммунноэлектрофореза в клеточной стенке ¡явлено до 28 белковых антигенов, общих для вида P. aeruginosa.

Данные, полученные Едвабной Л.С., Зайднер И.Г., Макаренко А. и др. (1986), а также результаты экспериментов Gilleland et .(1987) и Spect et а1.(1987) позволяют предположить, что белки еточной стенки могут быть использованы для создания эффективных кцин против синегнойной инфекции. Однако протективные свойства лков клеточной стенки P. aeruginosa окончательно не выяснены.

Известно, что в борьбе с синегнойной инфекцией гибиотикотерапия часто оказывается не эффективной, поэтому кное значение приобретают исследования, направленные на ¡работку иммунопрепаратов против данной нозокомиальной )екции. Начиная с 1986 года в Лаборатории протективных НШВС Мечникова антигенов проводятся исследования с целью получения

новой вакцины на основе очищенных белков клеточной стенки Р. aeruginosa без примеси эндотоксина (липополисахарида). • Настоящая работа является частью плана НИР лаборатории по разработке этой вакцины.

Цель данного исследования - изучить протективные свойства изолированных белков P. aeruginosa с разной молекулярной массой и экспериментально обосновать возможность использования этих клеточных белков для создания эффективной малотоксичной вакцины против синегнойной инфекции.

Для достижения указанной цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку методов выделения белко] клеточной стенки p. aeruginosa на основе данных химического i иммунохимического анализа.

2. Изучить в опытах активной и пассивной защиты мыше: изолированные белки клеточной стенки P. aeruginosa.

3 Приготовить экспериментальные серии белково псевдомонас-вакцины и провести ее испытания в эксперименте н животных.

4.Изучить безвредность и иммунологический ответ добровольцев, иммунизированных экспериментальными серия!, псевдомонас-вакцины.

Полученные нами данные могут стать основой для разработ! технологии приготовления новой очищенной бесклеточнс псевдомонас-вакцины.

Научная новизна и практическая значимость проведенных

исследований.

В результате проведенных исследований установлено, что в клеточной стенке P.aeruginosa локализованы белки с молекулярной массой:9,14,21,25,30,38,44,46 и 55 кД,которые стимулируют у лабораторных животных формирование протективного иммунитета к заражению различными иммунотипами P.aeruginosa.

Разр а ботан способ выделения очищенных белковых тротективных антигенов клеточной стенки P.aeruginosa с ^пользованием комбинации методов водно-солевой экстракции, долевого фракционирования и жидкостной хроматографии.

На основе результатов химического, физико-химического и шмунологического анализа впервые разработана бесклеточная гсевдомонас-вакцина (ПВ), содержания видоспецифические белковые фотективные антигены P.aeruginosa.

В эксперименте на животных вакцина мало токсична и вызывает :пецифический иммунитет к синегнойной инфекции.

Результаты клинико-иммунологических испытаний ПВ на Юбровольцах свидетельствуют о низкой токсичности и высокой ммуногенности препарата.

Полученные данные могут стать основой для разработки ехнологии получения новой псевдомонас-вакцины.

оложения, выносимые на защиту.

В клеточной стенкв P.aeruginosa локализованы протективные нтигены белковой природы с молекулярной массой в пределах от 9 о 55 кД.

Разработан способ выделения очинённых протективных белковых

антигенов Р.аеги^пога, основанный на водно-солевой экстракции, солевом фракционировании и жидкостной хроматографии.

Изученные Оелки обладают видоспецифической активностью к могут быть использованы для создания эффективной и малотоксично!? вакцины против Р.аегг^ЗлоБа инфекции.

Клинико-иммунологические испытания ПВ показали высокук эффективность разработанного препарата. .

Апробация работы.

Результаты исследований, представленных в данноР работе, доложены на Ученых Советах НШВС им. Мечникова РАЖ (Москва,1988,1993), на всероссийских и международны? конференциях:на всесоюзной конференции по прблемам медицинскоГ технологии (Санкт-Петербург, 1988), на конференции в Ташкенскол НШВС (1989), на международной конференции по вакцинам (Борстел, ФРГ, 1991).

Диссертация апробирована на научной конференции отделг средств и методов иммунопрофилактики и иммунодиагностики НИ1 вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текстг состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственны: исследований, обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 141 источника. Работа иллюстрирована 36 таблицами I 18 рисунками.

Содержание диссертации.

Материалы и метода исследования.

Исследования проводили на типовых штаммах P. aeruginosa, юлученных из Венгерской национальной коллекции бактериальных :ультур, а также из Института хирургии им. A.B. Вишневского РАМН, 'зучение штаммов показало, что они типичны по морфологии и ультуральным свойствам.

.Получение экстрактов и очищенных белковых препаратов.Водные кстракты (ВЭ) были приготовлены то методу, разработанному в аборатории протективных антигенов Московского НИИ вакцин и ывороток им. И.И. Мечникова( Станиславский и др.1986). сходный ВЭ очищали ультрацентрифугированием от основной массы ипополисахарида (ЛПС).

акой препарат, обозначали, как частично очищенный ВЭ (ЧОВЭ). ОВЭ - растворимые белки клеточной стенки подвергали солевому ракционированию: при 50% насыщении сульфатом аммония и при зсыщении солью до 80%.Обе фракции подвергали гель- и энно-обменной хроматографии.

Исходный ВЭ фракционировали такжеметодом ультрафильтрации эи помощи кассетной системы "Пеликон"(Миллипор, Франция). ?рвоначально ВЭ фильтровали через кассету РТНК-00005 (мол. масса X) кД), а полученный фильтрат через кассеты РТТК-00005 (мол. асса 30 кД) для концентрации активной фракции и удаления икомолекулярных малоактивных компонентов. Затем ВЭ подвергали ищостной хроматографии на колонке с сефадексом G-I00.

Нами получены также экстракты при помощи водно-солевого (тода (ВСЭ). Микробные клетки суспендировали в стерильном 0,15 М ютворе NaCl (pH 7,2-7,4) и подвергали экстракции, как при

получении ВЭ.

ВСЭ очищали при помощи ультрафильтрации с использование] кассетной системы "Пеликон" (Миллипор, Франция), также как : очищенные ВЭ.

Для получения экстракта при помощи трис-ЭДТ (ТЭДЭ) использовали буфер: 20 н. трис-буфера с добавлением 0,0. н. ЭДТА (рН 8). Экстракцию проводили таким же методом, как водну или водно-солевую экстракцию.Таким же методом получали экстрак при помощи 0,2 М трис-НС1 бу^па (рН 8). Экстракт обозначили- ТЭ

Исходный экстракт (ТЭДЭ) фракционировали на колонке сефадексом с-ЮО и выделяли четыре фракции.

2.Метод колоночной хроатографии.Использовали колонку (2,5 80 см) заполненную сефадексом с-юо (Фармация, Швеция). Элюци проводили дистилированной водой. Ионно-обменную хроматограф® проводили на колонке с ДЭАЕ целлюлозой. Колонка была уравновешен стандартным 1/15 М фосфатным буфером (рН 7,3), азатем проводи! поэтапную элюцию наносимого материала, создавая увеличена солевой нагрузки.

3.Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) проводили общепринятым способом

4. Иммуноферментный анализ (ИФА).Применяли метод ИФ/ описанный в работе Макаренко с соавт.(1993).

5.Электрофорез белковых препаратов в полиакриламиднс геле. Для характеристики белковых компонентов использовали мете электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутств! додецилсульфата натрия в модификации Ьаешш11 et а1.(1970).

6 Метод иммуноэлектрофореза и иммупреципитации в агаровом геле.Для постановки иммуноэлектрофореза в агаровом ге.

спользовали 1% агарозу (Merk, ФРГ), приготовленную на еронал-мединаловом буфере.

Антигенные препараты изучали в опытах иммунопреципитации в гаровом геле по Оухтерлони (1965).

7. Методы химического анализа.В препаратах определяли белок о Лоури (1951), гексозы с антроновым реактивом , гептозу (Roe •Н. 1955), КДО (кетодиоксиоктоновая кислота) (Anacker R.L. t.al., 1966).

ЛПС в препаратах определяли при помощи ИФА (Едвабная Л.С., 983).

8. Экспериментальные животные.В работе использовали ледующие виды животных: неинбредные белые мыши,мыши етрагибриды, мыши • M-cfip (весом IQ-20 г). Кроме того, ксперименты проводили на аутбредных морских свинках (вес 250-300 ), кроликах породы "Советская шиншилла" (вес 2,5-3,0 кг).Всего в кспериментах использовано: 320 кроликов, 100 морских свинок и 5000 мышей.

9. Тест активной защиты мышей. Мышей иммунизировали нутрибрюшинно и через 7 дней заражали живой культурой инегнрйной палочки. Опыт 'активной защиты проводили в 2-х ариантах:

1) титрование заражающей дозой на иммунизированных (опыт) и еиммунизированных (контроль) мышах с определением ЛД50;

2) титрование иммунизирующей дозы с определением ЕД50

Ю. Тест пассивной защиты мышей. Мышам внутрибршинно водили соответствующие антисыворотки или нормальную сыворотку контроль - I) в разведении 1:10 (в объеме I мл), через 2 часа ивотых заражали внутрибрюшинно разными дозами живой культуры Р.

aeruginosa.Опыты пассивной защиты проводили в 2-х вариантах как i опыты активной защиты мышей. Рассчитывали ЛД^0 для опытных \ контрольных мышей.

11. Методы определения токсичности. Токсичность получению препаратов определяли на мышах, кроликах и морских свинках. Мышам вводили препараты в объеме I мл внутрибрюшинно. Гибел! животных учитывали в течение 3 дней. Морским свинкам вводит препараты в объеме 2 мл подкожно. Животных наблюдали в течение С дней.

Кроме того, изучали токсичность препаратов при многократно!, введении животным: мышам подкожно 7 раз вводили репараты в .дозе от 100 до 1000 мкг (по белку) в объеме 0,5 мл с интервалом 2 дня. Наблюдения за животными проводили в течение 24 дней ежедневно, определяя массу тела животных. Кроликам вводили препарать возрастающими дозами подкожно: 0,5 мг и внутривенно I, I, 2 и с мг (по белку) - всего 5 инъекций с интервалом 11-30 дней.

12 Бактериологические.исследования органов мышей.Исследовании подвергали кровь, селезенку, печень, брыжеечные лимфоузлы \ почки.

.13. Экспериментальная модель ожогового сепсиса у мышей.Модел! синегнойного ожогового сепсиса воспроизведена на мыша? тетрагибридах cbwa по методу Holder et.al. (1971). статистическая обработка результатов всех опытов пассивной ъ активной защиты проведена по методу Ван дер Вардена ( i960).

Результаты исследований и обсуждение. (Сарактеристика изолированных белковых антигенов клеточной стенки P. aeruginosa.

Нами получены белковые антигенные препараты из р. ieruginosa: исходные водные экстракты (ВЭ), из них частично зчищенные ВЭ (ЧОВЭ) и фракции путем солевого осаждения; юдно-солевые экстракты (ВСЭ), очищенные методами гльтрацентрифугирования и ультрафильтрации; экстракты при помощи грис-ЭДТА (ТЭДЭ) и трис-буферов (ТЭ).

Все препараты были подвергнуты химическому и [ммунохимическому анализу, изучены при помощи ИФА и РПГА, а также гаучены в опытах активной и пассивной защиты мышей, 'езультаты химического анализа белковых препаратов показали, что чищенные ВЭ содержали, главным образом, белок: белок составлял римерно 50% от общего веса ВЭ. В препаратах обнаружено около 14% еществ » нуклеиновой природы, с небольшим количеством ипополисахарида (ЛПСЛ-0,08%. Фракции, полученные в результате идкостной хроматографии не содержали примеси ЛПС и арактеризсвались высоким содержанием бежа (табл.1), езультаты химического анализа свидетельстуют о примерно сходном имическом составе ВЭ и ВСЭ. Так ВСЭ содержат около 50% белка, ,5% углеводов и около 27% нуклеиновых кислот. Содержание ЛПС по энным ИФА не превышает 0,08%. ЛПС не выявлено во фракциях, элученных после жидкостной хроматографии.Углеводные компаненты знцентрировались в II и ill фракциях.

Препараты ТЭДЭ и ТЭ также сходны по химическому составу. ЭДЭ содержал около 50% белка и примерно 0,5% ЛПС, а фракции, )лученные в результате, хроматографии, содержали разное

количество белка й ЛПС.

*

Таблица 1.Химический анализ белковых препаратов.

Препараты Белок Углеводы ЛПС Нуклеиновые

% % % кислоты

ВЭ 50,0+4,6 4,5+1,3 0,08+0,0 14,3+5,6

1фракция 62,0+6,2 не следы не

Ифракция 46,0+7,2 определя- 0 определя-

Шфракция 34,0+8,4 ли 0 ли

ВСЭ 44,6+7,06 2,36+0,3 0,06+0,02 27,2+0,2

1фракция 50,0+10,9 2,16+0,3 0+0,01 не

Пфракция 43,3+7,4 13,6+0,2 0 определя-

шфракция 38,3+8,3 6,0+0,5 0 ли

ТЭДЭ 50,0+5,7 7,5+0,5 0,5+0,1 « не

1фракция 50,0+6,9 7,5+0,4 5,0+0,9 определя-

Пфракция Шфракция 70,1+10,0 4,5+0,6 0,25+0,1 ли

туфракция 14,6+7,1 2,5+0,8 0,15+0,06

Таким образом, в препаратах ТЭДЭ и фракциях полученных поел жидкостной хроматографии содержится больше ЛПС, чем в ВЭ и ВСЕ Данные химического анализа позволяют предположить, что ВЭ и ВС должны быть менее токсичными, чем ТЭДЭ и ТЭ.

Частично очищенный водный экстракт (ЧОВЭ) также бь подвергнут химическому и физико-химическому анализу (табл. 2).

При гель-хроматографии фракции I (Ф1), полученной при 50Я5 асыщении сульфатом аммония на колонке с сефадексом с-ЮО были ыделены следующие субфракции (СФ): СФ-1 и СФ-и (соответствующие ики).Из фракции, полученной при 80% насыщении сульфатом ммония(ФИ), выделены СФ-ш и СФ-1У.

Таблица 2. Химическая характеристика белковых препаратов,

выделенных из Ч0ВЭх.

Выход по Мол. Коэффициент Содержание Отношение масса седимента-[репараты белку п ,

{%) ВКД ЖдЙрта) 0елка ш бежж/

(%) (%) ЛИС

ЧОВЭ 100 не опред. гетерог. 38 0,3 126

СФ1 5,6 >150 _«_ 39 8 4,8'

ОФИ 4,3 не опред. 41 4 10

СФ111 9,2 37 0,1 370

СФ1У 0.7 40 2 28 0,05 560

СФУ 1,62 80 3 55 2 27,5

СФУ1 14,8 60 3 75 I 75

СФУН 0,89 30 • 2 50 0,07 714

СФУШ 0,27 не опред. не опред. 40 0,08 500

СФ1Х 0,86 74 1.2 61,6

Примечанием: Выход СФ относитеьно ЧОВЭ.

Ч0ВЭх - частично очищенный белковый препарат,

полученный при помощи водной экстракции.

1ри рехроматографии СФ-ш на сефадексе й-ЮО были изолированы Ф-V, СФ-У1, СФ-УИ.

СФ-1 была подвергнута хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и выделены СФ-УШ и СФ-IX.Методом колоночног хроматографии была определена примерная молекулярная массе белков, (см. табл. 2).

В результате рехроматографии СФ-1 на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой были выделены СФ-УШ и СФ-1Х , которые резке различались по содержанию белка (табл. 2).

Таким образом, удалось показать, что СФ-1 содержит высокомолекулярные компоненты, представляющие, по-видимому, комплекс ЛПС с белком.

Относительно низкомолекулярные белки СФ-1У (молекулярная масса 30 кД) и СФ-УИ (молекулярная масса 40 кД) были наиболее гомогенными по данным аналитического ультрацентрифугирования и практически свободны от примеси ЛПС (табл. г).

Результаты химического анализа свидетельствуют, что в ЧОВЭ выявлены следы углеводов, а в СФ-ГУ и СФ-УП углеводы не обнаружены.

Иммунохимический анализ белковых препаратов. Установлено, что СФ-1У и СФ-УП, полученные из ЧОВЭ .образуют по одной линии преципитации, которые идентичны между собой. Остальные СФ образуют по 2-4 линии преципитации, т.е. гетерогенны. СФ-УШ и СФ-1Х, полученные из СФ-1 при помощи ионно-обменной хроматографии, оказались гетерогенными, особенно, СФ-УШ . Эти СФ были идентичны между собой в антигенном отношении. Однако СФ-УШ образовывала одну из двух линий преципитаций, которая формировалась вблизи лунки с антисывороткой. СФ-УШ по данным иммунодиффузии была не идентична исходной Ф1.

В соответствии с результатами ИФА установлено, что наиболее активны СФ-1 и СФ-П, вероятно, за счет примеси ЛПС. Наименее активными оказались СФ-1У и СФ-УИ .

Результаты опытов иммунодиффузии в .ВСЭ и фракций, полученных 13 ВСЭ, свидетельствуют ,что Ф1 и Фи активны в ммунопреципитации с соответствующей антисывороткой образуя до -х линий преципитаций. Низкомолекулярная Ф-Ш не образует или бразует одну слабую линию преципитации.

Исследование белковых препаратов ТЭДЭ и ТЭ показали, что они ктивно реагируют с антисывороткой к ТЭДЭ. Наиболее активным казался ТЭДЭ: препарат образует 3-6 линий преципитаций.

Фракции, полученные из ТЭДЭ методом колоночной эоматографии, идентичны в антигенном отношении.В опытах лдуноэлектрофореза изучали препараты ТЭДЭ и фракции, полученные >сле гель-хроматографии из исходного ТЭДЭ, а также ВСЭ.Оказалось ■о.адсорбированная ЛПС антисыворотка реагирует с ТЭДЭ, с Ф1,и Ф11+Ш (плато). Однако, на ряду с белковыми антигенами в Ф1, дя по данным электрофореза, концентрируется значительное личество ЛПС.

По данным иммуноэлектрофореза Ф1У (низкомолекулярная) лоактивна и содержит небольшое количество низкомолекулярных пковых антигенов клеточной стенки. В опытах иммуноэлектрофареза установлено, что ВСЭ реагирует гомологичной антисывороткой образуя до 4-х линий >ципитаций.

Было проведено изучение полученных нами белковых препаратов ! помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии .ецилсульфата натрия.Изучали препараты: ТЭДЭ, ТЭ, ВСЭ, которые

оказались гетерогенными по белковому спектру и содержали набор белков с молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кД.

Анализируя наши данные электрофоретического изучения белковых препаратов в сравнении с данными Hancock et. al (1988,1990), которые классифицировали белки клеточной стенки по молекулярной массе, мы пришли к следующему заключению:во всех трех препаратах присутствуют иммунологически активные белки, а именно: белки F и i, а также белки н2, d1, d£h эстераза, иммунологические свойстве которых не изучены. В препаратах выявлен, вероятно, белок F с молекулярной массой 38 кД, который иммунологически идентиче} белку А Е. coli (Mizuno Т.1979,1982). По данным'Gilleland белок ] обладает выраженной протективной активностью (Gilleland н.Е 1988,Hancoc R.E.1981).

В процессе колоночной хроматографии ТЭДЭ изолированы i исследованы фракции: Ф1 - высокомолекулярная, ФП+Ш ("плато") Ф1У - низкомолекулярная. В Ф1 обнаружены белки с молекулярно массой 9, 14, 20, 25, 30, 38 и 44 кД. Таким образом, в Ф1 по-^видимому, присутствуют белки Е, F, G, Н1, н2 Ферриопиохелин связывающий белок, I, из которых иммунологическ активны белки I (липопротеин), F, Н (Hancock R.E.1978 ).Е ФП+Ш ("плато") присутствуют белки с молекулярной массой 9, 20, 21 и примерно 26 кД, которые соответствуют белкам с, Н1, iL ФСБ, I, но отсутствует иммунологически активный F белок.

Известные по данным литературы белки в Ф1У не выявлены.

б

Протективные свойства белковых препаратов.

I. Внутрибрюшшшая модель заражения.В опытах активной защиты лышей показано, что ВЭ защищают мышей от заражения гомологичным итаммом P. aeruginosa.

Из 4-х иммунотипов P. aeruginosa (F1, F2. F3 и F6). которые юиболее часто встречаются среди клинических штаммов, были григотовлены белковые препараты. В таблице 3 ' суммированы зезультаты изучения протективной активности 7 серий белковых фепаратов ВСЭ.

Таблица з. Активная защита мышей, иммунизированных ВСЭ, приготовленных из F1, F2, F3, F6- иммунотипов.

!ерии Индекс эффективности (ИЭ) при заражении штаммами

ВСЭ 8с(F3) 170015(F2) F1 F6

14 4,2 5,7 7.4 8,0

15 < 6,4 6,4 8,0 6,0

16 3,0 10,0 13.8 7,4

17 7,2 5,2 9.8 6.3

18- 4,9 4,6 8.0 5.7

19 3,0 2,0 3.3 15,8

20 7,1 2,3 6.4 • ; 13.8

¡реднии

¡энные 4,7 4,6 7,4 . 9.0

ю всем

»пытам

[римечание: иммунизирующие дозы составляют 200 мкг бежа/мышь

Суммарный результат по 7 сериям свидетельствует, чтс белковый препарат обуславливает примерно одинаковый протективны! эффект при заражении гомологичными штаммами 8с (F3), 170015 (F2), I7004I (F1) и 170046 (F6). Уровень защиты мышей от зараженш штаммами I7004I и 170046 статистически значимо выше, чем уровеш защиты мышей от заражения штаммами 8с и I700I5. Это, по-видимому, объясняется разной иммуногенностью исходных штаммов. Установлено, что при перекрестном заражении иммунизированных мышей выявле! высокий уровень протективной активности ВСЭ: ИЭ колеблется от 3,i до 17 и выше. Результаты опытов активной защиты мышей, иммунизированных ТЭДЭ свидетельствует, что белковый препарат ТЭДИ обладал выраженной протективной активностью: ИЭ=15.

.2. Модель ожогого P. aeruginosa сепсиса у мышей. В это! серии экспериментов проводили сравнительное бактериологическое исследование органов мышей, зараженных внутрибрюшинно и по; обожженную кожу (ожоговая модель). При использовании ожогово! модели применяли небольшие заражающие дозы культуры (1-3 ЛД50). На модели ожогового сепсиса установлено, что культуру Р. aeruginosa удается выделить из крови, печени, почек \ лимфатических узлов до 3 суток, а из селезенки - до 5 суток.

Таким образом, Р. aeruginosa-сепсис возникает у животных при обоих способах заражения, однако при ожоговой модели заражающа* доза примерно на четыре порядка меньше, чем при внутрибрюшинног заражении.

В таблице 4 суммированы результаты опытов активной защиты н; модели синегнойного ожогового сепсиса: мышей иммунизировали ВС! однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг белка. Оказалось, чтс

юлученный нами ВСЭ эффективно защищал мышей от

жспериментального ожогового сепсиса.

Таблица 4. Результаты опытов активной защиты мышей -модель ожогового сепспса.

*руппы животных Доза заражения, Результаты ЛД50-число

число микробных погибло/ % выжи- - микробных

клеток штамма заражено ваемости клеток

8с №3)

ммунизирован- Ю5 . 2/16 87,5

ые мыши (мо- Ю4 2/24 91,7

ель ожогового О

епсиса) кг 2/25 92,0 >10° >3333,3

102 2/30 93,0

10 0/18 100,0

зиммунизиро- ю3 20/20 0

знные мыши 102 25/30 28,6

модель ожого-

зго сепсиса) 50 22/30 26,7 30(14-59)

25 6/10 40,0

штроль I

12 2/10 80,0

! ИММуНИЗИрО- 25Х106 20/20 0

ппше мыши с

¡нутрибрю- 12,5x10 18/20 10,0

иное зара- 6,2x106 12/20 40,0 5,1x10®

ние) 3,1хЮ6 6/20 70,0 (3,6-7,2)хЮ6

ятроль 2

3. Пассивная защита мышей.В опытах пассивной защиты мышей пользовали нормальную сыворотку кроликов и антисыворотку лученную после иммунизации кроликов белковыми препаратами, условиях титрования заражающей дозы культуры выявлен высокий

уровень ее протективной активности. Максимальный уровень протективной активности наблюдался после 2-й иммунизации (ИЭ=32) и несколько снижался (статистически незначимо) после 4 и 5 иммунизаций (ИЭ=19). Результаты опытов 2-го варианта, т.е. титрование иммунизирующей дозы,свидетельствуют, что титры протективных' антител (ЕД50) резко возрастают после 5 иммунизации:ВД50антисыворотки составляло 1:112(1:89-1:191 ),а ЕД50 нормальной сыворотки было менее 1:10.

В опытах пассивной защиты мышей изучали также антисыворотки к ВСЭ. Оказалось, что антисыворотки обладали выраженными протективными свойствами.

К этим очищенным белкам (30 и 40 кД) получал! соответствующие кроличьи антисыворотки. Установлено, чтс анти-СФ-1У и анти-СФ-¥11 сыворотки обладали выраженным! протективными свойствами. Существенной разницы в активности междз обеими антисыворотками не обнаружено. Таким образом, очищенные ог ЛПС белки клеточной стенки с молекулярной массой 30 кД (СФ-уи или 40 кД (СФ-1У) стимулируют у кроликов образование протективны; антител.

(

Кожная реакция Шварцана у кроликов при введении белковых препаратов.

Препараты вводили внутрикожно в дозах (сенсибилизирующи дозы) 400, 200,100, 50 мкг по сухому весу, в объеме 0,1 мл. Чере 15 часов учитывали кожную реакцию и внутривенно вводили препара в дозе 200 мкг/кг массы кролика в объеме I мл (разрешающая доза) Реакцию учитывали через 5 часов после введения разрешающей дозы. Результаты изучения кожной реакции Шварцмана у кроликов пр

введении белкового препарата - ТЭДЭ показали, что исходный препарат ТЭДЭ обладает слабыми токсичными свойствами. Однако, выраженная местная реакция наблюдается при введении высокомолекулярной Ф1 из ТЭДЭ, особенно при разрешении ТЭДЭ или ЛПС. Так, при сенсибилизации кроликов ТЭДЭ или Ф1 и разрешение Ф1 или ЛПС наблюдается выраженная местная реакция, сопровождающаяся некрозом, геморрагиями и уплотнениями тканей .

Низкомолекулярная фракция почти не обладает токсическими свойствами.ВСЭ обладал слабыми токсическими свойствами. Только три разрешении ЛПС выявлена интенсивная гиперемия размером 25x15 ям, индуцированная введением максимальной дозы - 400 мкг ЗСЭ.Полученные нами данные позволяют заключить, что метод' зодно-солевой экстракции с последующей очисткой при помощи /льтрацентрифугирования и ультрафильтрации дает возможность юлучить белковый препарат ' с минимальными токсическими свойствами.

Изучение псвдомонас-вакцины в эксперименте В лабораторных условиях на основе очищенных ВСЭ нами было 1риготовлено 16 экспериментальных серий

гсевдомонас-вакцины (ПВ). Для'получения ПВ использовали 4 штамма: 368, 170015, 170041 и 170046, которые принадлежали соответственно с иммунотипам I, 2, 3 и 6.

Токсичность испытывали на 4-х видах животных: мышах, морских ¡винках, кроликах и крысах. Лабораторные серии ПВ не вызывали 'ибели животных в течение 3-х дней. Изучали токсичность на мышах [ кроликах при многократном введении ПВ.Мышам вводили препарат годкожно 3 раза с интервалом 1-3 дня: I группа - доза 0,25 мг

белка/мл, II группа - 0,025 мг белка/мл, III группа - I мл раствора 0,15 М МаС1. Установлено, что 3-х кратное введение препарата не токсично для животных.ПВ оказалась также не токсичной для кроликов.

Результаты изучения протективной активности

экспериментальных серий ПВ при заражении гомологичными штаммами свидетельствуют, что ПВ стимулируют примерно одинаковые протективный иммунитет.

Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных ПВ.

Для иммунизации доноров-добровольцев использовали С экспериментальные серии ПВ, прошедшие контроль на предприятие "Биомед" и ГИСК им.Тарасовича.

.Имунизацию доноров-добровольцев проводили в Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН (Москва), Военно-медидинско! академии им. С.М.Кирова (С-Петербург) и Гематологическом Центре МЗ России (Москва). Всего было проиммунизировано 119 доноров, Вакцину вводили подкожно. Каждый донор получал 3 инъекции < интервалом 7 дней: о,5 - 1-2 человеческие дозы (ЧД). Наблюденш за вакцинированными проводили в течение I года.Безвредность ] реактогенность ПВ оценивали в соответствии с требованием ГИС1 им. Л.А.Тарасевича.

Установлено, что ПВ вызывает у вакцинированных, главным образом, слабые (15,9%) и редко - средние (2,5%) температурил реакции, которые исчезали в течение 12-24 часов после введени: препарата. Из 119 человек только у 2-х доноров (1,66%) наблюдал повышение температуры тела до 38°С: у одного донора после И

лмунизации, у другого - после ii-й иммунизации. Температура )рмализовалась в течение 12-24 часов после инъекции.

Слабые местные реакции наблюдали у 36,1% и средние у 4,2% щ. Эти реакции исчезали в течение 12-24 часов, у некоторых жоров - в течение 48 часов.

За период наблюдения в течение 12 месяцев ни у одного донора ) зарегистрировано выраженных поствакцинальных реакций или ¡ложнений.

До и после 3-й иммунизации исследовали сыворотку или плазму »норов при помощи ИФА.

Установлено, что уровень специфических антител (ИФЕ), т.е. [тител к белковым протективным антигенам клеточной стенки Р. iruginosa резко возрастает в процессе иммунизации.Уровень [тител резко возрастает через 1-2 недели после 3-й иммунизации и охраняется в течение 5 месяцев (срок наблюдения). Таким образом, mo заключить, что ПВ - высокоиммуногенный препарат, который :зывает слабые поствакцинальные реакции у незначительной части норов-добровольцев.

Плазма от вакцинированных * доноров-добровольцев была пользована для лечения 46 больных (40 взрослых и 6 детей) желой формой P. aeruginosa инфекции. Из 46 больных ложительный эффект (полное выздоровление с прекращением деления P. aeruginosa) получено у 40 больных (87%X, а у 6 льных (13%) наблюдали улучшение общего состояния, однако деление P. aeruginosa из ран не прекращалось.

выводы

1.Результаты иммунохимического и иммунологического изучени свидетельствуют, что в клеточной стенке Pseudomona aeruginoza локализованы протективные антигены белковой природы молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кД.

2. Установлено, что клеточные белки P. aeruginosa обладак видоспецифической протективной активностью и могут быт использованы для создания эффективной и малотоксичной вакцин против P. aeruginosa инфекции.

3. Сравнительная оценка.методов экстракции белков наружно мембраны показала, что водно-солевая экстракция обеспечивае наибольший еыход активного продукта с наименьшей токсичностью выраженной протективной активностью.

4 .Методом солевого фракционирования и жидкостно хроматографии из водного экстракта изолировали очищенные белки молекулярной массой 30 и 40 кД, практически не содержащие примес липополисахарида. Антисыворотка к этим белкам обладала выраженно протективной активностью в опытах на мышах.

5. На модели синегнойного ожогового сепсиса у мыше продемонстрирован высокий уровень протективной активност белкового препарата, полученного методом водно-солево экстракции.

6. В^водно-солевом экстракте обнаружены белки с молекулярно массой в пределах от 9 до 55 кДа. Этот препарат облада протективной активностью в экспериментах, был слаботоксичным дл мышей, морских свинок и кроликов.

7. В эксперименте разработана 4-х валентная бесклеточна псевдомонас-вакцина, которая содержит клеточные белки

значительную примесь липополисахарида (не более 0,08% от сухой ссы).

8. Вакцина, на основе белков клеточной стенки р. aeruginosa вызывает явных признаков токсикоза у лабораторных животных,

фективно защищает мышей от экспериментального заражения Р. i ruginosa, принадлежащих к разным О-серогруппам (или мунотипам), стимулирует у кроликов синтез специфических ютективных антител.

9. ПВ - слабо реактогенный препарат, вызывает у 98Ж >норов-добровольцев формирование специфического гуморального мунитета.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Белковые протективные антигены Pseudomonas aeruginosa Л.С.Едвабная, И.Г.Зайднер, Т.А.Макаренко, В.Ф.Були М.И.Жванецкая, Г.М.Машилова, Е.С.Станиславский - ЖМЭИ 1985,No11,с.18-23.

2. Immunochemical and immunological study of cell-wal proteins of Pseudomonas aeruginosa. E.S.Stanislavsky L.S.Edvabnaja, I.G.Zaidner, T.A.Makarenko, V.F.Bulk M.I.Zhvanetskaya and G.M.Mashilova - Acta Microbiol. Hung., 1986 v.33, No3, pp.245-255.

3. Иммунологический ответ у доноров-добровольцев иммунизированных вакциной псевдомонас. Т.А.Макаренко С.С.Балаян, А.И.Сергиенко, Е.С.Станиславский, Л.С.Едвабная И.А.Абрамова, М.А.Крохина, В.М.Русанов - ЖМЭИ, 1991, Noll с.39-42.

.4.Clinico-inimunological trials of Pseudomonas aeruglnosi vaccine. E.S.Stanislavsky, S.S.Balayan, A.I.Sergienko T.A.Makarenko, L.S.Edvabnaja, M.A.Krohina and V.M.Rusanov Vaccine, 1991,v.9, pp.491-494.

5. Antibodies against the common polysaccharide and proteii protective antigens of Pseudomonas aeruginosa in normal blooc donors. T.A.Makarenko, L.S.Edvabnaja, I.Abramova anc E.S.Stanislavsky - FEMS Microbiol. Immunol., 1991, v. 76, pp.321-326.

Подп. в печ. 15/17 1994 г. Формат 60x84 I/I6 Объем 1,5 п.л. 1,03 уч.-изд.л. •

В1ШЭРХ. 101925, Москва, ул. Архипова, 4/2

Тираж 100 Заказ 312