Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Системная эндотоксинемия в патогенезе повреждения и регенерации печени при хронических вирусных гепатитах В и С

На правах рукописи

Созинов Алексей Станиславович

СИСТЕМНАЯ ЭНДОТОКСИНЕМИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ

ПОВРЕЖДЕНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ В и С

14.00.10 - инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

81Ы-*

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования Казанском государственном

медицинском университете Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Еналеева Диляра Шакировна.

доктор медицинских наук, профессор Киясов Андрей Павлович.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Антонова Тамара Васильевна,

доктор медицинских наук, профессор Иванов Константин Сергеевич,

доктор медицинских наук, профессор Сологуб Тамара Васильевна.

Ведушая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Санкт-Петербургская государственная медицинская академия последипломного образования

Защита состоится "_"_2004 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.086.03 Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И.Мечникова (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д.47)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И.Мечникова

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А. Г. Бойцов

Общая характеристика работы

Актуальность. В настоящее время хронические вирусные гепатиты В и С (ХГВ и ХГС) представляют актуальную медико-социальную проблему в связи с широким их распространением, возможностью развития серьезных осложнений, значительным экономическим ущербом (Шаханина И.Л., 2002; Лобзин Ю.В. и соавт., 2003). Более 350 млн. человек в мире инфицированы вирусом гепатита В (Поляков А., 1999), около 300 млн. являются хроническими носителями вируса гепатита С (Шерлок Ш., 1999). Цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома, развивающиеся в исходе хронического гепатита В и С, входят в десятку наиболее частых причин смерти (Purcell К, 1993; Davey S., 1996). Ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, на земном шаре умирает более 1 миллиона человек (Онищенко Г.Г., 2002).

Возбудители ХГВ и ХГС способны длительно, в ряде случаев пожизненно, персистировать в организме человека. Традиционный сценарий хронических вирусных гепатитов В и С с исходом в цирроз или гепатоцеллюлярную карциному предполагает наличие острой фазы, многолетнего латентного периода, тяжелой органной патологии, летального исхода, т.е. характерных этапов медленных инфекций (Турьянов М.Х., 1999). В то же время заболевание может протекать практически бессимптомно, инапарантно или, напротив, стремительно завершаться фатальным исходом фульминантного гепатита, отличаться проявлениями холестатического синдрома или выраженной внепеченочной манифестацией при отсутствии признаков поражения печени (Соринсон С.Н., 1996; Шерлок Ш. и соавт., 1999; Воробьев О.В., 2000; Ивашкин В.Т., 2000). Все многообразие клинических форм и вариантов течения вирусных гепатитов В и С не удается объяснить только особенностями генотипов вирусов HBV и HCV (Апросина З.Г. и соавт., 1995; Лопаткина Т.Н., 1997; Майер К.П., 2000; Абдурахманов Д.Т., 2002). Не вызывает сомнения, что существенную роль в формировании патогенетических основ повреждения печени и вирусной инфекции в целом, безусловно играют как защитные, так и повреждающие факторы эндогенной природы.

В качестве одного из патогенетических факторов, способных индуцировать многочисленные клинико-лабораторные феномены, описанные при ХГВ и ХГС, можно рассматривать эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных бактерий, вызывающий развитие комплекса

РОС'НАЦИОИАЛЬМАЯ БИБЛИОТЕКА

иммунологических и других биологических процессов, характерных для инфекционных заболеваний (Яковлев М.Ю.. 1993; Малов ВА и соавт.. 1997: Westphal О., 1984). Главным антиэндотоксиновым барьером является печень (Яковлев М.Ю., 1988; Пермяков Н.К. и соавт.. 1989; Thurman Ка et я1., 1997). При развитии дисбактериоза кишечника и других патологических процессов желудочно-кишечного тракта поступление ЭТ в системный кровоток повышается, что может быть как причиной, так и следствием альтерации печени. Рядом исследований последних лет (Волчкова Е.В. и соавт., 1997; Ткачева СВ., 2001) показано вовлечение ЭТ в патогенетические процессы при ХГВ и ХГС. Это делает изучение взаимосвязей эндотоксинемии с особенностями повреждения и регенерации печени чрезвычайно актуальным. Кроме того, неизученными остаются многие аспекты влияния проводимой терапии ХГВ и ХГС на эндотоксин-антиэндотоксиновую систему.

Вышеизложенное позволяет считать целесообразным проведение комплексного исследования патогенетических взаимосвязей эндотоксинемии, дисбактериоза кишечника, особенностей повреждения и регенерации печени у больных ХГВ и ХГС, а также изучение влияния интерферона и индукторов интерфероногенеза на указанные патогенетические звенья заболеваний.

Цель: Определить значение системной эндотоксинемии в формировании патогенетических механизмов повреждения и регенерации печени для улучшения диагностики, прогнозирования течения заболевания и совершенствования лечения хронических вирусных гепатитов В и С.

Задачи

1. Изучить частоту и выраженность системной эндотоксинемии, состояние основных плюральных и клеточных факторов антиэндотоксиновой защиты у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

2. Сопоставить выраженность системной эндотоксинемии с состоянием основных факторов антиэндотоксиновой защиты и клинико-лабораторным и показателями у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

3. Изучить характер клеточных реакций в печени при экспериментальном гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом и при экспериментальном дисбактериозе, индуцированном канамицином.

4. Разработать метод оценки степени и характера повреждения и регенерации печени при Хроничсских вирусных гепатитах В и С.

5. Определить информативность показателей, входящих в традиционный клинико-лабораторный комплекс обследования, а также морфологических характеристик повреждения и регенерации печени для диагностики хронических вирусных гепатитов В и С.

6. Оценить взаимосвязь показателей повреждения и регенерации печени с выраженностью системной эндотоксинемии, состоянием иммунной системы, характером дисбиотических реакций в толстой и тонкой кишке, развитием сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

7. Изучить влияние препаратов интерферона и индукторов интерфероногенеза на состояние микрофлоры кишечника и уровень системной эндотоксинемии у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Научная новизна:

1. Впервые у больных хроническими вирусными гепатитами В и С показано наличие эндотоксинемии и изменения основных гуморальных и клеточных факторов антиэндотоксиновой защиты.

2. Впервые у больных хроническим гепатитом В показана прямая связь между выраженностью системной эндотоксинемии и внутридольковым повреждением гепатоцитов, клинико-лабораторными особенностями, заболевания. У больных хроническим гепатитом С подобная закономерность не выявлена.

3. Установлено, что у больных хроническими вирусными гепатитами В и С системная эндотоксинемия и дисбиотические реакции в тонкой и толстой кишках определяют развитие и выраженность сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта.

4. Впервые установлено, что применение индуктора интерфероногенеза амиксина, препаратов а-интерферона в лечении ХГВ и ХГС приводит к уменьшению дисбиотических реакций, снижению выраженности системной эндотоксинемии и стимулирует выработку антиэндотоксиновых антител.

5. Впервые в эксперименте показано, что амиксин модулирует процессы, активации клеток Ито и их транедифференцировки в миофибробласты, оказывает влияние на процессы фиброгенеза в печени и не вызывает повреждающего действия на печень. Новыми являются данные о влиянии амиксина на микрофлору кишечника крыс, а также взаимосвязи дисбиоза кишечника с морфологическими изменениями структуры печени. Получены

новые данные о реакциях клеток Ито. особенностях регенерации гспатоцитов и холангиоцитов на фоне однократного введения эндотоксина и экспериментального дисбиоза кишечника. индуцированного введением канамицина.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе выполнения данного исследования были получены данные об участии эндотоксина в патогенезе альтерации и регенерации гепатощггов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Разработана методика морфологической и иммуногистохимической диагностики хронических вирусных гепатитов, которая позволяет достоверно определить степень активности, стадию развития заболевания, характер клеточных реакций в печени.

В качестве теста, характеризующего состояние системы антиэндотоксиновой защиты при хронических вирусных гепатитах В и С, рекомендовано определение антиэндотоксиновых антител.

Обоснована необходимость исследования состояния микрофлоры толстого кишечника- и 12-перстной кишки у больных хроническими вирусными гепатитами В и С для прогнозирования и диагностики сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Установлено влияние препаратов -интерферона, индуктора интерфероногенеза амиксина на микрофлору кишечника и эндотоксин-антиэндотоксиновую систему при хронических вирусных гепатитах В и С.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С состояние микробиоценоза кишечника оказывает влияние на патогенетические процессы. Основным фактором, опосредующим связь между качественным составом микробиоценоза кишечника и морфо-функциональным состоянием печени является эндотоксин грамотрицательных бактерий.

2. Достоверными критериями для определения степени активности, стадии развития и прогноза фиброзообразования у больных хроническими вирусными гепатитами В и С являются выраженность перипортальных, цетролобулярных некрозов, воспаления, фиброз и характер клеточных реакций в печени.

3. Препараты интерферона и индуктор интерфероногенеза амиксин уменьшают выраженность дисбиоза и системной эндотоксинемии у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Внедрение результатов исследовании

Методика морфологической диагностики хронических вирусных гепатитов внедрена на Федеральном уровне методическими рекомендациями Министерства здравоохранения Российской Федерации №2001/124. "Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах", запатентован Российским агентством по патентам и товарным знакам (решение о выдаче патента на изобретение от 25 сентября 2003 года).

Результаты исследований и использованные методики нашли применение в отделениях вирусных гепатитов клиник №1 и №2 городской клинической инфекционной больницы им. проф. Агафонова г.Казани, Республиканской клинической больнице Министерства здравоохранения Республики Татарстан' для диагностики вирусных гепатитов В и С, сопутствующих заболеваний. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на заседании предметно-проблемной комиссии по эпидемиологии, микробиологии и инфекционным болезням КГМУ (2003), на научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консснс)с)" (Москва, 26-27 сентября 2000), представлены на научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (1998, 1999, 2000, 2001) и КГМА (2000), на III Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатит В, С и D: проблемы диагностики, лечения и профилактики" (Москва, 1999), на научно-практической конференции "Инфекционные болезни на рубеже XXI века" (Москва, 2000), на юбилейной конференции Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний" (Казань, 2000), на VI Российско-Итальянской научной конференции "Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика" (Санкт-Петербург, 2000), Республиканской научно-практической конференции "Актуальные вопросы хронических вирусных гепатитов" (Казань, 2002)

Материалы диссертации доложены и обсуждены на пленумах Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 1998; Пермь. 1999), Четвертой и Седьмой Российских конференциях "Гспатология сегодня" (Москва, 1999, 2002),

к

на научно-практической конференции с между народным участием "Современные проблемы диагностики и терапии гепатитов" (Харьков. 2000). на 6-й конференции Международного эндотоксинового общества (Париж. Франция. 2000), международных симпозиумах "Alcohol and Liver"' (Венгрия. Будапешт. 1998), "Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry (Республика Словакия, Братислава. 1998), "Liver Cirrhosis and its Development" (Швейцария, Базель, 1999), "Hepatology 2000" (Мюнхен, Германия, 2000), "Progress in Gastroenterology and Hepatology" (Ганновер, Германия, 2001), "37th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver" (Мадрид, Испания, 2002). "XII Falk Liver Week" (Фрайбург, Германия, 2003)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 54 научные работы, монография, методические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации, получен патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (204 отечественных, 211 иностранных источников). Объем составляет 295 страниц машинописного текста, содержит 34 рисунка, 71 таблицу.

Диссертационные исследования поддержаны грантами НИОКР АН Республики Татарстан № 05 - 22/2000 (Ф), 03-3.5-94/2002(Ф).

Диссертация выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы №737 Министерства здравоохранения Российской Федерации "Снижение инфекционной заболеваемости в условиях социально-экологического неблагополучия".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась на базе клиник №1 и №2 городской клинической инфекционной больницы г.Казани (главврач - В. А. Саматов) в 1997-2003 годах.

Под наблюдением- находилось 168 больных хроническими вирусными гепатитами в возрасте от 15 до 73 лет, из них больных с хроническим вирусным гепатитом В - 45 человек, с хроническим вирусным гепатитом С - 123 человека. Пациенты с острыми вирусными гепатитами В и С (54 человека) обследованы в качестве групп сравнения. Апробация метода полуколичественной оценки морфологически и имму ногистохимически выявленных изменений в биоптатах

печени проведена у 214 больных, из них 132 - с ХГС. 8 2-е ХГВ. Больные микст-гепатитами в группы исследования не включались.

Среди заболевших преобладали люди молодого возраста от 15 до 30 лет (70,23 %). причем пациенты в возрасте от 21 до 30 лет составили почти половину (49,4%) всех больных. Мужчин и женщин было приблизительно поровну (соответственно 48,8 и 51.2%). Для контроля было обследовано 38 здоровых лиц в возрасте 16-60 лет.

Диагноз хронических вирусных гепатитов устанавливался на основе комплекса эпидемиологических и клинических данных, учитывалась продолжительность болезни не менее 6 месяцев. В качестве арбитражного метода диагностики использовались результаты ПЦР-детекции ДНК HBV, РНК HCV, в ряде случаев с генотипированием вируса гепатита С. Диагноз формулировался в соответствии с рекомендациями Европейского конгресса гастроэнтерологов (Рим, 1989) и классификацией, принятой на Всемирном конгрессе гастроэнтерологов (Лос-Анджелес, 1994). По результатам исследования специфических маркеров HBV мы выделяли ХГВ с высокой решшкативной активностью и ХГВ с низкой репликативной активностью (шггегративная фаза).

При постановке диагноза ХГС также учитывалась активность инфекционного процесса. По результатам суммарной оценки HCV РНК, спектра антител к структурным (HCV core) и неструктурным (NS4, NS5) белкам, гистологических данных разграничивались фазы ХГС (латенция, реактивация). Так, лица с суммарными антиНСУ, aHmHCV-NS4 в сочетании с нормальной или с небольшим подъемом ферментативной активностью (АлАТ менее 3 норм) относились к пациентам в фазе латенции ХГС. Лица, у которых обнаруживались антиНСУ IgM, HCV РНК в высокой концентрации в сочетании с увегпгоением уровня АлАТ более 3 норм, относились к пациентам в фазе реактивации ХГС (табл. 1).

Таблица 1

Распределение наблюдаемых больных по нозологическим формам с _учетом фазы течения заболеваний_

Нозологические формы, фазытсчетшя Всего

Абс. число %

Ииршгый гепатит В, в том числе: 45 100,0

Хрошгческий вирусный гепатит В, репликативная фаза 43 95,55

Хронический вирусный гепатит В, интсгративная фаза 2 4,45

Вирусный гепатит С, в том числе: 123 100,0

Хронический вирусный гепатит С, фаза реактивации 98 79,7

Хрошгческий вирусшлй гепатит С, латентная фаза 25 20,3

К)

Основываясь на данных эпидемиологического анамнеза, удалось установить пути заражения у большинства (71,43%) пациентов. При ХГВ наиболее часто (в 24.4% случаев) встречались сведения о семейно-бытовых контактах, приведших к инфицированию. При ХГС среди причин заражения чаще всего (в 26.83% случаев) было внутривенное введение наркотических веществ.

У значительной части пациентов с ХГВ и ХГС заболевание в течение многих лет протекало малосимптомно или бессимптомно. У ряда больных регистрировались изменения биохимических проб печени, носящие различный по времени и выраженности характер. У части больных субъективные жалобы не сопровождались какими-либо объективными симптомами. Наконец, у некоторых больных, чаще всего на поздних сроках болезни, к субъективным жалобам присоединялись стойкие изменения в биохимических анализах и объективные клинические симптомы.

Мы разделили больных ХГВ и ХГС на находящихся в бессимптомной стадии (при отсутствии жалоб и существенных изменений биохимических анализов); субклинической стадии при повышении функциональных проб печени и отсутствии клинической симптоматики; стадии клинических проявлений - при наличии таковых и, в подавляющем большинстве случаев, регистрации отклонений маркеров печеночных функций (табл. 2).

Таблица 2

Критерии диагностики клнннко-лабораторных Сталин хронических внрусных гепатитов В и С

Стадии Признаки

Клинические Биохимические Серологи-ческие маркеры Морфологические

1. Бессимптомная - - + +

2. Субклиническая - + + +

3. Клинических проявлений + + +

Группировка больных по клинико-лабораторным стадиям и анализ полученных данных производилась ретроспективно по результатам динамического наблюдения за больными в течение 6-24 месяцев. В клинической характеристике у 9,3% больных ХГВ в репликативной фазе, у 24% больных ХГС в фазе латенции и 39,8% больных ХГС в фазе реактивации выявлен синдром прогрессирующей астенизации (быстрая утомляемость. снижение трудоспособности, слабость, нарушения сна. отсутствие ощущения утренней свежести, подъем температуры до 37,5°С). Синдром астенизации часто сочетался

с ухудшением аппетита, ощущением горечи во рту. изжогой, появлением поташнивания. чувства тяжести в эпигастральной области, метеоризмом, расстройством стула, тенденцией к похуданию (диспепсический синдром). Сочетание астенического и диспепсического синдромов наблюдалось у 18,6% больных ХГВ в репликативной фазе, у 12,0% больных ХГС в фазе латенции и 2,0% больных ХГС в фазе реактивации. Изолированный диспепсический синдром был диагностирован у одного из двух больных ХГВ в интегративной фазе и у 39,5% больных ХГВ в репликативной фазе, у 40,0% больных ХГС в фазе латенции и 58,2% больных ХГС в фазе реактивации.

Сопутствующая патология со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) наблюдалась у 39 (86%) больных ХГВ и у 102 (83,1%) больных ХГС. Мы проанализировали взаимосвязь сопутствующей патологии ЖКТ и других органов у больных ХГВ и ХГС с разной давностью заболевания (табл. 3). Оказалось, что при давности заболеваний ХГВ и ХГС свыше 5 лет, сопуствующая патология со стороны ЖКТ регистрируется у 100% больных.

Таблица 3

Сопутствующая патология ЖКТ у больных ХГВ и ХГС в зависимости от

давности заболевания

Этиология До 1 года 1-5 лет Свыше 5 лет

Абс.число % Абс. число % Абс.число %

ХГВ п=45 3 50,0 14 82,4 22 100,0

ХГС п= 123 44 70,0 38 90,5 20 100,0

Больные были распределены в группы: не получавшие препаратов интерферона или индукторов интерфероногенеза (1); получавшие амиксин в таблетках по 125 мг по три 4-недельных курса с перерывами по 4 недели, за курс - 10-12 таблеток, первые 2 недели - через 48 часов, далее - через 72 часа (2); леченные неовиром по 250 мг 3 раза в неделю в течение четырех месяцев (3);

получавшые тот или иной препарат (Х-ИФН ("Реальдирон", Литва; "Реаферон", Россия; "Интрон-А", США) 6 месяцев по 3 млн. ME 3 раза в неделю (4);

леченные препаратами ОС-ИФН в указанной дозировке в комбинации с ремантадином по 100 мг ежедневно (5).

Для решения поставленных в работе исследовательских задач концентрацию эндотоксина в периферической крови определяли Limulus amocbocyte lysate - тестом (ЛАЛ-тест) в микрометодс с использованием набора реагентов "E-Toxate" ("Sigma", США). Степень полимеризации и кристаллизации субстрата в опытных и контрольных образцах сравнивали с

известным содержанием стандартного эндотоксина. Результаты выражали в международных эндотоксиновых единицах (ЭЕ/мкл). Напряженность гуморальных факторов антиэндотоксиновой защиты оценивали путем определения концентрации антител к эндотоксину (гликолипид RE 595 S.minnesota - ГЛП), а также к липополисахариду E.coli 014 методом иммуноферментного анализа. Биоактивность фибронектина определяли в тесте связывания желатинированных микрочастиц (Сафина НА и соавт., 1989). Исследования проведены в лаборатории иммунологии и биохимии Казанского НИИЭМ (зав. лабораторией - к.б.н., с.н.с. О. Д. Зинкевич).

Исследование микробного пейзажа толстой кишки проводили в соответствии с методическими рекомендациями, утвержденными МЗ СССР (1986) в модификации С.Д. Митрохина и соавт. (1997). Степень тяжести дисбактериоза толстого кишечника оценивалась по классификации Г.И. Гончаровой и Н.М. Грачевой (1986). Микрофлору дуоденального содержимого изучали по вышеописанным принципам, учитывали наличие и видовую принадлежность выделенных микроорганизмов (Приказ №535 от 22 апреля 1985 г.). Дуоденальное зондирование проводилось по классической методике Мельтцера-Лайона. Микробиологические исследования выполнялись в лаборатории кишечных инфекций Казанского НИИЭМ (зав.лабораторией Баязитова Л.Т.)

Определение ПОПУЛЯЦИИ И субпопуляций лимфоцитов проводили в непрямой реакции им.\гунофлюоресценции с моноклональными антителами серии ИКО НПЦ "Медбиоспектр" (г. Москва). Учет реакции иммунофлюоресценции проводили на проточном цитофлюориметре "FACScan" (Becton Dickinson. USA). Циркулирующие им\гунныс комплексы исследовали методом преципитации полиэтиленгликолем - 6000 по М. Dygcon и др.

(1977). Метаболическую активность нейтрофилов определяли в спонтанном и индуцированном (Serratia marcescens) вариантах НСТ-теста. Исследование факторов клеточного и гуморального иммунитета проводилось в иммунологической лаборатории РЦПБ СПИД совместно с заведующей лабораторией, к.м.н. И.Г. Мустафиным.

Прижизненная пункционная биопсия печени для морфологической диагностики ХГВ и ХГС производилась под контролем УЗИ иглами Менгини в Республиканской клинической больнице Минздрава Республики Татарстан (врач Фатхеева Л.С). Осуществлялось окрашивание препаратов гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону. Иммуногистохимически выявляли: ядерный антиген

пролифсрирующих клеток (PCNA), а-изоформу гладкомышечного актина (а-ГМА). цитокератины 7 и 19 (СК). HLA -DR экспрессир)тощие клетки (HLA-DR). HbsAg, HbcoiAg. В экспериментальной части исследования ткань печени дополнительно окрашивали антителами к десмину.

Совместно с клиническим аспирантом Абдулхаковым СР. был проведен эксперимент по моделированию у белых лабораторных крыс: хронического гепатита путем введения четыреххлористого углерода (ЧХУ), в том числе на фоне применения индуктора интерфероногенеза амиксина; дисбактериоза кишечника с помощью введения в желудок канамицина; системной эндотоксинемии (СЭЕ) внутрибрюшной инъекцией липополисахарида. ЧХУ разводили в оливковом масле и вводили подкожно в область бедра в дозе 0,1 мг/100 г веса два раза в неделю. Развитие дисбактериоза кишечника индуцировали ежедневным введением канамицина сульфата ("Брынцалов А", Россия), растворенного в физиологическом растворе, в желудок через зонд в дозе 1,4 мг/100 г веса животного в течение 2 недель. Амиксин ("Лэнсфарм", Россия) растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам per gaster через зонд в дозе 0,2 мг/100 г веса животного три раза в неделю. Высокоочищенный лиофилизированный липополисахарид E.coli O111 (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) инъецировали внутрибрюшинно в 1 мл стерильного физиологического раствора в различных дозировках: 0,5; 2,5; 10; 25 и 50 мг/кг веса животного.

Статистическая обработка цифровых данных производилась на компьютере IBM PC "Pentium" с помощью стандартного пакета программ "Statistika". Использованы критерии Стьюдента (t), Пирсона (х2), (Гублер Е.В., 1978; Болыиев Л.Н., Смирнов Н.В.. 1983). Информативность параметров и диагностические коэффициенты определяли с помощью последовательного статистического анализа Вальда (Гублер Е.В., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Феномен СЭЕ был исследован нами как потенциальный патогенетический фактор при ХГВ и ХГС в сравнении со здоровыми лицами. Для выявления так называемой физиолопгческой эндотоксинемии было обследовано 32 здоровых лица, у которых в периферической крови был обнаружен ЭТ в ЛАЛ-тесте в 10 (31.25%) случаях. Показатели СЭЕ колебались от 0,0001 ЭЕ/мкл до 0,163 ЭЕ/мкл (в среднем 0,042±0,012 ЭЕ/мкл).

У больных вирусными гепатитами СЭЕ - существенно более распространенное явление. В таблице 4 представлены результаты определения величины и частоты СЭЕ в зависимости от этиологии и формы заболевания. ХГВ характеризуется более интенсивной СЭЕ по сравнению с другими заболеваниями (3.02+0.66 ЭЕ/мкл). хотя чаще всего (83,8%) ЭТ обнаруживался в крови пациентов с ХГС.

Таблица 4

Частота н выраженность СЭЕ у здоровых лиц и больных вирусными

гепатитами различной этнологии, формы

СЭЕ Здоровые п=32 ОГВ (11=33) ОГС Гп=2П ХГВ (п=43) ХГС (п=83) Достоверность, р

1 2 3 4

Частота, % 31,25 81,25* 80,0* 69,0* 83,8* 3^» р<0,05

Выраженность, ЭЕ/мкл 0,042± 0,012 1,0± 0,41 0,30± 0,09* 3,02± 0,66* 0,99± 0,25* 1-3 р<0,01; 2-3;2-4;3-4 р<0,05

Примечание. * Показатели, достоверно отличающиеся от \ровня здоровых лиц (р<0,05).

Для подтверждения тезиса об участии ЭТ в патологических процессах при ХВГ мы исследовали взаимосвязь СЭЕ и различных характеристик заболевания. Результаты исследования СЭЕ в сопоставлении с данными ПЦР - диагностики приведены на рисунке 1.

У больных ХГВ при отрицательных результатах ПЦР ЭТ в крови не определялся ни в одном случае, при положительных результатах - СЭЕ выявлялась у 70,97% больных и составляла 2,99+1,23 ЭЕ/мкл. Максимальная выраженность 7,256±4,434 ЭЕ/мкл и частота (100%) СЭЕ у больных ХГВ наблюдались при активной репликации вируса (5+). У больных ХГС достоверных различий в частоте обнаружения и выраженности СЭЕ в зависимости от уровня репликации ИСУ мы не обнаружили.

В таблице 5 представлены данные СЭЕ в зависимости от стадии заболевания. Видно, что при ХГВ СЭЕ ассоциирована с клиническими обострениями, а также со стадией, когда регистрируется повышение цитолитических ферментов. При ХГС такой связи не выявлено.

ХГВИЦР(-) ХГС ГЩР (-)

Рис. 1. СЭЕ у больных хроническими вирусными гепатитами в зависимости от ПЦР-детекцни ДНК НВУII РНК НСУ.

Примечание. Заштрихованная часть диаграммы - доля больных (%), в крови которых выявляется ЭТ.

Таблица 5

Выраженность системной эндотокспнемип у здоровых лиц и у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в зависимости от клинико-лабораторной стадии заболевания

Стадии СЭЕ V здоровых лиц СЭЕ V больных ХГВ СЭЕ у больных ХГС

Выраженность, ЭЕ/мкл Частота, % Выраженность, ЭЕ/мкл Частота, % Выраженность, ЭЕ/мкл Частота, %

(.Бессимптомная 0,042+0,012 31,25 0,138± 0,042* п=27 82,9 0,834±0,384* п=27 90,4

2.Субкли-ническая 3,717± 1,890* п=9 88,2 0,248±0,068* п=48 79,4

3. Клинических проявлений 5,01±4,19 п=7 100 1,71±0,65* п=8 87,5

Достоверность, р 1-2 р<0,05 1-3 р<0,05 2-3 р<0,05

Нримечашге. * Показатели, достоверно отличающиеся от уровня здоровых лиц (р<0,05).

Естественным был наш интерес к возможной обусловленности синдрома цитолиза (по уровню Ал АТ) влиянием СЭЕ. Как выяснилось, при ХГВ увеличение активности АлАТ в крови сопровождается нарастанием частоты и выраженности СЭЕ (р<0,05). При нормальных показателях АлАТ были зарегистрированы самые низкие уровень и частота СЭЕ (0.10+0.026 ЭЕ/мкл, 60%), при- повышении АлАТ до 3-х норм выраженность СЭЕ составила 2,74+1,18 ЭЕ/мкл, при увеличении АлАТ свыше 3-х норм выраженность и частота СЭЕ были максимальными 4,01+1,99 ЭЕ/мкл (80,0%). В случае ХГС не наблюдалось достоверных тенденций.

Нами также было проверено предположение о том, что существует связь между уровнем ЭТ в крови и показателем синдрома холестаза. Даже в случаях незначительного (до 2,5 раз от уровня здоровых лиц) увеличения общего билирубина у больных ХГВ наблюдалась достоверно более высокая СЭЕ 8,03+3,01 ЭЕ/мкл. У больных ХГС при гипербилирубинемии ЭТ в крови обнаруживался реже, чем при отсутствии холестаза (28,6 и 84,1% соответственно).

Полученные нами данные позволяют утверждать, что СЭЕ является типичным патофизиологическим феноменом при ХГВ и ХГС. Развитию патологических последствий при этом препятствует ряд клеточных и гуморальных факторов, способных связывать ЭТ, главным из которых считают антитела к эндотоксину (АЭА).

У больных ХГВ в стадию обострения клинической картины заболевания наблюдается достоверное снижение АЭА 7,5+1,5 мкг/мл и аМьЕхоН (АЕС) 8,5+2,8 мкг/мл по сравнению со здоровыми лицами и больными, находящимися в бессимптомной стадии. Выяснилось также, что концентрация АЭА у больных ХГВ, имеющих повышенный уровень АлАТ, оказалась ниже 9,7+0.9 мкг/мл и 9.6+2,0 МКГ/МЛ В зависимости от уровня повышения, по сравнению с 12.2+0,8 мкг/мл у лиц с нормальным уровнем АлАТ. Гипербилирубинемия при ХГВ сопровождается снижением АЭА с 11,8+0,7 мкг/мл до 8,4+1,0 мкг/мл. Существенных изменений АЭА у больных ХГС мы не зарегистрировали. Необходимо отметить высокую корреляцию между АЭА и АЕС ^=0,57, р<0,01), которая, вероятно, отражает преимущественно кишечное происхождение ЭТ.

Сложилось впечатление, что при ХГС неспецифические факторы антиэндотоксиновой защиты как клеточные, так и белковые играют более значимую роль, чем АЭА. Об этом говорят высокая активация нейтрофилов в

НСТ-тссте. стимуляция синтеза ^-глобулинов и антител против E.coli в период обострения заболевания, возрастание биоактивности фибронектина у больных ХГС в фазу клинических проявлений и при гиперАлЛТемии.

Для ответа на вопрос о возможной связи СЭЕ с дисбиотическими состояниями и участии ЭТ в формировании сопутствующей гастроэнтерологической патологии у больных ХГВ и ХГС мы исследовали концентрацию ЭТ в периферической крови пациентов с разной степенью дисбактериоза толстого кишечника, наличием или отсутствием микроорганизмов в дуоденальном содержимом, сопутствующих заболеваний ЖКТ (табл. 6).

При увеличении степени дисбиотических изменений толстого кишечника наблюдалось нарастание интенсивности СЭЕ. Выявлена также выраженная тенденция к возрастанию концентрации ЭТ в периферической крови у пациентов, в дуоденальном содержимом которых бактериологически выделены условно-патогенные микроорганизмы. Связь сопутствующей патологии ЖКТ с более высокой СЭЕ у больных ХГВ и ХГС является достоверной: 0,137±0,032 ЭЕ/мкл при наличии и 0,025±0,009 ЭЕ/мкл при отсутствии сопутствующих заболеваний, р<0,05.

Таблица 6

Концентрация ЭТ в периферической крови у больных ХГВ и ХГС в зависимости от выраженности дисбактериоза толстого кишечника, дуоденального содержимого, наличия сопутствующей патологии ЖКТ

Показатель Дисбактериоз толстого кишечника, степень Микрофлора дуоденального содержимого Сопутствующая патология ЖКТ

0 (п=б) 1 (п-12) 2 (п=26) 3 (п=15) не обнаружена (п=8) обнаружена (п=14) не имеется (п=64) имеется (п=47)

ЭТ, ЭЕ/мкл 0,02± 0,013 0,043± 0,02 0,094± 0,031 0,714± 0,265* 0,064± 0,021 0,142± 0,068 0,025+ 0,009 0,137± 0,032*

Р 0,1,2 -3<0,05 р> 0,05 р<0,05

Примечание. * - Показатели, достоверно отличающиеся от уровня здоровых лиц (0,042 ±0,012) ЭЕ/мкл.

Дисбиотические сдвиги, зарегистрированные в содержимом толстого кишечника при хронических формах вирусных гепатитов В и С, могут являться причиной избыточной продукции ЭТ, источником ретроградного инфицирования тонкого кишечника и желчевыводящих путей, а следовательно, фактором развития сопутствующих заболеваний ЖКТ. Однако основной причиной развития СЭЕ является функциональная недостаточность печени.

Для изучения возможного участия ЭТ в патогенетических процессах повреждения и регенерации печени при ХГВ и ХГС у людей нами был разработан метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в ткани печени, который позволяет установить этиологию, степень активности и стадию развития хронических вирусных гепатитов, прогнозировать течение заболевания, выявлять механизмы повреждения и контролировать эффективность терапии. Предлагаемый метод (таблица 7) представляет собой унифицированную балльную систему оценки проявлений альтерации печени. Оценка производится раздельно для внутридольковой дегенерации и некрозов, перипортальных ступенчатых и мостовидных некрозов, портального воспаления. Стадия заболевания оценивается в общепринятом четырехбалльном диапазоне характеристики фиброза.

Таблица 7

Гистологический индекс активности (+/-) 1. Внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы

А. Нет

Б. Слабая (ацидофильные тельца, баллонная

Баллы

0

1

дегенерация и/или отдельные фокусы некрозов в <1/3 долек) В. Умеренная (как " Б " в 1/3-2/3 долек) Г. Выраженная (как "Б" > 2/3 долек)

2. Перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы

А. Нет

Б. Один или несколько "языков" ступенчатых некрозов в

О

3

4

отдельном ПТ В. Как"Б">1ПТ

Г. Ступенчатые некрозы занимают <50% большинства ПТ Д. Ступенчатые некрозы занимают >50% большинства ПТ Е. Как "Д" + септальный некроз Ж. Порто-портальный мостовидный некроз 3. Порто-центральный мостовидный некроз И. Панлобулярный (сливной) некроз 3. Портальное воспаление А. Нет

1 2

3

4

5

6 8 10

* ПТ - чдесь и далее портальный тракт

Б. Слабое (отдельные клетки воспаления в <1/3 ПТ) 1

В. Как"Б'">1/ЗПТ 2

Г. Умеренное (много воспалительных клеток в 1/3 - 2/3 ПТ) 3

Д. Выраженное (плотные воспалительные инфильтраты в > 2/3 ПТ)4 Сумма баллов

Повреждение желчных протоков есть / нет

Пролиферация протоков есть / нет

Дуктопения есть / нет

Иммуногисгохимня (+/-)

1. есть / нет цитоплазма / мембраны гепатоцитов

2. ИБс^ есть / нет ядро / цитоплазма / мембраны гепатоцитов

3. ИСУ есть/нет

4. а-ГМА сосуды / перипортальные клетки / синусоидные клетки

5. РСЧА

A. В гепатоцитах (0-1%, 1-10%, 10-30%, >30%) Б. Клетки воспаления есть / нет

B. Синусоидные клетки есть / нет

6. Цигокерагнны №7 /19 в гепатоцитах есть / нет

7. ША-БИ клетки воспаления / синлеоидные клетки / холангиоциты / гепатоциты

8. NK клетки (среднее кол-во) в ПТ_, в ацин\се_.

Оценивая степень активности, в зависимости от количества баллов может

быть поставлен следующий морфологический диагноз:

а) от I до 3 - хронический гепатит с минимальной активностью процесса;

б) от 4 до 8 - слабовыраженный хронический гепатит;

в) от 9 до 12 - умеренный хронический гепатит;

г) от 13 до 18 - тяжелый хронический гепатит.

Стадия развития заболевания (фиброз/цирроз) оценивалась по следующей шкале:

А. Нет 0

Б. Слабовыраженный (перипортальный) 1

Б. Умеренный [порто-портальные септы (1 и более)] 2 Г. Тяжелый [порто-центральные септы (1 и более)] 3

Д. Цирроз 4

Наиболее существенным, на наш взгляд, представляется включение в протокол арсенала иммуногистохимических методов исследования. В частности, для определения этиологии вирусного гепатита используется реакция с антителами против антигенов вирусов гепатита В и С. По паттерну экспрессии HbsAg, HbcorAg определяется фаза гепатита В, что учитывается при решении вопроса о назначении лечения препаратами интерферонов. Для оценки степени выраженности альтерации, напряженности регенераторного ответа и возможной узловой трансформации печени определяется пролиферативная активность различных типов клеток печени, которую отражает иммуногистохимическое выявление ядерного антигена пролиферирующих клеток - PCNA. Прогностически важным является и иммуногистохимическое выявление альфа-гладкомышечного актина (а-ГМА). Именно этот белок появляется в цитоплазме синусоидных клеток Ито, когда они транедифференцируются в миофибробласты. Последнее является признаком начала синтеза коллагенов и развития фиброза и выявляется до момента морфологически видимых изменений в виде отложения фибриллярных белков в зоне некроза и воспаления Кроме того, иммуногистохимически оценивается выраженность иммунных реакций по экспрессии HLA-DR и активация NK-клеток, что очень важно в случае вирусного повреждения печени. Иммуногистохимическое выявление "холангиолярных" цитокератинов (№ 7 и № 19) является наилучшим критерием оценки состояния желчных протоков.

Метод полуколичественной оценки морфологических и иммуногистохимических изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах В и С позволяет сформулировать диагноз заболевания в полном соответствии с требованиями международной классификации хронических гепатитов (Los Angeles. 1994) с указанием этиологии, фазы, степени активности, стадии развития патологического процесса, а также контролировать эффективность проводимой терапии и, в ряде случаев, прогнозировать риск неблагоприятного исхода заболевания. Для настоящего исследования особое значение приобретает возможность чувствительной и полноценной характеристики особенностей альтерации печени.

При определении с помощью метода последовательного статистического анализа Вальда информативности и диагностической значимости 47 употребляемых в практике симптомов и показателей для диагностики и дифференциальной диагностики ХГВ и ХГС, среди наиболее значимых большую часть составили данные гистологического и иммуношетохимического исследований по разработанном)' нами протоколу (индекс гистологической активности и его компоненты, степень фиброза, выраженность и локализация экспрессии цитокератинов. альфа-гладкомышечного актина). На основании

полученны\ данных сформированы диагностические таблицы, которые могут быть использованы в качестве вспомогательного инструмента для дифференциальной диагностики ХГВ и ХГС межд> собой и с первичным билиарным циррозом

Мы проанализировали взаимосвязь развития СЭЕ с особенностями воспалительно-некротических процессов в печени по данным морфологических исследований (рис. 2). Если по гистологическом) индексу активности в целом не прослеживается взаимосвязь с выраженностью СЭЕ, то при рассмотрении компонентов индекса раздельно выявлена корреляция между альтерацией ацинусов и СЭЕ Нарастание объема некротических процессов в печеночной дольке ассоциировано с увеличением концентрации ЭТ в кровотоке от (0,019±0,006) ЭЕ/мкл при некрозе 0-1 балл до (0,333±0,106) ЭЕ/мкл при некрозе 4 балла, р<0,05. Связь концентрации ЭТ в периферической крови с выраженностью воспаления в портальных трактах и перипортальными некоозами оказалась нелинейной.

Чтобы проверить вероятность ЭТ-опосредованной стим\ляции пролиферации гепатоцитов и транедифференцировки клеток Ито в миофибробласты в ответ на повреждение мы исследовали выраженность СЭЕ в зависимости от уровня экспрессии соответствующих антигенов (PCNA и а-ГМА) в биоптатах печени при ХГВ и ХГС. результаты отражены в таблице 8.

Таблица 8

Уровень СЭЕ у больных ХГВ и ХГС в зависимости от выраженное ги

экспрессии РСОД н а-ГМА в клетках нечени

Показа- Экспрессия РСЫА, % гепатоцитов а-ГМА, локализация

тели 0-1 1-10 >10 Сосуды Перипор-тальиые клетки Синусоидальные клетки Фокальные некрозы Паренхима диффуз-110

1 2 3 1 2 3 4 з

СЭЕ, ЭЕ/мкл 0,013± 0,007 (п=б) 0,142± 0,077 (п=4) 0,119± 0,019 (п=6) 0 (п=3) 0,101± 0,04 (п=10) 0,093± 0,017 (п=4) 0,044± 0,019 (п=4) 0,173± 0,035 (п=4)

Р 1-3<0,01 1-2,3,4<0,05; 2-4<0,05; 4-5<0,05

С нарастанием концентрации ЭТ в крови экспрессия PCNA в гепатоцитах увеличивается (от 0,013±0,007 ЭЕ/мкл при 0-1% гепатоцитов PCNA до 0,119±0,019 ЭЕ/мкл - более 10% PCNA). Также и при появлении миофибробластов (а-ГМА позитивных клеток) вне печеночных сосудов отмечается достоверное увеличение ЭТ в периферической крови больных. Наивысшая концентрация ЭТ ассоциируется с диффузным обнаружением о> ГМА-позитивных клеток внутри дольки (0,17310,035) ЭЕ/мкл.

Исходя из вышеизложенного, можно утверждать, что повреждение печени предопределяет уровень СЭЕ, равно как ЭТ может принимать участие в патогенезе печеночного повреждения и стимулировать регенераторные процессы при хронических вирусных гепатитах.

В соответствии с задачами настоящего исследования для экспериментального выяснения взаимосвязей СЭЕ, состояния микрофлоры кишечника, повреждения и регенерации печени была использована модель хронического токсического гепатита, индуцированного четыреххлористым углеродом.

При морфологической оценке ткани печени оказалось, что через 2

недели введения ЧХУ у всех животных наблюдались внутридольковая дегенерация и фокальные некрозы гепатоцитов. занимающие более 2/3 долек и

соответствующие преимущественно 3-й зоне ацин\са (4 балла в структуре ИГА). Воспалительная инфильтрация портальных трактов и перипортальные некрозы были выражены значительно меньше. При суммарной оценке морфологической картины ИГА составил от 6 до 10 баллов (в здоровой печени показатели ИГА колеблются в пределах 0-3 баллов). Аналогичная картина наблюдалась и через 4 недели введения ЧХУ. Через 2 недели "отдыха' после 4-недельного введения ЧХУ появились признаки восстановления паренхимы печени, хотя ИГА сохранялся в пределах от 4 до 10 баллов, внутридольковые показатели несколько уменьшились и составили 1 -4 балла.

Увеличение числа десмин-позитивных клеток (в печени крыс -нсактивированных клеток Ито) было обнаружено на сроке 2 недели введения ЧХУ и продолжалось вплоть до 4 недель введения препарата. Через 6 недель в I группе животных (4 недели ЧХУ, затем 2 недели *'отдых") количество клеток Ито значительно снижалось, однако экспрессия десмина оставалась выше контрольных показателей. Клетки Ито - основной клеточный тип, который участвует в восстановлении нормальной структуры органа. В то же время увеличение числа активированных клеток Ито - это возможность их транедифференцировки в миофибробласты, которые синтезируют компоненты межклеточного матрикса. Другими словами, это вероятность, того, что хроническое повреждение печени закончится формированием фиброза.

При окрашивании печени опытных животных антителами к а-ГМА, что свидетельствует о миофибробластической транедифференцировке клеток Ито, мы наблюдали увеличение числа позитивных клеток через 2 недели введения ЧХУ. Клетки, экспрессирующие а-ГМА, обнаруживались как в пределах портальных трактов, так и в составе формирующихся септ, берущих начало в области центральной вены. Внутренним положительным контролем при окрашивании антителами к а-ГМА служило выявление гладко-мышечных клеток кровеносных сосудов, содержащих а-ГМА в норме. Через 4 недели введения ЧХУ иммуногистохимическая картина печени практически не изменилась. При окрашивании срезов печени здоровых крыс по Ван Гизону мы наблюдали позитивное окрашивание в области соединительно-тканной капеллы печени, а также в стенке v. centralis и сосудов портальных трактов. Введение ЧХУ в течение 4 недель сопровождалось появлением небольшого количества соединительно-тканных структур, локализующихся вокруг центральной вены и перипортально. Таким образом, можно считать, что введение ЧХУ в течение 4 недель приводит к транедифференцировке клеток Ито в миофибробласты.

однако не сопровождается необратимыми изменениями архитектоники печени и не приводит к накоплению соединительной ткани.

Для оценки регенераторного ответа клеток печени было проведено иммуногистохимическое окрашивание антителами к PCNA. При окрашивании печени контрольных крыс антителами к PCNA обнаруживались единичные позитивно окрашенные гепатоциты. Через 2 недели введения ЧХУ наблюдалось значительное увеличение числа PCNA-позитивных клеток. Окрашивались ядра гепатоцитов и, в меньшей степени, синусоидных клеток. Дальнейшее введение ЧХУ до 4-х недель и последующий "отдых" в течение 2 недель сопровождались относительным снижением числа позитивных клеток, которое, однако, не уменьшилось до нормальных показателей.

При изучении микрофлоры здоровых крыс бактерии не были обнаружены в системном кровотоке, крови портальной вены, паренхиме печени и мезентериальных лимфатических узлах. В тонкой кишке здоровых крыс обнаруживались микроорганизмы 3-6 таксонов, представленные Е. coli (ЮМО5 КОЕ/г), Е. agglomérons (0-Ю4 КОЕ/г), бактериями родов Moraxella (105-108 КОЕ/г) и A Icaligenes (0-106 КОЕ/г), Staphylococcus saprophtticus ( 1 Or-103 КОЕ/г) и Streptococcus haemmUMcm (104 КОЕ/гЦ ^лслотМишшсасйещ^гагнншх крыс выделялось от 3 до 10 таксонов микроорганизмов: Е. coli (ЮМО КОЕ/г). Е. aggtlamewms (10s- 109 КОЕ/г), бактерии родов Moraxella (108-10'° КОЕ/г). Citrobacter (104-105 КОЕ/г), Alcaligenes (106 КОЕ/г), Corynebacterium (10бКОЕ/г). Clostridium (10б КОЕ/г) и Staphylococcus разных видов (102-10* КОЕ/г).

Проведенные исследования показали, что введение крысам ЧХУ приводит к количественным и качественным изменениям кишечной микрофлоры. После двухнедельного введения ЧХУ видовой состав микрофлоры тонкой и толстой кишок уменьшился с 3-10 до 2-3 видов. При этом выделяли несвойственные здоровым животным Candida albicans (104-106 КОЕ/г). Pseudomonas alcaligenes (109 КОЕ/г), штаммы видов Proteus (10s КОЕ/г). У двух из трех животных данной группы обнаружили в мезентериальных лимфо>злах

и 104 КОЕ/г Proteus alcaligenes в печеночной паренхиме. Таким образом, при экспериментальном токсическом гепатите зарегистрированы выраженные дисбиотические нарушения. которые сопровождаются бактериальной транслокацией.

Чтобы подтвердить наличие бактериального компонента в повреждении печени, необходимо было остановить влияние нарушенного состава кишечной микрофлоры на структурное состояние печени. С этой целью были изучены

микрофлора тонкой и толстой кишки крыс, а также морфологические характеристики печеночной ткани на фоне энтерального введения канамицина. приводящего к развитию дисбиотических изменений в кишечнике. Через 2 недели введения препарата в тонкой кишке определялись микроорганизмы 1-3 таксонов: Е. coli (10М05 КОЕ/г). Е. agglomérons (104-109 КОЕ/г), Proteus (106 КОЕ/г). Микрофлора толстой кишки также быта представлена сокращенным числом таксонов (1-2 вида): Е. coli (103 КОЕ/г), Е. agglomérons (104-109 КОЕ/г), Corynebactehum (103 КОЕ/г), B.subtilis (107 КОЕ/г). У одной крысы в даншой группе Enterobacter agglomerans был обнаружен в ткани печени (107 КОЕ/г) и в мезентериальных лимфатических узлах (Ю4 КОЕ/г).

Морфологически после введения канамицина мы наблюдали в печени внутридольковую дегенерацию гепатоцитов, воспаление в портальных трактах, перипортальные ступенчатые и мостовидные некрозы. ИГА составлял от 3 до 4 баллов (в среднем 3,7 балла), преимущественно за счет изменений в перицентральной зоне. Через 2 недели "отдыха" после 2-недельного курса антибиотика гистологическая картина печени практически не изменилась: ИГА составлял от 2 до 5 баллов (в среднем 3,3 балла), также преимущественно за счет перицентральной локализации повреждения. Число десмин-позитивных клеток Ито несколько превышало контрольные показатели через 2 недели введения канамицина и сохранялось на том же уровне в течение последующих 2 недель -"отдыха". Ни в одном случае не было клеток, позитивных при окрашивании антителами к что говорит об отсутствии миофибробластической

транедифференцировки клеток Ито. При окрашивании антителами А к PCNA оказалось, что 2 недели введения канамицина приводят к резкому повышению пролиферативной активности клеток печени.

При однократном внутривенном введении белым лабораторным крысам ЭТ морфологическая структура печени характеризовалась наличием небольшой лимфо-моноцитарной инфильтрации портальных трактов и минимальными изменениями паренхимы печени на сроках от 6 ч до 2 недель после введения ЛПС независимо от концентрации вводимого препарата. На более ранних сроках после введения ЭТ структура печени была идентична нормальной. Иммлногистохимически ЭТ был обнаружен как в синусоидных клетках, так и внутри гепатоцитов. Число десмин-позитивных клеток увеличивалось, начиная с 6 часов после инъекции ЭТ и достигало максимума к 48-72 часам независимо от дозы бактериального ЛПС. В последующем, на сроке 1 неделя, число десмин-позитивных клеток снижалось, однако оставалось выше контрольных

показателей. Число пролиферирующих клеток увеличивалось начиная с 24 часов после введения ЭТ. и достигало максимального значения через 72 часа после введения препарата. PCNA обнаруживался в ядрах гепатоцитов и синусоидных клеток. Ни в одном случае мы не наблюдали появления клеток, позитивным по а-ГМА, в синусоидах печени.

Таким образом на экспериментальный моделях токсического гепатита, дисбактериоза кишечника и СЭЕ у белых лабораторный крыс были продемонстрированы однотипные воспалительно-некротические изменения печеночной ткани, сопровождающиеся выраженным регенераторным ответом, активацией клеток Ито без выраженной миофибробластной транедифференцировки.

Наш интерес привлекла вероятность прямого или косвенного влияния различных методов лечения у больнык ХГВ и ХГС на наличие и выраженность СЭЕ. Результаты анализа концентрации ЭТ в системном кровотоке пациентов до и после курса терапии исследуемыми препаратами приведены в таблицах 9 и 10.

Таблица 9

Показатели СЭЕ и антщндотоксиповых антител у больных ХГВ в

зависимое ги от метода лечения

Показатели Препараты

Патоге1 ¡етическая терапия Амиксин Неовир а-ИФН

До лечения (п=3) После лечения (п=3) До лечения (п=5) После лечения (п=4) До лече- 1П1Я (п=15) После лечения (п=11) До лечения (п=6) После лечеши (п=5)

1.ЭТ, ЭЕ/мл 13,3± 8,29* 8,42± 4,11« 2,68+ 0,34* 1,89+ 0,91 2,53± 1,34* 3,67±1,8 1 7,20± 3,21* 0,02± 0,015

2. АЭА, мкг/мл 8,90± 1,08 10,14± 3,97 11,37± 4,82 13,16± 4,77 9,90± 1,25 9,03± 1,36 14,10± 4,19 17,90± 6,63

р - - - 1 р<0,05

Примечание * Показатели, достоверно отличающиеся от уровня здоровых лиц

У больных ХГВ курс интерферонотерапии сопровождался достоверным снижением средней выраженности СЭЕ на фоне тенденции к росту АЭА. Необходимо отметить, что использование амиксина также характеризовалось тенденцией к снижению частоты и выраженности СЭЕ у больнык ХГВ, так что средний уровень концентрации ЭТ в крови пациентов после лечения существенно не отличался от уровня здоровых лиц.

При ХГС статистически значимых изменений у ровня СЭЕ нам выявить не удалось. Практически при всех видах терапии отмечалась тенденция к росту концентрации АЭА.

Таблица 1»

noK-aiaie.ni СЭЕ и ангиэндотокснновых антител у больных ХГС н

зависимости от метола лечения

Пока- Препараты

затели 11атогеиети- Амиксин Неовир а-11ФМ а-ИФН+

ческая терапия ремантадин

До Пос- До Пос- До Пос- До Пос- До Пос-

лече- ле- лече- ле- лече- ле- лече- ле- лече- ле-

ния лече- Ш1Я лече- ния лече- ния лече- ния лече-

(п=7) ния (п=6) НИЯ (п=33) ния (п=8) ния (п=5) ния

(п=4) (п=3) (п=25) (п=6) (п=4)

1.Эт, 0,11 + 0,2 3± 0,71± 0,34± 1,38+ 3,22± 0,09± 0,67± 0,29+ 0,36±

ЭЕ/мл 0,07 0,14 0,38 0,19 1,21 2,17 0,04 0,49 0,18 0,21

2. АЭЛ, 13,20± 14,19± 12,53+ 15,07± 13,84± 14,30± 10,96± 16,90± 11,64± 13,39±

мкг/мл 1,92 3,87 3,31 4,82 2,34 2,49 2,30 4,27 3,12 3,74

Для изучения влияния различных методов лечения на состояние

симбионтной микрофлоры кишечника проанализированы микробиологические характеристики содержимого толстой кишки и дуоденального содержимого (табл. 11, 12).

Таблица И

Днсбнотические изменения толстого кишечника и дуоденального

содержимого у больных ХГВ в зависимости от метода лечения

Показатель Патогенетичес- Амиксин Неовир а-ИФН

кая терапия

До После До После До После До После

лече- лече- лече- лече- лече- лече- лече- лече-

ния ния Ш1Я Ш1Я ния ния ния ния

Степень дисбиоза 1,64± 1,29± 1,73+ 1,01± 1,44+ 1,30± 2,50+ 2,14±

толстого 0,24 0,32 0,26* 0,14* 0,33 0,21 0,54 0,29

кишечник, ед (п=11) (п=10) (п=9) (п=9) (п=14) (п=14) (п=6) (п=6)

Частота 50,0% 50,0% 66,7% 33,3% 50,0% 42,8% 33,3% 33,3%

обнаружения микрофлоры в (п=4) (п=4) (п=3) (п=3) (п=8) (п=7) (п=3) (п=3)

дуоденальном

содержимом

Примечание.* Величины, достоверно отличающиеся друг от друга, р<0,05.

Уменьшение средней степени дисбиотических сдвигов в толстой кишке при амиксинотерапии от 1,73+0.26 д0 1,01 ±0.14 при ХГВ и от 1.97+0.21 до 1,и±0,19 при ХГС. (р<0,05); тенденция к уменьшению частоты обнаружения микроорганизмов в содержимом двенадцатиперстной кишки дает основание говорить о положительном эффекте этого препарата на микрофлору желудочно-кишечного тракта.

Таблица 12

Дисбпотнчсскне изменения толе 101 о кишечника п дуоденальною содержимого у больных ХГС в зависимости от метода лечения

I Указатель Патогенетическое лечение Амиксин Неовир а-ИФН

До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения До лечения После лечения

Степени дисбиоза толстого кишечника, ед 2,28± 0,34 (п=6) 2,39± 0,41 (п=6) 1,97± 0,21* (п=]8) 1,14+ 0,19* (п=17) 2,00± 0,15 (п=24) 1,97± 0,27 (п=22) 2,16± 0,23 (п=9) 2,31± 0,37 (п=7)

Частота обнаружения микрофлоры в дуоденальном содержимом 40,0% (п=5) 60,0% (п=5) 60,0% (п=5) 20,0% (п-5) 71,4% (п=14) 66,7% (п=12) 66,7% (п=6) 80,0% (п=5)

Примечание. * Величины, достоверно отличающиеся друг от друга р<0,05.

Таким образом, терапия с использованием препаратов а-ИФН способствует купированию СЭЕ, выработке АЭА. Амиксин уменьшает степень дисбактериоза толстой и тонкой кишок и также способствует антиэндотоксиновой защите у пациентов с ХГВ и ХГС.

При проведении эксперимента по моделированию токсического гепатита, индуцированного ЧХУ, нами получены сведения, подтверждающие благотворное влияние амиксина на микробиоценоз и состояние печени при экспериментальном гепатите, индуцированном четыреххлористым углеродом. В группе животных, получавших амиксин на фоне введения ЧХУ, при исследовании на сроке 4 недели (2 недели ЧХУ, 2 недели ЧХУ с амиксином) мы не наблюдали полного отсутствия бактерий в содержимом кишечника, хотя разнообразие микроорганизмов, заселяющих кишечник, значительно уменьшилось. Последующее введение амиксина в течение 4 недель привело к восстановлению состава микрофлоры практически до контрольных показателей.

Показатели морфологической картины печени у животных, которым вводился амиксин, позволяют утверждать, что введение амиксина в сочетании с ЧХУ не влияет на степень повреждения печени. При этом поддерживается число активированных клеток Ито на уровне необходимом для полноценной регенерации печени. Через 4 недели после начала эксперимента в гр\ппе. получавшей ЧХУ 2 недели, затем ЧХУ в сочетании с амиксином 2 недели.

отмечено незначительно меньшее количество а-ГМА по сравнению с группой, не получавшей амиксина. Возможно, это связано со способностью ИФН ингибировать транедифференцировку клеток Ито в миофибробласты. Введение амиксина (как в сочетании с ЧХУ, так и после 4-недельного введения ЧХУ) никак не отражалось на процессах накопления соединительной ткани, по-видимому, не влияло на пролиферативную активность клеток печени. Следовательно, действие амиксина морфологически проявляется регуляцией1 процессов фиброзообразования.

Таким образом, полученные нами факты свидетельствуют о значительной роли нарушений микроэкологии человека, проявляющихся дисбиотическими реакциями толстой и тонкой кишок, в формировании- патогенетических механизмов альтерации и регенерации печени. Подтверждением этой гипотезы служит выявление тесной взаимозависимости микробных сообществ кишечника и характера клеточных реакций в печени при повреждении на экспериментальных моделях гепатита, дисбактериоза и системной эндотоксинемии. Существенным фактором, опосредующим влияние дисбактериоза на состояние печени, является эндотоксин грамотрицательных микроорганизмов. Обладая уникальной биологической полипотентностью, ЭТ принимает участие в патогенезе многих патологических феноменов, наблюдающихся при ХГВ и ХГС. Вирусная репликация, цитолиз, гипербилирубинсмия, клиническая манифестация астенического и диспептического синдромов у больных ХГВ и ХГС взаимосвязаны с эндотоксинемией. Частота и выраженность эндотоксинемии напрямую ассоциированы с выраженностью внутридольковых повреждений в печени и регенераторной пролиферацией гепатоцитов. Методы лечения хронических вирусных гепатитов В и С с использованием препаратов се-интерферона и индуктора интерфероногенеза амиксина оказывают нормализующее действие на микробиоценоз кишечника и уменьшают выраженность системной эндотоксинемии.

Выводы

1. Для хронических вирусных гепатитов характерна системная эндотоксинсмия, которая обнаружена у 69,0% больных хроническим вирусным гепатитом В и 83,8% больных хроническим вирусным гепатитом С, что превышает показатели здоровых лиц (31,25%).

2. При хроническом гепатите В выраженная клинико-лабораторная активность заболевания сопровождается увеличением частоты системной

эндотоксинемии до 100% и уменьшением концентрации антиэндотоксиновых антител, развитием дисбиотическич реакций в кишечнике, снижением иммунорегуляторного индекса, увеличением числа CD72+. изменением концентрации сывороточных иммуноглобулинов.

У больных хроническим вирусным гепатитом С отсутствует прямая зависимость системной эндотоксинемии от клинико-лабораторных показателей и репликации вируса.

3. Развитие сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта у 84.1% больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопровождается контаминацией содержимого 12-перстной кишки (79,4%) условно-патогенной флорой и нарастанием интенсивности системной эндотоксинемии (0,137±0,032 ЭЕ/мкл) по сравнению с (0,042±0,012 ЭЕ/мкл) у здоровых лиц.

4. При экспериментальном дисбактериозе, вызванном канамицином, и при гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, у лабораторных крыс наблюдаются: фокальные и мостовидные некрозы, лимфоцитарная воспалительная инфильтрация, активация клеток Ито без миофибробластной транедифференцировки, значительное увеличение числа клеток, экспрессирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток, бактериальная транслокация.

5. При дифференциальной диагностике хронических вирусных гепатитов В и С, первичного билиарного цирроза наиболее высокой информативностью (J более 1,0) среди морфологических признаков обладают показатели раздельной оценки компонентов индекса гистологической активности (перипортальные. центролобулярные. воспалительные изменения), фиброз, реакция желчных протоков, экспрессия альфа-гладкомышечного актина.

6. Выраженность системной эндотоксинемии при хронических вирусных гепатитах В и С зависит от объема и глубины внутридольковых повреждений печени (при оценке интралобулярных некрозов в 1 балл индекса гистологической активности - 0.019±0,006 ЭЕ/мкл, при оценке в 4 балла О,333±О,1О6 ЭЕ/мкл) и не имеет прямой зависимости от степени перипортальных некрозов и воспалительной реакции в печени.

7. Препараты -интерферона, амиксин при лечении больных хроническими вирусными гепатитами В и С уменьшают выраженность диспепсического синдрома, приводят к снижению интенсивности СЭЕ. Амиксин оказывает нормализующее действие на микробиоценоз кишечника.

8. Амиксин в экспериментальной модели хронического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом, у белых крыс способств\ст восстановлению микрофлоры кишечника, нормализации морфологической картины печени.

Практические рекомендации

1. Для морфологической диагностики хронических вирусных гепатитов рекомендуется использовать разработанный нами способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени.

2. Рекомендуется использовать предложенную диагностическую таблицу для дифференциальной диагностики хронических вирусных гепатитов В, С и псрв1гчного билиарного цирроза.

3. Для оценки состояния системы антиэндотоксиновой защиты у больных хроническими вирусными гепатитами В и С рекомендовано исследование антиэндотоксиновых антител.

4. Рекомендуется исследование микрофлоры толстой и 12-перстной кишок у больных ХГВ и ХГС для профилактики и своевременного лечения сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта.

5. В комплексной терапии ХГВ и ХГС рекомендуется использовать амиксин по 125 мг через 48 часов в течение 2 недель, затем - через 72 часа еще 2 недели, тремя 4-недельными курсами с перерывом по 4 недели, а также неовир -по 250 мг 3 раза в неделю в течение 4 месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Проблемы вирусного гепатита В в городе Набережные Челны // Материалы научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры инфекционных болезней КГМУ.-Казань, 1995. - С. 15-16. (Соавт. Макарова М.В.)

2. Инфицировашюсть вирусным гепатитом В населения г. Набережные Челны // Материалы международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями".- Санкт-Петербург, 1995.-С.92. (Соавт. Макарова М.В.)

3. Инфицировашюсть вирусными гепатитами В и С и особенности генотипического фона у пациентов центров гемодиализа // Гепатит В, С и Д - проблемы изучения, диагностики, лечения и профилактики. Материалы Российской научно-практической конференщо!. 1995. - С. 129. (Соавт. Еналеева Д.Ш., Курмышкин АА, Макарова М.В., Мухамстзянов И.Ш.)

4. Клеточные реакции при хронических заболеваниях печени человека // Тезисы научно-практической конференции.- Казань: КГМУ, 1997. - С. 14. (Соавт. Гумерова А.А., Фатхсева Л.С., Киясов А.П.)

5. Отсутствие миофибробластической трансформации кчеток Ито на фоне жировой дастрофии гепатоцитов // Современные методы исследования в кпинике и

• жсперимеше. Материалы научной конференции, посвященной ЗЗ-.юшю Ш1ИЛ КГМУ -Казаю>, 1997. -41.- С.50. (Соавт. Киясов Л.П., Г\мсрона Л.Л., Фатхссва Л.С.)

6. Использование иммуногисточимическич методой дчя прогнозирования исходов хронических 1снатитов // Гепатиты В, С, D, G - проблемы диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов П Российской научно-практической конференции с международным участием. - Москва, 1997.- С.94. (Соавт. Киясов Л.П.. Фатхесва Л.С, Гумерова АА., Одинцова А.Х., Анохин ВА)

7. Иммунокорригирующее влияние ксимедона при вирусных гена гитах // Там же.

- С. 225. (Соавт. Фазылов В.Х., Фазульзянова А.И., Еналеева Д.Ш.)

8. Альфа-гладкомышечный актин-фенотипический маркер активированных клеток Ито печени человека // "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины'". Материалы конференции молодых ученых России с международным участием, посвященной 240-летию ММА им.И.И.Сеченова.- Москва, 1998.- С. 94. (Соавт. Гумерова АА., Фатхеева Л.С, Киясов А.П.)

9. Активация перисинусоидальных клеток (клеток Ито) у больных с хроническим повреждением печени // Российский гастроэнтерологический журнач.-1998.- № 20. - С.83

- 84. (Соавт. Абдулхаков СР., Кгасов А.П., Абдулхаков Р.А.)

10. Гептрал в комплексной терапии больных хроническими вирусными гепатитами В и С, страдающих наркоманией // Инфекционные болезни: новое в диагностике и терапии. Тезисы докладов научной конференции. - Санкт-Петербург, 1998. - С 86. (Соавт. Загидуллина А.И., Еналеева Д.Ш.)

11. Состояние микрофлоры кишечника и желчи у больных различными формами вирусных гепатитов В и С // Ш научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ. - Казань, 1998. - С.53. (Соавт. Ткачева СВ., Баязитова Л.Т.)

12. Опыт применения отечественного индуктора интерферона неовира в лечении больных различными формами вирусных гепатитов В и С // Гепатит В, С, D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. Тезисы докладов Ш-й Российской научно-практической конференции с международным участием. - Москва, 1999.- С. 13. (Соавт. Бакеев Д.В., Еначеева Д.Ш., Фазылов В.Х., Загидуллина А.И., Ткачева СВ.)

13. Иммуногистохимические критерии дифференцированной диагностики хронических заболеваний печени //Там же. - С.213. (Соавт. Фатхеева Л.С, Гумерова АА, Бакеев Д.В., Еналеева Д.Ш., Киясов А.П.)

14. Нарушение микробиоценоза кишечника и желчи при вирусных гепатитах В и С // Там же. - С. 225. (Соавт. Ткачева СВ., Фазылов В.Х., Баязитова Л.Т.)

15. Изменения перисинусоидальных клеток (клеток Ито) в ответ на однократное введение эндотоксина // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатолопш, колопроктологии. - 1999. - Т. 9, № 1.- С 78. (Соавт. Абдулхаков СР., Киясов А.П., Салахов И.М., Яковлев М.Ю.)

16. Пересинусоидальный клетки Ито в эмбриональном гистогенезе и регенерации печени человека // Российский журнал гастроэнтерологии и, гепатолопш, колопроктологии. -1999. - Т. 9, № 1.- С.109. (Соавт. Киясов А.П., Гумерова А.А)

17. Опыт применения индуктора интерфероногенеза амиксин в лечении больных хроническими вирусными гепатитами В и С (сравнительное эксперименталыю-клиническое исследование) // Материалы научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)". Сателлитный симпозиум фармацевтической компашш "ЛЭНС-ФАРМ". - Москва, 2000.- С. 8 - 30. (Соавт. Еналеева Д.Ш., Бакеев Д.Н., Ткачева СВ., Гайфуллииа Э.Г., Хайрутдинова Э.И., Киясов А.П., Абдулхаков СР., Фазылов В.Х., Лченов М.Н., Турьянов М.Х.)

18. Имлпиные 1>еакции при печени при хронических гематитахразличной -ггиологии // Актуальные проблемы инфеклиошюй патологии. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию клинич. инфекн. большим № 1 им. А ФАгафонова- Казань, 2000. - С. 66. (Соавт. Гумерова АА, Киясов А.П., Минсафииа АР., Фатхеева Л.С.)

19. Вир> специфическая Т-клеточная реакнця в прогнозировании угрозы хронизалци и результатов интерферонотерапии у больных острым гепатитом С // Там же. - С. 112 - 113 (Соавт. Соболевская О.Л.)

20. Значение лшкрофлоры и колонизационной резистентности слизистой полости рта у больных хроническими воспалительными заболеваниями пародонта на фоне вирусных гепатитов // Там же. - С. 236 - 237. (Соавт. Фазылова Ю.В., Еналеева Д.Ш., Хитров В.Ю.)

21. Состояние местного и системного иммунитета у больных парентеральными вирусным гепатитами // Инфекционные болезни на рубеже XXI века. Материалы научно-практической конференции.- Москва, 2000. - ч. I. - С. 57 - 58. (Соавт. Фазылова Ю.В., Бакеев Д.В., Созинова Ю.М.)

22. Использование опросника NTODK-LTD дчя оценки качества жизни у больных хроническими вирусными гепатитами // Там же.- С. 48. (Соавт. Созинова Ю.М., Фазылов В.Х.)

23. Однократная эндотоксиновая агрессия вызывает дозонезависимую обратимую активацию клеток Ито печ«ш крыс без транедифференцировки их в миофибробласты // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - №10.- 2000. - С. 449-452. (Соавт. Салахов И.М., Абдулхаков СР., Киясов А.П., Лысова Н.Л., Яковлев М.Ю.)

24. Морфологическое обследование в диагностическом комплексе больных хроническими вирусными гепатитами // Современные проблемы диагностики и терапии гепатитов. Материалы научно-практической конференции с международным участием, Харьков, 2000. - С. 10-11. (Соавт. Бакеев Д.В., Еналеева Д.Ш., Фатхеева Л.С, Гумерова АА, Гайфуллина Э.Г.)

25. Исследование качества жизни у здоровых лиц с помощью опросника "NTÖDK -LTD" // Материалы Всероссийской конференции с международным участием "Исследование качества жизни в медицине". - Санкт-Петербург, 2000. - С. 129 - 130. (Соавт. Созшюва Ю.М., Фазылов В.Х.)

26. Участие эндотоксина в процессах повреждения/репарации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Материалы второй научно-практической конференции, посвященной памяти Заслуженного деятеля науки РФ, профессора Л.И.Геллера. - Хабаровск, 2001.- С 215-224.

27. Функциональная активность факторов, связывающих эндотоксин, при хронических вирусных гепатитах В и С // ЖМЭИ. - 2001. - №6.- С. 56 - 59. (Соавт. Алиховская ИА, Еналеева Д.Ш., Зинкевич О.Д., Лиходед В.Г., Салахов И.М., Ткачева СВ., Яковлев М.Ю.)

28. Продукция антител к представителям микрофлоры толстого кишечника у болыгых вирусными гепатитами В и С // Каз. мед. журнал.-2001.- № 3. - С. 176 -180. (Соавт. Ткачева СВ., Баязитова Л.Т., Зинкевич О.Д., Сафина НА, Гайфуллина Э.Г., Еналеева Д. Ш.)

29. Системная эндотоксинемия у здоровых людей // Тезисы XVHJ съезда физиологического общества им. И.П. Павлова.- Казань, 2001.- С. 427 - 428.

30. Изменение качества жизни при хронических вирусных гепатитах В и С // Гепатит В, С и D: проблемы диагностики, лечения и нп^гсгатг^^^^ЩДадов IV

I ° БИБЛИОТЕКА {

I СЛ1т*Си>г J

\ оа кз и» }

Российской научно-практической конференции. - Москва, 2001. - С.326 - 327. (Соавт. Собинова Ю.М., Фазылов ИХ.)

31. Особенности течения хронических вирусных гепатитов 13 и С // Там же. - С. 322 - 323. (Соавт. Фазульзянова А.И., Хусаинова Ф.М., Мокии М.И., Киясов АН.)

32. Системная эндотоксинемия при хронических вирусных гепатитах //Там же. -2001.-С323-324.

33. Взаимосвязь системной эндотоксинемии и иекро-воспалительных изменений в печени при хронических вирусных гепатитах // Там же.- С. 325. (Соавт. Фатхеева Л.С.)

34. Патогистологическая диагностика хронических вирусных гепатитов. Методические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации-Казань, 2001. - 16 с. (Соавт. Киясов А.П., Гумерова А.А., Фатхеева Л.С, Петров СБ.)

35. Морфологические и иммуногистохимические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии развития хронических вирусных гепатитов В и С // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. -№1-2. - 2002.- С 157 - 160. (Соавт. Киясов А.П., Гумерова АА, Фатхеева Л.С, Петров СБ.)

36. Сравнительная характеристика различных методов противовирусного лечения хронических вирусных гепатитов В и С// Медико-фармацевтический вестник Татарстана. -№43 (85). - 20.12.2002.-С 13.

37. Выявление NS3-airrareHa вируса гепатита С в печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы 7-й Российской конференции.- 2002. - Т. 12, № 1. - С. 9. (Соавт. Киясов А.П., Гумерова АА, Фатхеева Л.С, Гайфуллина Э.Г.)

38. Системная эндотоксинемия желудочно-кишечного тракта у больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Микроэкология матери и ребенка, принципы диагностики и лечения. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры детских инфекционных болезней КГМУ.-Казань, 2002. - С. 27 - 28 (Соавт. Ткачева СВ., Еналеева Д.Ш.)

39. Кишечная микрофлора и сопутствующие заболевания желудочно-кишечного тракта у больных хроническими вирусными гепатитами В и С // ЖМЭИ.- 2002. - №1.-С 61 - 64. (Соавт. Аниховская ИА, Баязитова Л.Т., Еналеева Д.Ш., Зинкевич О.Д., Сатахов И.М., Ткачева СВ., Лиходед В.Г.)

40. Предикторы эффективности лечения хронического вирусного гепатита С // Нижегородский медицинский журнал. - 2002.- №2. - С. 24 - 29. (Соавт. Бакеев Д.В.)

41. Системная эндотоксинемия при хронических вирусных гепатитах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - №2. - С. 183-185.

42. Возможность участия эндотоксина грамотрицательных бактерий в патогенезе повреждешш печени при вирусных гепатитах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - №3. - С 327 - 330.

43. Микрофлора кишечника крыс в условиях хронического токсического поражешы печени // ЖМЭИ. - 2002. - №3. - С. 60 - 63. (Соавт. Поздеев O.K., Лапшина Г.Н., Шулаева М.П., Абдулхаков СР., Киясоз А.П.)

44. Опыт применения индукторов интерфероиогенсза амиксина и неовира в лечешш больных хроническими вирусными гепатитами В и С // Казанский медицинский журнал. -2002. -№4. - С. 286 - 289. (Соавт. Бакеесв Д. В.)

45. Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах // Приоритетная справка но заявке на патент РФ №017711 от 24.06-2002 (соавт. Киясов А.П., Гумерова АА, Фатхеева Л.С)

46. Альтерация печени при экспериментальном дисбиоче крыс // Бюллетень •экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 136, №7. - С 23 - 26. (соавт.Абдулчаков С.Р . Киясов А . П., Гумерова АА.)

47. Хронические вирусные гепатиты В и С- М.: Медпресс- 2003. -144 с. (соавт. Еналеева Д.Ш., Фачылов В.Х.)

48. Оценка 'эффективности различюлх методов противовирусной терапии при ХГВ и ХГС // Материалы VI Российского съезда врачей-инфекционистов. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 121. (соавт. Еналеева Д.Ш., Бакеев Д.В.)

49. Expression of cytokeratin 7 in chronic aecochol liver // Austrian - Hungarian -Slovakian Falk Symposium "aicochol and liver Abstracts". - 1998. - P.31. (Соавт. Abdulchakov S., Kiassov A., Abdulchakov R.)

50. Peresinusoidal cell proliferation and activation in liver regeneration // Liver Cirrhosis and its Development. Abstracts. - 1998. - P. 3 (Соавт. Abdulchakov S., Gunerova A., Kiassov A.)

51. Desmin and Asmooth actin in normal and damaged human liver // Liver Cirrhosis and its Development. Abstracts. - 1998. - P. 16 (Соавт. Gumerova A., Kiassov A., Minsafina A., TuneginaN.)

52. Activation of Ito cells in alcocholik liver disease // "Progress in basic, applied in basic, applied and diagnostic histochemistry" Abstract book of International Symposium. -Bratislava. - 1998. - P. 39 (Соавт. Abdulchakov S., Kiassov A., Abdulchakov R.)

53. Relations of endotoxinemia indices and clinico-laboratory features in patients with chronical virus hepatitis // The Bulletin of CDS. -2000. - vol.2.- Special supplement for IES-2000. - P. 7 - 8. (Соавт. Tkacheva S., Anikhovskaya I.,Zinkevich O., Salachov I., Safma N., Yakovlev M.)

54. Immunohistochemical investigations in diagnostic and forecasting of chronic hepattis // XI th International congress ofHistochemistry and Citochemistry, York, UK. -. 2000. - P. 83. (Gumerova A., Kiassov A., Minsafina A., Fatcheeva L.)

55. Peculiarities of liver regeneration and hepatic cell activation in experimental intestinal dysbiosis // "State-of-the-art of Hepatology: Molecular and Cell Biology". ХП Falk liver week Abstract of Symposium №138.- Freiburg. -2003. -P. 67 (Соавт. Abdulchakov S., Kiassov A.)

*-*47в

Подписано в печать 25.02.2004 Бумага офсетная 60x84/16 Ризография Объем 2,0 усл.-печ. л. Тираж 100 Заказ №23

420012, г. Казань, Бутлерова, 49, типография КГМУ

Актуальность проблемы

В настоящее время хронические вирусные гепатиты В и С (ХГВ и ХГС) представляют актуальную медико-социальную проблему в связи с широким их распространением, возможностью развития серьезных осложнений, значительным экономическим ущербом (Шаханина И.Л., 2002), нерешенностью многих вопросов противовирусной терапии, ее недостаточной эффективностью и высокой стоимостью. Более 350 млн. человек в мире являются хронически инфицированными вирусом гепатита В (Поляков А., 1999), около 300 млн. - хроническими носителями вируса гепатита С (Шерлок Ш., 1999). Цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома, развивающиеся в исходе хронического гепатита В и С, входят в десятку наиболее частых причин смерти (РигсеП Я., 1993; Эауеу Б., 1996). Ежегодно от патологии, связанной с вирусными гепатитами, на земном шаре умирает более 1 млн. человек (Онищенко Г.Г., 2002).

В настоящее время доминирует представление о вирусах гепатитов В и С как возбудителях, которые способны длительно, в ряде случаев пожизненно, персистировать в организме человека. Традиционный сценарий хронических вирусных гепатитов В и С с исходом в цирроз или гепатоцеллюлярную карциному предполагает наличие острой фазы, многолетнего латентного периода, тяжелой органной патологии, летального исхода, т. е. характерных этапов медленных инфекций (Турьянов М.Х., 1999). Однако заболевание может протекать практически бессимптомно, инапарантно или напротив стремительно завершаться фатальным исходом фульминантного гепатита, отличаться проявлениями холестатического синдрома или выраженной внепеченочной манифестацией при отсутствии признаков поражения печени (Соринсон С.Н., 1996; Шерлок Ш. и соавт., 1999; Воробьев О.В., 2000; Ивашкин В.Т. 2000).

Объяснить многообразие клинических форм и вариантов течения вирусных гепатитов В и С только особенностями генотипов вирусов НВУ и

HCV не удается (Апросина З.Г. и соавт., 1995; Лопаткина Т.Н., 1997; Майер К.П., 2000; Абдурахманов Д.Т., 2002). Существенную роль в формировании патогенетических основ повреждения печени и вирусной инфекции в целом безусловно играют как защитные, так и повреждающие факторы эндогенной природы.

В качестве одного из патогенетических факторов, способных вызвать многочисленные клинико-лабораторные феномены, описанные при хронических вирусных гепатитах В и С, может рассматриваться эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных микроорганизмов, который считается одним из наиболее активных биологических соединений (Яковлев М.Ю., 1993; Малов В.А. и соавт., 1997; Westphal О., 1984). Главным антиэндотоксиновым барьером является печень (Яковлев М.Ю., 1988; Пермяков Н.К. и соавт., 1989; Thurman R.G. et al., 1997). При развитии дисбактериоза кишечника и других патологических процессов желудочно-кишечного тракта поступление ЭТ в системный кровоток повышается, что может быть как причиной, так и следствием альтерации печени. Рядом исследований последних лет (Волчкова Е.В. и соавт., 1997; Ткачева C.B., 2001) показано вовлечение ЭТ в патогенетические процессы при ХГВ и ХГС. Это делает изучение взаимосвязей эндотоксинемии с особенностями повреждения и регенерации печени чрезвычайно актуальным.

Исследование патогенетических основ хронических вирусных гепатитов приводит к закономерному выводу о необходимости их коррекции.

В настоящее время для лечения ХГВ и ХГС широко применяются различные иммунотропные препараты, прежде всего препараты а-интерферона (Соринсон С.Н., 1996; Подымова С.Д.,1996; Сологуб Т.В. и соавт., 2000).

Перспективным является использование индукторов интерфероногенеза амиксин, неовир, циклоферон и др. (Серебряков М.Ю. и соавт., 1998; Волчек И.В. и соавт., 2000; Фридлянд И.Ф., 2000). Влияние противовирусных методов терапии ХГВ и ХГС на эндотоксин-антиэндотоксиновую систему не изучалось.

Вышеизложенное позволяет считать целесообразным проведение комплексного исследования патогенетических взаимосвязей эндотоксинемии, особенностей повреждения и регенерации печени, дисбактериоза кишечника у больных хроническими вирусными гепатитами В и С, а также влияния интерферонотерапии и лечения индукторами интерфероногенеза на эти патогенетические звенья.

Цель: Определить значение системной эндотоксинемии в формировании патогенетических механизмов повреждения и регенерации печени для улучшения диагностики, прогнозирования течения заболевания и совершенствования лечения хронических вирусных гепатитов ВиС.

Задачи

1. Изучить частоту и выраженность системной эндотоксинемии, состояние основных гуморальных и клеточных факторов антиэндотоксиновой защиты у больных хроническими вирусными гепатитами ВиС.

2. Сопоставить выраженность системной эндотоксинемии с состоянием основных факторов антиэндотоксиновой защиты и клинико-лабораторными показателями у больных хроническими вирусными гепатитами ВиС.

3. Изучить характер клеточных реакций в печени при экспериментальном гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом и при экспериментальном дисбактериозе, индуцированном канамицином.

4. Разработать метод оценки степени и характера повреждения и регенерации печени при хронических вирусных гепатитах ВиС.

5. Определить информативность показателей, входящих в традиционный клинико-лабораторный комплекс обследования, а также морфологических характеристик повреждения и регенерации печени для диагностики хронических вирусных гепатитов ВиС.

6. Оценить взаимосвязь показателей повреждения и регенерации печени с выраженностью системной эндотоксинемии, состоянием иммунной системы, характером дисбиотических реакций в толстой и тонкой кишках, развитием сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

7. Изучить влияние препаратов интерферона и индукторов интерфероногенеза • на состояние микрофлоры кишечника и уровень системной эндотоксинемии у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Научная новизна:

1. Впервые у больных хроническими вирусными гепатитами В и С показано наличие эндотоксинемии и изменения основных гуморальных и клеточных факторов антиэндотоксиновой защиты.

2. Впервые у больных хроническим гепатитом В показана прямая связь - между выраженностью системной эндотоксинемии и внутридольковым повреждением гепатоцитов, клинико-лабораторными особенностями заболевания. У больных хроническим гепатитом С подобная закономерность не выявлена.

3. Установлено, что у больных хроническими вирусными гепатитами В и С системная эндотоксинемия и дисбиотические реакции в тонкой и толстой кишке определяют развитие и выраженность сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта.

4. Впервые установлено, что применение индуктора интерфероногенеза амиксина, препаратов а-интерферона в лечении ХГВ и ХГС приводит к уменьшению дисбиотических реакций, снижению выраженности системной эндотоксинемии и стимулирует выработку антиэндотоксиновых антител.

5. Впервые в эксперименте показано, что амиксин модулирует процессы активации клеток Ито и их трансдифференцировки в миофибробласты, оказывает влияние на процессы фиброгенеза в печени и не вызывает повреждающего действия на печень. Новыми являются данные о влиянии амиксина на микрофлору кишечника крыс, а также взаимосвязи дисбиоза кишечника с морфологическими изменениями структуры печени. Получены новые данные о реакциях клеток Ито, особенностях регенерации гепатоцитов и холангиоцитов на фоне однократного введения эндотоксина и экспериментального дисбиоза кишечника, индуцированного введением канамицина.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе выполнения данного исследования были получены данные об участии эндотоксина в патогенезе альтерации и регенерации гепатоцитов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Разработана методика морфологической и иммуногистохимической диагностики хронических вирусных гепатитов, которая позволяет достоверно определить. степень активности, стадию развития заболевания, характер клеточных реакций в печени.

В качестве теста, характеризующего состояние системы антиэндотоксиновой защиты при хронических вирусных гепатитах В и С, рекомендовано определение антиэндотоксиновых антител.

Обоснована необходимость исследования состояния микрофлоры толстой и 12-перстной кишок у больных хроническими вирусными гепатитами В и С для прогнозирования и диагностики сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Установлено влияние препаратов а-интерферона, индуктора интерфероногенеза амиксина на микрофлору кишечника и эндотоксин-антиэндотоксиновую систему при хронических вирусных гепатитах В и С.

Положения, выносимые на защиту

1. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С состояние микробиоценоза кишечника оказывает влияние на патогенетические процессы. Основным фактором, опосредующим связь между качественным составом микробиоценоза кишечника и морфо-функциональным состоянием печени, является эндотоксин грамотрицательных бактерий.

2. Достоверными критериями для определения степени активности, стадии развития и прогноза фиброзообразования у больных хроническими вирусными гепатитами В и С являются выраженность перипортальных, цетролобулярных некрозов, воспаления, фиброз и характер клеточных реакций в печени.

3. Препараты а-интерферона и индуктор интерфероногенеза амиксин уменьшают выраженность дисбиоза и системной эндотоксинемии у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Внедрение результатов исследований

Методика морфологической диагностики хронических вирусных гепатитов внедрена на Федеральном уровне методическими рекомендациями Министерства здравоохранения Российской Федерации №2001/124. «Способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени при хронических вирусных гепатитах» запатентован Российским агентством по патентам и товарным знакам (решение о выдаче патента на изобретение от 25 сентября 2003 года).

Практические рекомендации нашли применение в отделениях вирусных гепатитов клиник № 1 и № 2 городской клинической инфекционной больницы им. проф. A.A. Агафонова г. Казани, Республиканской клинической больнице Министерства здравоохранения Республики Татарстан для диагностики вирусных гепатитов В и С, сопутствующих заболеваний. Полученные данные используются в учебном процессе при преподавании разделов патогенеза вирусных гепатитов на кафедре инфекционных болезней Казанского государственного медицинского университета.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на заседании предметно-проблемной комиссии по эпидемиологии, микробиологии и инфекционным болезням КГМУ (2003), на научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» (Москва, 26-27 сентября 2000), представлены на научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (1998, 1999, 2000, 2001), на научно-практической конференции молодых ученых КГМА (2000), на III Российской научно-практической конференции с международным участием «Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 1999), на научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), на юбилейной конференции Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии «Современные проблемы эпидемиологии,, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний» (Казань, 2000), на VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000), Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы хронических вирусных гепатитов» (Казань. 2002)

Материалы диссертации доложены и обсуждены на пленумах Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 1998, Пермь, 1999), Четвертой и Седьмой Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 1999, 2002), на научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы диагностики и терапии гепатитов» (Харьков, 2000), на 6-й конференции Международного эндотоксинового общества (Париж, Франция, 2000) международных симпозиумах "Alcohol and Liver" (Венгрия, Будапешт, 1998), "Progress in Basic, Applied and Diagnostic Histochemistry" (Республика Словакия, Братислава, 1998), "Liver Cirrhosis and its Development" (Швейцария, Базель,

1999), "Hepatology 2000" (Мюнхен, Германия, 2000), "Progress in Gastroenterology and Hepatology" (Ганновер, Германия, 2001), "37th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver" (Мадрид, Испания, 2002). "XI1 Falk Liver Week" (Фрайбург, Германия, 2001).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 54 научные работы, в том числе монография, методические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации, получен патент на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (204 отечественных, 211 иностранных источников). Объем составляет 295 страниц машинописного текста, содержит 34 рисунка, 71 таблицу.

Выводы

1. Для хронических вирусных гепатитов характерна системная эндотоксинемия, которая обнаружена у 69,0% больных хроническим вирусным гепатитом В и 83,8% больных хроническим вирусным гепатитом С, что превышает показатели здоровых лиц (31,25%).

2. При хроническом гепатите В выраженная клинико-лабораторная активность заболевания сопровождается увеличением частоты системной эндотоксинемии до 100% и уменьшением концентрации антиэндотоксиновых антител, развитием дисбиотических реакций в кишечнике, снижением иммунорегуляторного индекса, увеличением числа С072+, изменением концентрации сывороточных иммуноглобулинов.

У больных хроническим вирусным гепатитом С отсутствует прямая зависимость системной эндотоксинемии от клинико-лабораторных показателей и репликации вируса.

3. Развитие сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта у 84,1% больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопровождается контаминацией содержимого 12-перстной кишки (79,4%), условно-патогенной флорой и нарастанием интенсивности системной эндотоксинемии (0,137±0,032 ЭЕ/мкл) по сравнению с (0,042±0,012 ЭЕ/мкл) у здоровых лиц.

4. При экспериментальном дисбактериозе, вызванном канамицином, и при гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, у лабораторных крыс наблюдаются: фокальные и мостовидные некрозы, лимфоцитарная воспалительная инфильтрация, активация клеток Ито без миофибробластной трансдифференцировки, значительное увеличение числа клеток, экспрессирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток, бактериальная транслокация.

5. При дифференциальной диагностике хронических вирусных гепатитов В и С, первичного билиарного цирроза наиболее высокой информативностью ^ более 1,0) среди морфологических признаков обладают показатели

раздельной оценки компонентов индекса гистологической активности (перипортальные, центролобулярные, воспалительные изменения), фиброз, реакция желчных протоков, экспрессия альфа-гладкомышечного актина.

6. Выраженность системной эндотоксинемии при хронических вирусных гепатитах В и С зависит от объема и глубины внутридольковых повреждений печени (при оценке интралобулярных некрозов в 1 балл индекса гистологической активности - 0,019±0,006 ЭЕ/мкл, при оценке в 4 балла 0,333±0,106 ЭЕ/мкл) и не имеет прямой зависимости от степени перипортальных некрозов и воспалительной реакции в печени.

7. Препараты а-интерферона, амиксин при лечении больных хроническими вирусными гепатитами В и С уменьшают выраженность диспепсического синдрома, приводят к снижению интенсивности СЭЕ. Амиксин оказывает нормализующее действие на микробиоценоз кишечника.

8. Амиксин в экспериментальной модели хронического гепатита, вызванного четыреххлористым углеродом, у белых крыс способствует восстановлению микрофлоры кишечника, нормализации морфологической картины печени.

Практические рекомендации

1. Для морфологической диагностики хронических вирусных гепатитов рекомендуется использовать разработанный нами способ полуколичественной оценки изменений в биоптатах печени.

2. Рекомендуется использовать предложенную диагностическую таблицу для дифференциальной диагностики хронических вирусных гепатитов В, С и первичного билиарного цирроза.

3. Для оценки состояния системы антиэндотоксиновой защиты у больных хроническими вирусными гепатитами В и С рекомендовано исследование антиэндотоксиновых антител.

4. Рекомендуется исследование микрофлоры толстой и 12-перстной кишок у больных ХГВ и ХГС для профилактики и своевременного лечения сопутствующих заболеваний желудочно-кишечного тракта.

5. В комплексной терапии ХГВ и ХГС рекомендуется использовать амиксин по 125 мг через 48 часов в течение 2 недель, затем - через 72 часа еще 2 недели, тремя четырехнедельными курсами с перерывом по 4 недели, а также неовир по 250 мг 3 раза в неделю в течение 4 месяцев.