Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Снгнал-проводящие системы клетки при воздействии экстремальных факторов окружающей среды

/^АгОеЛчТ-93

На правах рукописи

" " \ Буравкова Людмила Борисовна

Сигнал-проводящие системы клетки при воздействии экстремальных факторов окружающей среды

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 19 99

Работа выполнена в Государственном научном центре Институте медико-биологических проблем

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Григорьев Анатолий Иванович Ткачук Всеволод Арсеньевич

Панченко Леонид Федорович,

Оганов Виктор Сумбатович,

Воложин Александр Ильич.

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский испытательный Институт военной медицины Министерства обороны Российской Федерации

Защита диссертации состоится 1999 года в 10 часов на заседании

диссертационного Совета Д074.31.01 при Государственном научном центре Институте медико-биологических проблем по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское ш.76-а

Автореферат разослан: « 10» Л^ 1999 года

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра Института медико-биологических проблем

Ученый секретарь, '

доктор медицинских наук Э.И.Мацнев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Живой организм находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. От силы и времени воздействия факторов среды, а также от исходного состояния организма зависит степень изменения уровня функционирования его систем. Гормональная регуляция при действии экстремальных факторов не только позволяет физиологическим системам приспособиться к этим факторам, но и наряду с нервной и иммунной системами обеспечивает координацию работы различных органов, особенно важную в экстремальных условиях. Стоит отметить, что во многих случаях, особенно при действии экстремальных факторов, регуляторная функция одновременно становится зашитной. Открытое и великолепно обоснованное Г.Селье участие симпато-адреналовой системы в механизмах адаптации высокоразвитых организмов, включая дистресс, на много лет привлекло внимание исследователей к участию гормональной системы в приспособительных реакциях и регуляции физиологических процессов при изменении факторов окружающей среды. Гораздо хуже исследованы внутриклеточные регуляторные процессы, опосредующие действие экстремальных факторов, а также гормонов, факторов роста, цитокинов и других биологически активных веществ на органы и ткани при развитии так называемой «неспецифической стресс-реакции».

В дополнение к взаимодействию с внешней средой жизнь многоклеточного организма в высокой степени зависит от того, насколько его клетки способны обмениваться информацией, чтобы координировать свою программу метаболизма и развития. Регуляция метаболических процессов и взаимодействие клеток в многоклеточной системе (ткань, орган, организм) основана на связывании специфических веществ (гормоны, биологически активные амины, факторы роста и другие), высвобождаемых одной группой клеток, со специфическими рецепторными белками на клетках-мишенях. Это взаимодействие вызывает одно или множество изменений в активности внутриклеточных или мембранных белков, т.е. ферментов или ионных каналов в клетках-мишенях, которые в дачьнейшем модифицируют физиологическую активность клетки. Перечень биологически активных компонентов насчитывает сотни веществ, включая различные гормоны, рилизинг-факторы, аминокислоты, моноамины, нейротрансмиттеры, факторы роста, простагландины, лейкотриены, цитокины.

Биологически активные вещества могут связываться со своими специфическими рецепторами, а иногда и с несколькими видами рецепторов для одного лиганда, и активируют или ингибируют одну или несколько так называемых вторичных мессенджерных систем: аденилат-циклазную и гуанилатциклазную системы (Ткачук В.А., 1979, Shram М., 1984, Walter J., 1984), фосфоинозитидный обмен и регулируют цитоплазматический кальций (Berridge M.J., 1984).

Внутриклеточные посредники гормонального действия активируют специфические протеинки-назы, которые через фосфолирирование одного или нескольких специфических ферментов или других белков меняют функционирование клеточных систем и состояние клетки.

Во многих клетках более половины известных биологически активных веществ с различным физиологическим действием могут влиять через один и тот же вторичный посредник. Это, с одной стороны, указывает на универсальность системы передачи регуляторной информации через клеточную мембрану. С другой стороны, тканевая специфичность, фаза развития и функциональное состояние клетки определяют специфичность внутриклеточной реализации гормонального сигнала.

Наиболее изучены такие сигнал-проводящие системы, как аденилатциклазный комплекс (АЦ), осуществляющий превращение АТФ в цАМФ и фосфоинозитидный обмен (ФИ-обмен). Гидролиз фосфатидилинозитол-4-5-дифосфата осуществляется фосфолипазой С с образованием двух внутриклеточных сигнальных молекул: диацилглицерола и инозитол-1-4-5-трисфосфата (Berridge M.G., 1984). Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, тогда как инозитол-трисфосфат осуществляет посредническую роль при освобождении внутриклеточного кальция из саркоплазматического ретикулума. В проведении сигнала от рецепторов гормонов или нейротрансмиттеров на аденилатциклазу и фосфолипазу С участвуют G-белки (Bockaert J. et al., 1987).

От функционирования всех звеньев сигнал-проводящих систем зависит как жизнедеятельность клеток в нормальных условиях, так и клеточная адаптация при изменении условий окружающей среды и регуляция метаболических процессов. В зависимости от природы активирующего стимула и типа клеток взаимодействие агониста с рецептором может приводить к таким явлениям, как клеточный рост (Hatzinger Р.В., Stevens J.L., 1989), клеточная дифференци-ровка (Black B.L., Smith J.E., 1989) или адаптация метаболизма клеток к изменившимся условиям ее существования, которая в некоторых случаях может привести к патологии. Превышение внешним (физическим или химическим) фактором пороговых величин, которые зависят от времени экспозиции и функционального состояния клетки, может привести к необратимым изменениям, например, при гипоксии (Trandroyen F.T. et al., 1992). Несмотря на различный конечный результат, процессы клеточной активации, адаптации и патологии часто вовлекают одни v те же биохимические процессы, однако неизвестно, играют ли в них самостоятельную рол! сигнал-проводящие системы.

Два жизненно важных фактора - давление и состав газовой среды - при изменении вели чин их определяющих при нормальных условиях, становятся экстремальными и вызывают Kai специфические, так-и неспецифические реакции организма (П.Бэр, 1878, Лазарев Н.В., 1941

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Живой организм находится в постоянном взаимодействии с окружающей средой. От силы и времени воздействия факторов среды, а также от исходного состояния организма зависит степень изменения уровня функционирования его систем. Гормональная регуляция при действии экстремальных факторов не только позволяет физиологическим системам приспособиться к этим факторам, но и наряду с нервной и иммунной системами обеспечивает координацию работы различных органов, особенно важную в экстремальных условиях. Стоит отметить, что во многих случаях, особенно при действии экстремальных факторов, регуляторная функция одновременно становится защитной. Открытое и великолепно обоснованное Г.Селье участие симпато-адреналовой системы в механизмах адаптации высокоразвитых организмов, включая дистресс, на много лет привлекло внимание исследователей к участию гормональной системы в приспособительных реакциях и регуляции физиологических процессов при изменении факторов окружающей среды. Гораздо хуже исследованы внутриклеточные регуляторные процессы, опосредующие действие экстремальных факторов, а также гормонов, факторов роста, цитокинов и других биологически активных веществ на органы и ткани при развитии так называемой «неспецифической стресс-реакции».

В дополнение к взаимодействию с внешней средой жизнь многоклеточного организма в высокой степени зависит от того, насколько его клетки способны обмениваться информацией, чтобы координировать свою программу метаболизма и развития. Регуляция метаболических процессов и взаимодействие клеток в многоклеточной системе (ткань, орган, организм) основана на связывании специфических веществ (гормоны, биологически активные амины, факторы роста и другие), высвобождаемых одной группой клеток, со специфическими рецепторными белками на клетках-мишенях. Это взаимодействие вызывает одно или множество изменений в активности внутриклеточных или мембранных белков, т.е. ферментов или ионных каналов в клетках-мишенях, которые в дальнейшем модифицируют физиологическую активность клетки. Перечень биологически активных компонентов насчитывает сотни веществ, включая различные гормоны, рилизинг-факторы, аминокислоты, моноамины, нейротрансмитгеры, факторы роста, простагландины, лейкотриены, цитокины.

Биологически активные вещества могут связываться со своими специфическими рецепторами, а иногда и с несколькими видами рецепторов для одного лиганда, и активируют или ингибируют одну или несколько так называемых вторичных мессенджерных систем: аденилат-циклазную и гуанилатциклазную системы (Ткачук В.А., 1979, Shram М., 1984, Walter J., 1984), фосфоинозитидный обмен и регулируют цитоплазматический кальций (Berridge M.J., 1984).

Внутриклеточные посредники гормонального действия активируют специфические протеинки-назы, которые через фосфолирирование одного или нескольких специфических ферментов или других белков меняют функционирование клеточных систем и состояние клетки.

Во многих клетках более половины известных биологически активных веществ с различным физиологическим действием могут влиять через один и тот же вторичный посредник. Это, с одной стороны, указывает на универсальность системы передачи регуляторной информации через клеточную мембрану. С другой стороны, тканевая специфичность, фаза развития и функциональное состояние клетки определяют специфичность внутриклеточной реализации гормонального сигнала.

Наиболее изучены такие сигнал-проводящие системы, как аденилатциклазный комплекс (АЦ), осуществляющий превращение АТФ в цАМФ и фосфоинозитидный обмен (ФИ-обмен). Гидролиз фосфатидилинозитол-4-5-дифосфата осуществляется фосфолипазой С с образованием двух внутриклеточных сигнальных молекул: диацилглицерола и инозитол-1-4-5-трисфосфата (Berridge M.G., 1984). Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, тогда как инозитол-трисфосфат осуществляет посредническую роль при освобождении внутриклеточного кальция из саркоплазматического ретикулума. В проведении сигнала от рецепторов гормонов или нейротрансмигтеров на аденилатциклазу и фосфолипазу С участвуют G-белки (Bockaert J. et al., 1987).

От функционирования всех звеньев сигнал-проводящих систем зависит как жизнедеятельность клеток в нормальных условиях, так и клеточная адаптация при изменении условий окружающей среды и регуляция метаболических процессов. В зависимости от природы активирующего стимула и типа клеток взаимодействие агониста с рецептором может приводить к таким явлениям, как клеточный рост (Hatzinger Р.В., Stevens J.L., 1989), клеточная дифференци-ровка (Black B.L., Smith J.E., 1989) или адаптация метаболизма клеток к изменившимся условиям ее существования, которая в некоторых случаях может привести к патологии. Превышение внешним (физическим или химическим) фактором пороговых величин, которые зависят от времени экспозиции и функционального состояния клетки, может привести к необратимым изменениям, например, при гипоксии (Trandroyen F.T. et al., 1992). Несмотря на различный конечный результат, процессы клеточной активации, адаптации и патологии часто вовлекают одни у те же биохимические процессы, однако неизвестно, играют ли в них самостоятельную рол! сигнал-проводящие системы.

Два жизненно важных фактора - давление и состав газовой среды - при изменении вели чин их определяющих при нормальных условиях, становятся экстремальными и вызывают Kai специфические, так и неспецифические реакции организма (П.Бэр, 1878, Лазарев Н.В., 1941

Беннет П., 1975 и др.). Гипобария, приводящая к гипоксии, н гипербария, вызывающая гипе-роксию, а также проявляющая необычные свойства индифферентных при нормальном атмосферном давлении газов, - два полюса воздействия, в которые в силу естественных или искусственных обстоятельств может попасть живой высокоорганизованный организм, включая человека. Необходимо отметить, что при изменении параметров газовой среды в естественных условиях и при проведении комплексных моделируемых исследований с участием человека или в экспериментах на животных, как правило, трудно или невозможно выяснить первичные эффекты и клеточные механизмы возникновения и развития у человека и животных таких патологических состояний, как азотный наркоз, нервный синдром высоких давлений (НСВД), деком-прессионные расстройства и др. (Бресткин М.П., 1949, Зальцман Г.А., 1979).

Несмотря на довольно широкое использование различных биологических моделей в экспериментальных исследованиях, до настоящего времени не проводилось детального изучения состояния внутриклеточных посредников гормонального действия и их роли в реализации эффектов экстремальных факторов. Данные, имеющиеся в литературе по результатам изучения вторичных посредников при гипоксии разрозненны, так как эксперименты проводились в различных условиях и на разных типах клеток, что значительно затрудняет проведение сравнительного анализа. При действии повышенного давления были изучены лишь некоторые характеристики ионных токов, хотя мембранные изменения при высоком давлении предполагают модификацию мембранно-связанных систем, в том числе аденилатциклазной системы или интенсивности фосфоинозитидного обмена.

Цель работы. Целью настоящего исследования являлось выяснение роли систем внутриклеточных посредников в механизме адаптации клетки к таким изменяющимся физико-химическим факторам среды, как атмосферное давление и содержание кислорода, а также повышенное парциальное давление индифферентных газов в окружающей среде. Исходя из этой цели были поставлены следующие задачи:

* изучить изменение фосфоинозитидного обмена в культивируемых клетках под влиянием гипоксии in vitro, сопоставить клеточные эффекты гипоксии и кальций-мобилизующих агентов,

* исследовать механизмы гомо- и гетерологической десенситизации клетки при действии кальций-мобилизующих агентов и гипоксии,

* определить динамику изменений содержания циклических нуклеотидов в тканях и биологических жидкостях животных и человека в условиях недостатка кислорода,

* изучить влияние имитационных длительных насыщенных погружений на различные глубины с использованием индифферентных газов (азота, гелия, аргона) на метаболизм и состояние мембран эритроцитов у человека,

* сопоставить in vitro эффекты высокого гидростатического давления и высокого давления инертных газов на мембрану эритроцитов лабораторных животных,

* исследовать динамику мембранного потенциала in vitro с использованием биологически модели при компрессии,

* изучить изменения фосфоинозитидного обмена в культивируемых клетках при действи факторов гипербарии, сопоставить влияние высокого гидростатического давления, высоког парциального давления инертных газов in vitro на проведение кальций-мобилизующего сиг нала в клетке.

Экспериментальные исследования выполнялись в рамках плановых НИР Института ме дико-биологических проблем, по Государственной программе «Мировой океан», Научнс технической программе по решению важнейших медико-биологических проблем ГКНТ, Феде ральной целевой научной программе фундаментальных и поисковых исследований Миннаук России, грантам РФФИ.

Научная новизна. В диссертационной работе на культуре клеток обнаружена активаци фосфоинозитидного обмена при гипобарической гипоксии и показано, что это приводит к гс мологической и гетерологической десенситизации клеток к кальций-мобилизующим агентам v Р-адренергической стимуляции. Экспериментально доказано существование одного из мех; низмов потери чувствительности Р-адренергической системы клеток при недостатке кислород; который включает в себя активацию протеинкиназы С в ответ на обратимую стимуляцию пи ролиза фосфоинозитидов при гипоксии, действии кальций-мобилизуюших агонистов, либо hi обратимую активацию этого фермента форболовыми эфирами. Впервые выявлены особенное! изменения содержания циклических нуклеотидов в тканях и биологических жидкостях живо ных и человека при острой и хронической гипоксии, а также участие циклазных систем в ада] тации организма к недостатку кислорода.

Экспериментально установлено, что высокое гидростатическое давление и высокое па циальное давление индифферентных газов (в диапазоне 3-Ю МПа) приводит к снижению чу ствительности культивируемых клеток сосудистой стенки человека к гистамину, серотонину брадикинину. Эта десенситизация носит функционачьный характер и исчезает после медленнс декомпрессии или периода последействия, равного периоду декомпрессии.

Проведенное исследование клинико-биохимических показателей крови человека п] глубоководных спусках методом насыщенных погружений с использованием различных и дифферентных газов (азота, гелия, аргона) в дыхательной газовой среде показало, что набл! даются начальные признаки изменения липидного обмена и дисфункции печени, выраженное которых зависит от длительности погружения и величины давления. При этом доказана при ципиальная возможность использования аргона в дыхательной газовой среде в гермозамкнуп объектах при нормальном и повышенном до 0,1 МПа давлении.

Впервые обнаружено, что при длительном имитируемом погружении на глубину более 200 м с использованием в качестве дыхательной газовой среды гелиокса происходит уменьшение поперечных и продольных размеров эритроцитов человека. Декомпрессия влечет за собой появление редко встречающихся в нормальных условиях необычных форм эритроцитов (эхино-циты, сфероциты и др.).

Практическая ценность работы. Предложенный в диссертации подход к анализу внутриклеточных сигнал-проводящих систем позволяет более полно выяснить чувствительность клетки к гормональным стимулам и оценить механизмы метаболической адаптации к экстремальным воздействиям различной природы. Данные о состоянии аденилатциклазной системы при гипоксии необходимо учитывать при назначении и подборе p-блокаторов и р-агонистов пациентам в условиях кислородной недостаточности.

По данным клинико-биохимических исследований крови показана безопасность длительного пребывания человека в кислородно-азотно-аргоновой среде при избыточном давлении 0-0,1 МПа. Биохимический анализ плазмы крови обследуемых после имитируемых спусков методом насыщенных погружений свидетельствует о том, что при медицинском обследовании водолазов и акванавтов необходимо особое внимание обращать на такие показатели, как уровень триглицеридов, холестерина и его фракций в плазме крови, поскольку длительное пребывание в условиях высокого давления приводит к повышению атерогенного риска. Кроме этого, необходимо отслеживать динамику активности таких органоспецифических ферментов, как ACT и АЛТ в плазме крови обследуемых после воздействия гипербарии, поскольку наши результаты свидетельствуют о возможном развитии дисфункции печени в этих условиях.

Для проведения экспериментальных исследованиях на биомоделях и животных по разработанным совместно с д.м.н. Б.Н.Павловым медико-техническим требованиям были созданы гипербарические комплексы, позволяющие моделировать условия высокого гидростатического давления и высокого давления инертных газов (ВГД-1, КОНиКМ).

С учетом результатов экспериментальных исследований действия факторов гипербарической среды в соавторстве с Б.Н.Павловым, В.В.Смолиным, Г.М.Соколовым разработаны два ГОСТа РФ «Гипербарическая среда обитания. Термины и определения» и «Предельно допустимые параметры гипербарической среды обитания». Результаты работы были использованы при подготовке и чтении курсов лекций «Космическая физиология и медицина», «Экологическая медицина» и спецкурсов «Барофизиология» и «Молекулярная эндокринология» для студентов факультета фундаментальной медицины МГУ.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на: VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии (1982); Всесоюзном симпозиуме

«Легочные артериальные гипертензии» (Фрунзе, 1988); IX, X, XI Всесоюзных конференциях по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва-Калуга, 1990, 1994, 1998); II, III и Y Международной конференции по биологии высокого давления (Франция, 1990, США, 1992, Россия, 1997); Международном совещании по патофизиологии (Москва, 1991); Всесоюзной конференции «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 1995); I Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996); Международном рабочем совещании по вегетативным нарушениям (Германия, 1996); IV Международной конференции «Биологическое действие высокого давления и биотехнология» (Германия, 1998); VIII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 1998); III Международной конференции "Гипоксия в медицине" (Москва, 1998); XYII Всероссийском съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998).

Основное содержание диссертации отражено в 45 опубликованных в открытой печати работах.

Основные положения, выносимые на защиту:

Экстремальные факторы внешней среды (повышенное парциальное давление индифферентных газов, высокое гидростатическое давление, гипер- и гипоксия) приводят к полиморфной потере чувствительности клетки к сигналам различной природы (кальций-мобилизующие агенты, ß-адренергические стимуляторы). В реализации механизмов десенситизации ведущую роль играют системы внутриклеточных посредников гормонального действия, активно осуществляя через систему обратных связей влияние на различные этапы проведения внешнего сигнала в клетку.

Воздействие гипобарической гипоксии in vitro имеет сходство с действием кальций-мобилизующих агентов: в обоих случаях после активации фосфоинозитидного обмена и повышения цитоплазматического кальция происходит десенситизация клеток к ß-адренэргическим агонистам и кальций-мобилизукмцим гормонам. Необходимым звеном внутриклеточной регуляции, через которое гипоксия меняет функционирование Са-мобилизующей и ß-адрен-ергической систем, является протеинкиназа С.

Длительные погружения на различные глубины, судя по клинико-биохимическим показателям крови, не приводят к выраженным сдвигам метаболизма у человека, однако обнаруженные обратимые изменения ряда показателей указывают на возможную дисфункцию печени. В реализации клеточных эффектов в условиях гипербарии ведущую роль играет высокое гидростатическое давление per se. В электро-невозбудимых клетках независимо от состава газовой среды высокое давление, меняя структурно-функциональные свойства клеточной мембраны, нарушает проведение внешнего регуляторного сигнала в клетку.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 290 страниц машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и библиографии. В диссертации содержится 27 таблицы, 5 фотографий и 26 графиков. Библиография включает 470 наименований (116 отечественных и 364 зарубежные работы).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Организация и методы исследования При выполнении работы были проведены исследования с участием человека в условиях имитирующих длительные насыщенные погружения с избыточным давлением 0,1-2,5 МПа и использованием различных индифферентных газов (азота, гелия, аргона), реальной и моделируемой гипобарической гипоксии и физической нагрузки, исследования на животных при моделировании острой и хронической гипоксии в барокамерных условиях, исследования на различных биологических моделях in vitro в условиях высокого давления в барокамерах малого объема, а также эксперименты с использованием культивируемых клеток в условиях гипо- и гипероксии и гипербарии (табл. 1).

Таблица 1

Объем и структура экспериментальных исследований

Цель экспериментов Объект исследования (п) Число серий (измерений)

Изучение метаболизма человека при имитированных погружениях в барокамере с использованием различных индифферентных газов Обследуемые-добровольцы (45) 12 (280)

Изучение эритроцитов человека при длительных погружениях Обследуемые-добровольцы (14) 4(80)

Изучение эритроцитов животных in vivo и in vitro при действии высокого давления Крысы (36) Мыши (24) 12(160)

Изучение мембранного потенциала изолированной кожи лягушки при действии высокого гидростатического давления Лягушки (40) 15 (75)

Изучение эффектов кальций-мобилизирующих агентов на клетки в культуре при действии высокого давления Культивируемые клетки эндотелия 48

Изучение уровня циклических нуклеотидов в биологических жидкостях при действии гипоксии Альпинисты (24), Обследуемые-добровольцы (И) 12(176) 4(88)

Изучение уровня циклических нуклеотидов в тканях и крови крыс при острой гипоксии и адаптации Крысы (90) 12(150)

Изучение плотности рецепторов изолированных лимфоцитах человека при физнагрузке Обследуемые-добровольцы (6) 24(130)

Изучение влияния гипоксии, гипероксии и Са-мобилизующих агентов на фосфоинозитид-ный обмен в культивируемых клетках Эндотелий сосудов человека Эндотелий аорты быка Гладкомышечные клетки аорты кролика 110 18 12

Изучение механизмов гомо- и гетерологической десенситизации Культура эндотелиальных клеток пупочной вены человека 24

Имитационные глубоководные спуски методом насыщенных погружений проводили в рамках выполнения комплексных НИР на базе глубоководного берегового комплекса ГВК-250 в Институте медико-биологических проблем под руководством Б.Н.Павлова и гипербарическом комплексе Южного отделения Института океанологии РАН под руководством А.М.Генина и И.П.Полешука.

АМелирование эффектов высокого гидростатического давления и высокого давления индифферентных газов. Для физического моделирования высокого давления при работе с биологическими моделями использовали специально разработанные камеры ВГД, КОНиКМ и Мышка-2. Компрессию осуществляли инертными газами или гидравлически со скоростью 0,10,2 МПа/мин в гипербарических камерах объемом 0,5 и 2 л. Время изопрессии варьировали от 30 мин до 2 часов при температуре 37°С.

Моделирование гипоксии. Для создания гипобарической гипоксии конфлуентную культуру эндотелиальных клеток (в среде ММН) в открытых флаконах или мультивеллах помещали в гипобарическую барокамеру «Volsch-100» при температуре 37°С и снижали атмосферное давление до 290 мм рт. ст. С использованием оксиметра регистрировали РСЬ в среде культивиро-ьинш!.

Клинико-биохимический анализ крови. Исследование плазмы проводили спектрофото-метрическими методами на биохимическом анализаторе «ЕРАС 6140» фирмы Eppendorf (Германия), используя стандартные наборы реактивов фирм Raichem (США) и Biocon (Германия). Перечень исследуемых нами биохимических показателей охватывает все основные звенья метаболизма: белковый обмен (общий белок, альбумин, мочевая кислота), углеводный обмен (глюкоза), липидный обмен (холестерин, триглицериды, липаза), активность ферментов плазмы (АЛТ, ACT, ЛДГ, КФК, ХЭ).

Содержание общего белка в плазме крови определяли биуретовым методом; альбумина -по методу, предложенному Doumas; мочевой кислоты - энзиматическим методом; глюкозы -энзиматическим методом, основанном на реакции Триндера; холестерина - энзиматическим методом; триглицеридов - энзиматическим методом; неорганичесого фосфора - методом, предложенным Daly. Активность липазы в плазме крови определяли турбидиметрическим методом; аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-ФДГ) - методами, рекомендованными IFCC; креатинфосфокиназы (КФК) -кинетическим методом; холинэстеразы (ХЭ) - методом, предложенным Rnedel.

Изучение элементного состава эритроцитов проводили с использованием рентгенос-пектрального локального микроанализа на сканирующем электронном микроскопе «Hitachi S-500», оснащенном рентгеновским спектрометром «Kevex-5100». Морфометрию эритроцитов осуществляли с помощью анализатора изображений «IBAS».

Анализ жионокислатного состава липидов плагмы и эритроцитов. Все фракции липи-дов экстрагировали из 0,1 мл плазмы крови и из 0,1 мл эритроцитов с помощью перегнанных органических растворителей: изопропилового спирта и хлороформа. С целью получения метиловых эфиров жирных кислот экстракты липидов выпаривали в токе азота и затем проводили гидролиз липидов и этерификацию. Исследование жирнокислотного состава мембран эритроцитов и плазмы крови проводили на газовом хроматографе «Цвет-110». Полученные хромато-граммы жирных кислот количественно обрабатывали с помощью интегратора (Найдина В.П. и соавт., 1991).

Исследование мембранного транспорта в условиях ггтербарии. В работе использовали модифицированную для гипербарических условий установку Уссинга (Ussing, Zerahn, 1951). Совместно с М.Л.Рудаковским была изучена возможность использования данного метода для исследования мембранного транспорта в условиях гипербарии и влияния высокого гидростатического давления (ВГД) на разность потенциалов, спонтанно генерируемую изолированной кожей лягушки.

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток. Клетки выделяли из легочной артерии или пупочной вены человека путем энзиматической дезагрегации (0.1 %-ная коллаге-наза), как было описано ранее (Allikmets E.Yu. et al., 1986). Для роста культивируемых клеток использовали среду 199, содержащую 20%-ную сыворотку человека, пенициллин и стрептомицин (по 100 ед/мл каждого), 20 мМ HEPES (pH 7,3), 2 мМ глутамин, фактор роста из мозга че-

ловека (200 мг/мл) и гепарин (100 мг/мл). Клетки пассировали, используя 0.05 %-ный трипсин/0. 1 %-ную ЭДТА.

Выделение мембран. Культуру эндотелиальных клеток отмывали средой 199, и клетки механически снимали с поверхности, осаждали центрифугированием (300 g в течение 10 мин при 4 °С) и ресуспендировали в холодном (4 °С) буфере, содержащем 10 мМ HEPES (рН 7.5), 0.15 М NaCl, 1 мМ ЭДТА. Суспензию клеток замораживали в жидком азоте, оттаивали, гомогенизировали, используя стеклянный гомогенизатор, и затем центрифугировали при 32000 g в течение 10 мин. при температуре 4 °С. Мембранный осадок ресуспендировали (до концентрации белка 2.5 мг/мл) в растворе, содержащем 10 mMHEPES (рН 7.5) и 1мМ ЭДТА и замораживали при -70 "С.

Исследование В-адренореуепторов интактпых клеток. При измерении количества В-адренергических рецепторов в качестве лиганда использовали [' 51]-цианопиндолол (10"UM -2.4 ' 10" 0 М); время инкубации - 60 мин. при температуре 37 °С, реакцию проводили в конечном объеме 300 мкл. Неспецифическое связывание измеряли, добавляя в параллельные пробы 10"6 М пропропанол. Инкубацию останавливали добавлением 6 объемов холодного (4 °С) буфера, а мембранную фракцию осаждали на фильтрах «Whatman GF-С», которые трехкратно промывали тем же буфером. Радиоактивность фильтров или клеточных лизатов подсчитывали на гамма-счетчике. Специфическое связывание подсчитывали путем вычитания величины связывания в присутствии пропропанола из величины связывания в его отсутствие. Плотность рецепторов (EU) рассчитывали по кривой Скэтчарда и выражали в фмоль на мг белка.

Определение уровня цАМФ а биологических жидкостях и эндотелиальных клетках. Уровень циклических нуклеотидов определяли радиосатурационным способом, используя стандартные наборы фирмы «Amersham», в пробах плазмы крови после осаждения белка и аликво-тах суточной мочи после разведения. Клетки инкубировали 10 мин при 37°С в среде 199 с 1 мМ ингибитором фосфодиэстеразы - З-изобутил-1-метилксантином (ИВМК). В присутствии этого ингибитора проводили инкубацию клеток с гормоном при 37°С. Реакцию останавливали смесью метанола с водой (8:3). Пробы упаривали досуха, разводили в 50 мМ Трис-буфере (рН 7.5), в аликвотах измеряли уровень цАМФ радиосатурационным способом, используя стандартные наборы фирмы «Amersham». Концентрацию цАМФ определяли по линейной стандартной кривой и выражали в пмоль на 106 клеток.

Измерение продуктов фосфоинозитидного обмена в эндотелиальных клетках. Активность фосфоинозитидного обмена в культивируемых клетках определяли, как описано ранее (Resink T.J. et al., 1987). Преконфлуентные клетки в 24 ячеечных плашках инкубировали 48 ч с мио-2-[3Н]-инозитолом (5 мкКи/мл) в отсутствие фактора роста в среде. Перед экспериментом клетки отмывали от метки средой 199 без сыворотки и инкубировали 30 мин при 37°С в среде 199, содержащей 20 мМ HEPES (рН 7,3) и 20 мМ LiCl. Затем в лунки вносили агонисты в необходимых концентрациях. Инкубацию прерывали добавлением 1 мл раствора 1 % SDS / 3 мМ ЭДТА, и с помощью анионообменной хроматографии на колонках с Dowex 1-Х4 разделяли инозитолфосфаты (ИФ, ИФ2, ИФ3), как было описано ранее (Resink Т. J., 1987).

Определение аденичатииклазной активности в мембранах эндотелиачьных клеток. Реакцию проводили в инкубационной среде (конечный объем 100 мкл), содержащей следующие компоненты: 50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 3 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ, 1 мМ цАМФ, 10 мМ ГТФ 20 мМ Na-креатинфосфат, 2,5 мг/мл креатинфосфокиназы, 100 мг/мл миокиназы, 2 мкКи [а- Р]-АТФ. В некоторых экспериментах концентрации хлорида магния и АТФ варьировали. Реакцию запускали внесением суспензии мембран и останавливали через 10 мин добавлением 200 мкл 0.1 н. НС1 с последующей инкубацией в кипящей воде в течение 7 мин. Аликвоты наносили на колонки, содержащие по 1 г оксида алюминия (нейтральный по Брокману). После нанесения содержимого проб на окись алюминия колонки промывали водой и цАМФ элюировали 10 мМ имидазолом (рН 7.0) непосредственно в сцинтилляционные флаконы. Радиоактивность элюатов измеряли по методу Черенкова на счетчике фирмы «Intertechnique» (Франция), активность аде-нилатциклазы выражали в пмоль цАМФ, образующегося в минуту в расчете на мг белка мембран.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрических критериев для независимых выборок (критерии U и T Вилкок-сона), корреляционного и дисперсионного анализа, пакетов программ Statgraf и Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Раздел 1. Влияние факторов высокого давления на метаболизм человека и состояние клеточных сшиал-ироводяшнх систем

Изучение действия на организм факторов гипербарической среды - высокого давления per se, высокого парциального давления индифферентных газов, измененного содержания кислорода и температурного режима, процессов насыщения и рассыщения тканей газами при компрессии и декомпрессии чрезвычайно затруднено, поскольку даже незначительные изменения параметров гипербарической среды или увеличение времени экспозиции может кардинально изменить реакцию организма на их воздействие. Почти во всех случаях многофакторность гипербарической среды не позволяет проанализировать действие отдельных факторов и их вклад в физиологические реакции. Однако попытки понять механизмы развития в условиях гипербарической среды таких явлений, как азотный наркоз, нервный синдром высоких давлений, декомпрессионная болезнь, физиологические эффекты индифферентных газов под давлением, токсическое действие высоких парциальных давлений кислорода, предпринимаются на протяжении столетия и наиболее полно проанализированы в обзорах (Кребс Е.М., Зальцман Г.Л. 1977, 1984, Сапов И.А., 1984, Семко В.В., 1991, Тюрин-Кузьмин А.Ю. 1997, Смолин В.В., 1998, Bennett Р., 1975, 1982, Brauer R. 1975, 1984 и др.). Для этого используются биологические и физиологические модели, а основным приемом исследований является метод физического моделирования давления, газового состава, параметров микроклимата в специальных барокамерах.

При реальных и имитированных погружениях человека на различные глубины изучение функционирования физиологических систем и изменений биохимических показателей крови позволяет выяснить механизмы действия факторов гипербарической среды, а также следить за состоянием здоровья водолазов и акванавтов и на основании этого при необходимости изменять параметры среды, режимы компрессии или декомпрессии, разрабатывать рекомендации для сохранения здоровья и высокой работоспособности человека в гипербарических условиях.

Для изучения механизмов развития патологических проявлений и целенаправленного поиска методов предотвращения развития специфических состояний и профессиональных заболеваний, препятствующих освоению человеком морских глубин, необходимо изучение клеточной природы патофизиологических процессов, развивающихся в организме в условиях гипербарии. Особую важность для решения этой задачи приобретают исследования первичных эффектов действия давления, не опосредованных регуляторными механизмами целостных биологических структур, таких как ткань, орган и организм.

Исследование факторов высокого давления осуществляли как в экспериментах, имитирующих глубоководные спуски человека на различные глубины в барокомплексе ГВК-250, так и в экспериментах с использованием в качестве биологических моделей культивируемых клеток и переживающих тканей животных в специально сконструированных для этого в СКБ ЭО при ИМБП малых барокамерах с рабочим объемом 2-5 л.

Влняние diaicropoB гнпербарической среды на метаболизм человека.

Для оценки метаболизма и состояния регуляторных систем у человека существует только один путь - исследование содержания субстратов и активности ферментов в биологических жидкостях. Однако невозможность непрерывного длительного измерения исследуемых показателей приводит к тому, что, как правило, измерения проводят до и после воздействия, что затрудняет трактовку полученных результатов.

В литературе представлено мало данных об изменении показателей крови у испытателей при пребывании в условиях гипербарии (Гуляр С.А. и др., 1977, Семко В.В., 1992, Feller D. D. et al., 1971). К тому же имеющиеся литературные данные относятся к исследованиям, проводившимся при различных давлениях, с использованием различных по составу дыхательных смесей и продолжительности эксперимента в барокамере, поэтому сопоставление и обобщение полученных результатов представляет большую трудность. Комплексные исследования на животных, проведенные в Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова, не выявили каких-либо ярких закономерностей в обнаруженных биохимических изменениях в крови и различных органах животных (Зальцман Г.Л., 1984) при длительном их пребывании в условиях гипербарии (гелиокс, 35 кгс/см"). Одной из причин этого может быть быстрая нормализация биохимических параметров и регуляции метаболизма после (возможно, и во время) декомпрессии.

Исследование метаболизма у человека при кратковременных и длительных погружениях в кислородно-азотной среде.

С целью изучения физиологического механизма адаптации организма человека к наркотическому действию повышенного парциального давления азота были проведены последовательные серии коротких и длительных имитационных погружений на глубины, соответствующие 40 и 80 м. Клинико-биохимические исследования крови 14 здоровых мужчин-добровольцев показали, что повышение порога возникновения азотного наркоза во время тренировочных спусков на сжатом воздухе не сопровождается выраженными изменениями основных показателей метаболизма (табл. 2). Однако при имитированных спусках методами длительных насыщенных (ДП) и кратковременных погружений (КП) с использованием кислородно-азотных сме-

сей было выявлено повышение активности трансаминаз в крови и сдвиги показателей липидно-го метаболизма, что может быть связано с изменением функциональной активности клеток печени при пребывании организма человека в условиях гипербарии.

Исследование метаболами при кратковременных и длительных погружениях человека с использованием дыхательных газовых сред, содержащих аргон.

В последнее время уделяется повышенное внимание изучению влияния на живые системы и биологические процессы инертного газа - аргона. Известно, что при воздействии на организм животных и человека в условиях повышенного давления аргон вызывает наркотический эффект (Зальцман Г.Л., 1984). Однако при исследовании выживаемости крыс в гипоксической среде было установлено, что резистентность животных к гипоксии в кислородно-азотно-аргоновой среде достоверно повышается (Павлов Б.Н. и др., 1997). В связи с этим были проведены экспериментальные спуски по выяснению механизмов адаптации организма человека в кислородно-азотно-аргоновой среде.

Для изучения механизмов адаптации к длительному действию газовой среды, содержа-шей аргон в качестве газа-разбавителя кислорода, был проведен 7-суточный комплексный эксперимент при давлении, соответствующем глубине 10 м. Результаты этого эксперимента показали, что если при дыхании гипоксическими кислородно-азотными смесями, судя по различным пробам, снижалась работоспособность обследуемых, то при дыхании гипоксическими кислородно-аргоновыми смесями работоспособность сохранялась на прежнем уровне и резистентность организма к физическим нагрузкам практически не снижалась (Павлов Б.Н. и др. 1998). При этом ни у одного из обследуемых не было выявлено патологических сдвигов клинико-биохимических показателей крови (табл. 2), однако отмечались начальные сдвиги липидного обмена.

Таким образом, длительное пребывание человека в среде, содержащей аргон, не вызывает неблагоприятных изменений метаболизма, что в совокупности с физиологическими данными, полученными в отделе гипербарической физиологии ГНЦ РФ ИМБП, может позволить рекомендовать использование аргона в качестве индифферентного газа-разбавителя кислорода в гермозамкнутых объектах.

Известно, что высокое давление может модифицировать действие биологически активных веществ. Однако работы по изучению фармакодинамики и фармакокинетики лекарственных препаратов в условиях повышенного давления практически отсутствуют. Применение лекарственных средств при погружениях требует исследования эффектов комбинированного действия высокого давления и различных препаратов.

Таблица 2

Биохимические показатели крови человека после завершения кратковременных и длительных насыщенных погружений (М±т)

N Показатели Фон КП-КП-КП (сжатый воздух) КП-ДП-КП (кислородно-азотная среда) КП (кислородно-азотно-аргоновая среда + анестетические препараты) Норма

После 2 КП После 3 КП После КП-ДП После КП-ДП-КП После КП-КП без фарм. Препаратов После КП с фарм. препаратов

1. Триглицерид ы, мг/мл 123,4+16,7 182,0 ±4,29 130,0 ± 11,4 133,5 ±38,2 67,0 ±8,75 101,3 ±23,2 141,6± 56,1 10-150

2. Холестерин, мг/мл 224,5±19,1 197,5 ± 14,6 213,5 ±6,79 202,5 ±31,07 189,0 ± 11,4 10-200

3. Липаза, Е/л 11,8+15,9 117,5 ± 15,3 158 ±2,9 87,0 ±2,9 93,5 ± 20,36 113,3± 10,25 147,6 ±25,8 0-190

4. Лактат, ммоль/мл 1,1 ±0,10 2,05 ± 0,39 1,15 ±0,04 2,1 ±0,29 . 1,4 ±0,07 2,3 ±0,36 1,8 ±0,11 1,3-1,7

5. ЛДГ, Е/л 279,0+48,8 1009,5 ±19,39 478,5 ± 23,2 808,0 ±51,4 389,0 ±37,8 265,6 ±62,8 399,3 ± 93,6 138-276

б. ACT, Е/л 20,9+2,5 48,0 ±10,0 39,5 ±3,2 49,5 ± 12,5 26,0 ± 5,7 40,6 ± 0,57 53,0 ±14,6 6-38

7. АЛТ, Е/л 19,9+3,6 51,0 ± 2,1 33,0 ±1,41 47,5 ±8,2 28,5 ±7,5 26,6 ±5,0 54,6 ± 15,0 0-35

8. КФК, Е/л 123,0+28,0 262,5 ± 29,6 740, ± 387,1 156,5 ±28,9 110,0 ±7,1 175,0 ±49,4 329,0 ± 116,3 24-195

Целью экспериментальных кратковременных спусков до 40 и 60 м с участием человека являлось изучение действия анестетиков (кетамина и сибазона) в условиях гипербарии с использованием кислородно-азотных и кислородно-азотно-аргоновых дыхательных газовых смесей, для обоснования возможности их применения непосредственно в барокамере для обезболивания при травмах и хирургических вмешательствах.

В ходе эксперимента не было обнаружено изменений в плазме крови концентрации общего белка, альбумина, мочевой кислоты, концентрация триглицеридов имела тенденцию к повышению (табл. 2). Было показано, что активность ACT и AJIT в плазме крови после серии спусков немного увеличивалась, достигая верхней границы нормы. У обследуемых, подвергшихся на втором этапе сочетанному действию повышенного давления и фармакологических препаратов, активность этих ферментов была в 1,5-2 раза выше нормы.

Таким образом, было выявлено, что раздельное действие анестетических препаратов (кетамина и сибазона) и кратковременных погружений до 40 и 60 м с использованием для дыхания кислородно-азотной и кислородно-аргоновой смесей не оказывало существенного влияния на течение обменных процессов в организме человека и не сопровождалось патологическими сдвигами биохимических параметров крови. Активация трансаминаз (AJIT и ACT) и ЛДГ после серии кратковременных спусков до 40 и 60 м при совместном действии факторов гипербарической среды и использовании анестетических препаратов свидетельствовала о возможном си-нергическом влиянии на функциональное состояние печени примененных фармакологических препаратов. Полученные данные указывают на то, что применение обезболивающих препаратов в условиях повышенного давления газовой среды требует специальных схем дозировок и мони-торирования состояния печени в этих условиях.

Исследование метаболизма при кратковременных погружениях человека с использованием кислородно-гелиевых сред.

В связи с развитием азотного наркоза при дыхании кислородно-азотными смесями в условиях гипербарии для увеличения глубины погружений азот в дыхательной смеси полностью или частично заменяют гелием. Однако дыхание кислородно-гелиевой смесью с глубины 120140 м приводит к развитию симптомокомплекса неврологических расстройств - нервному синдрому высоких давлений (НСВД) (Bennett Р., 1975, Brauer R., 1975). При этом у человека развивается тремор рук и характерные изменения ЭЭГ: появление медленных волн в 9-диапазоне и угнетение активности а-ритма, ухудшение психомоторных функций, ухудшение показателей умственной работоспособности. Все это ставит задачу поиска средств и методов профилактики и купирования НСВД. Помимо используемых в практике глубоководных погружений снижения скорости компрессии, изменений состава газовой среды, отбора и тренировки водолазов, необ-

ходимо осуществлять поиск и апробацию эффективных фармакологических средств, смягчающих или предупреждающих развитие НСВД.

Ранее в "жсперимеитах на животных был обнаружен положительный анти-НСВД эффект препаратов бетодназе липового ряда при компрессии до 1,8 МПа (Плаксив С.Е., Павлов Б.Н., 1996). Целью экспериментального имитационного КП на гелиоксе до 200 м (2 МПа) являлась проверка эффективности транквилизатора гидазепама как средства профилактики и купирования симптомов НСВД у человека. В эксперименте принимали участие четверо здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 27-39 лет. Двое обследуемых принимали разовую терапевтическую дозу гидазепама (50 мг), а двое других - плацебо. После этого проводили быструю (9 мин) компрессию обследуемых в барокамере до 200 м. Обследуемые пребывали «на грунте» в течение часа, после чего производили декомпрессию. Кровь из вены брали до введения гидазепама и после декомпрессии (выхода обследуемых из барокамеры).

В ходе эксперимента не было выявлено отклонений от нормальных значений в плазме крови в активности КФК, ACT, холинэстеразы и липазы, не изменялась также концентрация неорганического фосфата, мочевой кислоты, альбумина, глюкозы, общего белка. Активность AJIT в плазме крови у двух обследуемых, принимавших плацебо, оставалась в границах клинической нормы. Однако у двух других, принимавших гидазепам, активность фермента после декомпрессии увеличивалась, выходя за верхнюю границу нормы. Концентрация триглицеридов в плазме крови в ходе эксперимента у всех обследуемых имела тенденцию к увеличению. Уровень холестерина уже в фоновом периоде у 3-х обследуемых выходил за верхнюю границу, что может свидетельствовать о несбалансированности пищевых рационов обследуемых.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что применение гидазепама в качестве средства фармакологической профилактики и терапии НСВД в ходе кратковременного имитационного погружения на глубину 200 м с высокой скоростью компрессии при дыхании кислородно-гелиевой смесью не сопровождалось патологическими изменениями клинико-биохимических показателей крови. По итогам комплексных физиологических исследований было показано, что гидазепам действительно снимал основные симптомы проявления НСВД у человека и не вызывал патологических сдвигов параметров внутренней среды, в связи с этим он был рекомендован к применению в водолазной практике. Однако тенденция к повышению активности трансаминаз и небольшие сдвиги липидного обмена при имитации КП с использованием гидазепама вновь обращают внимание на функционирование печени в условиях гипербарической среды обитания и осмотрительное использование фармакологических средств при глубоководных погружениях.

Исследование липидиого метаболизма человека при длительном насыщенном погружении в кислородно-гелиевой среде (2.5 МПа)

Для изучения возможных сдвигов липидного метаболизма у человека при имитации длительных погружений исследовали уровни триглицеридов, холестерина, липопротеидов высокой (ЛПВП) и низкой (ЛПНП) плотности в плазме, а также жирнокислотный состав липидов плазмы крови. В эксперименте участвовали трое здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 35-43 года. ДП проводили в барокамере ГВК-250 с использованием нормоксической гелиокислородной смеси до глубины 250 м. Продолжительность эксперимента составила 21 день, максимальное давление на изопрессии - 2,5 МПа, время изопрессии - 5 суток. Взятие проб венозной крови осуществляли врачи-спецфизиологи до «погружения» в фоновом периоде, а также в различные сроки компрессии (на глубине 10, 100 и 200 м), изопрессии (250 м) и декомпрессии (200, 90 и 12 м) и сразу после окончания декомпрессии при нормальном давлении.

Во время компрессии в течение первых суток уровень триглицеридов повышался и выходил за границы клинической нормы при достижении глубины 200-250 м (рис. 1). В период декомпрессии этот показатель нормализовался. Содержание холестерина в плазме повышалось незначительно при достижении 250 м и в начале декомпрессии, не выходя за границы физиологической нормы для данной возрастной группы. Уровень ЛПНП также повышался в этот же период ДП, причем это повышение было более выраженным, превышало границы клинической нормы и сохранялось до конца декомпрессии. При этом колебания ЛПВП были незначительными. Расчетный фактор атерогенности достоверно не изменялся, хотя можно отметить тенденцию к его увеличению.

Совместно с В.П.Найдиной в пробах плазмы крови методом газовой хроматографии был определен спектр жирных кислот липидов: относительное содержание пальмитиновой (С 16:0), стеариновой (С18:1), олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2), арахидоновой (С20.4) кислот. Мы не обнаружили достоверных изменений состава жирных кислот липидов плазмы при ДП. Отмечено лишь некоторое снижение ненасыщенных жирных кислот (CIS: 1 и С18:2) в течение всего экспериментального периода, и увеличение уровня арахидоновой кислоты в липидах плазмы крови во время декомпрессии. Суммарное количество полиненасыщенных жирных кислот (С20:п), являющихся предшественниками лейкотриенов, превышал фоновый уровень (7%) в 1,5-2 раза во все сроки исследования в условиях гипербарии, оставаясь высоким (17%) и после окончания декомпрессии.

Таким образом, длительное пребывание на глубине более 200 м может приводить к увеличению содержания ЛПНП и триглицеридов в плазме человека, что, в свою очередь, способствует активации атерогенеза, хотя в данном исследовании достоверного повышения фактора

атерогенности не было обнаружено. Тот факт, что повышение показателей, способствующих атерогенезу, наблюдаюсь постоянно при действии факторов гипербарической среды и сохранялось на протяжении недели, указывает на закономерность выявленных биохимических сдвигов.

Триглицериды

Холестерин

■

ЛПНП

ЛПВП

Фактор атерогенности

Рис. 1 . Динамика показателей липидного обмена (средние значения) при длительном насыщенном погружении в кислородно-гелиевой среде на глубину 250 м (2,5 МПа). По оси абсцисс - имитируемая глубина, м; по оси ординат - показатели липидного обмена, ммолях/л; фактор атерогенности - в относительных единицах. Прямыми жирными линиями выделены границы клинической нормы

Обнаруженные изменения липидного метаболизма были обратимы после декомпрессии, что свидетельствует о физиологической адаптации, а не о патологических изменениях. На это же указывает и увеличение предшественников лейкотриенов, активирующих метаболизм про-стагландинов. Тем не менее полученные результаты указывают на необходимость тщательно мониторировать липидный обмен у водолазов, участвующих в погружениях.

Исследование влияния длительного пребывания в кнслородно-гелиевой среде

на эрнтпоциты человека

При длительном пребывании человека в условиях повышенного давления в кислородно-гелиевой среде помимо высокого гидростатического давления, клетки организма испытывают действие растворенных инертных газов, в основном гелия. Однако вопрос о действии повышенного давления и инертных газов на клеточные мембраны до сих пор остается до конца невыясненным (Bennett Р., Bangham A.D., 1967). Одной из простых моделей для изучения действия высоких давлений in vivo является эритроцитарная клетка.

Осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) и их элементный состав изучали при имитации в гипербарической барокамере длительного погружения человека на глубину 100 м (1 МПа) в нормоксической кислородно-гелиевой среде. Исследования проводили с участием трех мужчин-добровольцев в возрасте 31-34 лет. Время пребывания под давлением составило 15 суток. Ступенчатую декомпрессию проводили в течение 4 суток. Температура в барокамере 30-31°С, относительная влажность 35-60 %.

Исследование ОРЭ показало значительное повышение устойчивости мембран эритроцитов к гемолизу гипоосмотическими растворами начиная с 7-х суток длительного погружения и в 1-2-е сутки периода реадаптации, что свидетельствует о том, что мембранные перестройки, вызванные действием повышенного давления и влияющие на осмотическую устойчивость клеток, не исчезают сразу после возвращения человека в нормальные условия.

Выявленное повышение устойчивости эритроцитов к осмотическим колебаниям окружающей среды можно объяснить вероятными конформационными перестройками белковых молекул, изменением липидного состава мембран или изменением фазового состояния липид-ных комплексов, из которых состоят мембраны, при гипербарии (Крепе Е.М., 1981). Кажется маювероятным увеличение ОРЭ за счет появления молодых, устойчивых к гемолизу форм эритроцитов в периферической крови, так как в исследованиях на животных (Соколовский Б.И., 1977) и с участием человека (Sagawa S., et al., 1980) не обнаружено активации эритропоэза при длительной гипербарии. Наши данные, полученные при клиническом исследовании крови, также не выявили появления молодых форм эритроцитов при ДП.

При изучение элементного состава эритроцитов не было различий в содержании фосфора и серы между контрольной группой и обследуемыми в начальный период реадаптации (Табл.3). Наряду с этим необходимо отметить некоторое снижение содержания натрия и достоверное понижение уровня хлора на 2-е сутки восстановительного периода, а также понижение концентрации калия в эритроцитах как в 1-е сутки, так и во 2-е сутки реадаптации.

Таблица 3

Элементный состав эритроцитов человека до и сразу после имитированного длительного погружения на 100 м в кислородно-гелиевой среде

Показатель N3 Р Б С1 К

Фон 34,54+2,65 22,22+0,83 33,80+0,74 17,26±1,81 86,22±3,31

1 сут реадаптации 40,52+8,04 24,24£2,34 33,97±1,39 16,П±1,16 68,87+7,98*

2 сут реадаптации 27,63±3,02 20,54+1,22 34,84+0,60 10,96±0,59* 64,95+6,49

Примечание. * - р < 0.05 по сравнению с контрольной группой.

Мы продолжили изучение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) и их элементного состава при имитации ДП в гелиево-кислородной атмосфере на 200 м с последующим увеличением «глубины» до 350 м (рис. 2).

Рис. 2. Осмотическая резистентность эритроцитов (средние данные для 3 обследуемых) в различные сроки воздействия.

По оси абсцисс - % №С1 в среде инкубации, по оси ординат - % интактных эритроцитов. 1-15 сутДП-200 -(- 3 сут350; 2- 15 сугДП-200; 3 - декомпрессия; 4-1 сут. реадаптации; 5-фон; 6- 1 сутДП-200.

Показано некоторое снижение устойчивости эритроцитов к гипоосмотическому гемолизу в 1-е сутки что, по всей видимости, свидетельствует о дестабилизации мембран эритроцитов

в этот период. После 15 суток пребывания на «глубине» 200 м, а также после дополнительного пребывания в течение 3 суток на «глубине» 350 м произошло значительное повышение ОРЭ. Во время декомпрессии (исследования проводили при достижении «глубины» 84 и 7 м) ОРЭ постепенно снижалась относительно величин, обнаруженных на «грунте», но не достигала фоновых значений (Рис. 2). Не произошло полной нормализации также через 12 и 36 ч реадаптации: ОРЭ по-прежнему оставалась выше исходных величин, хотя и приближалась к ним. Все это свидетельствует о том, что мембранные перестройки при длительном пребывании в условиях гипербарии в кислородно-гелиевой атмосфере носят не только функциональный, быстро проходящий, но и структурный характер, и для их нормализации требуется больше времени, чем период декомпрессии.

Изучение элементного состава эритроцитов с помощью рентгеноспектрального локального микроанализа (полуколичественный метод) не выявило достоверных отличий в содержании натрия, фосфора, серы и железа ни в одной из исследованных периодов (табл. 4). Наряду с этим отмечалось значительное повышение концентрации хлора в эритроцитах, особенно выраженное на 15-е сутки ДП. Содержание этого элемента после окончания действия факторов гипербарической среды не отличалось от фоновых значений. Полученные результаты указывают на возможность изменения анионного транспорта в эритроцитах в условиях гипербарии.

Таблица 4

Содержание элементов (мэкв) в эритроцитах человека при ДП в кислородно-гелиевой среде (М±_т для 10 измерений в каждой точке по каждому обследуемому)

Ыа Р Б С1 К Ре

Фон 21.66+2.12 19.93+0.29 33.0711.61 12.2612.35 77.9912.18 23.6310.8

15 сут. ДП 200 м 22.66±0.84 17.84+0.67 36.5711.21 28.2112.33* 90.5616.70* 23.9811.0

15-е сут. ДП 200 м + 3 сут. ДП 350 м 21.36±0.80 18.05+2.05 36.4011.38 17.0713.88 82.2315.01* 25.4210.7

Декомпрессия 100 м 20.08+0.66 18.5211.88 37.9510.60 10.7311.40 85.5412.27* 22.3511.4

1 сут. реадаптации 15.7811.63 17.89+1.57 37.40Ю.57 10.74+0.57 83.03+4.41 23.06Ю.6

Реадаптация (4 мес) 19.10+1.76 19.1512.11 35.3810.72 10.7311.01 91.6213.24 23.1411.0

Примечание: * - статистически достоверные различия по сравнению с фоном (р< 0,05).

Основная физиологическая роль анионного транспорта через клеточную мембрану эритроцитов - облегчение выхода СО; из тканей и обеспечение его перехода в альвеолы. При этом происходит обмен анионов СГ на НС03". Этот процесс протекает очень быстро (в 10 раз быстрее, чем обмен К+ и поэтому мембрана должна быть легко проницаема для СГ и

НСОз* (Ellory J.С., 1977). Увеличение содержания хлора в эритроцитах, отмечаемое в наших исследованиях при длительном пребывании в условиях гипербарии, может быть вызвано либо значительным изменением мембранной проницаемости для этого иона, либо активизации синтеза в эритроцитах аниона НСОз'". Возможным объяснением этих сдвигов может быть изменение активности карбонгидразы, обнаруженное в эритроцитах людей при компрессии до 31 ата в гелиево-кислородной среде (Carlyle R., et al., 1979). В периоды декомпрессии и адаптации содержание этого элемента достоверно не отличалось от фоновых значений.

В этом же эксперименте был проведен морфометрический анализ эритроцитов с использованием цифрового анализатора изображения IBAS. Измеряли минимальный и максимальный диаметр эритроцитов, их площадь, периметр и рассчитывали фактор формы. Каждая экспериментальная точка представляет собой среднее значение 40-50 измерений.

Показано, что в период изопрессии на имитируемой глубине 250 и 350 м было обнаружено достоверное снижение площади и периметра эритроцитов (на 11%) в основном за счет уменьшения максимального диаметра клеток. Несмотря на ожидаемое возможное округление красных клеток крови в этих условиях, такой расчетный показатель, как фактор формы, достоверно не изменялся. Декомпрессия приводила к нормализации размеров эритроцитов, однако возрастал процент редко встречающихся при нормальных условиях эхиноцитов и сфероцитов. Ранее норвежские исследователи также обнаружили увеличение до 15-20% эхиноцитов из общей популяции эритроцитарных клеток (Paciorek J. et al., 1982) и объяснили это возможными мембранными изменениями, приводящими при ДП к проявлениям анемии.

Таким образом, длительное пребывание в условиях гипербарии (2,5-3,5 МПа) приводит к уменьшению размеров эритроцитов без изменения формы клеток. Если предположить, что уменьшение размеров эритроцитарных клеток произошло за счет потери воды, обусловленной дегидратацией тканей при компрессии, то можно объяснить увеличение осмотической устойчивости клеток не только изменениями структуры мембран, но и процессами регидратации in vitro в гипоосмотическом растворе при тестировании клеток.

Выявленные изменения эритроцитов свидетельствуют о том, что компрессия до 2,1-3,6 МПа приводит к изменению как механических, так и транспортных свойств мембран эритроцитов. При этом необходимо учитывать влияние факторов измененной среды, таких как: 1) непосредственное действие высокого давления как физического фактора (гидростатического давления и скорости его повышения); 2) воздействие высокого парциального давления индифферентных газов (в основном гелия); 3) изменения, вызванные стрессом при пребывании в необычной окружающей среде в замкнутом гермообъекте.

Ситуация в реальном организме осложняется тем, что эти факторы действуют, как правило, в сочетании, а длительное их действие приводит к адаптивным перестройкам, подчас противоположным тем, которые наблюдались в начальный период воздействия. В данном случае такие изменения произошли с ОРЭ, при этом нормализовалась мембранная проницаемость по крайней мере для крупных белковых молекул, о чем свидетельствовал нормальный уровень активности исследованных ферментов (ЛДГ, КФК, ИЦДГ, Г-6-ФДГ).

Рис. 3. Динамика геометрических параметров эритроцитов человека при длительном насыщенном погружении до глубины 350 м в кислородно-гелиевой среде. На верхнем рисунке по оси ординат - плошадь эритроцитов, мкм2. На нижнем рисунке по оси ординат - периметр эритроцитов, мкм. По оси абсцисс - этапы длительного погружения («глубина» погружения).

Действие гидростатического давления может приводить к изменению стерических взаимодействий в мембранах эритроцитов, что нарушает нормальное функционирование мембранных белков и мембранную проводимость. Так, Goldinger J. и соавт. (1980), исследуя влияние гидростатического давления на ионный транспорт и метаболизм эритроцитов человека in vitro, обнаружили, что как активный транспорт, так и пассивная проницаемость мембран эритроцитов ингибируется на 40% при давлении свыше 3,0 МПа, а активность Ыа+,К+-АТФ-азы монотонно возрастает с увеличением давления. Можно предположить, что гипербария оказывает прямое воздействие на геометрию активных мест этого фермента. Вместе с тем изменение транспорта ионов может быть обусловлено изменением липидного матрикса вследствие снижения вязкости липидов эритроцитарных мембран (Heremans К. et al., 1982).

В одной из серий экспериментов мы определяли жирнокислотный спектр в цельной крови мышей после пребывания под давлением 9 МПа в течение 3 ч в кислородно-гелиевой среде (время компрессии - 45 мин, время декомпрессии - 4 часа). Воздействие давления привело к повышению содержания короткоцепочечных насыщенных жирных кислот (С:10-С:14) и снижению процентного содержания ненасыщенных кислот (арахидоновой и ленолевой). Таким образом достаточно короткая экспозиция при высоком давлении смещает равновесие жирных кислот липидов плазмы крови в сторону увеличения коротких насыщенных жирных кислот, что может приводить к изменению структурно-функциональных свойств клеточных мембран в условиях гипербарии.

Учитывая комплексность и многофакторность влияния гипербарии на организм человека, не представляется возможным однозначно ответить на вопросы, что же вызывает изменения эритроцитов in vivo, каковы конкретные механизмы этих процессов. В связи с этим возникает необходимость раздельного изучения эффектов факторов гипербарии на более простых, модельных системах и сопоставления полученных результатов с данными физиологических исследований.

Влияние высокого давления in vitro на биохимические показатели эритроцитов

Взвесь эритроцитов in vitro часто используется как простейшая клеточная безъядерная система для изучения обменных процессов и состояния мембраны при действии различных физических и химических факторов. Предполагается, что высокое давление может оказывать непосредственное влияние на биохимические процессы в клетке через активацию или ингибиро-вание ферментных реакций (Кребс Е.М. и соавт., 1977, 1984) или за счет изменения состояния мембран, обеспечивающих компартментализацию внутри клетки и поддерживающих равновесное состояние многих жизненно важных процессов (Heremans К. et al, 1982).

Прежде чем предпринимать попытки выяснения тонких механизмов действия давления на внутриклеточные процессы, необходимо установить, влияет ли компрессия на энергообмен в клетке и некоторые параметры перекисного окисления, поскольку сдвиг этих процессов в ту или иную сторону может в значительной степени определять последующие биохимические изменения. В изолированных эритроцитах крыс определяли содержание АТФ, 2,3-дифосфо-глицерата, восстановленного глутатиона и активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы после экспозиции клеток при повышенном давлении гелия в течение 1 часа. В параллельных пробах осуществляли анализ спектра жирных кислот фосфолипидов мембран эритроцитов. В этих опытах не было обнаружено каких-либо серьезных нарушений энергообмена и активации перекисного окисления) в эритроцитах in vitro при давлении 9-10 МПа и экспозиции 1 час.

Известно, что высокое давление меняет текучесть мембран клеток (Heinemann S., 1987). Это может происходить вследствие функциональных перестроек липидного бислоя (упорядочивание гидрофобных концов жирных кислот) (Finck Е., 1979, MacDonald А., 1983), изменения содержания холестерина в мембране (Chong Р., 1984, Sargent J., 1988), а также в результате изменения состава жирных кислот, входящих в липиды (Joanny Р., 1992). При этом повышение процента более коротких и насыщенных жирных кислот будет приводить к уменьшению подвижности молекул липидного бислоя, тогда как ненасыщенные жирные кислоты с разветвленной гидрофобной цепочкой дают обратный эффект.

В исследованиях in vitro экспозиция эритроцитов в условиях высокого давления гелия (9-10 МПа) в течение 1 часа не оказывала значительного влияния на жирнокислотный состав мембран эритроцитов, если до воздействия спектр жирных кислот не отличался от обычного. Однако при воздействии высокого давления на клетки в пробах, где предположительно был более высокий уровень бета-окисления липидов, выявились другие эффекты: отсутствие в спектре арахидоновой кислоты, а после воздействия и других длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, резкое увеличение коротких насыщенных кислот, что вызвало рост насыщения в спектре.

Таким образом, даже непродолжительное действие высокого давления in vivo приводит к сдвигу жирнокислотного спектра в мембранах эритроцитов в сторону насыщения. In vitro такой сдвиг при действии давления, по-видимому, можно наблюдать лишь в тех пробах, где существует предрасположенность к активации бета-окисления липидов. В этом случае давление является пусковым фактором, способствующим значительному изменению состава жирных кислот в мембране клетки.

Влияние высокого давления на мембранные процессы

Для исследования эффектов высокого давления на клеточном уровне используют различные модели биологических мембран: от культуры (суспензии) клеток до простейших бисло-ев (липосом), состоящих из однотипных липидов. При этом изучают ряд параметров проницаемости мембран для различных молекул, состояние мембранных структур, электрические параметры (Braganza L., Worcester D., 1986; Chapman К., 1967; MacDonald A., 1983). Одной из таких моделей для исследований транспортных мембранных процессов является изолированный лоскут абдоминальной кожи лягушки (Brouha A., Pequeux А., 1970). Однако необходимо учитывать, что эта модель представляет собой высокодифференцированную ткань, выполняющую узкоспециализированную функцию при нормальных физиологических условиях.

Кожа земноводных функционирует как единая целостная транспортная система, имеющая многослойный эпителий с различной структурой отдельных слоев. В связи с тем, что межклеточные контакты непроницаемы для ионов и молекул, не обладающих зарядом, а трансэпи-талиальный транспорт осуществляется через клетки (Наточин Ю.В. и соавт., 1976), изолированная переживающая кожа земноводных обладает способностью спонтанно генерировать разность потенциалов, и именно этот параметр позволит судить о влиянии различных факторов на транспортные процессы в данной биологической модели.

Результаты исследований показали, что при скорости компрессии (1,0 и 2,0 МПаУмин) увеличение гидростатического давления до 10-15 МПа приводило к гиперполяризации кожного лоскута, при этом прирост разности потенциалов линейно зависел от увеличения давления (рис. 4) и варьировал от 0.7 до 0.94 в различных опытах. Обнаружено также, что максимальная разность потенциалов при 10,0 МПа тем больше, чем выше исходные величины этого показателя при нормальном давлении (г2 = 0,76), т.е. чем активнее кожа земноводных генерирует разность потенциалов в нормальных условиях, тем более выражена фаза гиперполяризации при компрессии.

При повторной компрессии фаза гиперполяризации регистрировалась вновь, однако, динамика могла быть несколько иной и зависела от фоновых значений разности потенциалов. Таким образом, вызываемые высоким давлением изменения в определенных интервалах, являются быстро обратимыми, а повторное воздействие давления приводит к аналогичным сдвигам. При повышении гидростатического давления до 15,0-35,0 МПа фаза гиперполяризации сменялась медленной деполяризацией. Однако превышение величины 35,0 МПа приводило к быстрой деполяризации, которая регистрировалась вплоть до 60,0 МПа (рис. 5).

Рис. 4. Изменение разности потенциалов изолированной кожи лягушки при повышении гидростатического давления. 1 - средние значения (М) для 12 измерений, 2 - ошибка средней (т), 3 и 4 - максимальные и минимальные изменения при компрессии. По оси ординат - прирост разности потенциалов в %, по оси абсцисс - давление (МПа).

Рис. 5. Влияние изменений гидростатического давления на разность потенциалов, генерируемую изолированным лоскутом кожи лягушки

По оси абсцисс - время, мин, по оси ординат - гидростатическое давление, МПа, и разность потенциалов, мВ.

Можно было бы предположить, что давление повышает активный транспорт натрия и/или работу переносчика (Brouha A., Pequeux А., 1970), что и было доказано с использованием ингибиторов активного транспорта. Однако возможно, что упорядочение структуры мембраны при компрессии (Braganza L., Worcester D., 1986) приводит к ингибированию пассивных токов К+ и Na+, что вносит свой вклад в гиперполяризацию. Шунтирующим эффектом обладают и потоки анионов хлора, направленные по градиенту заряда, которые могут снижаться при повышении давления вследствие того же упорядочения структуры мембран.

Таким образом, повышение спонтанно генерируемой разности потенциалов при компрессии до 10,0 МПа может быть обусловлено усилением активного транспорта или ингибиро-ванием шунтирующих ионных токов ( СГ - внутрь, Na+ - наружу). Фаза «медленной» деполяризации при компрессии выше 10,0 МПа может быть вызвана ингибированием активных переносчиков натрия, что было показано и на других мембранных моделях (Chong P., et al.., 1985), а также «естественной» обратимостью фазы гиперполяризации, которую многие исследователи наблюдали и при нормальном давлении, и в случае изопрессии (10,0 МПа) в течение 60 мин. Резкое снижение транскутанной разности потенциалов ниже исходных величин при давлении выше 25,0 МПа свидетельствует о том, что нормальное поддерживание транспортных процессов в данной мембранной системе невозможно при таком давлении.

Однако, анализируя полученные результаты и учитывая данные литературы, правомочно сделать альтернативное предположение, что упорядочение структуры мембраны при компрессии приводит к деполяризации мембран клеток вследствие снижения токов утечки катионов. Повышение разности потенциалов кожи лягушки при компрессии до 10,0 МПа может быть обусловлено тем, что начальное действие давления приводит к деполяризации мембран клеток кожи, в ответ на которую открываются потенциал-зависимые апикальные СГ -каналы клеток, богатых митохондриями. В результате этого анионы СГ направляются внутрь клеток, что приводит к гиперполяризации.

Анализ приведенных данных указывает на то, что ведущую роль в опосредовании эффектов ВГД на клетку играют мембранные структуры. В возбудимых тканях белковые каналы и элементы активного транспорта ионов через мембраны являются, по-видимому, основным ло-кусом, через который давление модулирует функции клетки. При этом основным эффектом давления на ионные каналы является замедление их активации и инактивации без снижения проводимости. В случае активного транспорта высокое давление ингибирует Na+- и Са2+-насосы, за счет снижения субстратного связывания и каталитической активности (Hogan Р., 1993). Изменение транспорта натрия и кальция в возбудимых клетках влияет как на синаптиче-скую передачу в нервной ткани, так и на сопряжение процессов возбуждения и сокращения в

мышечных клетках. Наши исследования с использованием различных моделей (эритроциты, изолированная кожа лягушки) показали, что при объяснении механизмов действия ВГД необходимо учитывать не только вовлечение активного транспорта катионов, но и участие анионных токов и в первую очередь СГ.

Говоря о биологическом действии давления per se, можно сделать вывод, что поскольку при физиологических условиях липиды в мембране организованы в основном в ламеллярную фазу L(a), то действие гидростатического давления будет приводить к упорядочиванию жирно-кислотных остатков, к переходу определенных участков мембраны в ЦЬ)-фазу и анизотропному сжатию в плоскости бислоя, за исключением случаев перехода бислоя в фазу со взаимопроникновением жирнокислотных хвостов, обладающую большей упорядоченностью или увеличением наклона гидрокарбоновых цепей.

Все вышеизложенное, а также анализ результатов, приведенных в обзорах (Кребс Е.М., 1984, Тюрин-Кузьмин А.Ю., 1997, Braganza L., 1986, Cossins А., 1989, Heremans К., 1982, и др.) свидетельствует о том, что дальнейшее исследование клеточной мембраны и мембранных образований внутри клетки позволит выяснить механизмы возникновения многих нарушений при действии давления на живой организм, а химическая модификация мембран, возможно, укажет пути предупреждения неблагоприятных последствий.

Влияние высокого давления на сигнал-проводящие системы культивируемых клеток

Важная роль мембранных структур в живых клетках, их полиморфизм, гетерогенность, функциональная лабильность, высокая чувствительность к внешним воздействиям привлекает внимание исследователей, изучающих механизмы биологического действия высокого давления. Известно, что высокое давление изменяет структурно-функциональные свойства липидного бислоя, при этом может происходить модификация свойств ферментов и рецепторов, встроенных в клеточную мембрану. В ряде физиологических исследований продемонстрировано также, что гипербария приводит к изменению функционирования ионных каналов и нарушению чувствительности к гормональным стимулам (Ashford М., 1982, Bichard А., 1982, Bartlett D., 1997). Возможно, что токи Са2+ и обмен его внутри клетки могут быть вовлечены в реализацию нервного синдрома высоких давлений.

В начале 1980-х годов рядом зарубежных исследователей (Abdel-Latif А., 1986, Berrige М., 1984) продемонстрирована важная роль фосфоинозитидного обмена (ФИ-обмена) в регуляции метаболизма внутриклеточного кальция. Фосфоинозитиды (ФИ) являются минорными фосфолипидами представленными в мембранах всех эукариотических клеток. В разных клетках они составляют от 2 до 8% мембранных липидов, но метаболизируются во много раз активнее и

представляют собой «запасную» форму внутриклеточных молекул-посредников, передающих внешние гормональные сигналы. Фосфоинозитиды расщепляются специфической фосфолипа-зой С до 1,2-диацилглицерола (ДГ) и инозитолфосфатов (ИФ|, ИФ;, ИФ3), которые через ннози-тол утилизируются для ресинтеза ФИ. Активация фосфолипазы С происходит в результате связывания гормона со специфическим мембранно-связанным рецептором, при этом в процесс передачи сигнала вовлекаются ГТФ-связывающие белки (G-белки).

Продукты фосфоинозитидного обмена регулируют различные процессы в клетке. Инози-тол-1,4,5-трисфософат (ИФэ) мобилизует Са2+ из внутриклеточных депо, преимущественно из саркоплазматического ретикулума. ДГ активирует протеинкиназу С - фермент фосфорилирую-щий широкий спектр белков, включая мембранные рецепторы. Арахидоновая кислота является предшественником тканевых медиаторов, таких как простагландины, тромбоксаны и лейкотри-ены, которые получили название «региональных гормонов».

Таким образом мультикомпонентная система фосфоинозитидного обмена состоит из белковых молекул, встроенных в мембрану, функционально связанных друг с другом, и регулирует одновременно многие метаболические реакции, начиная от выброса Са" в цитоплазму (процесс реализуется в течение секунд) до фосфорилирования мембранных и цитоплазматиче-ских белков, включая ферменты, структурные белки, рецепторы и др. (требуются минуты и часы), и освобождения тканевых гормонов, изменяющих функционирование соседних клеток. Наряду с другими мембранными мультиферментными комплексами, такими как различные АТФ-азы, аденилатциклаза, дегидрогеназы, эта система, вероятно, является чувствительной к действию высокого давления и может быть вовлечена в реализацию его клеточных эффектов. Поэтому целью данного раздела работы было изучение влияния высокого давления in vitro на ФИ-обмен и его активацию Са^-мобилизующими агентами в культивируемые клетках.

Предварительно проведенные исследования доз-зависимой активации ФИ-обмена при активации культивируемых клеток Са2+-агонистами в условиях нормального давления показали, что максимум накопления инозитолфосфатов наблюдается после 5 мин инкубации клеток с активатором. При этом оптимальными концентрациями для стимуляции ФИ-обмена в различных типах клетках были для гистамина - 10 мкМ, для серотонина - 1 мкМ, для брадикинина - 100 кМ, которые мы и использовали в последующих экспериментах.

На первой стадии экспериментов исследовали суммарное накопление инозитолфосфатов (ИФп) в культивируемых клетках. Было показано, что после 30 мин экспозиции эндотелиальных клеток человека (HUVEC) в условиях высокого гидростатического давления (6 МПа) ни один из используемых Са-агонистов не активировал ФИ-обмен (рис. 6). По сравнению с контролем высокое давление приводило к снижению стимуляции клеток гистамином и серотонином в 2-3

раза. Аналогичный эффект подавления проведения сигнала внутрь клетки был получен и при использовании культур гладкомышечных клеток и другого типа эндотелиальных клеток (ВРАЕС). Таким образом, высокое давление не влияет в значительной степени на базальный уровень ФИ-обиена, но прерывает трансмембранное проведение Са^-мобилизующего гормонального сигнала.

юоооИФп<фт>

8000

НиУЕС-З контроль

КУ//1 ИФз ' ' ИФ2

ЮОО<3 ИФ

Баэальныб уровень

+гистаиин

НиУЕС-З

ВГД=8,5 МРа. ЗО глин ,

быстрая декомпрессия

ИФц,

юооо

*<<3ргп>

8000 6000 4000 2000 О

Базальный уровень

ГГ771 ИФз I I ИФ2 КХХХ1 ИФ

+гистамин

Рис. 6. Интенсивность фосфоинозитидного обмена в эндотелиальных клетках (НЦУЕС) без стимуляции (базальный уровень) и после инкубации в течение 5 мин с гистамином (10'5 М) в контрольных клетках (верхний рисунок) и после экспозиции в условиях высокого гидростатического давления (ВГД) в течение 30 мин и быстрой декомпрессии со скоростью 1 МПа/мин (нижний рисунок).

Исследование инозитолфосфатов (ИФ,, ИФ:, ИФ.?) продемонстрировало некоторое повышение всех фракций, особенно ИФ; и ИФз, при действии высокого гидростатического давления в диапазоне от 6 до 10 МПа. Необходимо отметить, что действие высокого давления приводило к повышению интенсивности ФИ-обмена в культивируемых ЭК в среднем на 20-35%. При этом гистамин не активировал клетки после декомпрессии в дозах 10 - 100 мкМ (в контрольных клетках при этой концентрации интенсивность ФИ-обмена удваивается). Полученные данные свидетельствуют о десенситизации клеток после их экспозиции в условиях гипербарии.

Для того, чтобы сравнить эффекты высокого гидростатического давления (ВГД) и высокого давления инертных газов (азота и гелия) ФИ-обмен в ЭК человека измеряли после быстрой декомпрессии (в течении 1 мин). Показано, что, как и при действии ВГД, экспозиция клеток при высоком давлении инертных газов не приводила к существенным изменениям базального уровня инозитолфосфатов, но практически полностью блокировала проведение сигнала от внесенных в среду инкубации Са:+-агонистов. Медленная декомпрессия в течение 30-40 мин в зависимости от величины давления в период изопрессии не изменяла базальную активность ФИ-обмена, но накопление инозитолфосфатов в культивируемых клеток после внесения в среду инкубации гистамина в концентрации 10 мкМ практически не отличалось от контроля (рис. 7).

Таким образом, увеличение времени декомпрессии позволяет практически полностью восстановить чувствительность клеток ЭК человека к гистамину и многокомпонентный комплекс «рецептор - G-белок - фосфолипаза С» проводит внешний гормональный стимул через клеточную мембрану. Аналогичные эффекты in vitro высокого давления инертных газов и декомпрессии выявлены при использовании в качестве экспериментальной модели другого типа клеток - ВРАЕС. Следовательно, высокое давление per se приводит к десенситизации клеток, которая может быть выявлена после быстрой декомпрессии.

Для того, чтобы попытаться понять возможность восстановления чувствительности ре-цепторного комплекса после действия гипербарии изучали интенсивность ФИ-обмена в восстановительном периоде. После экспозиции клеток в течение 30 мин при 6 МПа и быстрой декомпрессии клетки инкубировали 35 мин в нормальных условиях атмосферного давления при температуре 37°С. Период последействия в этом случае был равен времени медленной декомпрессии (скорость 0,15 МПа/мин). Стимуляция клеток гистамином в восстановительном периоде после экспозиции клеток в условиях гипербарии выявила увеличение накопления инозитолфосфатов сравнимое с величинами, получаемыми в контрольных клетках. Таким образом, нормализация активации фосфолипазы С при внесении в инкубационную среду Са2+-агонистов после действия гипербарии in vitro происходит либо при медленной декомпрессии, либо в период последействия.

НиУЕС-З

р№=8,5 МРа, 30мин.

быстрая декомпрессия С1 МРа/ мин }

юоой^4^-

8000 -

6000 -

4000 -

Базальный +тистамин

уровень

юооа

НиУЕС-З

р№=8,5 МРа, 30 мин,

медленная декомпрессия - (.0,15 МРа/мин?

ИФ^брт)

4000 2000 0

Базальный уровень

+гистамин

Г7771 ИФз ИФ2 ^та ИФ

Рис. 7. Интенсивность фосфоинозитидного обмена в эндотелиальных клетках (НиУЕС) без стимуляции (базальный уровень) и после инкубации в течение 5 мин с гистамином (10"5 М) после экспозиции в условиях высокого парциального давления азота и быстрой (верхний рисунок) или медленной (нижний рисунок) декомпрессии.

По-видимому, десенситизация, наступающая в результате действия высокого гидростатического давления или высокого давления инертных газов, является функциональной и обусловлена влиянием давления либо на клеточную мембрану, либо на белковые молекулы, в результате чего может нарушаться взаимодействия функциональных единиц многокомпонентного комплекса, встроенного в мембрану и регулирующего интенсивность фосфоинозитидного обмена, а также обеспечивающего проведение сигнала Са-мобилизуюших агентов внутрь клетки. Используемые величины давления, по-видимому, не могут модифицировать белковую структуру, но могут повлиять на текучесть мембраны и тем самым изменить микроокружение рецеп-торного комплекса, что и приведет к блокированию проведения внешнего гормонального сигнала, т.е. десенситизации клетки. Вопрос о том, какая из стадий проведения сигнала - связывание гормона с рецептором, функционирование С-белков или активация фосфолипиза С, ответственна за десенситизацию клеток в условиях гипербарии, остается открытым и требует разработки новых экспериментальных подходов при проведении исследований.

Особая роль, которую играет кислород в обеспечении жизненно важных процессов в живых системах, многократно возрастает при действии экстремальных факторов и особенно в условиях измененного давления. В гипербарической среде даже небольшие сдвиги в содержании О2 могут привести либо к токсическим повреждениям тканей (в случае его повышения), либо к гипоксическим проявлениям (в случае его снижения). Эти аспекты кислородного обеспечения при гипербарическом воздействии, а также проблема выяснения механизмов гипокси-ческих нарушений в экстремальных условиях и кислородной недостаточности при различных видах клинической патологии требуют специального рассмотрения вопросов влияния гипоксии на регуляторные процессы и сигнал-проводящие системы клетки.

Раздел 2. Роль сигнал-проводяших систем при адаптации к гипоксическим состояниям

Острая и хроническая альвеолярная гипоксия часто встречаются как в клинической практике, так и у здоровых людей при изменении условий окружающей среды. Люди, живущие в условиях высокогорья, или находящиеся в условиях замкнутых гермообъектов с измененной газовой средой, спортсмены, совершающие восхождение, больные с фиброзом легких, хроническим бронхитом и астмой могут страдать не только от кислородной недостаточности, но и от легочной гипертензии и отека легких, вызванных гипоксией ^¡БЬтап А.Р. е1 а1., 1985; Оау^еэ Р. е! а1., 1987). Моделирование гипоксической гипоксии осуществляется либо в гипобарической барокамере, либо с использованием дыхательных газовых смесей с различным содержанием в них кислорода.

Показано, что при подъеме на высоту концентрация адреналина в плазме крови у человека быстро возрастает и остается повышенной в течение продолжительного периода (Said S.I. et al , 1974). Хорошо тпестно. что длительное повышение уровня катечоламшюв и ß-адренергических агонистов приводит к развитию гомологической десенситизации тканей, что проявляется в снижении числа рецепторов на поверхности клеток и нарушении сопряжения рецепторов и АД (Lefkowítz R.J. and Carón M.J., 1990). Было показано также, что естественный отбор животных в условиях высокогорья приводит к снижению плотности ß-адренорецепторов в миокарде, но при этом повышается их аффинность (Алдашев A.A. и др., 1988). Таким образом, десенситизация может сопровождаться повышенной чувствительностью АЦ к агонистам, что в итоге сохраняет способность системы в целом отвечать на регуляторные влияния.

Известно, что пониженная доставка кислорода в клетку приводит к быстрому повышению цитоплазматического кальция. Механизм развития этого явления и участие в нем гидролиза фосфоинозитидов до конца не ясны, как и взаимодействие Са-мобилизующей и ß-адренер-гической систем клетки при гипоксии. В задачи данного раздела работы входило выяснение участия циклазных систем и фосфоинозитидного обмена в реализации эффектов гипоксии.

Исследование влияния гипоксической гипоксии на содержание циклических нуклеотидов в тканях и биологических жидкостях.

Для анализа метаболизма циклических нуклеотидов у человека во время пребывания в условиях высокогорья исследовали содержание цАМФ и цГМФ в биологических жидкостях у 25 высококвалифицированных альпинистов, которые совершали тренировочный подъем на высоту 4376 м.

Анализ результатов, полученных при обследовании кандидатов в экспедицию до тренировочного сбора, показал, что все полученные величины находятся в пределах описанных в литературе физиологических норм. Пребывание в базовом лагере на высоте 1660 м приводило к повышению содержания циклических нуклеотндов в плазме (табл. 5). Наблюдаемое при этом нормальное соотношение цАМФ/цГМФ в биологических жидкостях свидетельствует о равномерной активации двух систем без смещения акцентов, что можно рассматривать как адаптивный процесс при действии умеренной гипоксии и физической нагрузки.

Обследование альпинистов после восхождения показало реципрокные изменения содержания циклических нуклеотидов как в плазме крови, так и в суточной моче. Произошло нарастание уровня цАМФ, особенно выраженное в плазме, и снижение уровня цГМФ. В результате соотношение цАМФ/цГМФ в биологических жидкостях возросло почти в 2 раза, что свидетельствует о преобладании адренергической регуляции клеточного метаболизма при гипоксии и физической нагрузке.

Таблица 5

Влияние высокогорного восхождения на содержание циклических нуклеотидов в биологических жидкостях

Уровень циклических нуклеотидов в плазме ( пкмоль/мл) п=25

до подъема после подъема

цАМФ цГМФ цАМФ/цГМФ цАМФ цГМФ цАМФ/цГМФ

М 20.59 8.20 3.04 24.20 4.98* 6,12*

<т 5.62 3.65 1.11 4.69 2.02 2.33

шах 36.8 22 6.03 39 10 16.1

шт , 9.3 3 1.15 14.8 1 2.66

Суточная экскреция циклических нуклеотидов (ммоль/сутки) п=25

до подъема после подъема

цАМФ цГМФ цАМФ/цГМФ цАМФ цГМФ цАМФ/цГМФ

М 4.71 0.73 7.53 5.78 0.52 14.41*

ст 1.02 0.28 2.56 1.44 0.22 7.23

шах 8.52 1.87 15 11.27 1.43 32

тт 2 0.35 3.6 2.98 0.13 4.51

Примечание: здесь и далее * - различия между группами р < 0,05

Для дифференцировки влияния двух ведущих факторов - гипоксии и физической нагрузки была проведена серия исследований в гипобарической барокамере, в которой уровень циклических нуклеотидов в плазме определяли при действии непродолжительной острой гипоксии («высота» 5 км, экспозиция 20 мин). Показано, что у практически здоровых, но не тренированных к гипоксическим воздействиям мужчин, острая гипоксия ведет к 2-кратному увеличению уровня цАМФ в плазме, содержание цГМФ при этом практически не менялось. Десятидневная гипоксическая тренировка этих обследуемых в барокамере по 5 ч ежедневно на имитируемой высоте 5 км, привела к тому, что уровень цАМФ и цГМФ в плазме стал несколько выше, но значительных изменений в ответ на «тестовую» острую гипоксию уже не происходило. По всей видимости, повышенный уровень цАМФ и цГМФ до восхождения объясняется тренировкой организма к гипоксическому стимулу, а изменения, обнаруженные после восхождения, в большей степени связаны с большой физической нагрузкой во время восхождения.

Для установления возможной связи уровня циклических нуклеотидов плазмы с их суточной экскрецией и зависимости степени изменений от исходного уровня был проведен корреляционный анализ. Показано, что до восхождения суточная экскреция цАМФ прямо зависела от содержания этого нуклеотида в плазме (г = 0,76). После воздействия эта связь была менее выраженной (г = 0,63). В отношении цГМФ прямой зависимости его уровня в биологических жидкостях не обнаружено. Существует достоверная связь между уровнями вторичных мессендже-

ров в биологических жидкостях: в плазме - г = 0,56, в суточной моче - г = 0,47. Комплексное воздействие гипоксии и физической нагрузки ведет к значительному уменьшению практически всех выявленных коэффициентов корреляции. Необходимо отметить, что степень изменения уровня цАМФ в биологических жидкостях зависела от фонового уровня (г = 0,58, г = 0,46). Таким образом, корреляционный анализ показал существование взаимосвязей между содержанием внутриклеточных посредников в биологических жидкостях в нормальных условиях, однако действие комплекса экстремальных факторов во время высокогорного восхождения заметно ослабляет эти взаимосвязи.

Кратковременная динамическая физическая нагрузка, часто применяемая как тест, который позволяет оценить некоторые резервные возможности организма, может быть использована в качестве модели транзиторной функциональной гипоксии для исследования состояния адренергических рецепторов клеток крови и сопоставления его с изменениями физиологических и биохимических параметров при таком тестовом воздействии. При кратковременной физической нагрузке у 6 здоровых мужчин были изучены характеристики (3- и а-адренорецепторов лимфоцитов и тромбоцитов периферической крови здоровых доноров и проведено сопоставление этих характеристик с изменениями концентрации катехоламинов, ренина, альдостерона, кортизола, адренокортикотропного гормона, лактата, рН крови. Кровь из вены брали с помощью бранюли в положении испытуемого сидя до воздействия, сразу после окончания нагрузки и через 15 мин после отдыха.

Физическая нагрузка приводила к закономерному повышению концентрации катехоламинов, альдостерона, активности ренина в плазме крови. При анализе связывания иодциано-пиндолола выявлено повышение плотности Р;-адренорецепторов на интактных лимфоцитах сразу после окончания физнагрузки. После 15-минутного отдыха плотность рецепторов несколько уменьшилась, но не возвратилась к исходному уровню (табл. 6).

Таблица 6

Влияние физической нагрузки на адренорецепторы и аденилатциклазу (АЦ) клеток крови здоровых доноров

Характеристика Рг рецепторов лимфоцитов Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мг белка в мин)

Вщах (число рецепторов/ кл. КД(пкМ) для цианопиндолола базальная в присутствии адреналина

I 3551 ±747 97, 1± 31,8 3,6 ±0,8 2,2 ±0,5

II 6198 ± 521 71,9 ±9,9 2,5 ± 0,4 1,2 ±0,2

III 5272 ±760 59,3 ± 13,9 3,4 ±1,1 1,8 + 0,4

Примечание: I - фоновые исследования, II - сразу после окончания физнагрузки, III - через 20 мин восстановления.

После физнагрузки отмечена тенденция к снижению базальной активности АЦ тромбоцитов и уменьшению степени активирования адреналином (табл. 6), показатели частично возвращались к исходному уровню после отдыха. Такие изменения могут быть следствием противоположной функциональной роли сь- и (52-адренорецепторов в физиологических процессах.

На основании данных литературы и результатов нашего исследования можно предложить следующую схему регуляции адренорецепторов при кратковременной функциональной гипоксии, вызванной физнагрузкой: возрастание уровня катехоламинов в крови =5 увеличение количества рецепторов => уменьшение сродства рецепторов к агонисту => при более длительном воздействии - медленно развивающееся уменьшение плотности рецепторов. Возможно, что первоначальное увеличение Р-рецепторов связано с их выходом на внешнюю поверхность мембраны, то есть с демаскировкой. Поскольку после окончания физической нагрузки содержание в крови катехоламинов продолжает оставаться повышенным, это может приводить к интерна-лизации рецепторов и обратимости повышения их плотности.

Таким образом, транзиторная гипоксия, вызванная физической нагрузкой, приводит к изменению плотности и аффинности адренорецепторов на поверхности клеток, изменению регуляции активности АД. Однако поскольку она сопровождается выраженными гормональными сдвигами в крови, не представляется возможным отдифференцировать первичные причины обнаруженных изменений характеристик адренорецепторов клеток крови человека.

Изучение циклических нуклеотидов в тканях при гипоксическом воздействии проводили в экспериментах на крысах. Острую гипобарическую гипоксию создавали в барокамере ("высота" - 10000 м, экспозиция - 30 мин), для адаптивной тренировки животных использовали два режима: длительный ступенчатый в течение 30 мин и короткий "импульсный" в течение 10 дней с многократными подъемами на "высоту" 5000 м. Исследование уровня цАМФ в тканях показало, что при острой гипоксии у контрольных крыс происходит снижение его в таких органах как мозг, печень и скелетная мышца в 1,5-2 раза. Причем в печени и скелетной мышце это снижение выражено более значительно.

Судя по увеличению резервного времени и активации эритроидного ростка у крыс, оба режима адаптации были достаточно эффективны. Для выявления возможных изменений на клеточном уровне была использована острая тестирующая гипоксия, так как в нормальных условиях, как правило, не обнаруживаются различия в показателях метаболизма после тренировки к экстремальному фактору. У адаптированных животных при острой гипоксии не наблюдалось снижения цАМФ в тканях, а уровень цГМФ в мозге достоверно повышался, т.е. изменение соотношения цАМФ/цГМФ в тканях при гипоксическом воздействии после адаптации по сравнению с контролем достигается вовлечением разных циклазных систем.

Исследование клеточных сигнал-проводящих систем при действии гипоксии in

vitro. Очевидно, что, даже зная динамику уровней гормонов и состояние систем вторичных посредников в клетках, выделенных из организма человека, сложно проанализировать динамику изменений и механизмы участия различных гормонов и эффекторных систем в реализации действия фактора. Использование культивируемых клеток позволяет избежать влияния секрети-руемых в ответ на гипоксию нейротрансмиттеров или циркулирующих в крови гормонов и исследовать эффекты фактора per se.

Сосудистый эндотелий очень чувствителен к гипоксии. Скорость синтеза тромбоксана А2 эндотелием быстро возрастает в ответ на гипоксию, так же как и способность эндотелия продуцировать окись азота (Voelkel N.F., 1986; Rubanyi G.M., ¡993). Поскольку вторичные посредники в эндотелиальных клетках регулируют продукцию и секрецию вазоактивных соединений, исследование влияния гипоксии на сигнал-проводящие пути в эндотелиальных клетках весьма важно для понимания не только общебиологических закономерностей действия гипоксии на клетку, но и физиологии сердечно-сосудистой системы в условиях дефицита кислорода.

Эндотелиальные клетки отвечают на широкий спектр стимулов различной природы, включая гормоны, факторы роста, фармакологические агенты, физические и механические факторы. На поверхности этих клеток экспрессировано множество рецепторов, которые чувствительны к различным стимулам и передают сигнал в клетку через специфические эффекторные системы, такие как тирозинкиназы, гунилатциклаза, фосфолипазы, Са2+- или К+- каналы или аденилатциклаза (Michell R.FL, 1985; Freissmuth М. et al., 1989). Аденилатциклазная система в эндотелиальных клетках активируется различными гормонами, включая адреналин (через ß-адренергические рецепторы), гистамин (через Н2-рецепторы) и простагландины (через ПГЕ2 -или простациклиновые рецепторы) (Hopkins N.K. et al., 1981; Mclntyre R.M. et al., 1985; Freissmuth M. etal., 1989).

Задачей данного раздела исследований, проведенных на культивируемых эндотелиальных клетках человека, была проверка предположения, что стимуляция фосфоинозитидного обмена при недостатке кислорода может быть частью механизма десенситизации ß-адренергической системы, наблюдаемой при гипоксии.

Влияние гипоксии на фосфоинозитидный обмен. Различные агонисты (гистамин, фактор активации тромбоцитов, тромбин) стимулируют накопление метаболитов, образующихся при фосфоинозитидном обмене, в культуре эндотелиальных клеток, изолированных из легочной артерии и пупочной вены (табл. 7). В эндотелиальных клетках, инкубированных в условиях гипоксии в течение часа, также обнаружено накопление инозитолфосфатов до уровней, сравнимых с таковыми в гистамин-стимулируемых клетках эндотелия.

Таблица 7

Влияние гормонов и гипоксии на фосфоинозитидный обмен в культивируемых эндотелиальных клетках человека

Агонист ЭК легочной артерии ЭК пупочной вены

Накопление инозитолфосфатов, % от контроля

ИФ ИФ, ИФ, ИФ ИФ2 ИФ,

Гистамин (Ю^М) 530 ±53 203 ±72 153±33 248 +23 189± 18 312± 16

Тромбин (5 ед/мл) 200 ±48 110 ±32 122± 28 268+ 44 160±31 163± 28

ФАТ(10"9М) 239 ±16 194+57 220± 8 189± 20 135±17 208± 13

Гипоксия 1 ч 376 ±70 170 ±45 193± 40 290± 83 191+58 268± 45

Примечание. ЭК - эндотелиальные клетки; ФАТ - фактор активации тромбоцитов. Измерения проводили либо после 5 мин инкубации с гистамином, тромбином или фактором активации тромбоцитов с предшествующей преинкубаиией клеток в течение 55 мин в нормоксических условиях, либо после 1 ч инкубации в гипоксических условиях.

Эффекты гипоксии на фосфоинозитидный обмен зависели от времени экспозиции, при этом максимальное увеличение ИФ3 наблюдалось после 60 мин гипоксии (рис. 8А).

Время инкубации при гипоксия (мни) Время нлк>баош| с ФМЛ (мни)

Рис. 8. Интенсивность фосфоиноизитидного обмена в эндотелиальных клетках после экспозиции в условиях гипоксии (А) и после преинкубации с ФМА (В).

Максимальные уровни ИФз обнаружены при инкубации клеток с гистамином при

нормоксии и при воздействии гипоксии в течение 60 мин. Отсутствие аддитивности эффектов гипоксии и гистамина на продукцию ИФз в эндотелиальных клетках указывает на то, что гипоксия и гистамин (через Н[ - рецепторы) активируют обмен фосфоинозитидов по одному и тому же механизму. Действительно, часовая экспозиция клеток эндотелия в условиях гипоксии

делает их практически нечувствительными к стимуляции гистамином. Влияние гипоксии на потерю чувствительности клеток к гистамину обратимо: после их инкубации в течение 3 ч в нор-моксических условиях активация фосфоинозитидного обмена в ответ на гистамин полностью восстанавливалась.

Форболмиристатацетат (ФМА), необратимый активатор протеинкиназы С, понижал гис-тамин-стимулированный уровень ИФ3 (рис. 8, В), а базальный уровень продукции ИФ3 при этом достоверно не изменялся. Хорошо известно, что эффекты десенситизации, вызванные форбол-миристатацетатом, отражают отрицательную обратную связь при стимуляции гормонами, которые сопряжены с фосфолипазой С (МооЛгоек КО. е1 а1., 1988; НоиЬау М.Б., 1991).

Регуляция активности адетпатиикчазы и плотности Ц-адренорецеоров агонистами. Для выяснения возможного взаимного влияния сигнал-проводящих систем ЭК - ФИ-обмена и АЦ-системы клетки активировали Са-мобилизующими агентами, а затем изучали активность АЦ. Предварительная инкубация эндотелиальных клеток в течение 2 ч с гистамином или фактором активации тромбоцитов (оба агониста реализуют свое действие через активацию фосфоинозитидного обмена) (АШепс-СеЫ Т. е1 а1., 1982; И^шк ТЛ. ег а1., 1987) снижала ба-зальную и изопротеренол-стимулируемую активность аденилатциклазы в мембранах, выделенных из клеток (табл. 8).

Таблица 8

Влияние биологически активных веществ и гипоксии на плотность Р-адренергических рецепторов и активность аденилатциклазы в культивируемых эндотелиальных клетках пупочной вены человека

Условия преинкубации Р-адренорецепторы: Вмях,фмоль/мг Активность аденилатциклазы пмоль цАМФ/мг в мин

базальная +изопротеренол (10° М)

Контроль 14.3 + 3,0 33 ±1 . 85 ±4

Гистамин (10"*М) 4.6 ± 1,2* 12 ±6* 22 ±2.5*

ФМА(10'9М) 4.1 + 1.6* 9 + 0.5* 12 ± 1.6*

ФАТ (Ю'^М) 2.5+0.7* 16 ±5* 18 ± 2*

Гипоксия 9.8 ±1.3* 18±2* 22 ±3*

Примечание. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека были преинкубированы 2 ч в нормоксических условиях с добавлением указанных гормонов или в условиях гипоксии, после чего измеряли плотность р-адренорецепторов в культивируемом монослое. Все значения исследуемых показателей в присутствии агонистов и в условиях гипоксии достоверно отличались от контрольных величин * 0.005 <р< 0.05.

Схожесть эффектов гипоксии, гормонов, стимулирующих активность фосфолипазы С, и форболмиристатацетата на активность аденилатциклазы и плотность ß-адренорецепторов позволяет предположить, что протеинкиназа С может быть вовлечена в десенситизацию ß-адренергической сигнат-проводящей системы при гипоксии.

Роль протеинкиназы С в Ц-адренерсическпй стимуляции. Поскольку и гипоксия, и гиста-мин стимулируют обмен фосфоинозитидов через активацию фосфолипазы С, очевидно, что в этих условиях может происходить стимуляция протеинкиназы С продуктом фосфоинозитидно-го обмена диацилглицеролом (Abdel-Latif A.A., 1986; Exton J.H., 1986; Mooibroek M.J. et al., 1988; Nishizuka Y., 1992). Для того, чтобы исследовать, опосредуется ли десенситизация аденилатциклазы и ß-адренорецепторов через протеинкичазу С, мы изучили влияние гипоксии на протеинкиназа С-позитивные и протеинкиназа С-негативные эндотелиальные клетки.

Протеинкиназа С-негативные клетки получати классическим методом отрицательной обратной регуляции (down-regulation), а именно инкубацией культивируемых эндотелиальных клеток в присутствии ФМА (10'9 М) в течение 3 дней.

ПК-С-позитивпые ЭК

50' 40' 30 20 10' о

ПК-С-иегативные ЭК

А-

С.

<

В

контроль

коптроль ФМА гипоксия О

6'

4-

2-

гипоксия

ФМА

ФМА

Рис. 9. Влияние форболмиристатацетата и гипоксии на активность АЦ и плотность (3-рецепторов эндотелиальных клеток контрольных серий (А и В) и клеток, лишенных протеинкиназы С (Б и Г). * - достоверные различия с контролем р < 0,01

Об ингнбированин протеинкиназы С свидетельствовало отсутствие десенситизирующего эффекта форбомиристатацетатом как на Р-адренорецепторы и активность аденилатциклазы (рис. 9 Б и Г), так и на гистамин-стимулируемый обмен фосфоинозитидов. В противоположность клеткам, имеющим протеинкиназу С, гипоксия не вызывала снижения ни плотности р-адренорецепторов, ни базальной активности аденилатциклазы в клетках, лишенных активной формы протеинкиназы С (рис. 9).

Кроме этого, если гипоксия снижала изопротеренол-стимулируемую активность аденилатциклазы в протеинкиназа С-положительных клетках (рис. 10А), то в клетках, лишенных протеинкиназы С, изопротеренол-стимулируемая активность аденилатциклазы не отличалась в контрольной и «гипоксических» сериях (рис. 10Б).

ПК-С-позитиапые ЭК ПК-С-негативные ЭК

изопротеренол, М изопротеренол, М

Рис. 10. Активность аденилатциклазы при стимуляции изопротеренолом в протеинкиназа С-позитивных клетках (контрольные клетки) и протеинкиназа С-негативных клетках (после преинкубации в течение 24 ч с ФМА)

Использование в работе культивируемых клеток позволило избежать влияния секрети-руемых при гипоксии в организме нейротрансмиттеров и циркулирующих в крови гормонов на сигнал-проводящие системы клетки. Наши результаты свидетельствуют о том, что гипоксия может непосредственно стимулировать систему вторичных посредников в клетках эндотелия. При этом вызванное гипоксией снижение чувствительности к катехоламинам ín vivo может быть опосредовано влиянием недостатка кислорода на фосфоинозитидный обмен и последующей, опосредованной протеинкиназой С десенситизацией плотности p-адренорецепторов и активности аденилатцклазы.

Обнаруженная стимуляция гидролиза фосфоинозитидов при гипоксии в культивируемых клетках сосудов согласуется с опубликованными ранее сообщениями об аккумуляции инози-толфосфатов в кардиомиоцитах (Kawana S. et al., 1994) и гладкомышечных клетках (Plevin R. et al., 1994) при гипоксии. Гипоксия in vitro вызывала исчезновение Р-адренорецепторов с поверхности культивируемых кардиомиоцитов, что сопровождалось снижением катехоламин-стимулируемой аденилатциклазной активности (Marsh J.D. et al., 1989). Эти данные коррелируют с обнаруженным снижением ответа сердечной мышцы на изопротеренол в условиях острой и хронической гипоксии in vivo (Richalet J.P. et al., 1988).

Механизмы, через которые гипоксия стимулирует фосфоинозитидный обмен в клетках, не известен. Предполагается, что активация клеточного метаболизма может развиваться по нескольким путям: 1) снижение продукции макроэргов клетками; 2) активация «рецепторов», чувствительных к кислороду; 3) высвобождение аутокринных веществ; 4) кислородзависимая модификация мембранных структур. Основываясь на доступной информации, последние два механизма, по-видимому, являются более вероятными «кандидатами» для объяснения стимуляции фосфоинозитидного обмена при гипоксии в эндотелиальных клетках. Известно, что гипоксия может стимулировать генерацию свободных радикалов кислорода, которые приводят к пере-кисному окислению полиненасыщенных жирных кислот (Schinetti M.L. et al., 1989). Изменения структуры мембраны за счет перекисного окисления липидов могут быть причиной входа Са2+ в клетку и повышения его внутриклеточной концентрации (Ogawa S. et al., 1990). Поскольку фос-фоинозитид-специфическая фософолипаза С является Са-чувствительным ферментом (Cockroft S. et al., 1992), можно предположить, что индуцированный гипоксией вход Са*+ в клетку является причиной активации обмена фосфоинозитидов.

С другой стороны, гипоксия приводит к накоплению таких метаболитов липидного обмена, как фактор активации тромбоцитов, тромбоксан А2 и других продуктов липоксигеназного пути, которые усиливают вазоспазм (Voelkel N.F., 1986; Rubanyi G.M, 1993). Вазоактивное действие этих веществ может обусловливать стимуляцию фосфолипазы С в эндотелиальных или гладкомышечных клетках (Abdel-Latif А.А., 1986; Exton J.H., 1986). В случае освобождения этих вазоактивных веществ эндотелиальными клетками в ответ на гипоксию, стимуляция фосфоинозитидного обмена в клетках эндотелия может отражать аутокринный, рецепторзависимый процесс. Влияние гипоксии на аутокринную активность таких клеток может приводить также к секреции факторов роста и других пептидов. Например, было показано, что в эндотелиальных клетках легочной артерии гипоксия индуцирует секрецию такого вазоактивного пептида, как эндотелин-1 (Schwartz S.M. et al., 1986).

Касаясь механизмов активации фосфоинозитидного обмена в эндотелиальных клетках при гипоксии, стоит отметить, что эффекты гипоксии столь же выражены, как и эффекты фактора активации тромбоцитов, гистамина и тромбина - наиболее активных Са-мобилизующих гормонов для этих клеток. Поэтому зависимая от гипоксии активация фосфоинозитидного обмена должна стимулировать освобождение Са2+ из внутриклеточных депо (через ИФ3) и активировать протеинкиназу С (через диацилглицерол). Показано, что гипоксия приводит к повышению внутриклеточного уровня Са2+ в культивируемых кардиомиоцитах (Murphy T.W. et al., 1987) и эндотелиальных клетках (Amould S. et al., 1992). То есть гипоксия должна воспроизводить вазоактивное действие, характерное для Са-мобилизующих гормонов, что соответствует гипотезе, согласно которой гипоксия индуцирует вазоспазм in vivo (Voelkel N.F., 1986).

Более того, мы обнаружили, что гипоксия снижает чувствительность эндотелиальных клеток к Са-мобилизующим гормонам (гистамину) и к гормонам (катехоламинам), активирующим аденилатциклазу, эффекты которых сходны с влиянием вазоактивных веществ. Сходство десенситизирующего влияния Са-мобилизующих гормонов, фолбормиристатацетата и гипоксии на плотность Р-адренорецепторов и активность аденилатциклазы и отсутствие таких эффектов в клетках, лишенных протеинкиназы С, свидетельствуют о том, что активация этого фермента (т. е. протеинкиназы С) является необходимым звеном внутриклеточной регуляции, через которое гипоксия изменяет функционирование р-адренергической системы. Вовлечение протеинкиназы С в регуляцию плотности рецепторов клеточной мембраны, G-белков и активности аденилатциклазы хорошо обосновано для многих тканей (Mooibroek M.J. et al., 1988; Houlsay M.D., 1991).

Наши данные свидетельствуют о том, что в эндотелиальных клетках активность аденилатциклазы и плотность Р-адренорецепторов очень чувствительны к гетерологической десен-ситизации. Воздействие гормонов, стимулирующих фосфоинозитидный обмен, или гипоксии в течение 1-2 ч является достаточным для почти полной потери чувствительности клеток к катехоламинам. Влияние гипоксии на адренергическую систему эндотелиальных клеток опосредуется каскадом реакций (фосфолипаза С - протеинкиназа С), участвующих в проведении сигналов от вазоактивных гормонов и факторов роста.

По-видимому, снижение концентрации кислорода в окружающей среде воспринимается самой эндотелиальной клеткой и вызывает в ней активацию синтеза диацилглицерина, который в свою очередь (через протеинкиназу С) подавляет синтез цАМФ в эндотелии. Изложенный механизм гетерологической десенситизации аденилатциклазной системы может лежать в основе известного физиологического феномена развития при гипоксии толерантности Р-адренергической системы организма к катехоламинам.

Таким образом, воздействие гипоксии in vitro имеет сходство с катьций-мобилизующими агентами: в обоих случаях после начальной активации фосфоинозитидного обмена и повышения цитоплаз магического кальция происходит десенситизация клеток к аго-нистам, вызвавшим распад фосфоинозитидов и мобилизацию кальция. Длительная экспозиция в условиях гипоксии приводит также к десенситизации Р-адренергических рецепторов и снижению чувствительности аденилатциклазной системы клеток. Необходимым звеном внутриклеточной регуляции, через которое гипоксия меняет функционирование Са-мобилизующей и Р-адренергической систем, является протеиннкиназа С (рис. 11).

Гипоксия

Рис. 11. Механизм десенситизации Р-адренергических рецепторов и аденилатциклазы путем активации фосфоинозитидного обмена при гипоксии.

Таким образом, результаты работы позволяют заключить, что функционирование сиг-нал-проводяших систем клетки является универсальным дополнительным механизмом становления приспособительных реакций организма при действии экстремальных факторов окружающей среды. При этом экстремальный фактор может приводить к клеточным эффектам, аналогичным тем, которые являются следствием системной регуляции: к примеру, функциональная потеря чувствительности клетки к действию повышенного уровня циркулирующих в крови гормонов. Специфический ответ организма в целом на то или иное внешнее воздействие и адаптацию к нему формируется как комплексный ответ многоклеточной системы, включающий в себя все типы и уровни регуляции функций, включая внутриклеточные посредники гормонального действия.

Выводы

1. Чувствительность клеток к регуляторным веществам снижается при воздействии неблагоприятных факторов внешней среды, таких как измененное давление и газовый состав атмосферы. Ведущим механизмом реализации этого процесса являются системы вторичных посредников гормонального действия, которые на внутриклеточном уровне обеспечивают взаиморегуляцию при проведении сигналов различной природы.

2. Острая гипоксическая гипоксия, вызванная «подъемом» крыс в гипобарической барокамере на высоту 10000 м, приводит к увеличению содержания цАМФ в тканях и крови животных. Адаптация к хроническому действию недостатка кислорода не изменяет существенно ба-зальные уровни циклических нуклеотидов в тканях, однако уменьшает выраженность реакции систем внутриклеточных посредников на острое гипоксическое воздействие.

3. Кратковременная гипобарическая гипоксия (5 км, 30 мин) влечет за собой изменение соотношения цАМФ/цГМФ в плазме крови человека в основном за счет повышения уровня цАМФ. Кратковременная гипоксия, возникающая при физической нагрузке у человека, увеличивает экспрессию (5-рецепторов на поверхности лимфоцитов, что может быть причиной активации аденилатциклазной системы в условиях недостатка кислорода.

4. Одновременное действие гипоксии в условиях высокогорья (высота 5 - 8 км над уровнем моря) и интенсивная физическая нагрузка приводит к увеличению соотношения цАМФ/цГМФ в биологических жидкостях у тренированных спортсменов. Выраженность изменений уровня циклических нуклеотидов индивидуальна и зависит от исходного состояния и степени активации системы внутриклеточных посредников гормонального действия.

5. Нормо- и гипобарическая гипоксия in vitro в течение 20-40 мин активирует фосфоинозитид-ный обмен культивируемых клеток сосудистой стенки (эндотелий и гладкомышечные клетки), вызывая при этом снижение чувствительности к специфическим для каждого вида клеток кальций-мобилизующим агонистам.

6. Гомологическая десенситизация эндотелиальных клеток в культуре, вызванная инкубацией с гистамином или гипоксией, сопровождается гетерологической десенситизацией Р-адренергической системы, что выражается в уменьшении числа p-рецепторов на поверхности клеток и снижении активности аденилатциклазы, ключевую роль в этом процессе играет протеинкиназа С.

7. Высокое гидростатическое давление и высокое давление инертных газов (5 - 10 МПа) при кратковременной экспозиции вызывает десенситизацию эндотелиальных клеток in vitro к кальций-мобилизующим агентам. Чувствительность культивируемых клеток сосудистой стенки к биологически активным веществам восстанавливается либо при медленной декомпрессии, либо после периода реадаптации клеток при нормальных условиях.

8. Мембранные изменения, обнаруженные на различных биологических моделях при кратковременной (20-120 мин) экспозиции в условиях высокого давления (3-10 МПа), являются функциональными и возвращаются к исходному состоянию после нормализации давления и газового состава окружающей среды.

В условиях длительного (7 - 25 суток) пребывания человека при высоком давлении (1,0 - 3,5 МПа) на этапе изопрессии происходит уменьшение размеров эритроцитов при неизменной форме, следствием чего является увеличение их осмотической резистентности и изменение элементного состава. На этапе декомпрессии размеры эритроцитов нормализуются, но возрастает число патологических форм, таких как эхиноциты, сфероциты и др., что сопровождается снижением осмотической резистентности клеток.

). Длительные насыщенные погружения на глубину 10 - 350 м вызывают начальные сдвиги липидного обмена у человека, которые являются обратимыми, и повышение активности ор-ганоспецифических ферментов плазмы крови, указывающие на возможную дисфункцию печени в условиях гипербарии.

1. Использование аргона в атмосфере в качестве газа-разбавителя кислорода не приводит к выраженным изменениям клинико-биохимических показателей крови при кратковременном (несколько часов) и длительном (7 суток) пребывании человека в искусственно созданной атмосфере в диапазоне давления 0-0,1 МПа, что указывает на возможность применения этого индифферентного газа в замкнутых гермообъектах.

2. Изменения, происходящие на разных уровнях организации живых систем при воздействии факторов гипербарической среды в диапазонах использованных режимов и времени воздействия, имеют функциональный и обратимый характер.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Изменение АТФ-азной активности мозга при высотной адаптации. Патол. физиол. и ксперим. терапия, 1979, N1, с. 17-20 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

2. Влияние гипоксии на уровни цАМФ и цГМФ в костном мозге. В сб.: «Циклазная сис-ема и ее роль в регуляции клеточного обмена», Ташкент, 1978, с. 110-111 (совместно с Ермиль-1енко Г.В., Федоровым H.A.).

3. О тканевой адаптации головного мозга крыс в процессе высотной тренировке. В кии-•е: «Специальная и клиническая физиология гипоксических состояний.» Киев, 1979, ч 1, с. 96100 (совместно с Маилян Э.С., Кокоревой Л.В.).

4. Циклические нуклеотиды при острой гипоксии и высотной адаптации. В книге: «Специальная и клиническая физиология гипоксических состояний», Киев, 1979, ч. 1, с. 35-38 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

5. Об окислительном метаболизме мозга крыс при гипоксии. В книге:«Молекулярные аспекты адаптации к гипоксии», Киев, 1979, с.81-88 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

6. Некоторые особенности анаэробного обмена при адаптации к гипоксии. В сб. «Адаптации организма к природным условиям», VI Всесоюзная конференция по экол. физиологии,

1982, с.167 (совместно с Чабдарововой Р.Н., Катковым А.Ю.).

7. Исследования метаболизма циклических нуклеотидов у альпинистов во время тренировочного сбора в горах Тянь-Шаня. В сб. «Актуальные проблемы спортивной медицины и лечебной физкультуры». Каунас, 1983, ч. 1, с. 49-50.

8. К проблеме тканевой адаптации к гипоксии. Патол. физиология и эксперим. терапия,

1983, Nl»c. 14-17 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е. А.).

9. Роль циклических нуклеотидов в патогенезе острой гипоксии. Патол. физиол. и эспе-рим. терапия, 1983, N5 , с. 40-43 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

10. Система внутриклеточных гормональных посредников при действии экстремальных факторов. В сб.«Актуальные проблемы космической биологии и медицины», М., 1986, с. 26-29.

1 1. Влияние физической нагрузки на состояние адрененергических рецепторов лимфоцитов и тромбоцитов периферической крови здоровых доноров. Бюлл. Всес. кард, научного центра АМН СССР, 1987, N1, с. 83-87 (совместно с Коричневой И.Л., Красниковой Т.Л.).

12. Культивируемый эндотелий сосудов человека и животных: хеморецепторная регуляция в норме и при гипоксии. Материалы Всес. симп. «Легочные артериальные гипертензии». Фрунзе, 1988, с. 52-55 (совместно с Мирзапоязовой Т.Ю., Фарбером X., Григоряном Г.Ю.).

13. Влияние высокого давления на кальцмй-мобилизующуто систему в культуре эндоте-лиальных клеток. Тезисы IX Всес. конференции, по косм. биол. и авиакосмической мед. Москва-Калуга, 1990, с. 291-292.

14. Effects of high hydrostatic pressure on Ca-mobilizing system in cultured cells. Proc. Il-nd Intern. Meeting, on High Pressure Biology., Toulon, France, 1990, p.4 (co-authors Rudakovsky M.L.).

15. Исследование порогов возникновения симптомов НСВД у животных на фоне действия различных фармакологических препаратов. Тезисы IX Всес. конф. по косм, биологии и авиакосм, медицине, Калуга, 1990, с. 152-153 (совместно с Павловым Б.Н., Рудаковским МЛ.).

16. Phosphoinositide turnover and adenylate cyclase system in human endothelial cells under influence of calcium-mobilizing hormones and hypoxia. Proc. Intern. Society for Patophysiology, Moscow, 1991, N15 2,Abst. p.318 (co-authors MirzaponoyzovaT.Y, Grigorian G.Y., Tkachuk V.A.).

17. Эффекты гипоксии на фосфоинозитидный обмен и аденилатциклазную систему в культивируемых экдотелиальных клетках. Бюлл. эксп. биол. мед., 1991, N5, с. 464-466 (совместно с Мирзапоязовой Т.Ю., Григоряном Г.Ю., Ткачуком В.А.).

18. Влияние имитации длительного погружения на 100 м в гелио-кислородной среде на эритроциты человека. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1992, N 1, с.29-30 (совместно с Буравковым С.В., Полещуком И.П.).

19. Effects of high pressure and local anaesthetics on phosphoinositide turnover in endothelial cell culture. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p.135.

20. Diazepinic drug effect on the high pressure nervous syndrome in mice. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p. 151 (co-authors Pavlov B. N., Rudakovsky M.L., Kemenova N. A.).

21. The influence of long term heliox action under high pressure on blood enzymes and human erythrocytes. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p. 161 (co-authors Buravkov S. V., PoleschukI. P.).

22. Использование водорода в качестве компонента в дыхательных газовых смесях при глубоководных погружениях. Успехи физиологических наук, 1992, т. 23, N 4, с. 71-88. (совместно с Павловым Б.Н., Дьяченко А.И.)

23. Изменения эритроцитов и ферментов крови при длительном пребывании человека в гипербарических условиях под давлением 21-36 АТА в гелиево-кислородной среде. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1994, N3, с. 21-26 (совместно с Буравковым С.В., Полещуком И. П.).

24. Влияние декомпрессии на кислотно-щелочное равновесие крови и некоторые гематологические показатели у человека. В сб.: «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний», С.-Петербург, «Наука», 1995, с. 15.

25. Десенситизация сигнал-проводящих систем эндотелиальных клеток in vitro. В сб.: «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний», С.-Петербург, «Наука», 1995, с. 16 (совместно с Мирзаяпоязовой Т.Ю., Ткачуком В.А.).

26. Влияние высокого гидростатического давления на спонтанно генерируемую разность потенциалов изолированной кожи лягушки. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1994, N1, с. 51-54 (совместно с Рудаковским М.Л., Павловым Б.Н.).

27. Механизмы десенситизации бета-рецеторов и аденилатциклазы в эндотелиальных клетках сосудов человека при гипоксии. Материалы 1-го Российского конгресса по патофизиологии. М., 1996, с. 188 (совместно с Ткачуком В.А., Мирзапоязовой Т.Ю., Григоряном Г. Ю.)

В условиях длительного (7 - 25 суток) пребывания человека при высоком давлении (1,0 - 3,5 МПа) на этапе изопрессии происходит уменьшение размеров эритроцитов при неизменной форме, следствием чего является увеличение их осмотической резистентности и изменение элементного состава. На этапе декомпрессии размеры эритроцитов нормализуются, но возрастает число патологических форм, таких как эхиноциты, сфероциты и др., что сопровождается снижением осмотической резистентности клеток.

I. Длительные насыщенные погружения на глубину 10 - 350 м вызывают начальные сдвиги липидного обмена у человека, которые являются обратимыми, и повышение активности ор-ганоспецифических ферментов плазмы крови, указывающие на возможную дисфункцию печени в условиях гипербарии.

1. Использование аргона в атмосфере в качестве газа-разбавителя кислорода не приводит к выраженным изменениям клинико-биохимических показателей крови при кратковременном (несколько часов) и длительном (7 суток) пребывании человека в искусственно созданной атмосфере в диапазоне давления 0-0,1 МПа, что указывает на возможность применения этого индифферентного газа в замкнутых гермообьектах.

2. Изменения, происходящие на разных уровнях организации живых систем при воздействии факторов гипербарической среды в диапазонах использованных режимов и времени воздействия, имеют функциональный и обратимый характер.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Изменение АТФ-азной активности мозга при высотной адаптации. Патол. физиол. и ксперим. терапия, 1979, N1, с. 17-20 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

2. Влияние гипоксии на уровни цАМФ и цГМФ в костном мозге. В сб.: «Циклазная сис-ема и ее роль в регуляции клеточного обмена», Ташкент, 1978, с. 110-111 (совместно с Ермиль-:енко Г.В., Федоровым H.A.).

3. О тканевой адаптации головного мозга крыс в процессе высотной тренировке. В кни-е: «Специальная и клиническая физиология гипоксических состояний.» Киев, 1979, ч 1, с. 96.00 (совместно с Маилян Э.С., Кокоревой Л.В.).

4. Циклические нуклеотиды при острой гипоксии и высотной адаптации. В книге: «Спе-шальная и клиническая физиология гипоксических состояний», Киев, 1979, ч. 1, с. 35-38 (со-местно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

5. Об окислительном метаболизме мозга крыс при гипоксии. В книге:«Молекулярные аспекты адаптации к гипоксии», Киев, 1979, с. 81-88 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

6. Некоторые особенности анаэробного обмена при адаптации к гипоксии. В сб. «Адаптации организма к природным условиям», VI Всесоюзная конференция по экол. физиологии,

1982, с.167 (совместно с Чабдарововой Р.Н., Катковым А.Ю.).

7. Исследования метаболизма циклических нуклеотидов у альпинистов во время тренировочного сбора в горах Тянь-Шаня. В сб. «Актуальные проблемы спортивной медицины и лечебной физкультуры». Каунас, 1983, ч. 1, с. 49-50.

8. К проблеме тканевой адаптации к гипоксии. Патол. физиология и эксперим. терапия,

1983, N1, с. 14-17 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

9. Роль циклических нуклеотидов в патогенезе острой гипоксии. Патол. физиол. и эспе-рим. терапия, 1983, N5 , с. 40-43 (совместно с Маилян Э.С., Коваленко Е.А.).

10. Система внутриклеточных гормональных посредников при действии экстремальных факторов. В сб.«Актуальные проблемы космической биологии и медицины», М., 1986, с. 26-29.

11. Влияние физической нагрузки на состояние адрененергических рецепторов лимфоцитов и тромбоцитов периферической крови здоровых доноров. Бюлл. Всес. кард, научного центра АМН СССР, 1987, N1, с. 83-87 (совместно с Коричневой И.Л., Красниковой Т.Л.).

12. Культивируемый эндотелий сосудов человека и животных: хеморецепторная регуляция в норме и при гипоксии. Материалы Всес. симп. «Легочные артериальные гипертензии». Фрунзе, 1988, с. 52-55 (совместно с Мирзапоязовой Т.Ю., Фарбером X., Григоряном Г.Ю.).

13. Влияние высокого давления на кальций-мобилизующую систему в культуре эндоте-лиальных клеток. Тезисы IX Всес. конференции, по косм. биол. и авиакосмической мед. Москва-Калуга, 1990, с. 291-292.

14. Effects of high hydrostatic pressure on Ca-mobilizing system in cultured cells. Proc. Il-nd Intem. Meeting, on High Pressure Biology., Toulon, France, 1990, p.4 (co-authors Rudakovsky M.L.).

15. Исследование порогов возникновения симптомов НСВД у животных на фоне действия различных фармакологических препаратов. Тезисы IX Всес. конф. по косм, биологии и авиакосм, медицине, Калуга, 1990, с. 152-153 (совместное Павловым Б.Н., Рудаковским МЛ.).

16. Phosphoinositide turnover and adenylate cyclase system in human endothelial cells under influence of calcium-mobilizing hormones and hypoxia. Proc. Intern. Society for Patophysiology, Moscow, 1991, N15 2,Abst. p.318 (co-authors Mirzaponoyzova T.Y, Grigorian G.Y., Tkachuk V.A.).

17. Эффекты гипоксии на фосфоинозитидный обмен и аденилатциклазную систему в культивируемых эндотелиальных клетках. Бюлл. эксп. биол. мед., 1991, N5, с. 464-466 (совместно с Мирзапоязовой Т.Ю., Григоряном Г.Ю., Ткачуком В.А.).

18. Влияние имитации длительного погружения на 100 м в гелио-кислородной среде на эритроциты человека. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1992, N 1, с.29-30 (совместно с Буравковым С.В., Полещуком И.П.).

19. Effects of high pressure and local anaesthetics on phosphoinositide turnover in endothelial cell culture. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p.135.

20. Diazepinic drug effect on the high pressure nervous syndrome in mice. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p. 151 (co-authors Pavlov B. N., Rudakovsky M.L., Kemenova N. A.).

21. The influence of long term heliox action under high pressure on blood enzymes and human erythrocytes. Undersea Biomedical Research, 1992, Vol. 19 (Suppl.), p.161 (co-authors Buravkov S. V., Poleschuk I. P.).

22. Использование водорода в качестве компонента в дыхательных газовых смесях при глубоководных погружениях. Успехи физиологических наук, 1992, т. 23, N 4, с. 71-88. (совместно с Павловым Б.Н., Дьяченко А.И.)

23. Изменения эритроцитов и ферментов крови при длительном пребывании человека в гипербарических условиях под давлением 21-36 АТА в гелиево-кислородной среде. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1994, N3, с. 21-26 (совместно с Буравковым С.В., Полещуком И. П.).

24. Влияние декомпрессии на кислотно-щелочное равновесие крови и некоторые гематологические показатели у человека. В сб.: «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний», С.-Петербург, «Наука», 1995, с.15.

25. Десенситизация сигнал-проводяших систем эндотелиальных клеток in vitro. В сб.: «Физиологические механизмы развития экстремальных состояний», С.-Петербург, «Наука», 1995, с.16 (совместно с Мирзаяпоязовой Т.Ю., Ткачуком В.А.).

26. Влияние высокого гидростатического давления на спонтанно генерируемую разность потенциалов изолированной кожи лягушки. Авиакосмическая и экологическая медицина, 1994, N1, с. 51-54 (совместно с Рудаковским М.Л., Павловым Б.Н.).

27. Механизмы десенситизации бета-рецепторов и аденилатциклазы в эндотелиальных клетках сосудов человека при гипоксии. Материалы 1-го Российского конгресса по патофизиологии. М., 1996, с. 188 (совместно с Ткачуком В.А., Мирзапоязовой Т.Ю., Григоряном Г. Ю.)

28. Involvement of protein kinase С in hypoxia-induced desensitization of the P-adrenergic ystem in human endothelial cells. Biochem. Biophys. Research Commun., 1996, N 222, pp. 753-758 co-authors T. Resink, T. Mirzapoyazova, E. Kohler, V.A. Tkachuk).

29. Education program on aerospaceand environmental medicine for medical faculty of MSU., \cta astronautica, 1996, p. 409 (co-authors A. I. Grigoriev, V. A. Loginov, O. L. Vinogradova).

30. Cellular membrane lipids and fatty acid composition after high pressure exposure. Jndersea Hyperbaric Med., 1997, Vol. 24 (Suppl.), p.53 (co-authors V.P. Naidina, M.L. Rudakovsky).

31. Human blood lipids during dry deep diving in heliox (2,5 MP A). Undersea Hyperbaric vied., 1997, Vol. 24 (Suppl.), p.57 (co-authors B.N. Pavlov).

32. Investigations of different hyperoxic, hypoxic and normoxic oxygen-argon gaseous nixtures under different barometric pressure and respiration periods. 1997, pp. 133-142 (co-authors 3.N. Pavlov, A. I. Grigoriev et al.)

33. Investigations in animals of the capabilities of hydrogen as a component of respiratory :aseous mixtures in diving to 1900 m. 1997, pp. 152-156 (co-authors B.N. Pavlov, S.E. Plaksin et al.)

34. Molecular mechanism of the desensitization of P-adrenergic receptors and adenylate ;yclase by hypoxia in human endothelial cells. Russian Journal of Physiology, 1997, T. 83, N 5-6, c. 107-118 (co-authors V.A. Tkachuk, T.Y. Mirzapoyazova, G.Y. Grigorian, T.J. Resink).

35. Влияние длительных насыщенных погружений в геяиево-кислородной среде на ли-гиды крови у человека. Тезисы докладов XI Конференции »Космическая биология и авиакос-лическоя медицина», Москва, Россия, 1998, Т. 1, с. 132-133.

36. Fatty acid composition of plasma lipids and erythrocyte membranes during simulated ¡xtravehicular activity. Acta astronautica, 1998, Vol.43, N3-6, pp.77-86 (co-authors M.A. Skedina, V.P. Katuntsev, V.P. Naidina).

37. The effects of high pressure on signal transducing systems of cultural endotelial cells. \bstr. IVth joint Meeting on «High pressure bioscience and biotechnology», Heidelberg, Germany, 1998, p. 112.

38. Использование методов клинической биохимии для исследования обмена веществ три воздействии на человека факторов гипербарической среды. В сб.: Материалы VIII Между-гародного симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации», Москва, 1998, с. 104105 (совместно с Девятовой Н.В., Павловым Б.Н.).

39. Участие протеинкиназы С в десентизации Р-рецепторов в культивируемых эндоге-тиальных клетках при гипоксии. J. Hypoxia Medical, 1998, Vol. 6, N 2, p. 31 (совместно с Мир-¡апоязовой Т.Ю., Ткачуком В. А.).

40. Исследование метаболизма циклических нуклеотидов у человека при высокогорном зосхождении. J. Hypoxia Medical, 1998, Vol. 6, N 2, с. 105 (совместно с Коваленко Е.А.).

41. Изменения клинико-биохимических показателей крови человека при длительных погружениях. Материалы XYII Всероссийского съезда физиологов, 1998, с. 351-353.

42. Гипоксия и гипербария влияют на чувствительность эндотелиальных клеток к гормо-чам путем изменения активности фосфоинозитидного обмена. Материалы XYII Всероссийского :ъезда физиологов, 1998, с. 128.

43. Кислородно-азотно-аргоновая среда при длительном пребывании человека в барокамере при избыточном давлении. Морской медицинский журнал. 1999, № 2, с. 42-43 (совместно : Павловым Б.Н., Смолиным В.В., Соколовым Г.М. и др.).

44. Раздельное и сочетанное действие кратковременных имитационных погружений и анестетических фармакологических препаратов на метаболизм человека Авиакосмическая и экологическая медицина. 1999, т.ЗЗ, № 2, с. 26-30 (совместно с Девятовой Н.В.).

45. Влияние длительного пребывания человека в кислородно-азотно-аргоновой среде при избыточном давлении 0,1 МПа на биохимические показатели крови. Гипербарическая физиология и медицина, 1999, № 2, с. 2-7 (совместно с Девятовой Н.В.).