Автореферат и диссертация по медицине (14.00.19) на тему:Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия саркомы М1

На правах рукописи л

СПИЧЕНКОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

СОЧЕТАННАЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ И РЕНТГЕНОТЕРАПИЯ САРКОМЫ М1

(экспериментальное исследование)

14.00.19. - лучевая диагностика, лучевая терапия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Обнинск-2005

Работа выполнена в Государственном учреждении - Медицинском радиологическом научном центре Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Каплан Михаил Александрович Доктор медицинских наук Гулидов Игорь Александрович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Коноплянников Анатолий Георгиевич Доктор медицинских наук, профессор Титова Вера Алексеевна Ведущая организация:

Государственный научный центр лазерной медицины Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 24 мая 2005 года в 1 Iм часов на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ - Медицинском радиологическом научном центре РАМН (249036, г. Обнинск Калужской обл., ул. Королева,4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ - Медицинского радиологического научного центра РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор Куликов В.А.

F2Z5-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в нашей стране активно развивается новый метод борьбы с онкозаболеваниями - фотодинамическая терапия (ФДТ), основанный на способности некоторых химических веществ (фотосенсибилизаторов) избирательно накапливаться в опухолевой ткани и далее под воздействием лазерного света с длиной волны, соответствующей пику поглощения этих фотосенсибилизаторов (ФС), вызывать фотохимические реакции, приводящие к разрушению опухоли (Dougherty Т.J., 1978). Главное преимущество этого метода - избирательное поражение опухолевой ткани при максимальном сохранении окружающих здоровых тканей. Кроме того, вводимый в организм ФС (при использовании новых современных ФС, например, хлоринового ряда) достаточно быстро выводится из организма, не оказывая каких-либо серьезных побочных эффектов (Пономарев Г.В. и др., 1999). При ФДТ местная реакция (в виде геморрагического некроза, воспалительных явлений) носит временный характер, завершаясь полной эпителизацией дефекта тканей и не давая впоследствии каких-либо поздних осложнений. Однако ограничением применения существующего метода ФДТ является относительно небольшая (от 0,5 до 3,0 см) глубина проникновения лазерного излучения (Залесский В.Н. и Фильченков А.А., 2004, Соколов В.В. и др., 1999, Чиссов В.И. и др., 1999). Тем не менее, ФДТ хорошо зарекомендовала себя при лечении злокачественных опухолей мягких тканей различной локализаций, о чем свидетельствуют как отечественные, так и зарубежные публикации. Это - злокачественные новообразования кожи (Рябов М.В. и др.. 2002, Странадко Е.Ф. и др., 1999, Fritsch С. et al., 1996, Sitnik Т.М. et al„ 1998), внутрикожные метастазы меланомы, саркома Капоши (Dougherty Т.J., 1987, Pass H.I., 1993), рак слизистых оболочек полости рта и нижней губы (Странадко Е.Ф. и др., 2002, Цыб А.Ф. и др.,1999, Каплан М.А. и др., 2002), рак крупных бронхов (Bugelski P.J. et al., 1981, Pass H.I., 1992), рак плевры, мезотелиома (Ortner М.А. et al., loog Pfr" »1 'Я01). Г"" железы

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

(Цыб А.Ф. и др., 1999, Schun М. et al., 1987), рак пищевода (Corti L. et al., 2000, Heier S. К., 1995, McCaughan J.S. et. al.) и некоторых других локализаций.

В настоящее время многие авторы указывают на возможность сочетания ФДГ с другими методами лечения злокачественных опухолей, в том числе и с лучевой терапией (Гельфонд M.JI. и др., 2003, Соколов В.В., 1999, Цыб А.Ф. и др., 1999, Ost D., 2004, Schweitzer V.G. et al., 1993). Известно, что до 70% всех больных раком получают лучевое лечение в качестве радикального или паллиативного средства (Группа международных экспертов в области радиационной онкологии под эгидой ВОЗ, 2000). Предполагается, что комбинация ФДТ и лучевой терапии может существенно улучшить результаты лечения и уменьшить применяемые дозы ионизирующих излучений, а, кроме того, возможно, позволит эффективно воздействовать на радиорезистентные опухоли. В зарубежной литературе имеются отдельные сообщения о совместном применении ФДТ и лучевой терапии в клинических условиях для лечения центрального рака легких (Lam S. et al., 1991) и рака пищевода (Corti L. et al., 2000) с паллиативной целью, но экспериментального обоснования совместного применения этих двух методов в литературе мы не встретили.

Цель настоящего исследования. Разработать метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии относительно радиорезистентной опухоли саркомы М1 у крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить эффективность фотодинамической терапии саркомы М1 в зависимости от дозы фотосенсибилизатора и плотности энергии лазерного излучения.

2. Исследовать эффективность рентгенотерапии саркомы М1 в различных суммарных и разовых поглощенных дозах.

3. Отработать оптимальные параметры сочетания фотодинамической и рентгенотерапии.

Научная новизна. Впервые дано экспериментальное обоснование совместного применения фотддинамической и лучевой терапии на модели

. г •

лечения относительно радиорезистентной формы злокачественного новообразования. Показано, что сочетанное применение фотодинамической и рентгенотерапии в лечении саркомы М1 позволяет значительно повысить эффективность лечения при снижении дозы ионизирующего излучения до 5 Гр однократно и получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе. Выявлена зависимость эффективности такой сочетанной терапии от дозы вводимого ФС, последовательности применения ФДТ и рентгенотерапии, а в случае использования вначале ФДТ - от сроков проведения после нее рентгенотерапии.

Практическая значимость. Полученные данные послужат основанием для совместного применения в клинических условиях ФДГ и лучевой терапии для лечения злокачественных опухолей мягких тканей с целью повышения эффективности лечения, в том числе и радиорезистентных опухолей, и уменьшения суммарных поглощенных доз ионизирующего излучения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии относительно радиорезистентной опухоли саркомы М1 у крыс.

2. Сочетанное применение фотодинамической и рентгенотерапии позволяет повысить эффективность лечения по сравнению с самостоятельным применением этих методов.

з Выявлена оптимальная схема такой сочетанной терапии, позволяющая получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе: вначале проведение однократного рентгеновского облучения опухоли в дозе 5 I р, а на следующий день ФДТ (доза фотодитазина 5,0 мг/кг, плотность энергии лазерного излучения 300 Дж/см2).

Связь с основными научными направлениями исследований в ГУ МРНЦ РАМН. Работа проведена в рамках научно-исследовательской темы «Разработка и совершенствование существующих методов фотодинамической терапии опухолевых и неопухолевых заболеваний в самостоятельном и комбинированном вариантах» 1999 - 2003 гг. (№ гос. рег. 01.9.90002864).

Личный вклад соискателя в получении научного материала. Автор лично проводила экспериментальные исследования с использованием методик фотодинамической и лучевой терапии, принимала участие в последующей оценке и статистической обработке полученных результатов.

Степень обоснованности научных положений и выводов, изложенных в диссертации. Научные положения диссертации, выводы и рекомендации основаны на анализе результатов опытов на 244 животных с применением фотодинамической, рентгенотерапии и различных вариантов сочетанной терапии. Для оценки результатов опытов использовались современные методы статистической обработки.

Апробация диссертационной работы. Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научно-практической конференции клинического радиологического сектора ГУ - МРНЦ РАМН 24 января 2005 года.

Основные публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ (2 статьи, 4 тезиса докладов).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора научной литературы, главы с описанием материалов и методов проведенных исследований, главы с результатами собственных экспериментальных исследований, главы обсуждения и заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя цитируемой литературы. Работа изложена на 118 страницах текста компьютерной верстки, включает 8 таблиц и 18 рисунков. Библиографический указатель содержит 72 отечественных и 126 зарубежных работ.

Автор выражает глубокую признательность экспериментальной группе отдела лазерной и фотодинамической терапии во главе с к.м.н. Мардынской В.П. за помощь в проведении опытов с животными, а также к.м.н. Бандурко JI.H. и д.м.н. проф. Бродскому P.A., которые провели морфологические исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Характеристика объекта исследования. Исследования проведены на 244 самках беспородных крыс, достигших массы тела 130-230 г. В качестве экспериментальной опухоли использовали штамм - саркома М1. Эта опухоль относится к числу быстрорастущих с достаточно коротким инкубационным периодом, отличается большой биомассой и высокой степенью перевиваемое™, не образует метастазов. Опухоль перевивали под кожу бедра. Животных брали в опыт на 8-14 сутки, когда объем опухоли (V) достигал в среднем 0,4 см3. Он рассчитывался по формуле:

V = -í-^xd,xd, xd, 6 2 '

где dt, d2 и d¡ - три взаимно перпендикулярных размера опухоли. Замеры диаметров опухоли проводили в следующие сроки: исходные (непосредственно перед лечением), на 7-е, 10-е, 14-е и 21-е сутки после окончания лечения. Динамику роста опухоли определяли по коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К) по формуле:

v0 '

где V0 - исходный объем опухоли, V| - объем опухоли на день измерения. Динамика К оценивалась следующим образом:

1. При К = -1,0 (пальпаторно опухоль не определяется) ситуация расценивалась как полная регрессия опухоли.

2. ПриК> -1,0 ситуация расценивалась как продолженный рост опухоли. Методика проведения спектрометрии. Фотодитазин - препарат группы

хлоринов - вводили животным внутрибрюшинно. Исследование динамики накопления данного ФС в опухолях крыс выполнено с помощью спектро-флюоресцентного метода на комплексе «Lesa-б». Источником излучения, возбуждающим флюоресценцию ФС в биологических тканях, служило

излучение He-Ne лазера (633 нм). Спектро-флюоресцентное исследование проводили под прямым углом к объекту, слегка касаясь торцом оптоволоконного световода ткани. Измерялись спектры тканей опухоли (две точки в центре опухоли и две точки по периферии опухолевого узла) и в качестве контроля визуально здоровые ткани (одна точка) в аналогичной зоне на другом бедре. Спектры тканей анализировались по форме, величине и амплитуде сигнала. Определялась площадь пика флюоресценции (S2) и площадь пика отраженного излучения от тканей (Si), а также их отношения (S2/S|). Для суждения о величине накопления фотосенсибилизатора в опухоли по отношению к здоровым тканям рассчитывали индекс контрастности отношение среднего по группе значения S2/Si в области опухолевых тканей к среднему по группе значению S2/S| в области здоровых тканей. В опыте использованы 6 животных. Измерения проводили в течение 6 часов после введения ФС в дозе 5 мг/кг: через 1 час, далее каждые 30 минут до 3 часов, а затем каждый час.

Методика проведения ФДТ. Перед сеансом ФДТ шерстный покров в зоне роста опухоли депилировали. За 10 мин. до облучения животных наркотизировали (2,5% раствором тиопентала натрия, который вводили внутрибрюшинно в дозе 0,15 мл на 100 г веса). Источником излучения служили

полупроводниковые лазерные аппараты «Ламеда» и «Аткус-2» (длина волны

»

662 нм). Для доставки лазерного излучения использовали гибкие кварцевые моноволоконные торцевые световоды диаметром 600 мкм или такие же световоды с линзой на конце. Лазерное облучение проводили перпендикулярно к поверхности опухоли. Продолжительность облучения (Т) определяли по формуле:

где Е - заданная величина плотности энергии (Дж/см2), а - плотность мощности лазерного облучения (Вт/см2), представляющее собой отношение величины мощности лазерного излучения на выходе световода (Вт) к площади используемого светового пятна (см2). Границы поля облучения формировали с захватом здоровых тканей - не менее 2-4 мм от видимой или пальпируемой

границы опухоли. Облучение проводили однократно, через 3 часа после введения ФС, одним, реже двумя полями (в зависимости от размеров и конфигурации опухоли). Эффективность самостоятельной ФДТ опухолей в зависимости от дозы ФС и плотности энергии лазерного излучения изучена на 98 животных, которые были разделены на б групп, 69 крыс использованы в контроле (табл.1).

Таблица 1

Распределение животных в опытных и контрольных группах при

проведении самостоятельной ФДТ опухолей

Группы животных Количество животных Доза фотосенсибилизатора, мг/кг Плотность энергии лазерного излучения, Дж/см2

1 Опыт 15 2,5 300

Контроль 15 -

2 Опыт 35 5,0 300

Контроль 9 - -

3 Опыт 12 7,5 300

Контроль 12 - -

4 Опыт 13 10,0 300

Контроль 12 - -

5 Опыт 10 5,0 400

Контроль 7 - -

6 Опыт 13 5,0 500

Контроль 14 - -

Всего 98 животных в опытных группах.

Методика проведения рентгенотерапии. Близкофокусную лучевую терапию проводили на рентгеновской установке РУМ-7 (и = 40 кВ, I = 15 мА, диаметр тубуса 30 мм, кожно-фокусное расстояние 75 мм), в двух режимах: на фильтре 0,15 А1, с разовой поглощенная дозой (РОД) 10 Гр (одно-, двух- и трехкратное облучение) и на фильтре 1.44 А1 с РОД 5 Гр (четырех-, пяти- и шестикратное облучение). Многократное облучение проводили ежедневно. Мощность экспозиционной дозы по оси пучка измеряли с помощью дозиметра КД-114 №147 со сферической камерой. Погрешность измерений 10 %. Шерсгь в области опухоли депилировапи, животное фиксировали на специальном планшете таким образом, чтобы опухоль была направлена перпендикулярно

вверх. Эффективность самостоятельной рентгенотерапии опухолей в зависимости от применяемых разовых и суммарных очаговых доз облучения изучена на 54 животных, которые были разделены на 6 групп, 47 крыс использованы в контроле (табл.2).

Таблица 2

Распределение животных в опытных и контрольных группах при проведении самостоятельной рентгенотерапии опухолей

Группы животных Количество животных Толщина фильтра, мм Разовая поглощенная доза,Гр Суммарная поглощенная доза, Гр

1 Опыт 9 0,15 10 10

Контроль 8 - . -

2 Опыт 10 0,15 10 20

Контроль 8 - .

3 Опыт 12 0,15 10 30

Контроль 15 - - .

4 Опыт 7 1,44 5 20

Контроль 6 - . -

5 Опыт 9 1,44 5 25

Контроль 5 - - -

6 Опыт 7 1,44 5 30

Контроль 5 - - -

Всего 54 животных в опытных группах.

Методика проведения сочетанной терапии Опыты по изучению возможности сочетанного применения ФДТ и рентгенотерапии в лечении опухолей проводили с использованием различных разовых (РОД) и суммарных очаговых доз (СОД) рентгеновского облучения, разных доз ФС - 2,5 мг/кг и 5 мг/кг, изменяли последовательность проведения ФДТ и рентгенотерапии и сроки проведения рентгеновского облучения после ФДТ. Во всех случаях при проведении ФДТ использовали одинаковую плотность энергии лазерного излучения - 300 Дж/см2. Если сначала применяли рентгенотерапию, то ФДТ всегда проводили на следующий день после последнего сеанса рентгеновского облучения. Эффективность сочетанной терапии опухолей изучена на 76 животных, которые были разделены на 7 групп, 83 крысы использованы в контроле (табл.3).

Таблица 3

Распределение животных в опытных и контрольных группах при проведении сочетанной ФДТ и рентгенотерапии опухолей

Группа животных Кол-во животных Доза ФС, мг/кг Доза рентгеновского облучения, Гр Последовательность воздействия

РОД сод

1 Опыт 11 2,5 10 10 Рентгенотерапия, ФДТ

Контроль 7 - - - -

2 Опыт 10 2,5 10 20 Рентгенотерапия, ФДТ

Контроль 8 - - - -

3 Опыт 7 2,5 10 30 Рентгенотерапия, ФДТ

Контроль 15 - - -

4 Опыт 11 2,5 5 5 ФДТ, Рентгенотерапия на 4 сутки

Контроль 8 - - - -

5 Опыт 11 2,5 5 5 ФДТ, Рентгенотерапия на 1 сутки

Контроль 15 - - - -

6 Опыт 10 5,0 5 5 Рентгенотерапия, ФДТ

Контроль 15 - - - -

7 Опыт 16 5,0 5 5 ФДТ, Рентгенотерапия на 4 сутки

Контроль 15 - - - -

Всего 76 животных в опытных группах.

Метод морфологического исследования. На 21 сутки после окончания лечения брали мягкие ткани бедра животных толщиной 5 мм в зоне проведенной терапии, фиксировали их в 10 % растворе формалина трое суток, затем обезвоживали спиртами и заливали в парафин. Микротомные срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином.

Статистическая обработка результатов исследований. При вычислении средних показателей использованы методы вариационной статистики. Оценку уровня статистической значимости различий средних значений исследуемых показателей в опытных и контрольных группах оценивали, используя непараметрический и-критерий (Манна-Уитни) при 95% уровне значимости.

Результаты исследования и обсуждение

Изучение динамики накопления фотодитазина в опухоли и в здоровых тканях. Из данных, представленных на рис.1 видно, что в течение 6 часов после введения ФС происходит постепенное увеличение накопления препарата, как в опухоли, так и в здоровых тканях. Индекс контрастности достигает своего максимального значения - 2,58 через 3 часа после введения ФС. Начиная лазерное облучение опухоли в это время, можно добиться максимального эффекта ФДТ при минимальном повреждении окружающих здоровых тканей. Полученные результаты подтверждаются и данными других авторов (Пономарев Г.В. и др., 2003, Бурмистрова Н.В. и др., 2005).

иа

0 50-

Íi 45-Я

£ 40

1 35 О.

§ 30

ч

•е- 25

Í 20

« 15

о

X 10

J*

i* W 1А W I* I* М"

Индекс контрастности ш

с1(1)

JU

и

1

1,0 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 I (ч)

Г"""Ч опухоль Н здоровая ткань

ОЕ -относительные единицы

Рис. 1. Динамика накопления фотодитазина в опухоли и в здоровых тканях крыс.

Исследование эффективности фотодинамической терапии в зависимости от дозы фотодитазина и плотности энергии лазерного излучения Зависимость

эффективности ФДТ от дозы вводимого ФС и применяемой плотности лазерного излучения изучена в 2 сериях опытов (6 групп животных).

В первой серии исследовали влияние увеличения дозы ФС на эффективность ФДТ. Четырем группам животных проводили ФДТ с введением ФС в различных дозах: 2,5 мг/кг, 5,0 мг/кг, 7,5 мг/кг и 10,0 мг/кг. Плотность энергии лазерного излучения при этом во всех случаях составляла 300 Дж/см2. В качестве контроля использовали интактных опухоленосителей саркомы М1.

Увеличение применяемой дозы фотодитазина от 2,5 до 10,0 мг/кг веса, при использовании одной и той же плотности энергии лазерного излучения, показало, что имеется прямая зависимость эффективности лечения от дозы ФС. Так, на 21 сутки наблюдения процент полной регрессии опухолей составил при дозе ФС 2,5 мг/кг - 30,8 %; 5,0 мг/кг - 37,5 %; 7,5 мг/кг - 54,5 % и 10,0 мг/кг -76,9 %, а коэффициенты продолженного роста опухолей 18,48±4,68; 16,20±2,10; 11,42+2,95 и 2,72±0,82 соответственно (рис.2). Различия при сравнении с контролем и между группами достоверны (р<0,05).

(мгУкг) (ИГ(«Г)

Рис. 2. Показатели процента полной регрессии опухолей и коэффициента абсолютного прироста опухолей (М+т) при ФДТ в зависимости от дозы фотодитазина на 21 сутки наблюдения.

Во второй серии опытов исследовали влияние увеличения плотности энергии лазерного излучения на результаты ФДТ. Трем группам животных при проведении ФДТ вводили одинаковую дозу ФС - 5,0 мг/кг, а плотность энергии

лазерного излучения использовали различную: 300 Дж/см2, 400 Дж/см2 и 500 Дж/см2.

Увеличение плотности энергии лазерного излучения от 300 до 500 Дж/см2, при использовании одной и той же дозы фотодитазина, также способствовало росту эффективности лечения. Но при этом имело место только увеличение процента полной регрессии опухоли, который на 21 сутки наблюдения составлял - 37,5 % при 300 Дж/см2, 50,0 % при 400 Дж/см2 и 69,2 % при 500 Дж/см2, а уменьшения коэффициентов абсолютного прироста опухоли не происходило и они были равны 16,20±2,10; 21,71±9,55 и 22,43±12,54 соответственно (рис.3). Различия при сравнении с контролем достоверны

Рис. 3. Показатели процента полной регрессии опухолей и коэффициента абсолютного прироста опухолей (М±т) в зависимости от плотности энергии лазерного излучения при ФДТ на 21 сутки наблюдения.

Таким образом, повышение дозы ФС и увеличение плотности энергии лазерного излучения при ФДТ приводит к улучшению результатов лечения.

Высокая эффективность ФДТ с использованием фотодитазина в лечении экспериментальных опухолей, а также улучшение результатов лечения с увеличением дозы ФС и плотности энергии лазерного излучения подтверждается и другими исследователями (Васильев Д.В. и др., 2003, Пономарев Г.В. и др., 2003, Романко Ю.С. и др., 2004).

Рентгенотерапия саркомы М1. Известно, что саркома М1 является относительно радиорезистентной опухолью (Гаркуша Н.Ф. и др., 1990, Кублик Л.Н. и др., 1969). Поэтому облучение опухолей проводили с относительно

(р<0,05).

высокими суммарными поглощенными дозами (СОД). Кроме того, исследовали влияние разовой поглощенной дозы облучения (РОД) при различных СОД на эффективность лечения. Влияние рентгеновского облучения на рост саркомы М1 изучено в 6 группах животных, составивших две серии опытов.

В первой серии опытов трем группам крыс проводили ежедневное облучение опухолей с РОД 10 Гр при различных СОД: 10 Гр; 20 Гр; и 30 Гр.

Из данных, представленных на рис.4, видно, что увеличение СОД от 10 до 30 Гр при использовании РОД в 10 Гр улучшает результаты лечения - на 21 сутки наблюдения увеличивается процент животных с полной регрессией опухоли с 22,2 до 83,3 % и снижается средний по группе коэффициент абсолютного прироста опухолей у животных с продолженным ростом опухоли с 5,12±1,26 до 0,95±0,11. Различия при сравнении с контролем и между группами достоверны (р<0,05).

% 10090 Ж-

К>-

т »

» »

»

ю о

I полная рсгрсссии опухолей ] продолженный рост опухолей

83J

30 Гр

I 100-§ М

| «0

I 70

§ 60

I 50

| 40

6 30

20 10 0

Ш

Рис. 4. Показатели процента полной регрессии опухолей и коэффициента абсолютного прироста опухолей (М±ш) при рентгеновском облучении в зависимости от СОД при РОД в 10 Гр на 21 сутки наблюдения.

Во второй серии опытов трем группам крыс проводили ежедневное облучение опухолей с РОД 5 Гр при различных СОД: 20 Гр, 25 Гр и 30 Гр.

Из данных, представленных на рис.5, видно, что использование РОД 5 Гр при СОД от 20 до 30 Гр не приводит к повышению процента животных с полной регрессией опухоли (20 Гр - 0 %, 25 Гр - 33,3 %, 30 Гр - 14,3 %) на 21 сутки наблюдения, хотя и дает достоверное (р<0,05) снижение среднего по группе коэффициента абсолютного прироста опухолей у животных с

продолженным ростом опухоли с 7,13±1,80 до 2,05±0,65. Различия при сравнении с контролем достоверны (р<0,05).

мм

Ж

МЛН» [«[ИМИ И]ПМЙ ШЩ иуштеты! р*ст мути!

щ.

м

25

м Г,

Рис. 5. Показатели процента полной регрессии опухолей и коэффициента абсолютного прироста опухолей (М±ш) при рентгеновском облучении в зависимости от СОД при РОД 5 Гр на 21 сутки наблюдения.

Таким образом, на эффективность рентгенотерапии саркомы М1 большое влияние оказывает величина применяемой РОД - применение однократного рентгеновского облучение в дозе 10 Гр дает результаты лечения не хуже, чем рентгенотерапия в СОД 20 Гр, но с использованием РОД в 5 Гр.

В литературе была найдена только одна статья, посвященная анализу радиочувствительности саркомы М1 у крыс (Кублик Л.Н. и др., 1969). Авторы отмечают, что высокая радиорезистентность саркомы М1 обусловлена малой радиочувствительностью клеток опухоли в отношении подавления пролиферативной способности. При этом недостаточно большие фракции дозы приводят к восстановлению от сублетальных повреждений, что снижает эффективность лучевого воздействия на опухолевые клетки.

Сочетанием фотодинамическая и рентгенотерапия саркомы М1. Возможность сочетанного применения ФДТ и рентгенотерапии саркомы М1 изучена в 7 группах животных, составивших 4 серии опытов.

В первой серии опытов трем группам животных проводили сначала рентгеновское облучение опухолей с различными СОД при РОД 10 Гр, а на следующий день после последнего сеанса рентгеновского облучения

' применяли ФДТ опухолей с одинаковыми параметрами во всех трех группах (доза ФС 2,5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2): рентгенотерапия с СОД 10 Гр + ФДТ; рентгенотерапия с СОД 20 Гр + ФДТ; рентгенотерапия с СОД 30 Гр + ФДТ. Полученные результаты на 21 сутки наблюдения представлены на рис.б.

1в » э» сода»

Рис. 6. Показатели процента полной регрессии опухолей при рентгенотерапии и ФДТ саркомы М1 в сравнении с сочетанной терапией на 21 сутки наблюдения.

Сравнение результатов сочетанной терапии в данном варианте с самостоятельной ФДТ опухолей при тех же параметрах, показывает, что при СОД 10 Гр процент животных с полной регрессией опухолей на 10-12 % выше, чем при одной ФДТ» а при СОД 20 и 30 Гр полная регрессия опухолей получена у всех животных в группе.

Сопоставление результатов сочетанной терапии с результатами самостоятельной рентгенотерапии также выявило большую эффективность сочетанной терапии. Процент животных с полной регрессией опухоли на 21 сутки наблюдения при сочетанной терапии с СОД 10 Гр почти в 2 раза выше, чем при одной рентгенотерапии, а с СОД 20 и 30 Гр он достигает 100 % (при

одном только рентгеновском облучении он составлял 60,0 и 83,3 % соответственно).

Таким образом, сочетанная терапия саркомы М1 - рентгенотерапия с СОД от 10 до 30 Гр при РОД 10 Гр и ФДТ (доза ФС 2,5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2), проведенная на следующий день после рентгеновского облучения, увеличивает эффективность лечения по сравнению с самостоятельным применением этих методов.

доза ФС 2,5 мг/кг

* 101 »0 «о

70 «0

50 40 10 10 10 0

*дт

доза ФС 5,0 мг/кг

| Hfcnwpfiyw H;IMI» 3 n^awmtmwl уест «пухвлНк

♦дт

Сочстмш теряаяя

ФДТ

Сочетанм теряяяа

Рис. 7. Процент полной регрессии опухолей и коэффициент абсолютного прироста опухолей (М±ш) при сочетанной терапии с СОД 5 Гр в сравнении с ФДТ саркомы М1 при применении разных доз ФС на 21 сутки наблюдения.

Во второй серии опытов двум группам животных вначале провели ФДТ опухолей, а на 4 сутки после нее однократное рентгеновское облучение опухолей с СОД 5 Гр. Такие сроки проведения рентгенотерапии были выбраны потому что к этому времени полностью проходит отек мягких тканей в области опухоли, вызванный ФДТ. При проведении ФДТ крысам вводили разные дозы ФС (одной группе 2,5 мг/кг, другой 5 мг/кг), а плотность энергии в обоих

случаях составляла 300 Дж/см2. Полученные результаты представлены на рнс.7. Различия при сравнении с контролем достоверны (р<0,05).

Сравнивая результаты этих двух опытов между собой, можно сделать вывод, что увеличение дозы ФС с 2,5 до 5,0 мг/кг при сочетанной терапии повышает эффективность лечения - увеличивается процент животных с полной регрессии опухолей с 25,0 до 66,7 % и уменьшается коэффициент абсолютного прироста опухолей у животных с продолженным ростом опухоли с 15,48±5,18 до 3,06±1,01. Различия при сравнении между группами достоверны (р<0,05).

Рассмотрим результаты этих опытов в сравнении с самостоятельной ФДТ при таких же параметрах (также на рис.7). Очевидно, что сочетанная терапия с применением ФС в дозе 2,5 мг/кг не улучшает эффективности лечения. Применение ФС в дозе 5,0 мг/кг в сочетанной терапии увеличивает процент животных с полной регрессии опухолей с 37,8 до 66,7 % и уменьшает коэффициент абсолютного прироста опухолей у животных с продолженным ростом опухоли с 16,20±2,10 до 3,06±1,01 (различия между группами достоверны при р<0,05). Возникает вопрос, по какой причине применение меньшей дозы ФС при сочетанной терапии в данном случае не привело к синергизму цитотоксического действия на опухоль фотохимических реакций при ФДТ и ионизирующего излучения. Возможно, это связано с тем, что после ФДТ с относительно небольшой дозой ФС достаточно большое количество опухолевых клеток сохранило жизнеспособность. Согласно экспериментальным данным некоторых авторов (Stern S.J. et al., 1991), если часть клеток опухоли остается жизнеспособной после ФДТ, это может привести к рецидиву роста опухоли на 3-5 сутки, потому что к этому времени развиваются новые капилляры вблизи от сохранившихся опухолевых клеток. А так как рентгеновское облучение проводилось в данном случае на 4 сутки после ФДТ, то применяемая доза ионизирующего излучения была слишком мала, чтобы эффективно повлиять на продолженный рост опухоли в условиях хотя бы частично восстановленного кровотока.

В третьей серии опытов двум группам животных провели ФДТ (доза ФС 5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2) и однократное рентгеновское облучение опухолей с СОД 5 Гр в различной последовательности: ФДТ + рентгенотерапия на 4 сутки; рентгенотерапия + ФДТ на следующий день.

М И»'"".....р«ч—

ча

■

70 «Ц ■

" | |

: Ь I 20 ■ ■

1 И ■__

ФДТ + раяшинуям*

Рис. 8. Процент полной регрессии опухолей и коэффициент абсолютного прироста опухолей (М±ш) при сочетанной терапии с СОД 5 Гр и ФДТ (ФС - 2,5 мг/кг, Е - 300 Дж/см2) в зависимости от последовательности их проведения на 21 сутки наблюдения.

Данные, представленные на рис.8, свидетельствуют о том, что при проведении в первую очередь рентгенотерапии получена полная регрессия опухолей у всех животных в группе на 21 сутки наблюдения против 66,7 % животных с полной регрессией опухолей при проведении в первую очередь ФДТ. Различия при сравнении с контролем достоверны (р<0,05).

В 4 серии опытов двум группам животных вначале проводили ФДТ (доза ФС 2,5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2), а затем на разные сроки (на 1 и 4 сутки после ФДТ) однократное рентгеновское облучение опухолей с СОД 5 Гр. В данной серии опытов исследована возможность проведения рентгенотерапии на следующий день после ФДТ, несмотря на имеющуюся отечность мягких тканей в области опухоли.

Анализ данных, представленных на рис.9, показывает, что при проведении рентгенотерапии на 1 сутки после ФДТ опухолей отмечается улучшение показателей эффективности терапии - процент животных с полной регрессией опухолей увеличился в 2 раза по сравнению с проведением рентгенотерапии на

■ ю,

Н

ФДТ + рентгенотерапии

| опыт Шш контроль

4 сутки после ФДТ, а коэффициент продолженного роста опухолей уменьшился более чем в 2 раза. Различия при сравнении с контролем достоверны (р<0,05).

%100

90 80 70 60 60 40 30 20 10 О

1 сутки

полная регрессия опухолей продолженный рост опухолей

4 сутки

1 сутки 4 сутки

опыт

контроль

I

1

Рис. 9. Процент полной регрессии опухолей и коэффициент абсолютного прироста опухолей (М±т) при сочетанной терапии с СОД 5 Гр в зависимости от сроков проведения рентгенотерапии после ФДТ (ФС - 2,5 мг/кг, Е - 300 Дж/см2) на 21 сутки наблюдения.

Таким образом, воздействуя на сохранившие после ФДТ свою жизнеспособность опухолевые клетки сниженными дозами ионизирующего излучения в более ранний период, когда еще не произошло восстановления кровотока в опухоли, мы получили синергизм двух различных по механизму воздействия на опухоль методов лечения.

Морфологические исследования. Морфологические исследования проведены на 21 сутки у животных в следующих 3 группах (3-4 крысы из каждой группы):

1) Группа крыс после ФДТ (ФС в дозе 5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2). Заключение: У всех животных данной группы ФДТ вызывает некроз перевитой саркомы М-1 и окружающих ее тканей. Через 21 сутки происходит отграничение поврежденных масс фиброзной тканью с полной или частичной элиминацией опухолевых клеток. В последнем случае у некоторых животных в толще фиброзной ткани сохраняется небольшое число злокачественных клеток и, возможно, они могут стать причиной рецидива саркомы М-1.

2) Группа крыс после однократного рентгеновского облучения опухолей в дозе 10 Гр. Заключение: рецидивирующая, вяло пролиферирующая саркома М1 с признаками постлучевого патоморфоза.

3) Группа крыс после сочетанной терапии опухолей - однократного рентгеновского облучения с СОД 5 Гр и проведенного на следующий день сеанса ФДТ (ФС в дозе 5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2). Заключение: через 21 сутки после проведенного лечения саркома М-1 полностью некротизирована. На месте некроза происходит развитие фиброзной ткани, содержащей значительное число иммуннокомпетентных клеток. К исследуемому сроку на месте некротизированной опухоли образуется щелевидная полость, содержащая тканевую жидкость и рыхло расположенные соединительнотканные элементы, интенсивно инфильтрированные клетками иммунного ряда. Параллельно с некрозом опухоли в окружающих тканях происходят некродистрофические изменения с признаками умеренного воспаления.

Таким образом, проведенные морфологические исследования показали, что сочетанная терапия при использованных параметрах дает полную регрессию опухолей, в то время как самостоятельная ФДТ при применении таких же доз ФС и плотности энергии, и самостоятельная рентгенотерапия в СОД в 2 раза большей, чем использованная в сочетанной терапии, не приводят к полному уничтожению опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ

1. Увеличение дозы фотодитазина при фотодинамической терапии (ФДТ) от 2,5 до 10 мг/кг при плотности энергии лазерного излучения в 300 Дж/см2 увеличивает эффективность лечения в 2,5 раза, а увеличение плотности энергии лазерного излучения от 300 до 500 Дж/см2 при дозе фотосенсибилизатора (ФС) 5 мг/кг повышает эффективность лечения в 1,8 раза (по проценту полной регрессии опухолей).

2. При рентгенотерапии саркомы М1 увеличение суммарной очаговой дозы (СОД) от 10 до 30 Гр с разовой дозой облучения (РОД) 10 Гр увеличивает эффективность лечения в 3,5 раза, а увеличение СОД от 20 до 30 Гр с разовой дозой облучения 5 Гр не дает повышения процента полной регрессии опухолей, хотя имеет место снижение коэффициента абсолютного прироста опухолей.

3. Сочетайная терапия саркомы М1 - рентгенотерапия с СОД от 10 до 30 Гр при РОД 10 Гр и ФДТ (доза ФС 2,5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см2), проведенная на первые сутки после рентгеновского облучения, увеличивает эффективность лечения по сравнению с самостоятельным применением этих методов, а при СОД 20 и 30 Гр позволяет получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе.

4. Эффективность сочетанной терапии саркомы М1 зависит от дозы ФС, последовательности применения ФДТ и рентгенотерапии, а в случае использования вначале ФДТ от сроков проведения после нее рентгенотерапии. Оптимальным является использование ФС в дозе 5,0 мг/кг, применение в первую очередь рентгенотерапии, или проведение ее на 1 сутки после ФДТ.

5. Разработанный метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии саркомы М1 позволяет повысить эффективность лечения при снижении дозы ионизирующего излучения до 5 Гр однократно и получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе.

Практические рекомендации

Проведенные исследования позволяют рекомендовать сочетанное применения ФДТ и лучевой терапии в клинических условиях для лечения опухолей мягких тканей различной локализации, в том числе и радиорезистентных, при этом максимально используя возможности самой ФДТ с целью уменьшения суммарной поглощенной дозы ионизирующего облучения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Спиченкова И.С., Каплан М.А., Мардынская В.П., Малыгина А.И. Изучение эффективности хлорина Е-6 при фотодинамической терапии у экспериментальных животных // Тезисы научно-практической конференции Российских ученых «Актуальные аспекты лазерной медицины», Москва-Калуга, - 2002. - С.359-361.

2. Спиченкова И.С., Каплан М.А., Сокол Н.И. Комбинированная лучевая и фотодинамическая терапия экспериментальной опухоли саркомы М1 у крыс // Российский биотерапевтический журнал. - 2003, №4 - С.31-34.

3. Каплан М.А., Романко Ю.С., Мардынская В.П., Малыгина А.И., .Ярославцева-Исаева Е.В., Спиченкова И.С. Разработка метода фотодинамической терапии с фотодитазином у экспериментальных животных с саркомой М1 // Российский биотерапевтический журнал: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Москва - 1719 марта 2004. - 2/2004. - С.52

4. Спиченкова И.С., Каплан М.А., Гулидов И.А., Сокол Н.И., Пономарев Г.В., Бандурко Л.Н. Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия у крыс // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - в печати.

5. Спиченкова И.С., Каплан М.А., Гулидов И.А., Сокол Н.И., Пономарев Г.В. Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия у крыс// Материалы 1-го Российского форума «Инновационные технологии медицины XXI века» н научно-практической конференции «Медицинские компьютерные технологии». - 2005. - Москва, 12-15 апреля 2005. - в печати.

6. Спиченкова И.С., Каплан М.А., Гулидов И.А., Сокол Н.И., Пономарев Г.В. Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия у крыс // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва -16-18 марта 2005. - С.46-47.

Заказ 1078. Объем 2,5 п.л. Печать офсетная. Тираж 100. Формат ьило41/1б-

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6

I

I

i

I

I

I

I

} I

V-8440

РНБ Русский фонд

2006i4 5225

Актуальность темы исследования. Несмотря на огромные достижения за последние 50 лет в области хирургии, лучевой терапии и, позднее, химиотерапии и иммунотерапии смертность от рака остается неприемлемо высокой. За последние 20 лет статистическая картина смертности от злокачественных новообразований практически не изменилась. Одним из объяснений этого факта является то, что имеющиеся на сегодня методы лечения злокачественных опухолей применяются на уровнях, близких к оптимальным [19,89,182].

В настоящее время в нашей стране активно развивается принципиально новый метод лечения злокачественных опухолей, основанный на способности некоторых химических веществ (фотосенсибилизаторов) избирательно накапливаться в опухолевой ткани и далее под воздействием лазерного света определенной длиной волны, соответствующей пику поглощения используемого фотосенсибилизатора (ФС), вызывать фотохимические реакции, приводящие к разрушению опухоли [49,109,164,170]. Это - фотодинамическая терапия (ФДТ). Главное преимущество этого метода - избирательное повреждение опухолевых тканей при максимальном сохранении окружающих здоровых. Кроме того, разработанные в последние годы ФС достаточно быстро выводятся из организма, не оказывая каких-либо серьезных побочных эффектов [40]. Более того, при ФДТ местные реакции (в виде геморрагического некроза, воспалительных явлений) носят временный характер, завершаясь полной эпителизацией дефекта тканей, не дают впоследствии каких-либо поздних осложнений. Однако ограничением применения существующего метода ФДТ является, по данным различных авторов, относительно небольшая (от 0,5 до 3,0 см) глубина проникновения лазерного излучения [17,47,66]. Тем не менее, ФДТ хорошо зарекомендовала себя при лечении злокачественных опухолей мягких тканей различных локализаций -злокачественных заболеваний кожи [44,184], внутрикожных метастазов меланомы, саркомы Капоши [99,102,164], опухолей языка [36,100], рака слизистых оболочек полости рта, нижней губы [52,60,62], рака трахеи, крупных бронхов [87,166], рака плевры, мезотелиомы [167,162], раке молочной железы [60,181] и других локализаций. Поскольку возможности ФДТ еще не исчерпаны, во всем мире ведется активная работа по ее совершенствованию.

В настоящее время многие авторы указывают на возможность сочетания ФДТ с другими методами лечения злокачественных опухолей, в том числе и с лучевой терапией [62,94,119,143,180]. Известно, что до 70% всех больных раком получают лучевое лечение в качестве радикального или паллиативного средства [32]. Предполагается, что комбинация ФДТ и лучевой терапии может существенно улучшить результаты лечения и уменьшить применяемые дозы ионизирующих излучений, а, кроме того, возможно, позволит эффективно воздействовать на радиорезистентные опухоли. В зарубежной литературе имеются отдельные сообщения о совместном применении ФДТ и лучевой терапии в клинических условиях для лечения центрального рака легких [143] и рака пищевода [94] с паллиативной целью, но экспериментального обоснования сочетанного применения этих двух методов в литературе мы не встретили.

Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод, что использование ФДТ в сочетании с лучевой терапией является перспективным, поэтому данная работа представляется на сегодняшний день актуальной.

Цель исследования - разработать метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии относительно радиорезистентной опухоли саркомы Ml у крыс.

Задачи исследования:

1. Изучить эффективность фотодинамической терапии саркомы Ml в зависимости от дозы фотосенсибилизатора и плотности энергии лазерного излучения.

2. Исследовать эффективность рентгенотерапии саркомы Ml в различных суммарных и разовых поглощенных дозах.

3. Отработать оптимальные параметры сочетания фотодинамической и рентгенотерапии.

Научная новизна. Впервые дано экспериментальное обоснование совместного применения фотодинамической и лучевой терапии. Показано на модели относительно радиорезистентной формы злокачественного новообразования, что сочетанное применение фотодинамической и рентгенотерапии при определенных параметрах позволяет значительно повысить эффективность лечения: при более низкой дозе ионизирующего V излучения (до 5 Гр однократно) получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе. Выявлена зависимость эффективности такой сочетанной терапии от дозы вводимого ФС, последовательности применения ФДТ и рентгенотерапии, а в случае использования вначале ФДТ - от сроков проведения после нее рентгенотерапии.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные служат научным обоснованием совместного применения в клинических условиях ФДТ и лучевой терапии при лечении злокачественных опухолей мягких тканей, позволяют повысить эффективность лечения, в том числе радиорезистентных опухолей, в условиях снижения суммарных поглощенных доз ионизирующего излучения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии относительно радиорезистентной опухоли саркомы Ml у крыс.

2. Сочетанное применение фотодинамической и рентгенотерапии позволяет повысить эффективность лечения по сравнению с самостоятельным, раздельным применением этих методов.

3. Выявлена оптимальная схема такой сочетанной терапии, позволяющая получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе: вначале проведение однократного рентгеновского облучения опухоли в дозе 5 Гр, а на следующий день ФДТ при дозе фотодитазина 5 мг/кг, плотности энергии л лазерного излучения 300 Дж/см .

ВЫВОДЫ

1. Увеличение дозы фотодитазина при фотодинамической терапии (ФДТ) от 2,5 до 10,0 мг/кг при плотности энергии лазерного излучения в 300 Дж/см увеличивает эффективность лечения в 2,5 раза, а увеличение л плотности энергии лазерного излучения от 300 до 500 Дж/см при дозе фотосенсибилизатора (ФС) 5,0 мг/кг повышает эффективность лечения в 1,8 раза (по проценту полной регрессии опухолей).

2. При рентгенотерапии саркомы Ml увеличение суммарной очаговой дозы (СОД) от 10 до 30 Гр с разовой дозой облучения (РОД) 10 Гр увеличивает эффективность лечения в 3,5 раза, а увеличение СОД от 20 до 30 Гр с разовой дозой облучения 5 Гр не дает повышения процента полной регрессии опухолей, хотя имеет место снижение коэффициента абсолютного прироста опухолей.

3. Сочетанная терапия саркомы Ml - рентгенотерапия с СОД от 10 до 30 Гр при РОД 10 Гр и ФДТ (доза ФС 2,5 мг/кг, плотность энергии 300 Дж/см), проведенная на первые сутки после рентгеновского облучения, увеличивает эффективность лечения по сравнению с самостоятельным применением этих методов, а при СОД 20 и 30 Гр позволяет получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе.

4. Эффективность сочетанной терапии саркомы Ml зависит от дозы ФС, последовательности применения ФДТ и рентгенотерапии, а в случае использования вначале ФДТ от сроков проведения после нее рентгенотерапии. Оптимальным является использование ФС в дозе 5,0 мг/кг, применение в первую очередь рентгенотерапии, или проведение ее на 1 сутки после ФДТ.

5. Разработанный метод сочетанной фотодинамической и рентгенотерапии саркомы Ml позволяет повысить эффективность лечения при снижении дозы ионизирующего излучения до 5 Гр однократно и получить полную регрессию опухолей у всех животных в группе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Проведенные исследования позволяют рекомендовать сочетанное применения ФДТ и лучевой терапии в клинических условиях для лечения опухолей мягких тканей различной локализации, в том числе и радиорезистентных, при этом максимально используя возможности самой ФДТ с целью уменьшения суммарной поглощенной дозы ионизирующего облучения.