Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Белковые проективные антигены Р. aeruginosa.

российская академия медицинских наук

научно-исслэдовательскии институт вакцин и сывороток

БЕЛКОВЫЕ ПРОТЕКТИВНЫЕ АНТИГЕНЫ P. aeruginosa. 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ОД

им. и.и.мечникова

На правах рукописи УДК 576.8.097.2:851.132

Макаренко Татьяна Александровна

Москва - 1994

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. и.и.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медецинских наук, профессор Е.С.Станиславский

ОФЖШГЪНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук В.С.Кувакина доктор медицинских наук Д.Б.Егорова ВЦЦУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт хирургии им. А.В.Вишневского

РАМН.

Защита состоится 26 мая 1994 г. на заседании специализированного ученого совета (Д 001.38.01) при НИМ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064 г. Москва, пер. Мечникова, Ба.

Автореферат разослан 26 апреля 1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ЮТуальность проблемы.Поверхностные антигены бактериальной клетки даеют исключительно важное значение в стимуляции специфического и юспецифического иммунитета против инфекции. Среди поверхностных зятигенов велика иммунологическая значимость белков клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Белки клеточной стенки 1редставляют значительный интерес для создания новых бактериальных вакцин. Иммунологическое изучение белковых сомпонентов клеточной стенки P. aeruginosa было проведено Homma с »авторами (1976), а также Чеканом Л.В. (1980) в лаборатории фотективных антигенов НИИВС им. Мечникова.

По данным Homma, белок, выделенный из эндотоксина Р. leruginosa, обладает свойствами общего протективного антигена, ^следованиями, проведенными Чеканом Л.В., было показано, что ¡етодами двумерного иммунноэлектрофореза в клеточной стенке швлено до 28 белковых антигенов, общих для вида P. aeruginosa.

Данные, полученные Едвабной Л.С., Зайднер И.Г., Макаренко '.А. и др. (1986), а также результаты экспериментов Gilleland et ,1.(1987) и Speot et а1.(1987) позволяют предположить, что белки леточной стенки могут быть использованы для создания эффективных акцин против синегнойной инфекции. Однако протективные свойства елков клеточной стенки P. aeruginosa окончательно не выяснены.

Известно, что в борьбе с синегнойной инфекцией нтибиотикотерапия часто оказывается не эффективной, поэтому ажное значение приобретают исследования, направленные на азработку иммунопрепаратов против, данной нозокомиальной нфэкции.

Начиная с 1986 года в Лаборатории протективннх антигенов

НИИВС им. Мечникова проводятся исследования с целью получения новой вакцины на основе очищениях белков клеточной стенки Р. aeruginosa без примеси эндотоксина (липополисахарида).

Настоящая работа является частью плана НИР лаборатории по разработке этой вакцины.

Цель данного исследования - изучить протективные свойства изолированных белков P. aeruginosa с разной молекулярной массой и экспериментально обосновать возможность использования этих клеточных белков для создания эффективной малотоксичной вакцины против синегнойной инфекции.

Для достижения указанной цели наш были поставлены следующие задачи:

, I. Провести сравнительную оценку методов выделения белков клеточной - стенки P. aeruginosa на основе данных химического и иммунохимического анализа.

2. Изучить в опытах активной и пассивной защиты мышей изолированные белки клеточной стенки p. aeruginosa.

3 Приготовить экспериментальные серии белковой псевдомонас-вакцины и провести ее испытания в эксперименте на животных.

4.Изучить безвредность и иммунологический ответ у добровольцев, иммунизированных экспериментальными сериями псевдомонас-вакцины.

Полученные нами данные могут стать основой для разработки технологии приготовления новой очищенной бесклеточной псевдомонас-вакцины.

Научная новизна и практическая значимость проведенных

исследований.

В результате проведенных исследований установлено, что в клеточной стенке Р.aeruginosa локализованы белки с молекулярной массой:9,14,21,25,30,38,44,46 и 55 кД,которые стимулируют у лабораторных животных формирование протективного иммунитета к заражению различными иммунотипами P.aeruginosa.

Разработан способ выделения очищенных белковнх протективных антигенов клеточной стенки P.aeruginoea с использованием комбинации методов водно-солевой экстракции, солевого фракционирования и жидкостной хроматографии.На основе результатов химического, физико-химического и иммунологического анализа впервые разработана Оэсклеточная псевдомонас-ваквдна (ПВ), содержания видоспецифические белковые протективнне антигейы P.aeruginosa.

В эксперименте на животных вакцина мало токсична и вызывает специфический иммунитет к синегнойной инфекции.

Результаты клинико-иммунологических испытаний ПВ на добровольцах свидетельствуют о низкой токсичности и высокой иммуногенности препарата.

Полученные данные могут стать осиоеой для .разработки технологии получения новой псевдомонас-вакцины.

Положения, выносимые на защиту.

В клеточной стенке P.aeruginosa локализованы протективнне антигены белковой природа с молекулярной массой в пределах от 9 до 55- кД.

Разработан способ выделения очишенных протективных белковых антигенов P.aeruginoza, основанный на водно-солевой экстракции, солевом фракционировании и жидкостной хроматографии.

Изученные белки обладают видоспецифической активностью и могут Сыть использованы для создания эффективной и малотоксичной вакцины против P.aeruginosa инфекции.

Клияико-иммунологические испытания ПВ показали высокую эффективность разработанного препарата.

Алробация работы.

Результаты исследований, представленных в данной работе, доложены на Ученых Советах ШМВС им. Мечникова РАМН (Москва,1988,1993), на всероссийских и международных конференциях:на всесоюзной конференции по прблемам медицинской технологии (Санкт-Петербург, 1988), на конференции в Ташкенском ШИВС (1989), на международной конференции по вакцинам (Борстел, ФРГ, 1991).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела средств и методов иммунопрофилактики и иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы,' шести глав собственных исследований, обсуждения,' выводов, указателя литературы, включающего 141 источник. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 18 рисунками.

Содержание диссертации.

Материалы и методы исследования.

Исследования проводили на типовых штаммах P. aeruginosa, полученных из Венгерской" национальной коллекции бактериальных культур, а также из Института хирургии им. A.B. Вишневского РАМН. Изучение штаммов показало, что они типичны по морфологии и культуральным свойствам.

1 .'Получение экстрактов и очищенных белковых препаратов.Водные экстракты (ВЭ) были приготовлены по методу, разработанному в Лаборатории протективных антигенов Московского НИМ вакцин ■ и сывороток им. и.и. Мечникова( Станиславский и др.1986). Исходный ВЭ очищали, ультрацентрифугированием от основной массы липополисахарида (ЛПС).

Такой препарат, обозначали, как частично очищенный ВЭ (Ч0ВЭ)\ ЧОВЭ - растворимые белки клеточной стенки подвергали солевому фракционированию: при 50% насыщении сульфатом аммония и при насыщении солью до 8055.Обе фракции подвергали гель- и ионно-обмэнной хроматографии.

Исходный ВЭ фракционировали также методом ультрафильтрации при помощи кассетной системы "Пеликон"(Миллипор, Франция). Первоначально ВЭ фильтровали через кассету РГНК-00005 (мол. масса 100 кД), а полученный фильтрат через кассеты РТТК-00005 (мол. масса 30 кД) для концентрации активной фракции и удаления низкомолекулярных малоактивных компонентов. Затем ВЭ подвергали шдкостной хроматографии на колонке с сефадексом G-IOO.

Нами получены, также экстракты при помощи водно-солевого метода (ВСЭ). Микробные клетки суспендировали в стерильном 0,15 М

растворе ИаС1 (рН 7,2-7,4) и подвергали экстракции, как при-получении ВЗ.

ВСЭ очищали при помощи ультрафильтрации с использованием кассетной системы "Пеликон" (Миллшгар, Франция), также как и очищенные ВЭ.

Для получения экстракта при помощи трис-ЭДТА (ТЭДЭ) использовали .20 н. трис-буфер с добавлением 0,02 н. ЭДТА (рН 8). Экстракцию проводили таким же методом, как водную или водно-солевую экстракцию.Таким же методом получали экстракт при помощи 0,2 М трис-НС1 буфера (рН 8). Экстракт обозначили- ТЭ.

Исходный экстракт (ТЭДЭ) фракционировали на колонке с сефадексом с-ЮО и выделяли четыре фракции.

а.Метод колоночной хроатографии.Использовали колонку (2,5 х 80 см) заполненную сефадексом й-юо (Фармация, Швеция). Элюцию проводили днстштрованной водой. Ионно-оОменную хроматографию проводили на колонке с ДЭАЕ целлюлозой. Колонка была уравновешена стандартным 1/15 М фосфатным буфером (рН 7,3), а затем проводили поэтапную элюцию наносимого материала, создавая увеличение солевой нагрузки.

3.Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) проводили общепринятым способом

4. Иммуноферментный анализ (ИФА).Применяли метод ИФА, описанный в работе Макаренко с соавт.(1993).

5.Электрофорез белковых препаратов в полиакриламидном геле. Для характеристики белковых компонентов использовали метод электрофореза в 12Я полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в модификации ЬаеттН et а1.(1970).

6 Метод иммуноэлектрофореза и иммупреципитащш в агаровом

геле .Для постановки иммуноэлектрофореза в агаровом геле

использовали 155 агарозу (Merk, ФРГ), приготовленную на веронал-мединаловом буфере.

Антигенные препараты изучали в опытах иммунопреципитации в агаровом геле по Оухтерлони (1965).

7. Метода химического анализа.В препаратах определяли белок по Лоури (1951), гексозы с антроновым реактивом , гептозу (Roe~ J.H. 1955), КДО (кетодиоксиоктоновая кислота) (Anacker R.b. et.al., 1966).

ЛПС в препаратах определяли при помощи ИФА (Едвабная Л.С., 1983).

8. Экспериментальные животные.В работе использовали следующие виды животных: неинбредные белые мыши, мыши тетрагибриды, мыши M-CFIP (весом 18-20 г). Кроме того, эксперименты проводили на аутбредных морских свинках (вес 250-300 г), кроликах породы "Советская шиншилла" (вес 2,5-3,0 кг).Всего в экспериментах использовано: 320 кроликов, 100 морских свинок и Э5000 мышей.

9. Тест активной защиты мышей. Мышей иммунизировали знутрибрюшинно и через ? дней заражали живой культурой: зинегнойной палочки. Опыт активной защиты проводили в 2-х вариантах:

1) титрование заражающей дозы на иммунизированных (опыт) и »иммунизированных (контроль) мышах.с определением ЛД50;

2) титрование иммунизирующей дозы с определением ЕДБд.

Ю. Тест пассивной защиты мышей. Мышам внутрибрюшинно ¡водили соответствующие антисыворотки или нормальную сыворотку контроль - I) в разведении 1:10 (в объеме I мл), через 2 часа-

животых заражали внугрибршинно разными дозами живой культуры Р. aeruginosa.Опыты пассивной защиты проводили в 2-х вариантах как и опыты активной защиты мышей. Рассчитывали ЛД50 для опытных и контрольных мышей.

11. Методы определения токсичности. Токсичность полученных препаратов определяли на мышах, кроликах и морских свинках. Мышам вводили препараты в объеме I мл внутрибрюшнно. Гибель животных учитывали в течение 3 дней. Морским свинкам вводили препараты в объеме 2 мл подкожно. Животных наблюдали в течение 3 дней, после чего расчитывали ЛД50.

Кроме того, изучали токсичность препаратов при многократном введении животным: мышам подкожно 7 раз вводили препараты в дозе от 100 до 1000 мкг (по белку) в объеме 0,5 мл с интервалом 2 дня. Наблюдения за животными проводили в течение 24 дней ежедневно, определяя массу тела животных. Кроликам вводили препараты возрастающими дозами подкожно: 0,5 мг и внутривенно: I, I, 2 и 3 мг (по белку) - всего 5 инъекций с интервалом 11-30 дней.

12 Бактериологические исследования органов мышей.Исследованию подвергали кровь, селезенку, печень, брыкеечные лимфоузлы и почки.

13. Экспериментальная модель ожогового сепсиса у мышей.Модель синегнойного ожогового сепсиса воспроизведена на • мышах тетрагибридах СВШ по методу Holder et.al. (1971). статистическая обработка результатов всех оштов пассивной и активной защиты проведена по методу Ван дер Вардена ( i960).

в j

Результаты исследований и обсуждение. Характеристика изолированных белковых антигенов клеточной стенки P. aeruginosa.

.Нами получены белковые антигенные препараты из Р. aeruginosa: исходные водные экстракты (ВЭ), из них частично очищенные ВЭ (ЧОВЭ) и фракции путем солевого осаждения; водно-солевые экстракты (ВСЭ), очищенные методами ультрацентрифугирования и ультрафильтрации; экстракты при помощи трис-ЭДТА (ТЭДЭ) и трис-буферов (ТЭ).

Все препараты были подвергнуты химическому • и иммунохимическому анализу, изучены при помощи ИФА и РПГА, а также изучены в опытах активной и пассивной защиты мышей. Результаты химического анализа белковых препаратов показали, что очищенные ВЭ содержали, главным образом, белок: белок составлял примерно 50% от общего веса ВЭ. В препаратах обнаружено около 14% веществ нуклеиновой природы, с небольшим - количеством липополисахарида (ЛПС%-0,*08%. Фракции, полученные в результате жидкостной хроматографии не содержали примеси ЛПС и характеризовались высоким содержанием белка (табл.1). Результаты химического анализа свидетельстуют о примерно сходном химическом составе ВЭ и ВСЭ. Так ВСЭ содержат около 50% белка, 3,5% углеводов и около нуклеиновых кислот. Содержание ЛПС по данным ИФА не превышает 0,08$. ЛПС не выявлено во фракциях, полученных после жидкостной хроматографии.Углеводные компаненты концентрировались в II и ш фракциях.

Препараты ТЭДЭ и ТЭ также сходны по химическому составу. ТЭДЭ -содержал около- 50% белка и примерно 0,5% ЛПС, а фракции,

полученные в результате хроматографии, содержали разное количество белка и ЛИС.

Таблица 1.Химический анализ белковых препаратов.

Препараты Белок Углевода ШС Нуклеиновые

% % % кислоты

ВЭ 50,0+4,6 4,5+1,3 0,08+0,0 14,3+5,6

1фракция 62,0+6,2 не следы не

ифракция 46,0+7,2 определя- 0 определя-

Шфракция 34,0+8,4 ли 0 ли

ВСЭ 44,6+7,06 2,36+0,3 0,06+0,02 27,2+0,2

1фракция 50,0+10,9 2,16+0,3 0+0,01 не

Ифракция 43,3+7,4 13,6+0,2 0 определя-

Шфракция 38,3+8,3 6,0+0,5 0 ли

ТЭДЭ 50,0+5,7 7,5+0,5 0,5+0,1 не

1фракция 50,0+6,9 7,5+0,4 5,0+0,9 определя-

Ифракция Шфракция 70,1+10,0 4,5+0,6 0,25+0,1 ли

1Уфракция 14,6+7,1 2,5+0,8 0,15+0,06

Таким образом, в препаратах ТЭДЗ и фракциях полученных после жидкостной хроматографии содержится больше ЛИС, чем в ВЭ и ВСЭ. Данные химического анализа позволяют предположить, что ВЭ и ВСЭ должны быть менее токсичными, чем ТЭДЗ и ТЗ.

Частично очищенный водный экстракт (ЧОВЭ) также был

подвергнут химическому и физико-химическому анализу (табл. 2).

При гель-хроматографии фракции I (ФГ), полученной при 5СЙ насыщении сульфатом аммония на колонке с сефэдексом 0-100 были выделаны следующие субфракции (СФ): СФ-1 и СФ-И (соответствующие пики).Из фракции, полученной при 80% насыщении сульфатом аммония (Фи), выделены СФ-ИГ и СФ-1У.

Таблица 2. Химическая характеристика белковых препаратов,

выделенных из Ч0ВЭх.

Выход по Мол. Коэффициент Содержание Отношение, масса седимента-

пр^р,*, Г В а — » .

{%) {%) лпс

ЧОВЭ ТОО не опред. гетерог. 38 0,3 126

СФ1 5,6 >150 39 8 4,8

ОФИ 4,3 не опред. — 41 4 10

СФ1ХХ 9,2 37 0,1 370

СФ1У 0,7 40 2 28 0,05 560

СФУ 1,62 80 3 55 2 27,5

СФУ1 14,8 60 3 75 I 75

СФУИ 0,89 30 2 50 0,07 714

СФУИГ 0,27 не опред. не опред. 40 0,08 500

СФ1Х 0,86 74 1,2 61,6

Примечанием: Выход СФ относитеьно ЧОВЭ.

Ч0ВЭх - частично очищенный белковый препарат,

полученыый при помощи водной экстракции.

При рехроматографии СФ-Ш на сефадексе в-мо были изолированы

(ИНГ, 0Ф-У1, СФ-УП.

СФ-1 была подвергнута хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и выделены СФ-УШ и СФ-1Х.Методом колоночной хроматографии была определена примерная молекулярная масса белков, (см. табл. 2).

В результате рехроматографии СФ-1 на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой были выделены СФ-УШ и СФ-1Х , которые резко различались по содержанию белка (табл. 2).

Таким образом, удалось показать, что СФ-1 содержит высокомолекулярные компоненты, представляющие, по-видимому, комплекс ЖС с белком.

Относительно низкомолекулярные белки СФ-1У (молекулярная масса 30 кД) и ОФ-УП (молекулярная масса 40 кД) были наиболее' гомогенными по данным аналитического ультрацентрифугирования и практически свободны от примеси ЛПС (табл. 2).

Результаты химического анализа свидетельствуют, что в ЧОВЭ выявлены следы углеводов, а в СФ-1У и СФ-УИ углеводы не обнаружены.

йммунохимический анализ белковых препаратов. Установлено, что СФ-1У и СФ-УИ, полученные из ЧОВЭ,образуют по одной линии преципитации, которые идентичны между собой. Остальные СФ образуют по 2-4 линии преципитации, т.е. гетерогеннн. СФ-УШ и СФ-1Х, полученные из СФ-1 при помощи ионно-обменной хроматографии, оказались гетерогенными, особенно, СФ-УШ . Эти СФ были идентичны между собой в антигенном отношении. Однако СФ-УШ образовывала одну из двух линий преципитаций, которая формировалась вблизи лунки с антисывороткой. СФ-УШ по данным иммуноди^фузии была не

идентична исходной Ф1.

В соответствии с результатами МФА установлено, что наиболее активны СФ-1 и СФ-и, вероятно, за счет примеси ЛПС. Наименее активными оказались СФ-1У и СФ-УИ .

Результаты опытов иммунодиффузш . ВСЭ и фракций, полученных из ВСЭ, свидетельствуют ,что Ф1 и Фи активны в иммунопрецилитации с соответствующей антисывороткой образуя до 4-х линий преципитаций. Низкомолекулярная Ф-ш не образует или образует одну слабую линию преципитации.

Исследование белковых препаратов ТЭДЭ и ТЭ показали, что они активно реагируют с антисывороткой к ТЭДЭ. Наиболее активным оказался ТЭДЭ: препарат образует 3-6 линий преципитаций.

Фракции, полученные из ТЭДЭ методом колоночной хроматографии, идентичны в антигенном отношении.В опытах идауноэлектрофореза изучали препараты ТЭДЭ и фракции, полученные после гель-хроматографии из исходного ТЭДЭ, а также ВСЭ.Оказалось что,адсорбированная ЛПС антисыворотка реагирует с ТЭДЭ, с Ф1 и с Ф11+Ш (плато). Однако, на ряду с белковыми антигенами в Ф1, судя по данным электрофореза,, концентрируется значительное количество ЛПС.

По данным иммуноэлектрофореза Фгу (низкомолекулярная) малоактивна и содержит небольшое количество низкомолекулярных белковых антигенов клеточной стенки.

В опытах иммуноэлектрофареза установлено, что ВСЭ реагирует с гомологичной антисывороткой образуя до 4-х линий преципитаций.

Было проведено изучение полученных 'нами белковых препаратов при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии

додецилсульфата натрия.Изучали препараты: ТЭДЭ, ТЭ, ВСЭ, которые оказались гетерогенными по белковому спектру и содержали набор белков с молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кД.

. Анализируя наш данные электрофоретического изучения белковых препаратов в сравнении с данными Hancock et. al (1988,1990), которые классифицировали белки клеточной стенки по молекулярной массе, мы пришли к следующему заключению:во всех трех препаратах присутствуют иммунологически активные бэлки, а именно: белки ? и I, а также белки н2, D1, П2и эстераза, иммунологические свойства которых не изучены. В препаратах выявлен, вероятно, белок Р с молекулярной массой 38 кД, который иммунологически идентичен белку А Е. coli (Mizuno Т.1979,1982). По данным Gilleland белок F обладает выраженной протективной активностью (Gilleland Н.Е. 1988,Hanooc R.E.1981 ).

В процессе колоночной хроматографии ТЭДЭ изолированы и исследованы фракции: Ф1 - высокомолекулярная, ФИ+Ш ("плато"), ФГУ - низкомолекулярная. В Ф1 обнаружены бежи с' молекулярной массой 9, 14, 20, 25 , 30, 38 и 44 кД. Таким образом, в Ф1, по-видимому, присутствуют белки Е, F, G, н,,, н2 Ферриопиохелин связывающий белок, I, из которых иммунологически активны белки I (липопротеин), р, н (Hanoock R.E.1978 ).Во Фи+Ш ("плато") присутствуют белки с молекулярной массой 9, 14, 20, 21 и примерно 26 кД, которые соответствуют белкам с, н.,, н2, ФСБ, I, но отсутствует иммунологически активный F белок.

Известные по данным литературы белки в ФГУ не выявлены.

Протективнне свойства белковых препаратов.

I. Внутрибршинная модель заражения.В опытах активной защиты мышей показано, что ВЗ защищают мышей от заражения гомологичным штаммом P. aeruginosa.

Из 4-х иммунотипов Р. aeruginosa (PI, F2, F3 И F6), которые наиболее часто встречаются среди клинических штаммов, были приготовлены, белковые препараты. В таблице з суммированы результаты изучения протективной активности 7 серий белковых препаратов ВСЭ.

Таблица 3. Активная защита мышей, иммунизированных ВСЭ, приготовленных из т1, f2, рз» f6- иммунотипов.

Серии Индекс эффективности (ИЭ) при заражении штаммами

ВСЭ 8с (РЗ) 170015 0F2) F1 гб

14 4,2 5,7 7,4 8,0

15 6,4 6,4 8,0 6,0

16 3,0 10,0 13,8 7,4

17 7,2 5,2 9,8 6,3

18 4,9 4,6 8,0 5,7

19 3,0 2,8 3,3 15,8

20 7,1 2,3 6,4 13,8

Средним

данные 4,7 4,6 . 7,4 9,0

по всем

опытам

Примечание: иммунизирующие дозы составляют 200.мкг белка/мышь

Суммарный результат но 7 сериям свидетельствует, что белковый препарат обуславливает примерно одинаковый протективный эффект при заражении гомологичными штаммами 8с (F3), I700I5 (F2), I7Q04I (Р1) и 170046 (Еб). Уровень защиты мышей от заражения штаммами I7004I и 170046 статистически значимо выше, чем уровень защиты мышей от заражения штаммами 8с и I700I5. Это, по-видимому, объясняется разной ишуногенностью исходных штаммов. Установлено, что при перекрестном заражении иммунизированных мышей выявлен ■ высокий уровень протективной активности ВСЭ: ИЭ'колеблется от 3,5 до 17 и выше. Результаты опытов активной защиты мышей, иммунизированных ТЭДЭ свидетельствует, что белковый препарат ТЭДЭ обладал выраженной протективной активностью: ИЭ=15.

.2. Модель ожогого р. aeruginosa сепсиса у мышей. В этой серии экспериментов проводили сравнительное бактериологическое исследование органов мышей, зараженных внутрибршинно и под обожженную 'кожу (ожоговая модель). При использовании ожоговой модели применяли небольшие заражающие дозы культуры (1-3 ДИ5о). На модели ожогового сепсиса установлено, что культуру Р. aeruginosa удается выделить из крови,- печени, почек и лимфатических узлов до 3 суток, а из селезенки - до 5 суток.

Таким образом, Р. aeruginosa-сепсис возникает у животных при обоих способах заражения, однако при окоговой модели заражающая доза примерно на четыре порядка меньше, чем при внутрибрюшинном заражении.

В таблице 4 суммированы результаты опытов активной защиты на

модели синегнойного ожогового сепсиса: мышей иммунизировали ВСЭ

однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мкг белка. Оказалось, что

полученный нами ВСЭ эффективно защищал ' мышей от экспериментального ожогового сепсиса.

Таблица 4. Результаты опытов активной защиты мышей -модель ожогового сепспса.

Группы животных

Доза заражения, число микробных клеток штамма 8с (КЗ)

Результаты

ЛД50-число

погибло/ % выжи- микробных ю заражено ваемости клеток

Иммунизирован- Ю5 2/16 87,5

ные мыши (мо- Ю4 2/24 91,7

дель ожогового о с

сепсиса) 1СГ 2/25 92,0 >10& >3333,3

Ю2 • 2/30 93,0

10 0/18 100,0

Неиммунизиро- ю3 20/20 0

ванные мыши ю2 25/30 28,6

(модель ожого-

вого сепсиса) 50 22/30 26,7 30(14-59)

25 6/10 40,0

контроль I

12 2/10 80,0

Неиммунизиро- 25x1О6 20/20 0

ваннне мыш с

(внутрибрю- 12,5x10 18/20 10,0

щинное зара- 6,2хЮ6 12/20 40,0 5,1x1О6

жение ) 3,1x10® 6/20 70,0 (3,6-7,2)хЮ6

контроль 2

3. Пассивная защита мышей.В опытах пассивной зашиты мышей использовали нормальную сыворотку кроликов и антисыворотку

полученную после иммунизации кроликов белковыми препаратами. В условиях титрования заражающей дозы культуры выявлен высокий уровень ее ггротективной активности. Максимальный уровень протективной активности наблюдался после 2-й иммунизации (ИЭ=32) и несколько снижался (статистически незначимо) после 4 и 5 иммунизация ' (ИЭ=19). Результаты опытов 2-го варианта, т.е. титрование иммунизирующей дозы,свидетельствуют, что титры протективных антител. (ЕД50) резко возрастают после. 5 иммунизации:ЕД50антисыворотки составляло 1:112(1:89-1:191),a ЕЩ^д нормальной сыворотки было менее 1:10.

В опытах пассивной защиты мышей изучали также антисыворотки к ВСЗ. Оказалось, что антисыворотки обладали выраженными протекгивными свойствами.

К этим очищенным белкам (30 и 40 кД) получали соответствующие кроличьи антисыворотки. Установлено, что анти-СФ-iy и анти-СФ-vri сыворотки обладали выраженными протективными свойствами. Существенной разницы в активности между обеими антисыворогками не обнаружено. Таким образом, очищенные от ЛИС белки клеточной стенки с молекулярной массой 30 кД (СФ-УИ) или 40 кД (СФ-IV) стимулируют у кроликов образование протективных антител.

Кожная реакция Шварцана у кроликов при введении белковых препаратов.

Препараты вводили внутрикокно в дозах (сенсибилизирующие дозы) 400, 200,100, 50 мкг по сухому весу, в объеме 0,1 мл. Через 15 часов учитывали кожную реакцию и внутривенно вводили препарат в дозе 200 мкг/кг массы кролика в объеме I мл (разрешающая доза).

Реакцию учитывали через 5 часов после введения разрешающей дозы. Результаты изучения кожной реакции Шварцмана у кроликов при введении белкового препарата. - ТЭДЭ показали, что исходный препарат ТЭДЭ обладает слабыми токсичными свойствами. Однако, выраженная местная реакция наблюдается при введении высокомолекулярной Ф1 из ТЭДЭ, особенно при разрешении ТЭДЭ или ЛПС. Так, при сенсибилизации кроликов ТЭДЭ или Ф1 и разрешение Ф1 или ЛПС наблюдается выраженная местная реакция, сопровождающаяся некрозом, геморрагиями и уплотнениями тканей .

Низкомолекулярная фракция почти не обладала токсическими свойствами.ВСЭ обладал слабыми токсическими свойствами. Только при разрешении ЛПС выявлена интенсивная гиперемия размером 25x15 мм, индуцированная введением максимальной дозы - 400 мкг ВСЭ.Полученные нами данные позволяют заключить, что метод водно-солевой экстракции с последующей очисткой при помощи ультрацентрифугирования и ультрафильтрации дает возможность получить белковый препарат с минимальными токсическими свойствами.

Изучение псвдомонас-вакцины в эксперименте В лабораторных условиях на основе очищенных ВСЭ нами было приготовлено ^экспериментальных серий псевдомонас-вакцины (ПВ). Для получения ПВ использовали 4 штамма: 868, 170015, 170041 и 170046, которые принадлежали соответственно к иммунотипам I, 2, 3 и 6.

Токсичность испытывали на 4-х видах животных: мышах, морских свинках, кроликах и крысах. Лабораторные серии ПВ не вызывали гибели животных в течение 3-х дней. Изучали токсичность

на мышах и кроликах при многократном введении ПВ.Мышам вводили препарат подкожно 3 раза с интервалом 1-3 дня: I груша - доза 0,25 мг белка/мл, II группа - 0,025 мг бежа/мл, III группа - Г мг белка/мл раствора 0,15 М HaCl. Установлено, что 3-х кратное введение препарата не токсично для животных.ПВ оказалась также не токсичной для кроликов.

Результаты изучения протективной активности

экспериментальных серий ПВ при заражении гомологичными штаммами свидетельствуют, что ПВ стимулируют примерно одинаковый протективный иммунитет.

Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных ПВ.

Для иммунизации доноров-добровольцев использовали 3 экспериментальные серии Ш, прошедшие контроль на предприятии "Биомед" и ГИСК им.Тарасовича.

Имунизацию доноров-добровольцев проводили в Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН (Москва), Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (С-Пвтербург) и Гематологическом Центре МЗ России (Москва). Всего было проиммунизировано 119 доноров. Вакцину вводили подкожно. Каждый донор получал 3 инъекции с интервалом 7 дней: '0,5 - 1-2 человеческие дозы (ЧД). Наблюдение за вакцинированными проводили в течение I года.Безвредность и реактогенность ПВ оценивали в соответствии с требованием ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Установлено, что ПВ вызывает у вакцинированных, главным образом, слабые (15,9%) и редко - средние (2,5%) температурные реакции, которые исчезали в течение 12-24 часов после введения

препарата. Из 119 человек только у 3-х доноров (1,66%) наблюдали повышение температуры тела до 38°С: у одного донора после 1-й иммунизации, у другого - после и-й иммунизации. Температура нормализовалась в течение 12-24 часов после инъекции.

Слабые местные реакции наблюдали у 36,1% и средние у 4,2$ лиц. Эти реакции исчезали в течение 12-24 часов, у некоторых доноров - в течение 48 часов.

За период наблюдения в течение 12 месяцев ни у одного донора не зарегистрировано выраженных поствакцинальных реакций или осложнений.

До и после 3-й иммунизации исследовали сыворотку или плазму доноров при помощи ИФА.

Установлено, что уровень специфических антител (ИФЕ), т.е. антител к белковым протективным антигенам клеточной стенки 7. aeruginosa резко возрастает в процессе иммунизации.Уровень антител резко возрастает через 1-2 недели после 3-й иммунизации и сохраняется в течение 5 месяцев (срок наблюдения). Таким образом, можно заключить, что ПВ - высокоиммуногенный препарат, который вызывает слабые поствакцинальше реакции у незначительной части доноров-добровольцев.

Плазма от вакцинированных доноров-добровольцев была использована для лечения 46 больных (40 взрослых и 6 детей) тяжелой формой P. aeruginosa инфекции. Из 46 больных положительный эффект (полное выздоровление с прекращением выделения P. aeruginosa) получено у 40 больных (875?), а у 6 больных (13Ж) наблюдали улучшение общего состояния, однако выделение P. aeruginosa из ран не прекращалось.

вывода

1.Результаты иммунохимического и иммунологического изучения свидетельствуют, что в клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa локализованы протективные антигены белковой природы с молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кД.

2. Установлено, что клеточные белки P. aeruginosa обладают видоспецифической протекгивной активностью и могут быть использованы для создания эффективной и малотоксичной вакцины против P. aeruginosa инфекции.

3. Сравнительная оценка методов экстракции белков нарукной мембраны показало, что водно-солевая экстракция обеспечивает наибольший выход активного продукта с наименьшей токсичностью и выраженной протективной активностью.

4 ■ .Методом солевого фракционирования и жидкостной хроматографии из водного экстракта изолировали очищенные белки с молекулярной массой 30 и 40 кД, практически не содержащие примеси липополисахарида. Антиснворотка к этим белкам обладала выраженной протективной активностью в опытах на мышах.

5. На модели синегнойного ожогового сепсиса у мышей продемонстрирован высокий уровень протективной активности белкового препарата, полученного методом водно-солевой экстракции.

6. В водно-солевом экстракте обнаружены белки с молекулярной массой в пределах от 9 до 55 кДа. ' Этот препарат обладал протективной активностью в экспериментах, был слаботоксичным для мышей, морских свинок и кроликов.

незначительную примесь липополисахарида (не более 0,08?» от сухой массы).

8. Вакцина, на основе белков клеточной стенки P. aeruginosa не вызывает явных признаков токсикоза у лабораторных животных, эффективно защищает мышей от экспериментального заражения Р. aeruginosa, принадлежащих к разным О-серогруппам (или иммунотипам), стимулирует у кроликов синтез специфических протективных антител.

9. ПВ - слабо реактогенный препарат, вызывает у 98% доноров-добровольцев формирование специфического гуморального иммунитета.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Белковые протективные антигены Pseudomonas aeruginosa. Л.С.Едвабная, 'и.Г.Зайднер, Т.А.Макаренко, В.Ф.Булк, М.И.Жванацкая, Р.М.Машилова, Е.С.Станиславский - ЖМЭМ, 1985,No11,0.18-23.

2. Immunochemical and immunological study of oell-wall proteins of Pseudomonas aeruginosa. E.S.Stanislavsky, L.S.EdvabnaJa, I.G.Zaidner, T.A.btakarenko, V. P. Bulk, M.I.Zlivanetskaya and G.M.Mashilova - Acta Microbiol. Hung., 1986, v. 33, НоЭ, pp.245-255-

3. Иммунологический ответ у доноров-добровольцев, иммунизированных вакциной псевдомонас. Т. А. Макаренко,' С.С.Балаян, А.И.Сергиенко, Е.С.Станиславский, Л.С.Едвабная, И.А.Абрамова, М.А.Крохдна, В.М.Русанов - ЖМЭИ, 1991, Holl, с.39-42.

.4.ciinioo-immunologioal trials of Pseudomonas aeruginosa vaccine. E.S.Stanislavsky, S.S.Balayan, A.I.Sergienko, T.A.Makarenko, L.S.Edvabnaja, M.A.Krohina and V.M.Rusanov -Vaccine, 1991 ,v.9, pp.491-494.

5. Antibodies against the common polysaccharide and protein protective antigens of Pseudomonas aeruginosa in normal blood donors. T. A.Mabarenko, L.S.Edvabnaja, I.Abramova and E.S.Stanislavsky - PEMS Miorobiol. Immunol., 1991, v. 76, pp.321-326.

Пода, в печ; 15/1У 1994 г. Формат 60x84 2/16 Тираж 100

Объем 1,6 п.л. 1,03 уч,-изд,л. Заказ 312

ШИЭРХ. 101925, Москва, ул. Архгаова, 4/2

■ '-"Л

':••( t - ' ' '.'•.'.'i