Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Нейро-иммунно-эндокринные взаимодействия

На правах рукописи

РЕСНЕНКО АЛЕКСЕЙ БОРИСОВИЧ

НЕЙРО-ИММУНННО-ЭНДОКРИННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ: ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-АДРЕНОКОРТИКАЛЬНАЯ СИСТЕМА В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ У КРЫС.

14.00.16. Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2004

Работа выполнена в группе нейроиммуноэндокринологии государственного учреждения научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук, кафедре гистологии и эмбриологии педиатрического факультета Российского Государственного Медицинского Университета.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук В.В. Гриневич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т.К. Дубовая доктор биологических наук, профессор O.A. Гомазков

Ведущее учреждение: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Защита диссертации состоится: 25 ноября 2004 г. в 16:00, на заседании Диссертационного совета Д.001.003.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии Российской Академии медицинских наук, по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН.

Автореферат разослан 24 10.04 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская

&Q91

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

На рубеже XX и XXI столетий сформировалась интегративная медико-биологическая дисциплина - нейроиммуноэндокринология. В ее основу легли представления о сходстве организации и общих сигнальных механизмах взаимодействий основных регулирующих систем организма -нервной, иммунной и эндокринной. Тесные взаимодействия данных систем сложились в ходе длительного эволюционного пути и наиболее ярко проявляются в реакции адаптации, развивающейся в ответ на любые нарушения гомеостаза. Ганс Селье, впервые описавший это состояние как "основной адаптационный синдром" [Selye Н. 1936; Selye et al 1949], обратил внимание на четкую связь нервной и эндокринной систем. Позже стало очевидным, что такое тесное взаимодействие возможно благодаря единым сигнальным молекулам и рецепторам синтезируемым и экспрессируемым клетками и тканями трех систем - нервной, иммунной и эндокринной [Акмаев, 1996;2003; Гриневич и др., 1999; Tumbull, River 1999; Гриневич 2001;2003].

Ведущим нейроэндокринным компонентом единой интегрирующей системы у млекопитающих является гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система (ГТАС), а иммунным - паттерн цитокинов -сигнальных молекул, вырабатываемых преимущественно клетками лимфоцитарного и макрофагально-мононуклеарного ряда [Elenkov et а! 1998; Masek et al 2003] (Рис.1).

Единство регуляторных систем наиболее ярко проявляется при воспалительной реакции. В основе ее реализации лежит феномен общеорганизменной хемокоммуникации - обмен информацией между клетками с помощью биологически активных веществ обладающих исключительной эволюционной консервативностью [Акмаев и др., 2002]

Цитокины, как главные факторы воспаления, оказывают разнообразные эффекты на нейроэндокринные нейроны гипоталамуса и клетки эндокринных желез, изменяя активность гормональных систем, которые в свою очередь компенсируют вызванные воспалением нарушения. Процесс регуляции воспаления должен быть чрезвычайно точным, поскольку недостаточный ответ не позволит элиминировать возбудителя, а чрезмерная активация грозит повреждением здоровых тканей и развитием аутоиммунной патологии.

Рис. 1. Взаимоотношения факторов очага воспаления и ГГАС. (По Гриневич и др., 1999 с изменениями)

Сокращения- АКТГ - адренокортикотропный гормон, ВП - вазопрессин, КРГ -кортиколиберин, ГК - глюкокортикоиды, К - клубочковая зона коры надпочечника, П - пучковая зона коры надпочечника, С - сетчатая зона коры надпочечника, МВ -мозговое вещество надпочечника ЛФ - лимфоцит, МФ - макрофаг, ФЗК -фолликулярно-звездчатая клетка, ТК - тучная клетка, ДК - дендритная клетка.

Отрицательная связь

Положительная связь

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение нейроиммуноэндокринных механизмов регуляции ГГАС в условиях хронического бактериального воспаления у крыс.

Для достижения данной цели мы поставили следующие задачи:

1. Разработать адекватную модель хронического бактериального воспаления путем введения крысам бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС).

2. Исследовать эффекты острого и длительного введения бактериального эндотоксина ЛПС на экспрессию генов основных гормонов ГТАС в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках

3. Исследовать эффекты хронического бактериального воспаления на продукцию цитокинов в органах ГГАС.

4. Исследовать морфологию конечного звена ГТАС - надпочечников -при хроническом воспалении как для выявления изменений в стероидогенных клетках, так и для обнаружения возможных источников синтеза цитокинов.

Научная новизна исследования. На основании экспериментальных данных выявлены новые физиологические феномены в нейроэндокринной и иммунной системах, сопутствующие острому и хроническому воспалению.

1. Использована принципиально новая модель хронического бактериального воспаления (длительное введение ЛПС в нарастающих дозах), вызывающая в ГГАС изменения близкие аутоиммунной патологии и выражающиеся в изменении экспрессии генов гормонов и их рецепторов.

2. Показано нарастание количества биологически-активных рецепторов к глюкокортикоидным гормонам в мелкоклеточной части паравентрикулярного ядра гипоталамуса при остром воспалении (однократное введение ЛПС) и его снижение до контрольных величин при хроническом воспалении (длительное введение ЛПС), что определяет регуляцию экспрессии гена кортиколиберина в этих условиях.

3. Обнаружено, что экспрессия генов центральных нейрогормонов ГТАС при хроническом воспалении не зависит непосредственно от локального или периферического синтеза цитокинов, интерлейкина-1 (3 и йнтерлейкина-6, в то время как активация синтеза АКТГ в' гипофизе коррелирует с нарастанием локальной продукции интерлейкина-1, но не интерлейкина-6.

4. На световом и ультраструктурном уровнях в надпочечниках обнаружены характерные морфологические изменения, свойственные воспалительному процессу. Показана возможность локального влияния медиаторов иммунной системы, выделяемых активированными лейкоцитами, на стероидпродуцирующие клетки коркового вещества надпочечника.

Теоретическая и практическая значимость. Воспалительный процесс, имеющий глубокие эволюционные корни, неизменно привлекает

специалистов в области биологии и медицины как с точки зрения своей феноменологии, так и практического здравоохранения. Все исследования, проливающие свет на механизмы его реализации и понимания роли в этих механизмах взаимодействия основных регулирующих систем организма, представляются важными в своей концептуальной основе и значимыми для практической медицины, поскольку подводят теоретический базис к разработке новых диагностических критериев и терапевтических подходов к лечению и профилактике воспалительных процессов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Длительное введение бактериального эндотоксина в нарастающих дозах, судя по состоянию ГТАС, воспроизводит изменения характерные для воспалительных процессов наблюдаемых в клинике и других экспериментальных моделях хронического (аутоиммунного) воспаления у животных. Оно характеризуется угнетением синтеза кортиколиберина и нарастанием экспрессии вазопрессина в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса, а также повышенным синтезом АКТГ в аденогипофизе и кортикостерона в надпочечниках.

2. Наблюдаемые в ГГАС изменения обусловлены влиянием основных провоспалительных цитокинов (интерлейкииа-lp и интерлейкина-6) на различные ее звенья, преимущественно на гипофизарно-адренокортикальную ось.

3. При хроническом воспалении происходит частичная автономизация функций надпочечников, обусловленная вероятно локальными факторами (включающими цитокины), источником которых служат клетки иммунной системы.

Апробация работы. Результаты проведенной работы были доложены и обсуждены на Пироговской Межвузовской Научной Конференции (Москва 21-24 марта 2000), Юбилейной Научной Конференции посвященной 75-летию СПбГМА (Санкт-Петербург, 27-28 апреля 2000), 43 Annual Meeting of Society for Histochemistry (Austria, Vienna 26-29 September 2001), I Всероссийской Конференции "Физиология Иммунной Системы", 1 Всероссийской Конференции по Иммунотерапии (Сочи, Дагомыс, 11-14 октября 2003),

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, выводов и обсуждения результатов собственных исследований. Диссертация содержит 2 таблицы и 23 рисунка. Библиографический указатель включает 199 ссылок (20 отечественных и 179 зарубежных источника).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперименты проводились на крысах-самцах линии Wistar (питомник Кардиологического Научного Центра РАМН, Москва) весом 250-300 г в начале эксперимента. Животные содержались по 3 в клетке, получали свободный доступ к воде и сухому корму. Световой день составлял 14 часов. Адаптация к условиям вивария (кафедра гистологии и эмбриологии педиатрического факультета РГМУ) проводилась в течение 2 недель. За это время животных приучали к рукам ухаживающего персонала. За день до начала эксперимента животных взвешивали и рассчитывали дозировки ЛПС.

Всего в экспериментах было использовано 132 животных.

Экспериментальные группы

1) Контроль (п=24). Крысы получали и/п инъекции стерильного физ. р-ра (300 мкл). Инъекции производили 1мл (инсулиновыми) одноразовыми шприцами.

2) Однократное введение ЛПС (п=36). Использовали ЛПС, полученный из культуры Esherichia coli (Серотип Olli:В4, №L-3012, лот №36Н4130, Sigma, США). Дозировка ЛПС составляла 250 мкг на 100 г веса животного. Непосредственно перед инъекцией ЛПС растворяли в стерильном физ. р-ре, 300 мкл которого приходилось на одну инъекцию. Крыс убивали через 6 часов после инъекции.

3) Длительное введение ЛПС (п=72). Крысы получали ежедневные и/п инъекции ЛПС в течение 13 дней. Чтобы избежать привыкания к эндотоксину его дозу увеличивали каждые два дня: 25, 50, 100, 150 и 200 мкг на 100 г веса. В последний, 13-й, день эксперимента, животные получали ЛПС в дозе 250 мкг на 100 г веса и были убиты через 24 часа.

После декапитации крыс с помощью гильотины, определяли общий вес животного и обоих надпочечников, предварительно очистив их от жировой ткани.

Для проведения гибридизации in situ мозг быстро извлекали из черепной коробки и целиком замораживали на сухом льду. Гипофиз, надпочечник и селезенку заливали в среду Tissue Teck (Sacura Finetek Inc.USA), полимеризующуюся при охлаждении (-20С). В дальнейшем органы хранили в холодильнике при -80С°. Для проведения гибридизации использовали материал от 12 животных из каждой группы. Всего было использовано 36 животных.

Для проведения радиоактивной иммунной гистохимии мозг также быстро замораживали, а затем изготавливали серийные криостатные срезы гипоталамуса толщиной 20 мкм. С этой целью был проведен дополнительный эксперимент (10 животных в каждой группе)

Для проведения иммунной гистохимии ДАБ-глюкозооксидазным методом гипоталамус заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5 мкм, и монтировали на стекла в виде ступенчатой серии. После депарафинирования проводили иммуногистохимическое окрашивание ДАБ-глюкозооксидазным методом. Для этого исследования было проведен дополнительный эксперимент^ 10 животных в каждой группе).

Изучение морфологии надпочечников проводили у крыс общим числом 36 (12 животных из каждой группы). Для проведения исследования на световом уровне надпочечники фиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего заливали в парафиновые блоки. Для электронной микроскопии надпочечники фиксировали в 1% глутаровом альдегиде и заливали в эпон-аралдит для приготовления ультратонких срезов.

Гибридизация in situ.

Метод был использован для количественной оценки уровней транскрипции (гетеронуклеарной РНК) и экспрессии (матричной РНК) генов нейрогормонов:КРГ,ВП, их рецепторов, предшественника АКТГ-ПОМК, и фермента стероидогенеза в надпочечниках-Ир гидроксилазы, а также цитокинов в органах ГТАС.

Гибридизационные рибопробы синтезировались с фрагментов генов указанных пептидов, клонированных в плазмиды. Приготовление рибопроб производилось по стандартной методике, включающей линеаризацию плазмид, проведение in vitro транскрипции, преципитации пробы с транспортной РНК дрожжей, центрифугирование, высушивание и растворение осадка [Grinevich et al.,1997].

Гибридизация проводилась согласно стандартному протоколу [Grinevich et al., 1997]. Стекла с криостатными срезами (12 мкм) органов размораживали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем фиксировали в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере (рН 7,4) 5 мин, отмывали в фосфатном буфере (3 раза по 5 мин) и ацетилировали 10 мин в 0,25% уксусном ангидриде с добавлением 0,1М триэтаноламина на физиологическом растворе. Затем срезы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и хлороформе и высушивали при комнатной температуре. После этого на срезы наносили гибридизационный буфер, содержащий 2x106 микрокюри в мкл. пробы, меченой S-35, и инкубировали 12 часов при 55С°. После инкубации неспецифическое связывание удалялось путем промывки в стандартном цитратном солевом буфере (4xSSC) с 50% формамидом/250 мМ NaCl при 60С° в течение 20 мин, а затем - с добавленной в SSC рибонуклеазой А при 37С° в течение 30 мин. Затем проводили длительную промывку срезов в SSC нисходящих концентраций, финальным этапом которой был O.lxSSC при 50С 15 мин. После этого стекла переносились в 70 спирт на 1 -2 мин и высушивались при комнатной температуре.

Для определения мРНК ПОМК в гипофизе и llp-гидроксилазы в надпочечниках использовались синтетические 48 нуклеотидные пробы, которые метили S-35-дАТФ. Гибридизация проводилась при 47С в течение

12 ч, после чего стекла длительно промывали в стандартном цитратном солевом буфере (lxSSC) и экспонировали с рентгеновской пленкой 12-16 ч [ Harbuz, Lightman, 1989; Li, Grinevich et al., 1995].

Для оценки гибридизационных сигналов срезы экспонировались на высоко-чувствительной авторадиографической (рентгеновской) пленке ВЮМАХ MR (Kodak, IBI, New Heaven, CT, USA) с опытным выбором оптимального времени экспозиции для каждой из проб: 15 мин для мРНК ВП, 5ч для мРНК КРГ, 3 ч для мРНК ПОМК и 30 дней для мРНК ИЛ-1 и ИЛ-6. После проявления пленки оптическая плотность сигнала определялась с помощью компьютеризированной системы анализа изображений (Imaging Research, St Catherine, Ontario, Canada).

Плотность гранул серебра над каждой клеткой проводилась с помощью компьютеризированной программы NIH Image.

Статистическая обработка проводилась с помощью комплексного пакета программ ANOVA, включающего тест Fisher'a (least significant difference procedure - PLSD). P<0.05 считалось статистически достоверной разницей между экспериментальными группами.

Иммунная гистохимия.

ДАБ-глюкозооксидазный метод

На срезах гипоталамуса толщиной 5 мкм, содержащих ПВЯ и срединное возвышения нейрогипофиза выявляли КРГ и ВП, по ДАБ-глюкозооксидазной методике [Zaborsky, Heimer 1989].

В качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи антитела к КРГ (raGFP, Mobitec) и ВП (Chemicon International, CA, USA) в разведение: 1:10.000.

В качестве вторых антител использовали биотинилиорованные козьи антитела к иммуноглобулину кролика (Vector, USA) в

разведении 1:500. После инкубации с антителами срезы инкубировали с ABC комплексом (Vector, USA), Для визуализации срезы переносили в раствор содержащий 0.75% диаминобензидин, глюкоз-оксидазу (Sigma, США) и ß-D-глюкозу (Sigma, США). Продукт реакции приобретал коричневый цвет. Радиоактивная иммунная гистохимия

Для выявление и количественной оценки биологически-активных рецепторов к глюкокортикостеороидам в паравентрикулярном ядре гипоталамуса иммуногистохимическую реакцию проводили на криостатных срезах. В качестве первых антител использовали кроличьи поликлональные антитела к рецептору глюкокортикоидов (II типа), меченные S-35 (BuGR2, разведение 1:4000, Affinity Bioreagents).

В качестве вторых антител использовали радиоактивно-меченые (S35) ослиные антимышиные вторые антитела (разведение 1:500, Affinity Bioreagents) [Herman, Spencer. 1998].

После обезвоживания и высушивания стекла помещали в кассету с рентгеновской пленкой Kodak ВЮМАХ MR на 2 недели. Анализ

рентгеновских пленок проводили аналогично таковому после гибридизации in situ.Морфологическое исследование надпочечников

Для проведения исследования на световом уровне парафиновые срезы изготавливали через участок с максимальным диаметром надпочечника (толщина срезов 5 мкм). После этого срезы размещали на предметном стекле (SuperFrost Plus. Menzel-Glaser Germany), депарафинировали и окрашивали гематоксилином (по Эрлиху) и 1% р-ром эозина. Оценку средней ширины коры проводили на снимках полученных с использованием микроскопа Axiopran-2, Zeis, Германия и цифровой камеры Progress 3012 Control Electronic, Zeis, Германия, при увеличении х 20 , как минимум на 6 различных срезах от одного надпочечника (правого) от каждого животного из группы. Оценка снимков проводилась с использованием Adobe Photoshop 5.0

Статистическую обработку данных полученных при световой микроскопии проводили с помощью программ Biostat. Exe., Microsoft Excel, включающих тест Fisher'a (least significant difference procedure - PLSD). P<0.05 считалось статистически достоверной разницей между экспериментальными группами.

Для ультраструктурного исследования ткани надпочечника фиксировали в 1% глутарровом альдегиде в течении 3 часов после чего поводили осмирование в 2% 0s04 на 0,1 моль/литр какодилатном буфере (pH 7.3), дегидратировали в этаноле и заливали в смесь эпон 812-аралдит М. Для приготовления ультратонких (0.1 мкм) срезов использовали ультратом LKB [Bromma, Швеция]. Срезы исследовали на электронном микроскопе Yem-1200 EXIL

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеристика ГГАС при остром и хроническом воспалении

Вес животных и надпочечников Длительное введение ЛПС приводит к снижению динамики роста (день 13 - день 1 эксперимента) крыс: 11.0 ± 2.0 г в сравнении с контролем 32.9 ±4.1 г, Р0.01. При этом вес надпочечников в группе с длительным введением ЛПС был достоверно выше, чем в контроле (соответственно, 21.1 ± 0.7 и 18.0 ± 1.1 мг, Р<0.05).

Гипоталамус

мРНК КРГ в ПВЯ Однократная инъекция ЛПС вызывают существенное увеличение оптической плотности метки мРНК КРГ в мелкоклеточной части ПВЯ (Рис. 2, 3). Длительное введение ЛПС приводит к выраженному снижению (41%) уровней мРНК КРГ в ПВЯ (24 ч после последней инъекции) в сравнении с контролем, получавшим с физ. р-р (Рис. 2,3).

ЗЭНЗ-

ШЭШЙ - •

Рис.2 Экспрессия мРНК КРГ в мелкоклеточной части пяравентрикулярного ядра гипоталамуса после длительного введения ЛПС. Микрофотографии сделаны со стекол, покрытых фотоэмульсией после проведения авторадиографической in situ гибридизации с мРНК КРГ. Люминисцентная микроскопия. Объектив: 10

I ! базальные уровни ж -

6ч 13» бч 13л

Рис. 3 Экспрессия мРНК КРГ и КРГ-Р в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. * Р< 0.01 в сравнении с общим контролем, # Р< 0.01 с соотносимым контролем, @ Р< 0.01 с группой, длительно получавшей ЛПС.

мРНК рецептора КРГ в ПВЯ У контрольных животных экспрессия мРНК рецептора КРГ в мелкоклеточной части ПВЯ была очень низкой (Рис. 3). Однократное введение ЛПС вызывало значительное нарастание плотности метки мРНК КРГ-Р (на 585%, Р<0.01) (Рис. 3).

В группе с длительным введением ЛПС мечениебыло несколько выше показателей в контроле, но это различие было статистически недостоверным (Рис. 3).

КРГ-иммунореактивность в ПВЯ и СВ В то время как однократное введение ЛПС существенно не влияет на интенсивность окрашивания КРГ в мелкоклеточных нейронах ПВЯ и аксонах наружной зоны срединного возвышения, длительное введение эндотоксина приводит к выраженному снижению КРГ-иммунореактивности в этих структурах (24 ч после последней инъекции) в сравнении с контролем, получавшим с физ. р-р. мРНК мелкоклеточного ВП в ПВЯ Однократная инъекция ЛПС приводит к существенному нарастанию оптической плотности метки мРНК ВП в мелкоклеточных нейронах ПВЯ (на 201%, Р<0.001) (Рис. 4). Длительное введение ЛПС вызывает существенное нарастание оптической плотности метки, которое превышает этот показатель на 118% (Р<0.01) по сравнению с контролем, получавшим физ. р-р (Рис. 4).

Рис. 4 Экспрессия мРНК ВП в мелкоклеточной части ПВЯ гипоталамуса крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. * Р< 0.01 в сравнении с общим контролем, # Р< 0.01 с

соотносимым контролем, @ Р< 0.01 с группой, длительно получавшей ЛПС.

Ш6

ебазальмые уровни ЛПС

с* Ш

ВП-иммунореактивность в СВ Однократная инъекция ЛПС не вызывает существенных изменений в ВП-иммунореактивности крупноклеточных нейронов гипоталамуса, аксонах гипоталамо-нейрогипофизарного тракта и ВП-позитивных волокнах наружной зоны срединного возвышения. Однако, длительное введение ЛПС вызывает существенное нарастание иммунного окрашивания ВП в наружной зоне СВ без существенных изменений в других отделах гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы. Глюкокортикоидные рецепторы в ПВЯ Однократная инъекция ЛПС приводила к выраженному нарастанию плотности метки (153%, Р<0.01) по сравнению с контрольными уровнями (Рис.5). Длительное введение ЛПС также вызывало нарастание оптической плотности мечения. Однако степень нарастания сигнала была меньшей (137%, Р>0.05), чем в группе животных, однократно инъецированных ЛПС и этот показатель статистически достоверно не отличался от базальных уровней (Рис.5).

£ 2

£ |

о 5

ё 5

_ О)

£ ф

3 £

¡8

Р и

50

40

30

* 20

10

| | контроль К ЛПС 6ч

★

ЛПС 13д

Рис. 5 Уровни глюкокортикоидных рецепторов (II тип) в мелкоклеточной части ПВЯ у крыс с однократным и длительным введением ЛПС. *Р<0.01 в сравнении с общим контролем (физ. р-р).

Гипофиз

мРНК ПОМК и КРГ-Р в адсногипофизе Инъекция ЛПС вызывала достоверное увеличение плотности метки мРНК ПОМК по сравнению с контролем (30%, Р<0.05) (Рис. 6). При этом отмечалось снижение плотности метки мРНК КРГ-Р («даун-регуляция») (51%, Р<0.01) (Рис. 6). Длительное введение ЛПС, как и однократное, приводило к нарастанию мРНК ПОМК (30%, Р<0.05). При этом плотность метки мРНК КРГ-Р у этих животных не отличалась от контрольных цифр.

1 I базальные уровни ■ ЛПС

«ч 13ч

Рис. 6 Экспрессия мРНК ПОМК и КРГ-Р в передней доле гипофиза крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. @ Р<0.01, * Р<0.05 в сравнении с общим контролем, # Р<0.01- с соотносимым контролем.

Надпочечники

мРНК 11р гидроксилазы в надпочечниках Меченая мРНК 11 бета гидроксилазы (цитохром Р450) диффузно распределялась в пучковой и сетчатой зонах коры надпочечников (Рис. 7). Плотность метки нарастала после инъекции ЛПС до 130% (Р<0.01) (Рис. 7). На 14 день после введения ЛПС интенсивность мечения была еще выше - 160%, Р<0.001.

Морфология надпочечников

Однократное введение ЛПС приводит к достоверному увеличению ширины коркового вещества надпочечника по сравнению с контрольной фуппой (Табл. 1).

физ. р-р

ЛПС 13 дней

а

« я

с* £ <«

им Ь «9

я Е

ь 2

а §

Г к 20

1с а

X ш

а *

2 "

I о

ш

□ базальные уровни

Ж лпс

бч Ш

Рис. 7 Экспрессия мРНК 11 бета гидроксилазы в надпочечниках крыс, подвергнутых длительному введению ЛПС. Сверху представлены рентгенограммы транскриптов мРНК цитохрома. @ Р<0.01, * Р<0.05 в соавнении с обшим контоолем. # Р<0.01- с соотносимым контполем.

Таблица.1

Ширина коры надпочечника после однократного и длительного введения ЛПС

Контроль 4.8 +0,49 (Р<0.05)

Острое воспаление 5,4+0,20 (Р<0.05)

Хроническоке воспаление 6ч. 6,4+0,38 (Р<0.05)

Хроническоевоспаление 24ч. 6,8+0,28 (Р<0.05)

Рис.8 Электроннограмма коры надпочечника в группе крыс, длительно получавших ЛПС (увеличение 18000).

На световом уровне изменения характеризуются спазмом артерий и выраженным отеком их стенок. Наблюдается выраженный отек мелких артерий и фиброзной капсулы, расширение капилляров и венул с нарушением в них реологических свойств крови, краевое стояние клеток белого ростка крови.

На электронно-микроскопическом уровне отмечаются выраженные расширения эндоплазматического ретикулума, набухание митохондрий. Везикулярные кристы крупные, плотно прилежат друг к другу. При этом встречаются картины тесного контакта митохондрий с липосомами, лакунарная резорбция липидов. В стероидпродуцирующих клетках происходит увеличение количества мелких, темных, гомогенного вида гранул эндокринного типа, увеличено количество ядерных пор, что отражает усиление секреторной активности надпочечника в условиях возрастающих потребностей организма в ГК гормонах.

Эндотелиоциты, особенно венул и капилляров, имеют набухшую цитоплазму, отростки их укорочены (Рис 8). Клетки отличаются неровной поверхностью цитоплазматической мембраны, сохраняют способность к микропиноцитозу. Их ядра приобретают фестончатые контуры с множественными инвагинациями кареолеммы, маргинальным расположением крупных глыбок конденсированного хроматина и эксцентричной позицией ядрышек. В цитоплазме наблюдается расширенный гранулярный эндоплазматический ретикулум и большое число лизосом.

Ширина коры надпочечника была больше у животных в группах хронического воспаления и составила в группе животных забитых через 6 ч после последней инъекции ЛПС 6,4 +0,38 (Р<0.05), в группе животных забитых через 24 ч после последней инъекции ЛПС 6,8+0,28 (Р<0.05) (Табл. 1). Нарастание ширины коры происходит преимущественно за счет пучковой зоны На смену экссудативным процессам, преобладающим после однократной инъекции ЛПС, приходит активация клеток фибробластического ряда. Ширина коркового слоя надпочечника увеличена, клетки ее просветлены, что особенно заметно в периферическом отделе пучковой зоны, вакуолизированы, часть светлых эпителиоцитов в состоянии деградации.

В просвете сосудов нарастает количество элементов белой крови (Рис 8) (мононуклеаров с морфологией малых лимфоцитов), с тенденцией к краевому стоянию, встречаются очаговые скопления нейтрофилов и мононуклеаров.

В ткани надпочечника сосуды микроциркуляторного русла расширены с выраженными нарушениями реологических свойств крови и набуханием эндотелиоцитов.

На электроннограммах в группе животных, забитых через 6 ч после последней инъекции ЛПС, отмечается полиморфизм митохондрий с матриксом низкой электронной плотности, деструкцией их крист и мембран. Отмечается опустошение и вакуолизация цитоплазмы светлых клеток. Эндотелиоциты округлены, отростки укорочены с образованием широких фенестр (что повторяет картину острой фазы воспаления). Цитоплазма их просветлена, выражены явления пиноцитоза. В более поздние сроки (через 24ч после введения ЛПС) отчетливая гиперемия отмечается только в сосудистом аппарате внутренних отделов пучковой зоны. Содержание клеток белого ростка снижается от 6 к 24 ч, при этом отмечается повышение числа мезенхимальных элементов.

На электронно-микроскопическом уровне отмечается нарастание деструктивных процессов в клеточных элементах надпочечника, в том числе, отмечается отчетливое усиление процесса деструкции везикулярных крист митохондрий с дезорганизацией наружной и внутренней мембран митохондрий, отеком; происходит массивная резорбция липидных капель. В адренокортикоцитах увеличивается число первичных лизосом и аутофагосом. В некоторых клетках отмечается пикноз, рексис ядер. Максимально деструктивные явления выявлены в клетках находящихся в

фазе выделения секрета. Количество поли- и мононуклеаров в группе 24 ч относительно меньше по сравнению с острым воспалением и труппами 6 ч. В группах хронического воспаления выявлено большое количество

активированных и дистрофически измененных нейтрофилов.

Экспрессия цитокинов в головном мозге, гипофизе мРНК интерлейкина-1|3 В головном мозге контрольных животных специфического мечения обнаружено не было ни в одной из структур. Инъекция ЛПС вызывала появление метки в области циркумвентрикулярных органов и в сосудистых сплетениях боковых желудочков. У животных группы с длительным введением ЛПС плотность мечения была как минимум в 3 раза ниже, чем после однократного введения ЛПС.

В аденогипофизе однократная инъекции ЛПС вызывала увеличение плотности метки в передней доле на 335% (Р<0.01). У крыс с длительным введением ЛПС уровень и интенсивность сигнала была аналогичным. мРНК интерленкнна-6 В головном мозге контрольных животных специфического мечения обнаружено не было Инъекция ЛПС вызывала появление метки в циркумвентрикулярных органах в сходной манере с мечением мРНКИЛ-1. Однако после длительного введения ЛПС мы вообще не обнаружили специфического мечения в мозге.

В аденогипофизе инъекция ЛПС вызывала его увеличение на 242% (Р<0.001). Однако у животных с длительным введением ЛПС плотность метки не отличалась от контрольных уровней.

ОБСУЖДЕНИЕ

Эффекты острого и хронического воспаления

Ранее уже проводились попытки исследовать состояние ГГАС в моделях хронического воспаления, как аутоиммунного характера (артрит вызванный введением адьюванта, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, системная красная волчанка и др.), так и путем длительного введения ЛПС в течение нескольких дней. Использование одной и той же дозынеизбежно приводит к десенситизации к препарату [Такетига ^ а1., 1997; НасНс! й а!., 1995], именно поэтому мы использовали схему его двухнедельного введения в нарастающих дозировках, что позволило нам получить изменения в ГТАС характерные для хронического воспалительного процесса.

Гипоталамус

Однократная инъекция ЛПС приводила к нарастанию уровней мРНК КРГ и его рецептора в мелко и крупноклеточных частях ПВЯ гипоталамуса, что согласуется с данными группы Шуей из университета Лаваля, Канада [Я1уез1, ^уеБ! и ЬаПатте,1995] было также обнаружено, что после введения ЛПС происходит повышение плотности метки мРНК ВП в мелкоклеточной части ПВЯ.

Смыслом нарастания уровней мРНК ВП в КРГ нейроне после введения ЛПС могут быть альтернативные пути трансдукции через цАМФ (КРГ) и протеинкиназу А (ВП) синтеза АКТГ [Gilles et al., 1982; Münk et al., 1984; Aguilera, 1994; McEwen et al., 1997; Гриневич и др., 1999]. При этом полученные данные свидетельствуют о различиях в регуляции двух генов КРГ и ВП в одном и том же мелкоклеточном нейроне.

Экспрессия КРГ и его рецептора находится в динамическом равновесии, мРНК КРГ и КРГ-Р1 коррелируют друг с другом при остром воспалении, что указывает на роль этого рецептора в ауторегуляции КРГ нейрона. Хотя до сих пор нет однозначных свидетельств этой зависимости [Luo et al., 1994], можно лишь предполагать, что локальное выделение дендритами КРГ приводит к связыванию КРГ с рецептором, что активирует цАМФ и стимулирует транскрипцию гена КРГ. Таким образом, КРГ-синтезирующий нейрон может представлять собой некую замкнутую саморегулируемую систему, что проявляется как при остром воспалении, так и при хроническом.

Интересной и приоритетной находкой при остром введении ЛПС было обнаружение парадоксального нарастания количества биологически-активных, «открытых» ГК рецепторов в мелкоклеточной части ПВЯ. Известно, что нейрогенные стрессы приводят к «даун-регуляции» ГК рецепторов [Herman et al., 1995, Makino et al., 1995]. Это вызывает снижение ингибирующего действия ГК на КРГ нейрон по принципу обратной связи и способствует его активации при стрессе. Скорее всего, именно поэтому ГК не подавляют стресс-индуцированную экспрессию мРНК КРГ, что было показано ранее [Гриневич и др., 1999; Grinevich et al.,2001].

Важно отметить, что после длительного введения ЛПС количество рецепторов ГК в мелкоклеточной части ПВЯ у этих животных достоверно не отличается от контроля (с некоторой тенденцией к нарастанию). Снижение количества «открытых» ГК рецепторов (по сравнению с однократным введением ЛПС) отражает процесс их активной утилизации. Это может лежать в основе угнетения транскрипции гена КРГ в условиях хронического воспаления, указывая на реализацию длинной отрицательной обратной связи на гипотапамическом уровне.

Гипофиз

Как при остром, так и при длительном введении ЛПС мы обнаружили нарастание синтеза АКТГ в аденогипофизе. При этом, только в случае острого воспаления происходило снижение продукции в аденогипофизе рецептора КРГ. Подобная «даун-регуляция» была ранее описана а работах Rivier . При этом, хроническое введение ЛПС не оказывало

существенного влияния на уровни мРНК КРГ-Р. Последнее может связано со сниженной продукцией самого КРГ при хроническом воспалении. Исходя из этого предположения, можно заключить, что при хроническом воспалении даже небольшие уровни КРГ могут оказывать постоянное тоническое

влияние на синтез АКТГ. Кроме того, повышенные уровни ВП могут играть доминирующую роль в потенциации действия КРГ на аденогипофиз и регуляции синтеза и выделения АКТГ.

Надпочечники

Длительное введение ЛПС в нарастающих дозировках оказывало характерное для хронического стресса и хронического воспаления общеорганизменное влияние, снижая динамику роста животных и увеличение массы их надпочечников, демонстрирует активацию стероидогенеза в адренокортикоцитах.

Данные, полученные при морфологическом исследовании надпочечника, на световом уровне демонстрируют выраженные неспецифические изменения наблюдаемые в различных органах (в нашей ситуации органов брюшной полости) и характерные для воспалительных процессов, оказывающих системное влияние, на электронномикроскопическом уровне отражают активацию стероидогенеза в адренокортикоцитах.

Данные, полученные при анализе клеточного инфильтрата согласуются с патофизиологическими изменениями сопровождающими бактериальное воспаление. Наблюдаемая динамика в клеточном инфильтрате говорит о том, что в группе животных, длительно получавших ЛПС и забитых через 6 ч после последней инъекции на фоне выраженности воспалительного процесса, связанного с длительным введением антигена, сохраняется его активность вызванная новой инъекцией антигена. В группах 24 часа острота процесса падает, тем не менее сохраняющийся воспалительный процесс и поставляемые им медиаторы позволяют функционировать ГГАС на пределе функциональных возможностей. Продукты выделяемые активированными иммуноцитами инфильтрирующими надпочечник с одной стороны способны оказывать стимулирующее действие на секреторные клетки (цитокины), а с другой стороны (ферменты активированных макрофагов, НК, продукты респираторного взрыва) оказывают токсическое действие на функционально перегруженные клетки. В конечном итоге это приводит к их деградации стероидогенных клеток и возможной гибели части из них [Маэек е1 а1., 2003]. Однако в нашей модели мы не видели участков некроза и сопровождающих их кровоизлияний в ткань надпочечника, что, вероятно, говорит об обратимости наблюдаемых процессов и (или) значительных регенераторных способностях клеток надпочечника.

Тот факт, что при хроническом воспалении максимальное количество клеток крови выявлено в периферическом отделе пучковой зоны и сетчатой зоне так же подтверждает теорию о роли клеток ИС в локальной регуляции ГГАС и, в частности, ее периферического отдела посредством выделения различных медиаторов, в том числе цитокинов. Изменения же в циркуляторном русле демонстрируют предпосылки для такой "точечной" регуляции.

Цитокины

Экспрессия ИЛ-1 и ИЛ-6 в циркумвентрикулярных органах головного мозга и ПВЯ под действием ЛПС была продемонстрирована как в нашей работе, так и в предшествующих исследованиях ([Breder, Dinarelo, 1988; Lechan et al., 1990 Однако, демонстрация небольших

уровней ИЛ-1 в мозге при длительном введении ЛПС является нашим приоритетом. Весьма вероятно что даже небольшое (по сравнению с острым воспалением) нарастание мРНК ИЛ-1 способно изменять реактивность центрального звена ГГАС - КРГ нейронов ПВЯ в условиях хронического воспаления..

В аденогипофизе также была обнаружена экспрессия ИЛ-1 и ИЛ-6, что соответствует данным других исследователей , ;. Причем, экспрессия ИЛ-1 (но не ИЛ-6) оказалась достаточно высокой как после однократной инъекции ЛПС, так и после длительного введения эндотоксина. Поэтому можно предположить, что не только при остром], но и при хроническом ИЛ-1 р способен паракринно воздействовать на клетки аденогипофиза увеличивая продукцию ПОМК и, соответственно, усиливать секрецию глюкокортикоидов.

Экспрессия ИЛ-1 и ИЛ-6 в надпочечниках после однократного введения ЛПС также показана в ряде предшествующих работ

Однако, длительное аутоиммунное воспаление (артрит, вызванный введение адъюванта) не вызывал существенного напятяния уровней мРНК цитокинов ч

* Последнее может быть обусловлено недостаточной чувствительностью метода гибридизации in situ, поскольку в нашей работе был обнаружен морфологический субстрат продукции цитокинов - малые лимфоциты и моноциты., инфильтрирующие надпочечник при длительном введении ЛПС. Кроме того, сами кортикоциты способны продуцировать цитокины \ Возможно, что даже небольшие количества цитокинов,

действующих паракринно, могут оказывать существенное влияние на стероидогенез. Однако, этот вопрос требует дальнейшего изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

» В условиях хронического воспаления, моделируемого с помощью

длительного введения ЛПС, выявлены характерные изменения в ГГАС, свойственные хроническим аутоиммунным заболеваниям как в эксперименте, так и в клинике [8гегпЬег§. 2001]. Однако, при хроническом бактериальном воспалении выявлены и уникальные особенности, отличающие его от аутоиммунных процессов, в том числе особенности клеточного инфильтрата наблюдаемого при морфологическом исследовании. Основываясь на наших данных можно заключить, что при длительном бактериальном воспалении происходит смещение иммунного ответа с клеточного (Тх-1 типа) на Тх-2 тип на гуморальный (Тх-2 типа) ответ

[БгегпЬе^. 2001]. Данные процессы, вероятно, определяют характер цитокинового ответа и вызываемую ими стимуляцию синтеза центральных нейрогормонов ГТАС. Однако, остается открытым вопрос- что же может определять чувствительность иммунокомпетентных клеток к антигену при его длительном введении. Возможно, вследствие хронической стимуляции бактериальным антигеном происходит сенсибилизация и развивается процесс, аналогичный инфекционной аллергии, который присущ большинству бактериальных инфекций [Вейип й а!., 2001].

В модели хронического воспаления отчетливо просматривается автономизация периферических отделов ГТАС от центрального звена. Вероятно, это обусловлено локальным действием цитокинов в гипофизе и надпочечниках. Источником синтеза цитокинов в этих органах могут быть как клетки эпителия этих органов, так и клетки белого ростка, обнаруженные нами в надпочечнике.

Таким образом, представленные сведения расширяют наши представления о взаимодействии трех интегрирующих систем организма в условиях хронического воспаления. Кроме того, результаты этой работы имеют перспективу приложения в клинике для диагностики и прогнозирования степени тяжести воспалительных и аутоиммунных заболеваний и профилактики их обострений.

ВЫВОДЫ

1. Моделирование хронического воспаления путем длительного (13 дней) введениея бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС) в нарастающих дозировках (25-250 мкг на 100г., и/п) приводит к характерным изменениям в ГТАС,которые выражаются в подавлении синтеза кортиколиберина и нарастании синтеза вазопрессина, усилением продукции АКТГ в гипофизе и глюкокортикоидов в надпочечниках. Таким образом, мелкоклеточный вазопрессин становится основным центральным агентом в регуляции гипофизарно-адренокортикальной оси при хроническом воспалении.

2. При длительном введении ЛПС происходит активная утилизация глюкокортикоидных рецепторов в мелкоклеточном нейронах паравентрикулярного ядра гипоталамуса, что может быть причиной угнетения синтеза кортиколиберина.

3. Как при остром, так и при хроническом воспалении обнаружен л параллелизм в экспрессии генов кортиколиберина и его рецептора в мелкоклеточном нейроне паравентрикулярного ядра гипоталамуса, что позволяет предполагать существование внутриклеточного механизма саморегуляции этого нейрона.

4. При хроническом воспалении изменения в мелкоклеточных нейронах гипоталамуса не коррелируют с экспрессией цитокинов - интерлейкина-ф и ИЛ-6. Однако, активация гипофизарно-адренокортикальной оси в этих условиях возможно определяется локальными эффектами интерлейкина-1р

(но не ИЛ-6), уровень синтеза которого в гипофизе соответствует острому воспалению.

5. Детальный анализ морфологии надпочечников показал, что при хроническом воспалении происходит гипертрофия коры надпочечников обусловленная активацией и функциональной гипертрофией стероидогенных клеток. Наблюдаемые структурные и функциональные изменениями надпочечников коррелируют с типом клеток белого ростка крови инфильтрирующих надпочечник. Это позволяет говорить о том, что продукты активированных иммуноцитов способны локально влиять на функциональную активность органа в условиях хронического воспаления

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ресненко А.Б., Савелов Н.А. Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система у условиях воспаления // Материалы Пироговской студенческой научной конференции. Вестник РГМУ. -М,- 2000. -Т. 12. -№2.-С. 176.

2. Мишарин А.В., Савелов Н.А., Ресненко А.Б. Водно-электролитный баланс при воспалении // Материалы Пироговской студенческой научной конференции. Вестник РГМУ. - М.- 2000. - Т. 12. -№2.-С. 166.

3. Misharin A.V., Resnenko А.В., Savjolov N.A., Jirikowski G.F., Grinevich V.V. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) potentiates effects of osmotic stimulation on hypothalamic magnocellular neurons in the rat // Cellular and Molecular Biology. -2000. -Vol. 46. -Abstract 154.

4. Ресненко А.Б., Мишарин A.B. Гипотапамо-гипофизарно-адреналовая система в условиях воспаления // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию СПбГМА -Санкт-Петербург.- 2000-С.78.

5. Акмаев И.Г., Волкова О.В., Гриневич В.В., Мишарин А.В., Поскребышева Е.А., Савелов Н.А., Ресненко А.Б. Вазопрессин и воспаление // Морфология. -2001. -Т. 120. -№5. -С. 7-16.

6. Мишарин А.В., Ресненко А.Б., Гриневич В.В., Волкова О.В., Акмаев И.Г. Гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система при воспалении // Материалы XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. -Казань.-2001.-С. 390.

7. Grinevich V.V., Resnenko А.В., Jirikowski G.F. Effects of endotoxin lipopolysaccharide on vasopressin secretion in osmotically challenged rats. 43 Annual Meeting of Society for Histochemistry -Austria, Vienna -2001. -C. 206.

8. Акмаев И.Г., Волкова O.B., Гриневич В.В., Ресненко А.Б.Эволюционные аспекты стрессорной реакции // Вестник РАМН. -2002. -№6. -С. 24-27.

9. Ресненко А.Б., Абрамова Н.А., Мишарин А.В. Регуляция центральных звеньев гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при длительном воспалительном стрессе // Вестник молодых ученых. -2002. -Т. 1.-С. 16-22.

10. Ресненко А.Б., Мишарин A.B. Исследование функционирования гипоталамо-гипофизарно-нейросекреторной система в условиях острого воспаления // Материалы Открытого Российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2001 года по разделу "медицинские науки" Москва, 2000 С.150-151.

11. Гриневич В.В., Поскребышева Е.А., Мишарин A.B., Ресненко А.Б., Волкова О.В., Акмаев И.Г. Регуляция гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы при воспалении // Материалы II научной конф. С международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии", посвящ. 80-летию со дня рождения, проф. М.Г. Колпакова.-Новосибирск, 15—17октября 2002- С. 45-46.

12. Лискина Е.Б., Ресненко А.Б., Поскребышева Е.А., Волкова О.В., Гриневич В.В. Эффекты бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС) на синтез и секрецию вазопрессина в условиях депривации воды и солевой нагрузки // Материалы Всероссийской конференции "Нейроэндокринология-2003", Санкт-Петербург.- 2003.

13. Поскребышева Е.А., Волкова О.В., Ресненко А.Б., Гриневич В.В. Реакция коркового вещества надпочечников на острое и длительное введение бактериального эндотоксина липополисахарида у крыс (морфо-функциональное исследование) // Тез. II Общероссийской конф. "Проблемы морфологии (теоретические и клинические аспекты)", Сочи, Дагомыс, - 2003

14. Ресненко А.Б., Лискина Е.Б., Мишарин A.B., Поскребышева Е.А., Гриневич В.В., Акмаев И.Г.Роль интерлейкина (ИЛ) -lß и ИЛ-6 в регуляции гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при длительном воспалении у крыс // Физиология и патология иммунной системы -2003 -Т. 5. -С. 173-174

15. Мишарин A.B., Ресненко А.Б., Фиделина О.В., Гриневич В.В., Акмаев, И.Г. Система: «рецептор антидиуретического гормона 2-го типа — аквапорин-2» в почке крысы при остром воспалении. Бюлл. эксперим. биол. и медицины. -2004. -Т. 137. -№11. -С. 511-517.

Подписано в печать 18.10 2004 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная. Усл.п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №820

Типография АПРИКТ 123007, Москва, 5-я Магистральная 5.

РНБ Русский фонд

2006-4 20992