Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Система: "рецептор антидиуретического гормона 2-го типа - аквапорин-2" в почке крысы при остром воспалении

На правах рукописи

МИШАРИН АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

СИСТЕМА: «РЕЦЕПТОР АНТИДИУРЕТИЧЕСКОГО ГОРМОНА 2-ГО ТИПА - АКВАПОРИН-2» В ПОЧКЕ КРЫСЫ ПРИ ОСТРОМ

ВОСПАЛЕНИИ.

14.00.16. Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2004

Работа выполнена в группе Нейроиммуноэндокринологии Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, академик РАМН АКМАЕВ И.Г.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор РУДЬКО И.А. доктор медицинских наук, профессор БОГОЛЕПОВА И.Н.

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится: 28 октября 2004 г. в 14:00, на заседании Диссертационного совета Д.001.003.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской Академии медицинских наук, по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. Автореферат разослан 28.09.04.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

СКУРАТОВСКАЯ Л.Н.

2005-4

12624 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Водный обмен всегда был объектом пристального внимания исследователей, но современные представления о транспорте воды через биологические мембраны сформировались совсем недавно — в середине 90-х годов XX века, после открытия аквапоринов — семейства белков водных каналов. Именно это открытие позволило заполнить «белые пятна» в наших знаниях о механизмах обмена воды в организме и, в частности, механизмах действия антидиуретического гормона (АДГ), реабсорбции воды в почках и концентрации мочи.

Однако, несмотря на существенный прогресс в этой области знаний, многие вопросы до сих пор остаются нераскрытыми. К их числу относится и регуляция водного обмена при различных патологических состояниях. В последнее время этому разделу стало уделяться особое внимание, поскольку исследование патологических процессов нередко позволяет лучше понять нормальные физиологические процессы. Так, в частности, стали появляться работы, которых изучается состояние собирательных трубочек почки при нарушении оттока мочи, при ишемии почек [Kwon Т.Н., et al., 1999; Femandez-Llama P., et al., 1999], а также при действии воспалительных факторов [Tamma G., et al., 2003].

Среди различных патологических состояний воспаление занимает особое место. С одной стороны это связано с тем, что нарушения регуляции водного обмена, возникающие при воспалении, имеют большое значение для практической медицины, а с другой— в воспалительной реакции наиболее ярко проявляется взаимодействие основных регуляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. Появившаяся в конце XX века концепция нейроиммуноэндокринологии позволяет по-новому осмыслить роль медиаторов иммунной системы в адаптивных реакциях организма [Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Besedovsky H.O., Del Rey A., 1996]. Для моделирования воспалительной реакции общепринятой является модель с внутрибрюшинным введением бактериального эндотоксина— липополисахарида (ЛПС) в высоких дозах (200—250 мкг/100 г веса тела). Ранее было показано, что такая модель не только приводит к выраженной эндотоксемии и активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, но и запускает экспрессию цитокинов в тех органах, которые находятся вне очага воспаления [Гриневич и др., 1999; Grinevich et al., 2001].

Но, несмотря на явную важность этой темы и интенсивные исследования в этой области, ряд аспектов до сих пор не изучен. В частности, есть отдельные данные о влиянии ЛПС на экспрессию аквапорина-2 [Jonassen Т.Е., et al., 2002], однако экспрессия рецептора АДГ 2-го типа (Vj-рецептора) в условиях воспаления практически не изучена. Имеются сведения, что ЛПС и цитокины могут усиливать апоптоз в культуре клеток почечных канальцев [Jo S.K., et al., 2002], но насколько значим этот механизм в целом организме— также не известно. По-прежнему не исследована динамика изменений, происходящих в собирательных трубочках почки после введения ЛПС. Но до сих пор не было проведено систематического исследования

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

системы «Уг-рецептор—аквапорин-2» под действием ЛПС, и именно это и обусловило направление нашей работы.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы— изучение состояния системы «рецептор антидиуретического гормона 2-го типа (У2-рецептор)—аквапорин-2» в собирательных трубочках почки крысы в условиях острого воспаления. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику изменений осмолярности плазмы крови в условиях острого воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС).

2. В этой же модели воспаления исследовать динамику уровня биологически активного ^-рецептора и экспрессии его мРНК в собирательных трубочках почки.

3. В этой же модели воспаления исследовать динамику уровня аквапорина-2 и экспрессии его мРНК в собирательных трубочках почки.

4. Оценить концентрационную функцию почки в описанной модели, исследовав осмолярность мочи.

5. Исследовать экспрессию основных воспалительных цитокинов (интерлейкина-1{3 и интерлейкина-6) в ткани почки в условиях экспериментального воспаления.

6. Исследовать влияние ЛПС на индукцию апоптоза в мозговом веществе почки.

Научная новизна исследования. На основании экспериментальных данных обнаружен ряд особенностей в функционировании собирательных трубочек почек при остром воспалении:

1. Впервые показано, что острое воспаление нарушает концентрационную функцию почек, что выражается в снижении осмолярности мочи.

2. Впервые исследована динамика уровней белка и мРНК -рецептора и аквапорина-2 в собирательных трубочках почки в условиях воспаления. Это позволило объяснить тот факт, что при введении ЛПС почка выходит из-под контроля АДГ.

3. Обнаружено, что в условиях воспаления отмечается диссоциация между динамикой изменений уровней мРНК аквапорина и содержанием этого белка в клетке.

4. Впервые описана индукция в мозговом веществе почки экспрессии воспалительных цитокинов— интерлейкина- 1р и интерлейкина-6 под действием ЛПС.

5. Показано, что изменения, происходящие в собирательных трубочках почки в условиях острого воспаления, носят функциональный и временный характер и не связаны с апоптозом клеток собирательных трубочек.

Теоретическая и практическая значимость. Работа представляет собой теоретический базис для внедрения новых диагностических и терапевтических подходов в клинике. Полученные данные о состоянии почки

в условиях острого воспаления могут быть полезны для коррекции нарушений водного баланса при септическом шоке и других близких состояниях у человека.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. В условиях воспаления почка выходит из-под контроля АДГ, что связано со снижением уровней Vj-рецептора и аквапорина-2 и проявляется снижением осмолярности мочи. В этой ситуации ведущая роль в регуляции функции собирательных трубочек принадлежит провоспалительным цитокинам— интерлейкину-1 и интерлейкину-б. 3. Нарушение концентрационной функции почек носит временный характер и связано не с гибелью клеток почечных канальцев.

Апробация полученных результатов и практической ценности. Результаты проведенной работы были доложены и обсуждены на на конгрессе «Морфологические науки на рубеже XXI века» (Ульяновск, 20—22 июня 2000), II Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 10—12 октября 2000), , на III конгрессе по клеточной и молекулярной биологии (Йена, Германия, 8—13 октября 2000), на IX всероссийской конференции по физиологии почек и водно-солевого обмена (Санкт-Петербург, 12—14 сентября 2001), на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 25—28 сентября 2001).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, выводов и обсуждения результатов собственных исследований. Диссертация содержит 4 таблицы и 16 рисунков. Библиографический указатель включает 224 ссылки (на 18 отечественных и 206 зарубежных публикаций).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Животные. Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Wistar (питомник Кардиологического Научного Центра РАМН, Москва и виварий Университета г. Йена, Германия) весом 200—250 г. Животные содержались по 5 в клетке, получали свободный доступ к воде и сухому корму. Световой день составлял 14 часов. За день до начала эксперимента животных взвешивали и рассчитывали дозировки Л ПС.

Всего в экспериментах, с учетом проведения предварительных опытов для отработки методик и повторных опытов, было задействовано 112 крыс.

Экспериментальные группы.

1. Контроль (6 крыс). С помощью одноразового инсулинового шприца крысам внутрибрюшинно вводили 300 мкл стерильного физиологического раствора.

2. Однократное введение ЛПС. Использовали ЛПС, полученный из культуры Esherichia coli (Серотип 0111:В4, №L-3012, лот №36Н4130, Sigma, США). Дозировка ЛПС составляла 250 мкг на 100 г веса животного. За день

до начала эксперимента готовили базовый раствор Л ПС, из которого отбирали нужное количество и растворяли до окончательного объема 300 мкл стерильным физиологическим раствором. Инъекции выполняли одноразовыми инсулиновыми шприцами. Крысы из экспериментальной группы были убиты декапитацией через 3 ч (7 крыс), 6 ч (9 крыс), 12 ч (7 крыс) и 24 ч (7 крыс) после введения ЛПС.

После декапитации кровь их туловища собирали в охлажденные гепаринизированные пробирки, центрифугировали, собирали плазму и замораживали ее на сухом льду для последующего определения содержания натрия. Пробы мочи были получены путем аспирации шприцом из мочевого пузыря после декапитации. Для проведения гибридизации in situ, полуколичественного ГЩР с обратной транскрипцией и определения количества белка аквапорина-2 методом Вестерн блот сразу же после декапитации почки или их части иссекались, замораживались на сухом льду и хранились в пластиковых контейнерах при —70°С до проведения указанных исследований.

Для изучения связывания радиоактивного лиганда с У2-рецептором была выделена отдельная группа, по 6 крыс на каждую временную точку (контроль, 3, 6 и 12 ч после введения ЛПС). Сразу же после декапитации почки иссекались, помещались в охлажденный до 4°С фосфатный буфер и в дальнейшем обрабатывались по изложенному ниже протоколу.

Для проведения иммунной гистохимии и исследования фрагментации ДНК в мозговом веществе почки после введения ЛПС была выделена отдельная группа, по 5 крыс в каждой временной точке (контроль и через 6 ч после введения ЛПС). Крыс усыпляли эфиром, вскрывали грудную клетку и, после установки катетера в левый желудочек сердца, проводили длительную перфузию смесью 0,1% глутаральдегида и 4% параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,8). После этого почки извлекали, иссекали мозговое вещество и фиксировали в 4% параформальдегиде при температуре 4°С. Далее образцы ткани заливали в эпоксидную смолу по стандартному протоколу.

Уровень натрия в плазме и осмолярность мочи. Уровень натрия в плазме определялся с помощью анализатора Beckman Elise Na/K/Cl Analyzer, а осмолярность мочи — с помощью анализатора Osmomat 010.

Гибридизация in situ. Метод заключается в инкубации срезов ткани с искусственными фрагментами РНК (рибопробами), комплементарными искомым последовательностям мРНК. В результате происходит гибридизация мРНК и рибопробы, визуализация осуществляется за счет мечения рибопробы изотопами и последующим экспонированием с высокочувствительной рентгеновской пленкой. Метод позволяет определить наличие в ткани искомой мРНК, локализовать ее в отдельных структурах и установить как изменяется ее количество. Для синтеза рибопроб были использованы следующие матрицы:

Vj-рецептор: фрагмент кДНК длиной 745 нуклеотидов клонированный в плазмиду pcDNAl по сайту рестрикции EcoR I (плазмида любезно предоставлена Dr. Lolait, Национальные Институты Здоровья США).

ИЛ- 1(5: фрагмент кДНК длиной 552 нуклеотида клонированный в плазмиду pGEM-5zf(+) по сайту рестрикции EcoR V.

ИЛ-6: фрагмент кДНК длиной 529 нуклеотида клонированный в плазмиду pGEM-5zf(+) по сайту рестрикции EcoR V (плазмиды с зондами к ИЛ- 1(3 и ИЛ-6 были любезно предоставлен Dr. Dantzer «Concerted action for the European community», INSERM, Франция).

Приготовление гибридизационных проб, их очистка и гибридизация проводились по стандартным протоколам.

Для оценки гибридизационных сигналов срезы экспонировались на высокочувствительной авторадиографической (рентгеновской) пленке ВЮМАХ MR (Kodak, IBI, New Heaven, CT, США) с опытным выбором оптимального времени экспозиции для каждой из проб (30 дней для мРНК ИЛ-1 и ИЛ-6). После проявления пленки оптическая плотность сигнала определялась с помощью компьютеризированной системы анализа изображений (Imaging Research, St Catherine, Ontario, Canada), используя программу анализа изображений Национальных Институтов Здоровья США (интернет-сайт: http://www.rsb.info.nih.gov/nih-image). Оптическую плотность определяли как минимум на 2 последовательных срезах, вычисляли среднее значение для каждой крысы, а потом — для всей группы.

Уровень белка У2-рецептора на мембранах собирательных трубочек. Исследовали связывание меченного тритием АДГ со срезами почки, для выявления и оценки количества биологически-активных Уг-рецепторов в почке при воспалении. Исследование проводилось по методике, изложенной в статье Aguilera et aL, 1994.

Образцы ткани почки от 5-ти крыс после добавления 10 мл охлажденного (4°С) 20 мМ раствора натрия бикарбоната гомогенизировали 10-ю ударами в гомогенизаторе Даунса, профильтровали через нейлоновый фильтр, а затем центрифугировали с ускорением в 100 g в течение 10 мин и с ускорением 30000 g в течение 30 мин. Осадок растворили в 10 мл 50 мМ раствора TRIS НС1 (рН7,4), содержавшего 5мМ MgCl2, 2мМ ЭГТА и 10 мкг/мл бацитрацина, и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, чтобы эндогенный АДГ полностью перешел в раствор. Эту взвесь повторно центрифугировали с ускорением 30000 g в течение 30 мин и осадок растворили в 2,2 мл описанного выше буфера. При этом концентрация белка в образцах составила 30—50 мкг/50 мкл. Образцы этой взвеси, объемом по 50мкл инкубировали вместе меченым тритием АДГ ([3Н]АДГ, 50 мКюри/мМоль; NEN DuPont Research Products, Boston, MA, США) в восходящей концентрации от 0,1 до 8 нМ (от 1,5 до 150000 срт), доведя объем до 200 мкл описанным выше буфером содержащим 0,2% бычьего альбумина с добавлением или без добавления 1 мкМ немеченого АДГ (Peninsula Labs, Vermont, CA, США). После инкубации в течение часа при 23°С несвязавшийся АДГ отделили фильтрацией через фильтр из

стекловолокна и дважды отмыли охлажденным до 4°С фосфатным буфером. Радиоактивность измеряли счетчиком ß-частиц. Предварительные опыты показали, что в интервале от 30 до 80 мкг связывание лиганда линейно нарастает с увеличением количества белка. Насыщение рецептора лигандом наступало на 50—60 минуте инкубации и оставалось неизменным при инкубации еще в течение часа. Расчет концентрации и афинности рецептора производили с использованием компьютерной программы «Лиганд» [Munson P.,RodbardD., 1980].

Вестерн блот. Для оценки количества белка аквапорина-2 методом Вестерн блотвнутреннее мозговое вещество почек и почечный сосочек были иссечены, гомогенизированы и подготовлены к электрофорезу в 12% полиакриламидном геле. После электрофореза, белок был перенесен на нитроцеллюлозную мембрану, которая инкубировалась с первыми антителами к аквапорина-2 (любезно предоставлены Dr. Knepper, Национальные Институты Здоровья США), а затем с набором вторых антител, меченных пероксидазой хрена (Pierce Chemical Co., 31463). Визуализацию сигнала осуществляли с помощью набора для хемолюминисценции на основе люминола (LumiGLO, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, США) и светочувствительной пленки Kodak (165-1579). Полученное изображение обработано с помощью компьютерной программы NIH Image, как это изложено в разделе, посвященном гибридизации in situ.

Исследование апоптоза в мозговом веществе почки. Из залитых в эпоксидную смолу блоков с помощью ультратома LKB [Bromma, Швеция] были получены полутонкие срезы толщиной 1мкм. Срезы монтировали на стекла, покрытые поли^-лизином. Смолу растворяли путем последовательного проведения по смесям метанол/NaOH и метанол/бензол, затем через ацетон и заканчивая регидратацией в фосфатном буфере.

Для исследования апоптоза в мозговом веществе почки исследовали фрагментацию ДНК (известно, что апоптоз сопровождается фрагментацией ядерной ДНК [Aschoff A.P., Jantz M., Jirikowski G.F., 1996]).

Для исследования фрагментации ДНК на срезы наносили фермент терминальную трансферазу, растворенную в реакционном буфере, содержащем 5-бром-2-дезоксиуридин (Terminal Transferase, DNA Labeling Kit, Boehringer Mannheim, Германия), реакцию проводили при 370С. В результате реакции на 5'-концах ядерной ДНК образовывались поли-бромдезоксиуридиновые последовательности. После прекращения реакции, срезы отмывали в фосфатном буфере и инкубировали с антителами к бромдезоксиуридину (Progen, Heidelberg), дальнейшую визуализацию проводили по стандартному протоколу с использованием пероксидазного метода. Для контроля неспецифической реакции проводилась инкубация срезов с реакционным буфером и бромдезоксиуридином, но в отсутствии фермента (дальнейшая обработка как обычно), при этом мечения и окраски не отмечалось. В другой контрольной серии, вместо антител к бромдезоксиуридину срезы инкубировали с раствором альбумина сыворотки

быка, в этом случае окрашивания также не отмечалось. Окрашенные срезы анализировали на микроскопе Olympus BX50, совмещенном с цифровой камерой Olympus PC 10.

Иммунная гистохимия на аквапорин-2. Из залитых в эпоксидную смолу блоков с помощью ультратома LKB были получены полутонкие срезы (толщиной 1 мкм). Срезы монтировали на стекла покрытые поли^-лизином. Смолу растворяли путем последовательного проведения по смесям метанол/NaOH и метанол/бензол, затем через ацетон и заканчивая регидратацией в фосфатном буфере. Затем срезы инкубировали с первыми антителами к аквапорину-2 серии LL127AP (любезно предоставлены Dr. Knepper, Национальные Институты Здоровья США) в разведении 1:1000 в течение 12 часов при 4°С. Далее срезы отмывали в фосфатном буфере и инкубировали со вторыми антителами (анти-кроличий IgG) в разведении 1:100 (Sigma, США) 1 час при 200С. После отмывания в фосфатном буфере срезы инкубировали с пероксидазным комплексом (1 час при 20°С) и после отмывки визуализировали с помощью диаминобензидина в качестве хромогена по стандартному протоколу (10 мл фосфатного буфера, 2 мг ДАБ, 2 мкл 30% Нг02,20 мкл 8% NiCl2). Для контроля за специфичностью реакции антитела к аквапорину-2 заменяли раствором альбумина сыворотки быка, в этом случае окрашивания не отмечалось. Окрашенные срезы анализировали на микроскопе Olympus BX50, совмещенном с цифровой камерой Olympus РС10.

Экспрессия мРНК аквапорина-2 методом полуколичественного ПЦР с обратной транскрипцией. Сразу после забора почек мозговое вещество и почечный сосочек были иссечены, заморожены на сухом льду и хранились при -700С в пластиковых контейнерах. РНК выделяли с помощью реактива TRfzol Reagent (Gibro-BRL, США), представляющего собой модифицированный метод фенол-хлороформенной экстракции (Chomczynski P., SacchiN., 1987]. Замороженные фрагменты ткани почки быстро взвешивали на электронных весах и помещали в предварительно охлажденные в жидком азоте камеры шарикового дисмембратора. Дробление проводили в течение 45 сек, со скоростью 1500 ударов в минуту. Измельченную до пылевидного состояния ткань почки переносили в стерильную пластиковую пробирку и заливали TRIzol Reagent,ом из расчета 1 мл на 100 мг ткани. После оттаивания и периодического переворачивания пробирки в течение 5 минут, добавляли 200 мкл хлороформа на 1 мл TRIzol Reagents и энергично встряхивали пробирку (на мешалке типа Vortex) в течение 15 сек. После пятиминутной инкубации при 4°С, пробирки центрифугировали 15 минут при 14000 оборотов в минуту. Полученную после центрифугирования водную фазу с помощью пипетирования аккуратно переносили в новые пробирки, смешивали с равным объемом изопропанола и инкубировали при -200С в течение 3 часов. После повторного центрифугирования (4°С, 15 минут 14000 оборотов в минуту) надосадочную жидкость сливали, осадок заливали 1 мл абсолютного спирта. «Встряхивали» пробирку на vortex'е, так, чтобы осажденная РНК отошла от стенок и плавала

в спирте, а затем центрифугировали при 4°С, 15 минут 14000 оборотов в минуту. Затем спирт сливали, осадок РНК высушивали в ламинаре и растворяли в 20 мкл стерильной воды. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм. В среднем, в 1 мкл содержалась 1 мкг тотальной РНК.

На следующем этапе, чтобы устранить возможное «загрязнение» препарата геномной ДНК (которое могло исказить последующие результаты ПЦР анализа), его обрабатывали ДНКазой (Дезоксирибонуклеаза I, без РНКазной активности, MBI Fermentas, Литва) с использованием прилагающегося буфера и раствора ЭДТА После проведения реакции РНК переосаждали в спирте/ацетате, отмывали в абсолютном спирте и вновь растворяли в стерильной воде. Отсутствие ДНК проверено с помощью ПЦР на GPDH с образца тотальной РНК.

Обратную транскрипцию проводили с помощью набора Cloned AMV First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen, США) с 1 мкг общей РНК с лолиТ20 праймерами в 20 мкл смеси. В качестве контроля проводили аналогичные реакции, но без добавления обратной транскриптазы— в этом случае, последующий ПЦР была отрицательной. Это свидетельствует в пользу того, что образцы РНК не были загрязнены геномной ДНК. После этого 1 мкл реакционной смеси использовался для проведения ПЦР с помощью готового набора MagAmp MIX (Диалат, Россия), объем реакционной смеси 20 мкл. Использованы следующие пары праймеров: аквапорин-2: (AQP2s: 5' AGT-GCT-GGC-TGA-GTT-CTT-GG3' AQP2as: 5' GCT-GTG-GCG-TTG-TTG-TGG-AG 3' размер фрагмента— 344 пары нуклеотидов), глицерол-3-фосфатдегидрогеназа: (GAPDHs: 5' GGA-CAT-TGT-TGC-CAT-CAA-CGA-C 3' GAPDHas: 5' ATG-AGC-CCT-TCC-ACG-ATG-CCA-AAG 3' размер фрагмента — 441 пара нуклеотидов) [Yasui M., et aL, 1996]. ПЦР проводили в следующих условиях: первоначальное плавление при 94°С в течение 2 мин, с последующими 20 циклами отжига праймеров при 55°С в течение 45 сек., элонгации при 72°С в течение 90 сек. и плавления при 95 "С в течение 20 сек. По окончании 20 циклов следовала финальная 5-ти минутная элонгация при 72 0С. Полученные продукты визуализировали в ультрафиолете после электрофореза в 1,5% агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Для определения молекулярного веса продуктов ПЦР использовался маркер 100 bp DNA ladder (Promega, США). При анализе соотношение ДНК в разных образцах выравнивалось по уровню мРНК глицерол-3-фосфат дегидрогеназы (GPDH). GPDH относится к так называемым генам «домашнего хозяйства» (house keeping genes), экспрессия которых постоянна и не изменяется при воспалении. То, что полученные при ПЦР фрагменты ДНК относятся именно к аквапорину-2 и GPDH было подтверждено с помощью рестрикционного анализа (данные не представлены). Чтобы удостовериться в точности опыта, каждый образец РНК исследовался трижды. Изображение записывали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Литех, Россия) и анализировали с помощью программы «Gel-Pro Analyzer 3.1» (Media Cybernetics, США). Для

оценки сигнала от полосы использовали показатель интегральной оптической плотности.

Статистический анализ. Статистическая обработка проводилась с методом одномерного дисперсионного анализа (ANOVA), включающего тест Фишера (РЬ8Б — наименьшая значимая разность). Р<0,05 считалось статистически достоверной разницей между экспериментальными группами. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего. Плотность сигнала (уровень мРНК, белка, ПЦР-продуктов) представлены либо в виде абсолютных единиц оптической плотности, либо в виде процентов по отношению к контролю, принятому за 100%.

Результаты исследований

Уровень натрия в плазме и осмолярность мочи. После внутрибрюшинного введения ЛПС изменений в концентрации № в плазме крови (и, следовательно, осмолярности) не отмечалось (таблица 1).

Через 3 ч после внутрибрюшинного введения ЛПС происходило выраженное снижение осмолярности мочи (на 65% от исходного уровня), которое сохранялось в течение суток (ниже 50% от исходного уровня через 24ч).

Состояние ^.-рецептора после введенияЛПС. Введение ЛПС вызывает снижение связывания радиоактивного лиганда с Уг-рецептором мембранами собирательных трубочек (таблица 2, рисунок 1). Параллельно с этим отмечалось выраженное снижение уровня мРНК Уг-рецептора (рисунок 2 и 3). Так, уровень мРНК ^-рецептора снижался более чем на 90% от исходного уровня через 3 и 6 ч после введения ЛПС и постепенно нарастал к 24 ч, но даже к этому времени не достигал контрольных величин.

Аквапорин-2 после введения ЛПС. Через 3 ч после введения ЛПС уровень белка аквапорина-2 значительно снижался, оставаясь пониженным вплоть до 24 ч (таблица 3, рисунок 4). При этом статистически значимое снижение обнаружено только в гликозилированной форме аквапорина-2 с молекулярным весом 36—45 кД.

Иммуногистохимическое окрашивание на аквапорин-2 после введения ЛПС показало, что через 6 часов после введения ЛПС общая интенсивность окрашивания уменьшается с преимущественным снижением окраски на апикальной мембране главных клеток собирательных трубочек. Однако типичный характер окрашивания с более интенсивным окрашиванием апикальной мембраны и слабоокрашенной цитоплазмой сохраняется (рисунок 5).

При изучении экспрессии мРНК аквапорина-2 оказалось, что ее уровни также снижаются. При этом максимальное снижение отмечалось через 3 и 6 ч, но уже через 12 ч уровни мРНК аквапорина-2 не отличались от контрольных. Важно отметить, что к 24 ч уровни мРНК аквапорина-2 даже несколько превышали контрольные величины (на 20%). Однако подобное нарастание не было статистически достоверным (рисунок 6).

Экспрессия мРНК цитокинов в мозговом веществе почки после введения ЛПС. До введения ЛПС мРНК интерлейкина- 1р и интерлейкина-6

100 200

связывание меченного АДГ (фмоль/мг)

Рисунок 1. Связывание меченного лиганда с мембранами внутреннего мозгового вещества почки крысы, после однократного введения ЛПС.

методом гибридизации in situ в ткани почки не обнаруживалась. Однако после введения ЛПС уровень мРНК ИЛ- 1Р значительно повышался, достигая максимума через 6 ч, и оставался повышенным вплоть до 12 ч (таблица 4, рисунки 2 и 7А). При этом уровень мРНК ИЛ-6 нарастал еще раньше — через 3 ч, но снижался к 6 ч, оставаясь соответствующим контролю до 12 ч (таблица 4, рисунки 2 и 7Б). Важно отметить, что экспрессия обоих цитокинов отмечалась преимущественно во внутреннем мозговом слое и почечном сосочке, тогда как экспрессия в корковом веществе была незначительной (данные не представлены).

Апоптоз в мозговом веществе почки после введения ЛПС. До введения ЛПС в мозговом веществе почки после проведения реакции на выявление фрагментированной ДНК обнаруживались единичные клетки с окрашенным ядром, в том числе и в собирательных трубочках. Через 6 ч после введения ЛПС отмечалось незначительное увеличение числа клеток с окрашенным ядром, в основном это были клетки эндотелия сосудов. Таким образом, введение ЛПС не приводит к усилению апоптоза в почечных трубочках.

У2-рецептор ИЛ-1Ь ИЛ-6

Рисунок 2. Экспрессия мРНК V2-рецептора, ИЛ- 1Ри ИЛ-6 в почке после введения ЛПС.

На рисунке представлены типичные изображения, получаемые на рентгеновской пленке. В случае У2-рецептора сигнал распределен как в наружном, так и во внутреннем мозговом веществе почки. В случае ИЛ-1|} и ИЛ-6 — преимущественно в области внутренней полоски мозгового вещества. Обозначения: К — корковое вещество почки; НМ — наружное мозговое вещество почки; ВМ — внутреннее мозговое вещество почки (включая почечный сосочек)

Таблица 1. Концентрация Na+ плазмы и осмолярности мочи после введения ЛПС._____

Контроль 3 ч 6ч 12 ч

Na плазмы (мэкв/л) 144±3 138±3 145±2,8 138±3,1

Осмолярность мочи (мосмоль/л) 2210±238 774±81* 1292±152* 1036±152*

Р<0,001 по сравнению с контролем.

О 3 6 12

время после введения ЛПС (часы)

Рисунок 3. Уровень мРНК У2-рецептора после введения ЛПС. На графике представлены средние значения мРНК У2-рецеитора± стандартная ошибка. * Р<0,01 по сравнению с контролем.

Таблица 2. Связывание меченного лиганда с мембранами внутреннего

мозгового вещества почки к] рысы, после однократного введения ЛПС.

Контроль 6ч 12 ч 24 ч

Связывание, кО, пмоль/л 39±0,4 35±1,2 30±1,5 31 ±0,9

В таблице представлены средние значения связывания радиоактивного лиганда по результатам трех повторных опытов ± стандартная ошибка.

Таблица 3. А свапорин-2 после введен ия ЛПС.

Аквапорин-2 Контроль 6 часов 12 часов 24 часа

36-45 кДа 100,7±8,3 40,3±8,3* 49,0±2,3* 55,7±2,8*

29 кДа 66,7±6,7 38,3±4,6 37,3±3,8 29,0±5,7

Р<0,05 по сравнению с контролем.

36—45 кДа — гликозилированная форма аквапорина-2. 29 кДа — негликозилированная форма аквапорина-2. Уровень аквапорина-2 (условные единицы) выражен в виде среднего ± стандартная ошибка.

Рисунок 4. Уровень белка аквапорина-2 после введения ЛПС. А. Типичное изображение, полученное при проведении анализа уровня аквапорина-2 в ткани почки методом Western blotting. В каждой группе представлен материал от трех крыс. Цифры и полосы слева — маркер относительного веса белка (в килоДальтонах). Верхний ряд полос 36—45 кД (гликозилированная форма аквапорина-2), нижний ряд — 22 кД (негликозилированная форма). Б. Графическое представление данных полуколичественного анализа уровня аквапорина-2 после введения ЛПС. *Р<0,05 по сравнению с контролем.

Рисунок 5. Иммуногистохимическое окрашивание ткани почки на аквапорин-2.

А. Контроль. Б. Через 6 часов после введения ЛПС. Стрелками обозначено окрашивание апикальных мембран собирательных трубочек. Увеличение х40.

Таблица 4. мРНК интерлейкина- 1р и интерлейкина-6 в ткани почки через 3,6 и 12 ч после введения ЛПС.

Контроль Зчаса 6 часов 12 часов

интерлейкин-1 р 6,34±0,9 10,65±4,36 16,38±3,7* 13,11±2,42*

интерлейкин-6 7,9 19,2±4,57* 8,2±1,9 7,9±1,2

* Р<0,01 по сравнению с контролем.

Уровень мРНК интерлейкина- и интерлейкина-6 (условные единицы) выражен в виде среднего ± стандартная ошибка.

Контроль ЛПС Зч ЛПС 6*, ЛПС 12ч ЛПС 24м

Б 140 -1

120 •

1100 -г

1 80"

I 60%

£

6 40©

20 *

О ......I 1 I 1 1 'I '"Г............... >

Контроль ЛПС Зч ЛПС вч ЛПС 12ч ЛПС 24ч

Рисунок 6. мРНК аквапорина-2 после введения ЛПС. А. Электрофорез продуктов ПЦР с обратной транскрипцией в 1,5% агарозном игле. Использованы праймеры для аквапорина-2. Б. мРНК аквапорина-2 после введения ЛПС. На графике представлены средние значения мРНК У2-рецептора ± стандартная ошибка. * Р<0,05 по сравнению с контролем.

Цифры обозначают размер фрагментов ДНК (пар нуклеотидов). Крайняя правая полоса—маркер размера ДНК 100 Ьр.

Контроль Л ПС Зч ЛПС 6ч Л ПС 12 ч

Рисунок 7. мРНК интерлейкина- ]ф (А) и интерлейкина-6 (Б) в ткани почки через 3,6 и 12 ч после введения ЛПС. * Р<0,01 по сравнению с контролем.

Обсуждение

Уровень Na+ в плазме и осмолярность мочи после введения ЛПС. Как

и было показано ранних работах [Акмаев И.Г., с соавт., 2001; Grinevich V., et al, 2001; Grinevich V., et al, 2003], однократное внутрибрюшииное введение ЛПС не влияет на уровень АДГ в плазме крови . При этом нами обнаружено выраженное нарушение концентрационной функции почек: осмолярность мочи снижалась более чем на 60% и даже через 12 ч достигала лишь половины от исходного уровня. Эти данные согласуются с результатами других работ, в которых показано, что даже небольшое и кратковременное воздействие на почку, приводит к очень выраженным и длительным изменениям, в частности, к нарушению концентрационной функции почки [Fernandez-Llama P., et al., 1999; Kwon Т.Н., et al., 1999].

Таким образом, можно предположить, что в отсутствии выраженных влияний со стороны АДГ, а также гемодинамических и осмотических сдвигов, те изменения, которые происходят в почках при введении ЛПС, связаны с действием факторов воспаления, как синтезирующихся локально, так и поступающих из системного кровотока. То есть при воспалении собирательные трубочки почки выходят из-под контроля АДГ и регуляция их функции осуществляется под действием факторов воспаления.

У,-рецептор после введения ЛПС. В настоящей работе было показано, что воспаление, вызванное однократной инъекцией ЛПС, приводит к выраженному снижению уровней биологически активного Vj-рецептора на мембранах собирательных трубочек почки. Одного этого уже достаточно, чтобы вызвать нарушение концентрационной функции почки, поскольку снижение числа активного -рецептора автоматически приведет к нарушению выхода аквапорина-2 на апикальную мембрану и, соответственно, функции собирательных трубочек в целом (что и проявляется в снижении осмолярности мочи).

Помимо снижения числа активного -рецептора на мембранах клеток собирательных трубочек, отмечается выраженное снижение уровня его мРНК. Эти изменения также носят длительный характер: даже через 12 часов после введения-ЛПС уровень мРНК Vj-рецептора оставался менее 50% от исходного уровня. Объяснить причину такого выраженного снижения достаточно сложно, поскольку регуляторные последовательности гена рецептора плохо изучены.

Аквапорин-2 после введения ЛПС. Как и следовало ожидать, снижение уровня ^-рецептора сопровождалось снижением уровней аквапорина-2, как белка, так и мРНК. Как и в случае с -рецептором, эти изменения были выраженными и продолжительными по времени. Однако интересно другое: через 12 часов уровни мРНК Vj-рецептора остаются все еще очень низки, также как и уровни активного -рецептора. Но в это же время уровень мРНК аквапорина-2 почти достигает исходного уровня, а в 24 часа даже немного превышает его (последние изменения статистически недостоверны). При этом уровень белка аквапорина-2 даже через 24 часа все еще не достигает исходных значений. Такую диссоциацию между уровнями белка и

мРНК можно объяснить тем, что в норме синтеза белка почти всегда несколько запаздывает за нарастанием мРНК, однако есть еще одно возможное объяснение этого феномена. Известно, что простагландин Е2 по-разному действует на внутриклеточное перемещение аквапорина-2 и на экспрессию его гена: под действием простагландин Е2 «уходит» с апикальной мембраны, в тоже время, повышая уровень внутриклеточного кальция, простагландин Е2 может стимулировать экспрессию гена аквапорина-2 [Nadler S.P., et al., 1992; Zelenina M., et al., 2000; Klussmann E., et al., 2001; Tamma G., et al., 2003]. Разумеется, это не единственный (и, возможно, не самый важный) фактор, который может вызывать подобные изменения в уровнях белка и мРНК.

Следует отметить также, что в недавней работы группы Olsen [Jonassen Т.Е., et al., 2002], было показано, что внутривенное введение очень высоких доз ЛПС приводило к значительному повышению уровня АДГ в плазме крови, однако уровень белка аквапорина-2 в почке оставался неизменным. Уровень ^-рецептора— основного регулятора экспрессии аквапорина-2 в этой работе не был изучен. Возможно, что при внутривенном введении ЛПС не происходило снижение уровня ^-рецептора, поэтому уровень аквапорина-2 и оставался неизменным.

Экспрессия цитокинов в почке после введения ЛПС. Внутрибрюшинное введение ЛПС сопровождалось нарастанием экспрессии цитокинов ИЛ-lp и ИЛ-6 в ткани почки. Причем экспрессия отмечалась именно в наружном мозговом веществе почки, тогда как в корковом веществе экспрессия практически не обнаруживалась. Какие именно клетки являются источником цитокинов — точно не установлено, но, скорее всего, это интерстициальные клетки мозгового вещества. Возможно, что выраженное снижение уровня ^-рецептора связано именно с экспрессией цитокинов. В большинстве случаев именно они опосредуют дальнейшую экспрессию таких факторов воспаления как простагландины и окись азота.

Алоптоз в мозговом веществе почки после введения ЛПС. Ожидалось, что введение ЛПС приведет к усилению апоптоза в мозговом веществе почки. Теоретически такое предположение хорошо согласуется с недавними данными о том, что ЛПС и цитокины вызывают усиление апоптоза в культуре клеток почечных канальцев [Jo S.K., et al., 2002;]. Однако это предположение в нашей работе не подтвердилось. Из этого следует, что обнаруженные изменения в динамике ^-рецептора и аквапорина-2 носят хоть и длительный, но обратимый характер, поскольку не связаны с гибелью клеток почечных канальцев.

Заключение. Суммируя полученные данные, можно сказать, что в условиях острого воспаления, вызванного введением ЛПС, собирательные трубочки почки выходят из-под контроля АДГ, уровень которого остается неизменным [Акмаев И.Г., с соавт., 2001]. При этом нарушается концентрационная функция почек, что проявляется снижением осмолярности мочи. Вероятно, что ведущая роль в этом процессе принадлежит V2-рецептору, поскольку от его активности зависит как экспрессия гена, так и

перемещение аквапорина-2 внутри клетки (рисунок 7) [Мишарин А.В., с соавт., 2004]. Уменьшение активности Уу-рецептора обязательно приведет к снижению уровня мРНК и белка аквапорина-2. Снижение активности Уг рецептора и угнетение экспрессии его гена может быть связано с действием факторов воспаления: эйкозаноидов, интерелейкинов и окиси азота. Однако в последнее время появились убедительные данные, что такие факторы воспаления как эйкозаноиды, в частности, простагландин Еа, могут действовать независимо от -рецептора, непосредственно на аквапорин-2, усиливая его эндоцитоз и уменьшая его количество на апикальной мембране [2е1епта М., Ы а1., 2000; Татта О., й а1., 2003]. Описанные изменения носят хотя и длительный, но функциональный, а значит и обратимый характер. В пользу последнего свидетельствует тот факт, что воспаление не усиливает апоптоз в мозговом веществе почки.

ВЫВОДЫ

1. Воспаление, вызванное введением липополисахарида не вызывает существенных изменений в осмолярности плазмы. Однако при этом происходит отчетливое снижение осмолярности мочи.

2. В условиях воспаления снижается синтез рецептора антидиуретического гормона 2-го типа -рецептора) и аквапорина-2 в собирательных трубочках почки. Таким образом, почка частично выходит из-под контроля антидиуретического гормона.

3. Описанные изменения сочетаются с нарастанием в мозговом веществе почки экспрессии воспалительных цитокинов— интерлейкина- 1|3 и интерлейкина-6.

4. В условиях воспаления отмечается диссоциация между динамикой возвращения к исходным значениям уровней белка и мРНК аквапорина-2.

5. В условиях острого воспаления не выявлено усиления апоптоза в мозговом веществе почки, что отражает сохранность клеток собирательных трубочек и свидетельствует о временном и функциональном характере происходящих в них изменений синтеза У2-рецептора и аквапорина-2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мишарин А.В., Савелов Н.А., Ресненко А.Б. Водно-электролитный баланс при воспалении // Материалы Пироговской студенческой научной конференции. Вестник РГМУ. - Москва. 2000. Т. 12. -№2.-С. 166.

2. Гриневич В.В., Мишарин А.В., Поскребышева Е.А., Волкова О.В., Акмаев И.Г. Крупно клеточные ядра гипоталамуса при воспалении // Тезисы конгресса «Морфологические науки на рубеже XXI века». - Ульяновск. 20-22 июня 2000.

3. Гриневич В.В., Мишарин А.В., Поскребышева Е.А., Савелов Н.А., Волкова О.В., Акмаев И.Г. Регуляция водно-электролитного баланса при

воспалении // Тезисы докладов II Российского конгресса по Патофизиологии. - Москва, 10-12 октября 2000. - С. 259.

4. Misharin A.V., Resnenko A.B., Savjolov N.A., Jirikowski G.F., Grinevich V.V. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) potentiates effects of osmotic stimulation on hypothalamic magnocellular neurons in the rat // Cellular and Molecular Biology. -2000. -Vol. 46. -Abstract 154.

5. Акмаев И.Г., Волкова О.В., Гриневич В.В., Мишарин А.В., Поскребышева Е.А., Савелов Н.А., Ресненко А.Б. Вазопрессин и воспаление // Морфология. -2001. -Т. 120. -№5.-С. 7-16.

6. Мишарин А.В., Ресненко А.Б. Изменения в собирательных трубочках почки при остром воспалении // Материалы Пироговской студенческой научной конференции. Вестник РГМУ. - Москва. 2002. Т. 22. -№1. -С. 142.

7. Мишарин А.В., Ресненко А.Б., Гриневич В.В., Волкова О.В., Акмаев И.Г. Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система при воспалении // Материалы XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. - Казань. 25:—28 сентября 2001. - С. 390.

8. Ресненко А.Б., Абрамова Н.А., Мишарин А.В. Регуляция центральных звеньев гипоталамо-гипофизарио-адренокортикальной системы при длительном воспалительном стрессе // Вестник молодых ученых. —2002. — Т. 1.-С. 16-22.

9. Мишарин А.В., Ресненко А.Б., Акмаев И.Г., Гриневич В.В. Концентрационная способность почки при остром воспалении // Материалы IX всероссийской конференции по физиологии почек и водно-солевого обмена. Нефрология. - Санкт-Петербург. - 2001. -Т. 5. - С. 108.

Подписано в печать 24.09.2004. Формат 60x84 1/16 Печать офсетная. Усл.п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №197.

Типография АПРИКТ 123007, Москва, 5-я Магистральная 5.

PI 8 2 27

РНБ Русский фонд

2005-4 12624