Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Система крови и массоперенос в организме

1:Я Г: - Я'?

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

БЕКЛЕМИШЕВ Игорь Борисович

УДК 612.111.113+612.111.''■ .о12.42

СИСТЕМА КРОВИ И МАССОПЕРЕНОС ' О*. ЧИЗМЕ

14.00.17 - пор -,ая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТОМСК 1992

ч • \

Работа выполнена в институте физиологии АН Республики Казахстан

Официальные оппоненты:

Академик, РАМН доктор медицинских наук, профессор Н.ВЛЗасильев

N1

Член-корр, РАН доктор биологических наук, профессор ЛДЛукьянова

Доктор медицинских наук профессор А-Н.Байков

Ведущая организация: Московский Государственный Университет, биологический факультет

Защита диссертации состоится " %Ь ' Ц10//Л, 1992г.

в_____часов на заседании специализированного совета (Д

084.28.02) по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Сибирском Государствнном Медицинском Университете (634050,Томск,Московский тракт-2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского Государственного Медицинского Университета (634050,Томск,Московский тракт-2 )

Автореферат разослан" ХУ " сМ<ЯЛ 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских

наук, профессор Федорова Т.С.

-••.ссертгцкй

Актуальность проблемы. Действие экологических факторов на организм прежде всего сказывается на состоянии крови (Ага-джанян, 1986; Агаджанян и др., 1987; Тевс, 1986). Поскольку кровь является всеобъемлющей системой в организме (Домбро-вский, 1968), можно предположить, что взаимодействие внешней среды и организма идет через внутреннюю среду и кровь, в частности. По всей видимости, в процессах их взаимодействия кровь не является пассивным переносчиком массы, энергии и информации к клеткам органов, а, обладая свойствами статистически детерминированной системы, активно удерживает кре-од Уоддингтона в оптимальном состоянии. Нарушения в системе крови приводят к изменениям качественно-количественных характеристик потоков вещества и информации от внешней среды к клеткам органов и между органами, что, видимо, и вызывает патологию. Свидетельством тому является диагностическая ценность показателей крови, а также обнаруженная закономерность, когда изменения мембран эритроцитов вызывает патологию в организме (Орлов с соавт., 1988). Не изучен вопрос массопереноса в системе внутренней среды. Существующая теория, основанная на градиентах осмотического, онкотического и гидродинамического давлений входит в противоречие с рядом фактов: избирательность переходов вещества, энергозависимость процессов и перенос против градиентов давлений. Несложный расчет площадей поверхности эритроцитов и капиллярной сети по исходным данным работ (Левтов, Регирер, 1982; Чернух, Александров, 1975) показывает, что общая площадь эритроцитов около -4 тыс. кв. м, а обменных капилляров- 8-50 тыс. кв. м. Если нанести слой плазмы крови на эту поверхность, то толщина его будет равна около 0.2 мкм, что более чем в 10 раз меньше радиуса действия молекулярных сил вблизи твердых поверхностей, образующих периодическую коллоидную структуру, приближающуюся к кристаллической при контакте с коллоидным раствором (Дерягин и др., 1990). В то же время, величина гидростатического давления на уровне.обменных капилляров падает в миллионы раз по сравнению с давлением в аорте и становится несущественной. Другими словами, на уровне обменных капилляров существешгую роль в процессах массообмена, по всей видимости, играет взаимодействие поверхностей эри-

троцитов и капилляров и изменение их адсор бентных свойств, т.е. переход состояний, а также взаимодейс твие адсорбентных слоев.

Цель работы. Исследование физиологических показателей системы крови, таких как вязкость, электролюминесценция, осмотическая и механическая устойчивость эритроцитов, их адгезивноств и адсорбентные свойства, активность мембранных №,К-АТФазы и 1^-АТФазы, протеаз и др. в связи с функцией обеспечения и инициации массопереноса. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: а) разработать методологические принципы исследования и специальные методики; б) изучить свойства крови как системы, т.е. переходные процессы в крови, реакцию крови на экологические факторы, такие как электромагнитные, магнитные, геомагнитные поля и космические излучения, 3,4-бензпирен, ионы свинца и др.;стру-ктурную кооперативность путем исследования фазовых температурных переходов, межклеточные взаимодействия в системе эритроцит-лейкоцит-эндотелиоцит и функциональную дифференциацию эритроцитов; в) исследовать механизмы обеспечения кровью массообмена в организме, т.е. адсорбентные свойства эритроцитов и артерио-венозный переход физиологических состояний крови.

Научная новизна. В работе показано, что основная функция крови -биохимическая интеграция в организме. Кровь, являясь термодинамически открытой системой, организована на принципах статистической детерминации.Кровь реагирует на внешние возмущения (такие, как воздействие лазерного излучения и изменение гидродинамического давления) с проявлением переходных процессов. Кровь имеет высокую степень структурной кооперативности, о чем свидетельствует узость области температурного перехода (/у = 2°С). Кооперативность наблюдали и в межклеточных взаимодействиях в ансамблях эритроциты-лейкоциты,эритроциты-эндотелиоцитыргейкоци-ты-эндотелиоциты.Эти взаимодействия опосредованы гуморальными факторами с мембранотропным типом воздействия,и-зменяющими вязкоэластические и адсорбционные свойства плазматической мембраны эритроцитов, митоген-активацию лимфоцитов и активность Иа, К-АТФазы клеток. Показано, эри-

троциты проявляют свойства адсорбента и ионообменника. Эти свойства эритроцитов, также как и активность иммобилизованных в плазматической мембране ферментов (Na.K-АТФаза, про-теазы), изменяются при действии на них мембранотропных веществ (колхицин, Кон А, ФГА, уабаин), а также при окси-и део-ксигенации. Адсорбентные свойства эритроцитов являются причиной изменения величины и состава адсорбционного слоя. Установлено, что адсорбционный слой эритроцитов, имеющий в своем составе белки, липиды, редуцирующие сахара и ферменты (каталазы, протеазы, пероксидазы), претерпевает изменения в количестве прочно- и слабоассоциированных с мембраной белков и компонентном их составе при переходе эритроцитов из артериального в венозное русло, при кровопотерях и введении фенилгидразина. Адсорбционный слой оказывает влияние на реализацию действия гормонов и проявляет свойства самостоятельного регулирующего фактора. В модельных экспериментах в диффузионных камерах изменение адсорбентных характеристик эритроцитов вызывало волну массопереносаДп vivo массоперенос в системе кровь - интерстиций - лимфа при мышечном сокращении проявляется в волнообразном изменении компонентного состава и содержании белка в лимфе, разно-направленности переноса белков с различной электрофоретиче-ской подвижностью.

Основные результаты и положения,выносимые на защиту. 1.Кровь является системой со статистической детерминацией и высокой степенью структурной кооперативносга. Кооперативно-сть охватывает и межклеточные взаимодействия в системе эритроцит - лейкоцит - эндотелиоцит, опосредованные гуморальными факторами. 2. Эритроциты проявляют свойства адсорбента и ионообменника, с изменением их свойств при действии ряда химических факторов, а также при окси - деоксигенации. изменение адсорбентных свойств эритроцитов влечет качественные и количественные изменения в адсорбентном слое. 3. Переход эритроцитов из артериального в венозное русло и изменение при этом их адсорбентных свойств инициирует волну мас-сопереноса в системе кровь-интерстиций-лимфа.

Практическая значимость. Разработанные методы и устройства внедрены в ряде НИИ АН КазССР, клиник МЗ КазССР, по-

дтверждены 12 актами внедрения. Внедрены 23 рационализации, получено 25 авторских свидетельств, включая три положительных решения на выдачу авторского свидетельства, продана лицензия в Югославию. Устройства демонстрировались на международной и ряде республиканских выставок. Экспонаты удостоены дипломами I и И степени ВДНХ КазССР.

Апробация-Результаты исследований были представлены на Всесоюзной конференции по биодинамике и биоэнергетике (Алма-Ата, 1972), III Всесоюзной конференции но фотоэнергетике (Алма-Ата, 1974), Всесоюзном симпозиуме по физико-химической основе действия физических факторов (Москва, 1974), I Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и прикладной биофизике (Краснодар, 1974), Всесоюзном симпозиуме по биофизическим свойствам крови (Саранск, 1975), ¡Всесоюзном семинаре по проблемам биоэнергетики организма (Алма-Ата, 1976), научно-практической Всесоюзной конференции по исследованию оптических квантовых генераторов в современной технике (Ленинград, 1977), Всесоюзной конференции по применению методов и средств лазерной техники в биологии и медицине (Киев, 1979), Всесоюзном симпозиуме по исследованию действия магнитных полей на живые организмы (Баку, 1972; Калининград, 1975), Всесоюзной научно-технической конференции по проблемам техники в медицине (Таганрог, 1980), на III конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1981), на Всесоюзной конференции-по проблемам нейрогуморальной регуляции деятельности висцеральных систем (Ленинград, 1987), Всесоюзной конференции "Массоперенос в системе микроциркуляции" (Горький, 1988), на I Съезде физиологов Казахстана (Алма-Ата, 1988), Всесоюзном семинаре по экологии человека (Самарканд, 1989), в различных 9 республиканских конференциях.

Публикации. Основные положения работы освещены в 52 статьях, 25 авторских свидетельствах и положительных решениях, 1 монографии и 1 методическом руководстве, 12 тезисах.

Объем работы. Текст изложен на 539 страницах машинописи, включая 184 рисунка и 18 таблиц, и состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, со-

держащего 629 наименований на русском и 391 на иностранных языках, 33 страниц приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом исследований была кровь экспериментальных животных- крыс, кроликов и собак, стабилизированная гепарином (50 Е/мл). Лимфу получали из доузловых и послеузловых протоков и грудного протока. Наркоз гексеналовый или тиопе-нталовый в зависимости -от вида животных в соответствии с прописями, описанными А.М. Чернух с соавт. (1975) и в кн.'Мо-делирование заболеваний " под ред. C.B. Андреева (1973). Преме-дикация гексеналом 40 мг /кг внутрибрюшинно или внутримышечно. Применяли следующие методы : (1) определение ка-талазной и (2) пероксидазной активности (Веггшеуег, 1974); (3) определение глюкозооксидазной активности (Меньшикова и др., 1987); (4) протеазной активности (Дэвени, Гергэй, 1979); активности (5) альфа-амилазы и (6) бета-амилазы (Bernfeld, 1955), активности (7) Na.K-АТФазы (Казеннов с соавт., 1984). Содержание неорганических элементов определяли на атомно-эмисси-онном спектрофотометре ДФС 13 и 11, а также на атомно-адсо-рбционном спектрофотометре "Perkin-Elmer" (США). Приготовление проб и работу осуществляли в соответствии с прилагаемыми прописями. Измерение молекулярных адсорбционных спектров производили на СФ -26, СФ-46, "Specord" и "Specol"

(ГДР).

Спёктрофлуориметрию осуществляли на MPF-2 (Япония), иК-спектроскопию - на UR-20 (ГДР). Содержание (8) белка определяли биуретовым методом в модификации Гареева (1982), а также по Лоури (9) (Lowry et al., 1951); (10) общие липиды определяли по прописи к набору химреактивов "Хемапол" (Чехословакия). Определение редуцирующих Сахаров (Somogy, 1952); (12) концентрацию гемоглобина определяли при помощи гемогло-бинцианидного метода (Пименова, Дервиз, 1974) , оксигемогло-бин - путем фотометрирования на длинах волн 650 и 550 нм в соответствии со спектрами поглощения гемоглобина и дезоксиге-моглобина (Вейеблут, 1%9), а также на оксигемометре. Механическую резистентность эритроцитов (14) определяли с помощью ультразвукового дезинтегратора "Uli" (ПНР) при частоте 1 кГц и времени экспонирования 2 с. Осмотическую резистенто-

сть (15) исследовали по методу Идельсона (1970), для полного гемолиза применяли "Lysing agent" (Швеция). Определение активности хроматина (16) определяли по методу Риглера с модификацией (Толмачев, 1986), измерение флуоресценции зондов осуществляли на микроскопе "Люмам и-3"(СССР) и на проточном цитофлуориметре "Coulter Epics С" (США). Относительную вязкость (17) определяли на вискозиметре Убеллоде. Показатель гематокрита (18) получали при помощи центрифугирования образцов в капиллярах на центрифуге МЦГ8 (СССР). Микрокалориметрические исследования (19) проводили на прецизионном микрокалориметре (СССР), спектр ЯМР (20)- на BS-467 (ЧССР). ЭПР (21)- на радиоспектрометре (СССР). Подсчет количества форменных элементов крови проводили на приборе "Celloscope-134" (Швеция) и "Picoscale" (Венгрия).Кондуктометри-ческие исследования (22) проводили на ОК-Ю2/. 1. Полярографические исследования (23) на полярографической установке. Прецизионную РНметрию- на ОР-925/2 ("Radelkis", Венфия). Электрофоретические исследования проводили в устройстве для электрофореза в трубке "Reanal" (Венгрия) в прямоугольном блоке геля (Хийу Калур, Эстония). Дискэлектрофорез без DS-Na (24) и в присутствии DS-Na осуществляли по методу, описанному Хабел, Салман(1972). изоэлектрофорез (25) - по методу, предложенному фирмой LKB с модификацией коллектива лаборатории биохимии ИМББ (Алма-Ата) (Гильманов и др.Д983}. Фиксацию и окраску зон проводили по способу Vesterberg(1971). Нами также разработаны 54 новых методических и технических решений, 26 из которых защищены авторскими свидетельства: ми.

Математическую обработку данных осуществляли на ЭВМ "Искра-1256* и ПЭВМ IBM PC/XT с использованием критериев Стьюдента, Вилкоксона и корреляционного анализа. Программы написаны самостоятельно по алгоритмам (Урбах, 1975). Достоверность отличия данных принималась при уровне значимости отличий с Р<0.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе эволюции организм выделил как особое резонансное состояние материи статистически детерминированную систему- внутреннюю среду, находящуюся одновременно в со-

стоянии системы и целостности, через внутреннюю среду организм осуществляет связь с внешней средой. Внутренняя среда обеспечивает биохимическую интеграцию в организме и состоит из следующих систем: крови артериального русла- инте-рстиция - лимфы- крови венозного русла, замкнутых в цикл и имеющих перемежающуюся активность с принципом сохранения mv, где m - масса, a v - скорость потоков. Кровь в этом цикле занимает особое положение, т.к. она обеспечивает первичную волну массопереноса в системе внутренней среды. Реакция на действие внешних факторов может.быть адекватной с нелинейным соотношением доза - эффект и "шумовой", когда доза-эффект имеют линейную зависимость. Однако во всех случаях кровь - это открытая термодинамическая система, что обеспечивается нарушением ядерно-цитоплазматических отношений клеточных элементов крови.

Реакция крови, как системы со статистической детерминацией процессов на действие внешних факторов.

Исследование осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) в течение суток и зависимость этого параметра от вертикальной (Z) и горизонтальной (Н) составляющих геомагнитного поля (ГМП), а также космического излучения показало, что корреляционная счязь ОРЭ с ГМП как (Z), так и (Н) имеет высокие значения, достигающие г = 0.70-0.87, причем более высокое воздействие оказывала Z-составляющая ГМП. Еще более стабильные значения коэффициентов корреляции получены с интенсивностью космического излучения. Эта закономерность наблюдалась как в случае изучения ОРЭ, так и при исследовании светорассеяния монохромного излучения эритроцитами. Ферромагнитное экранирование снижало корреляционную зависимость с ГМП. Однако при экранировании крови от космического излучения в свинцовых экранах наблюдали более высокую корреляцию с Н-составляющей ГМП на фоне значительного понижения резистентности эритроцитов.

Важным, на наш взгляд, является тот факт, что кровь in vivo имела меньшую корреляцию с ГМП и космическим излучением и большую индивидуальность, чем in vitro, а также то, что при растворении крови в физиологическом растворе Рингера-Локха наблюдалось снижение корреляции ко всем видам внешних си-

нхронизирутощих факторов, исследование действия искусственных магнитных полей в пределах 5-25 кА-в/м обнаружило ма-гнитозависимые процессы в клетках. Далее мы исследовали кровь, как периодическую коллоидную структуру и степень ее кооперативности. Такие параметры, как вязкость, сила поверхностного натяжения, электробиолюминесценция, электросопротивление на низких и высоких частотах, реологические характеристики кровотока, адсорбентные характеристики эритроцитов и активность Иа.К-АТФазы эритроцитарных плазматических мембран в зависимости от температуры в области 36-45° С имели экстремумы и изломы с /\1 2 С. Полученные данные свидетельствуют о температурном структурном переходе с высокой степенью кооперативности системы. Реакция крови на внешние возмущения, такие, как экстравазирование и воздействие лазерного излучения имела вид переходных процессов. Другими словами, реакция выражалась в резком изменении величин показателей крови с последующим возвращением к исходному значению. На основании всей совокупности результатов можно заключить, что кровь представляет собой статистически детерминированную систему с высокой степенью структурной кооперативности, которая охватывает сферу функциональных-межклеточных связей. В связи с этим в следующем разделе мы изучали межклеточные взаимодействия.

Межклеточные взаимодействия в крови Особенное в организации биологических систем проявляется в межклеточном и межтканевом взаимодействии в виде несимметричности характеристик обратной связи, как по информационной емкости, так и по силовым и энергетическим параметрам. Все это обусловливается сложностью пространственно-временной организации взаимодействующих подсистем с эффектами кумуляции функций, организаций фреймов и циклов и тд. Функциональная кооперация охватывает обе реципрокные системы клетки ядерную и цитоплазматическую, и по существу есть ни что иное, как многоуровневая регуляция.

Межэритроцитарные взаимодействия Опыты показали, что при линейно возрастающей концентрации эритроцитов в пределах гематокрита от 20 до 100% как в собственной плазме, так и в растворе Рингер-Локка осмотиче-

и

екая устойчивость клеток изменялась нелинейно и на графике имела вид колебательной кривой. При этом процент распавшихся эритоцитов при гематокрите 20, 50 и 80%, а также при гема-токрите 35, 65 и 100% имел очень близкие средние значения, равные соответственно 65,63,62 и 48,43,45%. Колебательный характер осмотической устойчивости эритроцитов при линейном изменении гематокрита в области 20-1СЮ% был получен как на крови практически здоровых людей (20 человек, 100 проб), так и на крови интактных животных (80, 400 проб) разного возраста и вида. Установлено, что обнаруженный нами концентрационный эффект проявлялся только при предварительном инкубировании клеток в среде, наиболее адекватной плазме крови здорового животного или человека. В случае таких патологий, как онкологические заболевания, концентрационная кривая существенно изменялась. Естественно было предположить, что концентрационный эффект должен проявиться и in vivo при изменении гематокрита, например в результате кровопотери и изменении состава среды и вымывания регуляторов путем активации фильтрационной способности крови методом инфузии физиологического раствора.

После острой кровопотери наблюдали три типа выраженных реакций со стороны эритроцитов. У 14 животных осмотическая резистентность(ОР) эритроцитов по сравнению с исходной уменьшалась на 15+4% (Р<0.01), у 15 животных увеличилась на 26 + 1% (Р<0.001), у 7 - осталась неизменной (Р=05). Особенность реакции крови на кровопотерю заключалось в том, что направление реакции зависело от исходной их устойчивости: если она была высока, то после кровопотери уменьшалась, если низка - увеличивалась, если близка к норме - не менялась. Во всех случаях после геморрагии у экспериментальных крыс наблюдали закономерное уменьшение гематокрита на 12+3% (р<0.01).

Закономерное уменьшение гематокрита, по-видимому, было следствием возмещения кровопотери в организме инте-рстициальной жидкостью, следовательно, выбросом в кровь и тканевых гемолитиков, что увеличило распад эритроцитов. С помощью этого предположения можно объяснить только часть полученных результатов, т. е. увеличение осмотического гемо-

лиза у ряда животных, вызванного геморрагией. Остальные полученные факты не укладываются в рамки предполагаемой модели постгеморрагической реакции эритроцитов. Так, увеличение устойчивости эритроцитов, вероятно, обусловлено специфическими химическими факторами, которые действуют реципро-кно гемолизинам, а при равенстве их действия реакции со стороны эритроцитов не наблюдается. Вследствие того, что в тканях найдены вещества, увеличивающие устойчивость эритроцитов, можно предположить, что они продуцируются эритроцитами или молодыми формами, способными к белковому синтезу с последующим их накоплением, или, что более вероятно, в результате ограниченного протеолиза гемоглобина.

Таким образом, постгеморрагическая реакция в первый час после кровопотери, возможно, обусловлена изменением соотношения гемолизинов и химических веществ, увеличивающих устойчивость эритроцитов. В таком случае реакция должна зависеть от исходного соотношения этих факторов, которое можно изменить, например инфузией 0.14 М ЫаС1 в количестве 20 мл/кг. Через 40 минут после внутримышечной инфузии раствора Рингера-Локка установлены выраженные, противоположно направленные реакции крови. При высоком распаде эритроцитов до инфузии наблюдали закономерное увеличение их устойчивости после инфузии. Так, до инфузии величина распада эритроцитов была равна 84+5%, после инфузии уменьшилась на 12% (Р<0.02). Если величина распада была близка к нормальной (72%), то инфузия не вызывала достоверных изменений (Р = 0.5). В случаях низкого распада эритроцитов (62+4%) после инфузии наблюдали ее увеличение на 10% (Р<0.02). Показания гематохрита во всех случаях до и после инфузии оставались неизменными. Количество лизированных эритроцитов при гема-токритах 20,50, 80%, а также 35,65 и 100% имело близкие средние значения. Такая симметрия является, видимо, показателем нормального соотношения клеточных популяций эритроцитов различного возраста. Если эритроциты разделить по возрасту на фракции и инкубировать отдельно, то характер зависимости осмотической устойчивости от гематокрита существенно изменялся. Это проявлялось в отсутствии вершин, симметрии и т.п. С помощью специального устройства - диффузионных камер,

предназначенных для изучения клеточных взаимодействий, было установлено явление дистантного взаимодействия двух зрптроцитарных кззесей с различно;: исходной осмотической с»о:п:остыо, находящихся в смежны;; камерах, разделенных мембранными фильтрами. Для этого в одну из рабочих полостей камеры вносили с помощью шприца взвесь эритроцитов с высоко;! осмотической резистентностью (ОР), в другую - с низкой ОР.Было обнаружено, что через 20 минут инкубирования клеток при температуре 36 + 0.5 С ОР эритроцитов в обеих рабочих камерах становилась одинаковой -средней между исходным!? величинами. Так, в опыте исходные значения ОР составляли 64+4% и 20 + 2%. После инкубации взвесей эритроцитов в смежных камерах, разделенных миллипоровым фильтром "Сь- пор" (диаметр пор 0.45 мгем), их ОР стала одинаковой 52+о%. Экспериментальные результаты по вышеописонной логике показали, что ОР эритроцитов з объемных соотношениях 1:1 и 1:0.25 действительно приближалась к среднему арифметическому значению от исходного, но только в случае миллипоро-вого фильтра, в случае же полиэтиленовой пленки или кварцевого стекла данный эффект отсутствовал. Отсюда можно сделать вывод, что эффект был обусловлен химическими веществами. Выяснение природы молекулярных соединений, повышающих ОРЭ, показало, что это вещество окрашивается фуксином, амидочерным 10 Б и дает положительную реакцию по Лоури. Вещество в спектре имело три максимума поглощения при 210, 280 и 350 им, инактивировалось термически при 60° С и при действии трипсина. Совокупность полученных результатов позволило сделать вывод, что факторы, повышающие устойчивость (резистины) имеют белковую природу. Было установлено также антигемолитическое действие белков, повышающих ОРЭ в гипотонической среде на 27 % (Р<0.01) по сравнению с контролем. Антигемолитические свойства белков (геморезистинов) были изучены при рентгеновском облучении животных и острой лучевой болезни. Белки антигемолитического действия разделялись электрофоретиче-ски в. ПААГе и по относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) находятся в предгемоглобиновых фракциях.

: юс;г. отмыт: .я эрлтрсцятоп в пнтерюккческо:I растворе 0.5 ^ каотлоаплп псааксслае осмотической устойчивости па 17 ЧР<0.С01). Характер аопцелтрацлолной ар ;сол нарушался. Кр'. с:::лее о елки с поверхности плазмаяеммы эритроцитов ;сопцсн7сл1т,.:оа:.глГ: эффехт ¡¡а фоне повышения г6шеЛ уегой-нааостг; ор:п'ро:;::то:: настлано сохранился, что, б щпмо, являлось ресультатом смыва гемолизинов, локалгпугс. ;ихсл на по-ьгьлиссгк плазм ал еммы. Б то :ке время гг.% ар .„гепшы, локализующиеся' в цитоплазме, выделялись в ере,-,,. Воздействие 1\таР приводило к значительному искажению ко..:,ентрацион-ных кривых.

Взаимодействия эритроцитов, лейкоцитов и зндотелиоци-

тов

В настоящее время интерес к изучению межклеточных взаимодействий, межклеточных интегративных или кооперативных систем резко возрос. Причина этого в том, что ряд жизненно важных функция организма не только кумулируется в пределах определенных компетентных клеток, но и модулируется клетками и тканями, не имеющими, как казалось ранее, отношения к данной функции.

В данном разделе описываются изученные нами взаимодействия эритроцитов, лейкоцитов и эндотелиоцитов. В первой серии изучали взаимодействие лейкоцитов и эритроцитов. Для этих целей ис,следовали кровь здоровых людей и больных с активным иммунным ответом с диагнозом:">троза прерывания беременности" (Авт. свид. N 876111).

Клинико-лабораторные исследования с использованием предлагаемого способа показали , что интенсивность флуоресценции повышалась.в 2 раза при действии среды, где инкубировали эритроциты больных. Сравнивая интенсивность флуоресценции лимфоцитов донора с собственной сывороткой, интенсивностью флуоресценции при добавлении сыворотки больной видно, что флуоресценция уменьшалась в среднем на 7.5%. В то время как добавление в 5-минутную культуру среды, где инкубировали эритроциты этих же больных, показало увеличение интенсивности флуоресценции и составило 16%. Следует обратить внимание, что в тех случаях, где процент отличий интенсивности флуоресценции под действием сыворотки был

низок и затруднял постановку диагноза, то под действием среды, где инкубировали эритроциты пациентов, процент отличий достоверно увеличился и позволил поставить точный диагноз угрозы выкидыша. 60-минутное культивирование лимфоцитов донора с сывороткой крови больных показало, что интенсивность флуоресценции лимфоцитов увеличивается з среднем на 6%, в то время как добавление в культуру среды, где инкубировали эритроциты пациентов, вызывало увеличение интенсивности флуоресценции почти в 3 раза и составило в среднем 13%, что способствовало более точному установлению диагноза.

В следующей серии экспериментов исследовали взаимодействие эритроцитов и лейкоцитов,где в качестве показателя изучали активность мембранной Ма,К-АТФазы. Особенность хода экспериментов заключалась в том, что клетки (эритроциты и лейкоциты) крови белых беспородных крыс весом 250-300 г., стабилизированной гепарином (50 Е/мл), отмытые в растворе 0.14 М №С1 инкубировали с раствором ФГА или Кон А (10 мкг/мл физраствора) в соотношении 1:1. После часа инкубации центрифугировали 10 мин при 400 g и 20°С. Супернатант применяли в качестве инкубационной среды. Были получены следующие результаты. ФГА в указанной выше концентрации подавлял активность мембранной №,К-АТФазы эритроцитов артериального русла с 1.8 до 0.62 мкМ К/час на 1 мл клеток (Р<0.001) и венозного русла с 1.25 до 0.54 мкМР1/час на 1 мл клеток (Р<0.05). Влияние на эритроциты инкубационной среды лейкоцитов неоднозначно в случае эритроцитов артериального и венозного русла. Так, инкубационная среда не изменила активность мембранной Иа,К -АТФазы артериальных эритроцитов (1.68 и 1.8 мкМ Р1/час на 1 мл клеток (Р = 0.5) в контроле и опыте соответственно). Однако в случае венозных эритроцитов инкубационная среда вызвала подавление активности 1Ча,К-АТФазы с 1.25 до 054 мкМ Р1/час на 1 мл клеток £Р<0.05).

Совместная инкуоация эритроцитов с инкубационной средой неактивированных ФГА лейкоцитов не вызвала изменения активности N3,К-АТФазы как эритроцитов венозного (Р = 05), та-X и артериального (Р=0_5) русла крови. Поскольку в инкуоаци-онной среде активированных ФГА лейкоцитов имеется определенная концентрация ФГА, которая и подавляет активность-

№,К-АТФазы эритроцитов, мы провели исследование влияния инкубационной среды активированных лейкоцитов на эритроциты также после часовой инкубации с ФГА. В случае артериальных эритроцитов мы наблюдали повышение активности Ка,К-АТФазы в инкубационной лейкоцитарной среде с 0.62 до 1.63 мкМ Р1/час на 1 мл клеток (Р<0.001). В то же время венозные эритроциты не реагировали на инкубационную лейкоцитарную сроду - 0.54 и. 0.68 мкМ Р1/час на 1 мл .-леток (Р=0.5) в контроле и опыте соответственно, тогда как подавление активности Ма,К-АТФазы после инкубации с ФГА было одинаковым - 0.62 и 0.54 мкМР1/час на 1 мл клеток (Р=0.5) у артериальных и венозных эритроцитов, соответственно.

Достоверно отличались и активности эритроцитарных №,К-АТФаз после инкубации с лейкоцитарной средой (Р=0.001). Таким образом, полученные результаты прямо указывают на существование гуморальных факторов, влияющих на эритроциты артериального русла. В следующей серии экспериментов мы исследовали активность мембранной №,К-АТФазы лейкоцитов при воздействии на них инкубационной среды эритроцитов, преинкубированных с митогеном Кон А (10 мкг/мл). Условия эксперимента были те же, что и с ФГА. Воздействие на эритроциты также аналогичное в отношении активности АТФазы т.е. наблюдали повышение активности (активность фермента выражали в мкМ Р1/час на 1мг белка). Супернатант, полученный после инкубации с артериальными эритроцитами, не оказал влияния на активность АТФазы артериальных лейкоцитов (0.26 + 0.02), но повысил активность этого фермента у венозных лейкоцитов (0.440+0.016, Р<0.01). Супернатант, полученный после инкубации с венозными эритроцитами, снизил активность Ма,К-АТФазы артериальных лейкоцитов до 0.080 + 0.009 (Р=0.01), и, в меньшей степени, венозных лейкоцитов - 0.128 + 0.006, Р=0.1. Полученные результаты доказывали существование эритроцитарных факторов, модулирующих активность Ка,К-АТФазы лейкоцитов. Таким образом, обнаружено взаимодействие и кооперация лейкоцитов и эритроцитов, исследование адгезии лейкоцитов и эритроцитов показало, что эритроциты артериального русла имеют более низкую, на 34% адгезию к лейкоцитам, нежели эритроциты венозного русла. Если эритроциты отмывали

от плазмы в растворе 0.14 М №С1, отличие артериальных и венозных эритроцитов сохранялосьна фоне значительного понижения адгезии эритроцитов к лейкоцитам. Существенно различалась адгезия эритроцитов разного возраста :< лейкоцитам.

В следующей серии экспериментов мы исследовали взаимодействие эритроцитов и эндотелиоцитов. В качестве показателя исследовали активность >Та,К-АТФазы эритроцитов. На специально разработанной установке осуществляли перфузию кровеносных сосудов: вен, артерий и аорты изотоническим раствором сахарозы в течении одного часа, после чего раствор применяли в качестве инкубационной среды эритроцитов.

Получили следующие результаты . Перфузат сосудов - вен, артерий и аорты оказывал различное влияние на активность ИаД-АТФазы: так,перфуза1 вен понижал активность N8, К-АТФазы эритроцитов, аорты повышал, а действие перфузата артерий проявляло тенденцию к повышению активности фермента.

Таким образом, полученные результаты указывают на взаимодействие лейкоцитов с эритроцитами и эритроцитов с эндо-телиоцитами.

Взаимодействие клеток с образованием кооперативных систем и множественности одномоментного взаимодействия с регулирующими факторами по типу адекватного и "шумового" взаимодействия стайит вопрос о системной реакции клеток. Поэтому в следующей серии исследований мы изучали вопросы системных реакций клеток и роли в них плазменного окружения (микросреды). Все мембранные сайты, воспринимающие информацию от первичных мессенджеров - гормонов, антигенов и др. - составляют высоко-кооперативный кластер, системно связанный с соответствующим цитоплазматическим компа-ртментом. Мембранный кластер и цитоплазматический компа-ртмент составляют элементарную бинарную ячейку, системного восприятия и системной реакции на внешнюю информацию. Основным принципом данной модели является принцип ассоциации. Он означает, что при воздействии гуморального фактора на определенные сайты происходит, во-первых, восприятие информации кластером в целом в результате распространения в его пределах волн ассоциации с ++,--, + - и -+ взаимовлияния-

мн, во-вторых, сродство сайта лиганду зависит от конкретной ситуации,определяемой вышеуказанными взаимодействиями с +-г,--,-г- и —г характером. Ксоперативность кластера определяют пре;кде всего белки цитоскелета и липидныи опекой. Длл доказательства основных моментов предложенной медели были проведены исследования па эритроцитах и лейкоцитах.

В качестве модели-, изменяющей состояние цитоплазмы, использовали оксиг .¡нацию эритроцитов. После оксигенации по сравнению с эритроцитами венозной крови (ВК) осмотическая устойчивость увеличивалась на 20% (Р<0.05), адгезивность снижалась на 5%, а вязкость отмытых эритроцитов- на 54% ^Р<0.01) и на 1% (Р<0.05)- неотмытых, уменьшалась адсорбция с елка на мембране с 75.4 мг/л до 26 мг/л (Р<0.05), возрастала активность мембранной На,К-АТФазы с 1.02 до 154 мкМ Р1/час на 1 пл клеток (Р<0.01), активность иммобилизованных протеаз до оксигенации была 2.04 ед., а после оксигенации - 1.44 ед(Р<0.01). Наблюдали также отличия в реактивности на адреналин и ацетилхолин (о чем будет сказано ниже). Итак, вышеприведенные данные свидетельствуют о наличии влияния ци-топлазматического компартмента на плазматическую мембрану.

В случае артериальных эритроцитов(АК) одновременное действие адреналина и ацетилхолина повышало активность ИаД-АТФазы по сравнению с одиночными вариантами, но до уровня, несколько ниже контрольного ( 1.224 и 1.612 мкМР1/ча-с/мгНЬ в контроле). Был выявлен антагонизм действия адреналина и ацетилхолина на активность ЫаД-АТФазы эритроцитов АК и ВК. Для оценки вклада белков цитоскелета и липидов мембраны в ассоцииации восприятия сигнала было изучено влияние преинкубации клеток с колхицином и последующей инкубации с адреналином и ацетилхолином на активность Ка,К-АТФа-зы. Колхицин в контроле снижал активность фермента с 0.972 до 0.580 мкМР^час/мгНЬ ( Р = 0.05 ). Реакция ИаД-АТФазы на адреналин инвертировалась после действия колхицина - возрастала до 0.732 мкМР^/час/мгНЬ ( Р = 0.05 ). Ацетилхолин после инкубации с колхицином практически не изменял активности АТФазы. Также не отличалась активность фермента после со-

>

вместного действия адреналина, ацетилхолина и колхицина от контроля с колхицином, но была существенно ниже таковой в варианте "совместное действие адр + ацх в отсутствии колхицина" - 0-532 и 0.816 мкМР1/час/мгНЬ соответственно (Р= 0.06). Эти данные указывают на несомненное участие цитоскелета во взаимодействии адрено- и холинорецепторов с ИаД-АТФазой и в целом в обеспечении эффекта ассоциации ++,+-,-+ и +- влияний на уровне плазматической мембраны. В следующей серии мы использовали олеиновую кислоту (ОК) для оценки роли липи-дов мембраны в данном взаимодействии. В присутствии ОК адреналин меньше ингибировал активность фермента, ацети-лхолин несколько повышал активность по сравнению с контролем. Адреналин и ацетилхолин вместе также повышали активность, но в меньшей степени, чем в случае без олеиновой кислоты. Эти данные указывают на то, что липиды мембраны также оказывают влияние на антагонистические ваимодей-ствия адрено- и холинорецепторов и ИаД-АТФазы эритроцитов и обусловливают кооперативность кластера.

В следующей серии экспериментов исследовали системные реакции лимфоцитов. В качестве показателя выбрана адсорбция акридинового оранжевого (АО) с последующим люмини-сцентным анализом. В качестве воздействующих агентов применяли адреналин, ацетилхолин, инсулин и альфа-токсин. Механизмы реализации действия агентов и активация биологических процессов в клетке отличаются, но сходство заключается в том, что первичным процессом является лиганд-рецепторное взаимодействие. Для изучения системных реакций лимфоцитов применяли одновременное и раздельное действие агентов и сравнивали с расчетным ожидаемым эффектом. Полученные результаты указывают на проявление ассоциации сигнала с + + , +-, - + и — влияниями при сочетанном .действии вышеперечисленных агентов. Итак, экспериментальные результаты подтверждают основные положения высказанной гипотезы. Следующий раздел работы основывался на предположении, что адсорбционный слой (АС) играет важную роль в гуморальной регуляции клеток, в частности эритроцитов. Мы рассматриваем АС как структурно-организованную систему с высокой лабильностью, с изменяющейся во времени и регионально по площади

клетки фильтрационной способностью по отношению к компонентам плазмы и, в частности, гуморальным регуляторам. Исследование активности ИаДС-АТФазы показало, что удаление слабоассоциированных белков вызывает тенденцию к повышению активности. Удаление сильноассоциированных белков

•приводило к резкому увеличению активности Ка,К-АТФазы, с.....

0.628 до 1.124 мкМ Р^час/мг НЬ (Р=0.001). Действие адреналина в концентрации, превышающей физиологический уровень - 0.1 мкМ, на эритроциты с АС, с прочноассоциированной частью АС и без АС значительно различалось. Действие адреналина на эритроциты с АС вызывало тенденцию к уменьшению активности фермента. Удаление слабоассоциированной части белков увеличивало активность фермента после действия адреналина по сравнению с неотмытыми эритроцитами с 0.532 до 0.696 мкМ Р1/час/мг НЬ (Р<0.1). Полное удаление АС на фоне адреналина в данной концентрации приводило к увеличению активности АТФазы до 1.02 Р1 /час/мг НЬ, однако эта величина была ниже, чем у клеток с удаленным АС и не подвергнутых действию адреналина - 1.124 /час/мг НЬ. Необходимо отметить, что изучение активности Иа,К -АТФазы после инкубации с адреналином в супрафизиологической концентрации не показало резких различий с контролем, и картина влияния АС на активность фермента была аналогичной таковой в контроле. При действии адреналина в концентрации 50 нМ наблюдали значительное влияние АС на реализацию действия катехоламина. При сохранении АС адреналин не изменял активность АТФазы, при удалении слабоассоциированной части наблюдали резкое увеличение активности фермента с 0.692 до 0.964 Р1/час/мг НЬ (Р< 0.001). Полное удаление слоя привело к незначительному уменьшению активности с 1.124 Р1/час/мг НЬ в контроле до 1.064 Р^ча-с/мг НЬ, но превышению по сравнению с действием адреналина в высокой концентрации -1.02 Р|/час/мг НЬ.

Функциональная дифференциация эритроцитов Морфофункциональное разнообразие эритроцитов является важным свойством крови, как системы,необходимым для обеспечения ее устойчивости за счет авторегуляции, так и способности к множественным адекватным взаимодействиям. Для изучения физиологического разнообразия мы исследовали эри-

троциты, разделенные седимеитацпонно по плавучей плотности. Изучали следующие параметры: электропроводность на частоте измерения 1115 Гц; вязкость при помощи капиллярного вискозиметра, гематокрит ( в этих трех случаях исследовали кровь быков и озец), pH, активности протеаз и Ка,К-А1Фазы, количество белка, адсорбированного на мембране, механическую и осмотическую резистентности. В ряде случаев эритроциты получали из артериального (ЭАК) и венозного (ЭЗК) русла и изучали в сравнении.

Для разделения эритроцитарной массы на возрастные группы по плотности кровь центрифугировали при SGGg в течении 20 минут,плазму и слой лейкоцитов удаляли, а эритроцитарную массу делили на пять равных частей в градуированных пробирках по методике A.SAllison и G.P.Burn (1955), A.Tokunaga (1983), считая, что возраст эритроцита коррелирует с его плотностью (Prentice, Bishop, 1965; Gansoni et al., 1971; Bentier, 1985) и самая старая популяция расположится на дне пробирки, а в верхней ее части самая молодая (Allison, Burn, 1955). Условно обозначили наиболее молодые формы эритроцитов 1-ой фракцией и далее цифрами по мере старения - 2,3,4 и 5. Как показали наши исследования, вышеописанный способ разделения эритроцитарной массы наиболее прост и наименее губителен для клеток, нежели существующие наряду с ним высокоскоростное центрифугирование (85000g) (Ли и др., 1982) и, кроме того, позволяет получить больше экспериментального материала по сравнению с разделением в градиенте плотности (Grzelinska et 25 - al., 1983).

Изменения возрастного и функционального разнообразия эритроцитов в кровотоке добивались 2 типами воздействия: 1) введением фенилгидразина (2.5% раствор фенилгидразина на физрастворе вводили подкожно, из расчета 0.3 мл на 1 кг веса животного в течение 5 дней, на восьмой день осуществляли забор крови для анализов), разрушающим старые эритроциты, и 2) подострой кровопотерей (20% общей массы циркулирующей крови), вызывающей выброс депонированной крови.

При введении фенилгидразина происходит разрушение старых форм эритроцитов и активация клеточной продукции, т.е. омоложение крови. При 20% кровопотере у собак не происходит изменения гематокрита, т.е. кровь возмещается за счет депони-

рованного объема,функционально отличающегося от циркулирующих эритроцитов, в связи с чем вносится фушщноналыюе разнообразие в систему.

Результаты измерения вышеприведенных параметров ЭВК и ЭАК, разделенных по плотности (возрасту) на 5 фракций, сведены в таблицу 1. За исключением электропроводности, вязкости, гематохрпта г. рН ЭАК, для Есех изученных параметров не выявлена линейная зависимость от возраста клеток. Это, по всей вероятное. I, позволяет сделать вывод, что не возраст, а изначальное функциональное разнообразие клеточных популяций является основой межфракционных отличий. После крово-потери (см. табл.2), наблюдали существенные изменения в изучаемых параметрах с более контрастным проявлением у ЭВК и следующими закономерностями. Коэффициент корреляции (г) зависимости рН от возраста ЭАК до кровопотери и после нее -0.515, венозных 0.209, ЭАК и ЭВК в норме -0.478, после воздействия 0.908. После кровопотери наблюдали общее увеличение количества белка, слабоассоциированного с поверхностью как ЭАК, так и ЭВК на фоне уменьшения его в плазме. Исключение составили клетки артериальной крови третьей фракции, где уровень изучаемого показателя в контроле достоверно превысил таковой после воздействия (0.250 + 0.015 г/на 1 мл клеток и 0.217 + 0.020 г/на 1 мл клеток, соответственно, р< 0.02). Количество белка, прочносвязанного ион-ионными силами с мембраной, существенно изменялбеь после кровопотери. Так, до кровопотери количество прочноассоциированного белка на поверхности ЭАК четвертой фракции было мини мальным в контроле, что составило 0.033+0.001 г/на 1 мл клеток, после кровопотери -0.067 + 0.008 г/на 1 мл клеток, что оказалось максимальным для клеток всех фракций (р< 0.02). Лишь в третьей фракции ЭАК было получено снижение количества прочносвязанного с мембраной белка после кровопотери (0.041+0.002 г/на 1 мл клеток в контроле и 0.026 + 0.001 г/на 1 мл клеток после воздействия, р< 0.02). Коэффициент корреляции уровня протеолитической активности между эритроцитами артериальной и венозной крови в зависимости от их возраста в норме был равен -0.095, после воздействия -0394; между ЭАК в норме и после кровопотери 0.490, ЭВК до и после кровопотери 0.249. Полученные данные свидете-

льствуют о том, что после кропопотерл возросла отрицательная :;орреляцпя между :.ритроцт1таг.;и артериальной и венозной кро-зи. Количество белков, прочносвяза:шых с мембраной эрнтро-цитоз, значительно изменилось после кровопотери. Коэффициент корреляции у ЭАК до и после кровопотери -0541, ЭБК -0.091, между ЭАК и ЭБК до кровопотери -0.724, после Бездействия -0.015. Обращает на себя внимание тот факт, что но всех случаях наблюдалась обратная корреляция изучаемого показателя у эритроцитов артериального и венозного русла, видоизменяющаяся после кровопотери. Корреляционный анализ,проведенный между рН и количеством прочносвязанных белков на поверхности эритроцитов показал, что для эритроцитов артериальной крови составляло г=0.237, для эритроцитов венозной крови г=0.001; после кровопотери для ЭАК г=0.076, для ЭВК г=-0.852. В случае слабосвязанных белков корреляция с рН у ЭАК в норме оказалась равной -0.873, у ЭВК 0.689; после кровопотери у ЭАК г=-0.853. у ЭВК г= -0.256. Полученные данные указывают, прежде всего на то, что рН-зависимые взаимодействия определяют преимущественно адсорбцию и десорбцию прочносвязанных белков и, кроме того, на то, что после кровопотери эти связи изменяется. Если разделенные по возрасту эритроциты преи-нкубировать в аутоплазме, то в результате постоянного протекающих процессов адсорбции и десорбции происходило изменение концентрации белка в ней. Исследования количества белка в плазме, в которой инкубировали эритроциты разного возраста показали, что количество белка существенно изменялось в зависимости от возраста эритроцитов артериального и венозного русла. Корреляционные зависимости в этом случае были следующие: у ЭАК и ЭВК в норме была обнаружена практически полная корреляция по данному показателю (г=0.997), после кровопотери картина изменилась на противоположную (г=-0.711). Коэффициент корреляции уровня данного показателя у эритроцитов артериальной крови до и после кровопотери 0.399, у эритроцитов венозной крови 0.446.

После введения фенилгидразина и изменения возрастного состава клеток изменения изученных показателей были не столь значительны (см. табл. 3). Содержание слабоассоциирован-ного белка на поверхности эритроцитов артериального русла

после действия фенилгидразина ниже контрольного при сохранении характера изменений количества белка по плотностпым фракциям -..-.им же, как п в контроле. Для ЗВК также было отмечено снижение содержания слабоассоцнированного белка после воздействия у клеток всех фракций, кроме первой. Коэффициент корреляции у ЭАК по содержанию белка, слабоассоци-ированпсго с поверхностью клеток, до и после действия фенилгидразина 0.993, ЭВХ - 0.668, между ЗАК и ЭВК в контроле 0.874, после воздействия 0.935.7Г.с., данный вид воздействия по показателю адсорбции слаоссзязанных белков не вызвал сухцествел-ных сдвигов. Анализ показал, что коэффициент корреляции ЭАК и ЭВК в содержании прочноассоциированного белка в контроле -0.724, после действия фенилгидразина 0.967. т.е. данный вид воздействия значительно изменял содержание прочноассоциированного белка. Как видно из таблицы, действие фенилгидразина не вызвало достоверных изменений уровня активности протеаз у ЭАК всех фракций, кроме четвертой (р < 0.01) и пятой (р< 0.02). Активность протеаз при подострой кровопотере снизилась у эритроцитов артериальной и венозной крови. Действие фенилгидразина проявилось в разнонаправленном характере изменений ее уровня у клеток разного возраста артериальной и венозной крови.

Таким образом, изменение эритроцитарного состава крови изменяло зависимости измеряемых параметров от плотности фракции эритроцитов. Действие подострой кровопотери проявилось в увеличении количества слабоассоциированных белков на поверхности ЭАК и ЭВК и прочноассоциированных белков на поверхности ЭАК при разнонаправленном характере изменений количества прочноассоциированных белков на поверхности ЭВК. Действие фенилгидразина связано со снижением количества слабоассоциированных белков и увеличением - прочно-ассоциированных белков на поверхности ЭАК и ЭВК разделенных по возрасту.

Адсорбентные свойства эритроцитов

Транспортная функция крови осуществляется в основном эритроцитами и обусловлена их значительной поверхностью. Эритроциты можно рассматривать как объемный адсорбент, причем объемная абсорбция осуществляется по отношению к

кислороду и неорганическим элементам, а поверхностная ад сорбция - по отношению к органическим компонентам среды и неорганическим элементам. При "том абсорцня и адсорбция взаимосвязаны и взаимоооуслоп лепы, о чем будет сказано ниже. Силовое проявление адсорсентных свойств клеток в связи с энергонасыщенностыо поверхности ¡5 специфичностью связывания имеет высокую мощность.

Адсорбция эритроцитами кислорода.

Транспорт кислорода и. кислородсвязывающая функция эритроцитов является ведущим процессом в общем адсорбционном процессе в крови. В данной части работы высказываются следующие предположения. 1. Кислород, связанный с гемоглобином эритроцитов может участвовать в бьгетропротекаю-щих процессах путем электрон-протонного пробоя и образования воды. 2.Возможен перенос молекулярного и атомарного кислорода в цепи биохимических реакций. З.Все процессы с участием эритроцитов в окислительно-восстановительных реакциях регулируются специфическими регуляторами.

По второму механизму передачи кислорода мы предполагаем, что транспорт кислорода через эритроцитарную мембрану в процессах оксигенации и деоксигенации осуществляется в цепи, катализируемой оксигеназами. Нами изучались активности глюкозооксидазы, пероксидазы и каталазы теней эритроцитов и цитозоля. Если принять за сто процентов активности коммерческих препаратов: 0.2 мг/мл глюкозооксидазы, 10 мг/мл каталазы и 20 мг/мл пероксидазы, то активности этих ферментов в эритроцитарном цитозоле составляют : пероксидаза - 545%, каталаза - 102% и глюкозооксидаза - 740%; в тенях эритроцитов: пероксидаза - 109%, каталаза - 122 % и глюкозооксидаза '-500%.Как видно из представленных данных, наблюдалась очень высокая активность изучаемых ферментов как в цитозоле, гак и в мембране эритроцитов. Была составлена биохимиче-:кая модель, работающая в циклическом режиме и активируемая кислородом, включающая глюкозооксидазу, пероксидазу, «талазу, глюкозу и кислород.

По третьей схеме было высказано предположение о суще-ггвовании гуморальных регуляторов адсорбции (А) и десорбции (Д) кислорода клетками организма, включая эритроциты.

Были пояучс::ы экспериментальные данные, подтверждающие данное прсд^оло'кгх ие. Выявлена следующая заколо.мерлост:: сенозные гнлроцгггы оксигениропалнсь больше па 5.0% (?<0.и1) ПОС.-.Л шпг/иацин в венозной плазме , артериальные эритроциты проявляли тенденцию к увеличенному на (? = 0.2) део:чС::генированию в артериальной плазме. Это может быть объяснено тем, что артериальные эритроциты прочно связаны с (А), т.е. индукторами адсорбции кислорода, л и то же время свободны от (В); венозные, напротив, связаны с (•/) и свободны ст (А). Свободные (А) и (Б) определяют получе.чную закономерность, слабое проявление которой обусловлено, видимо, несоответствием условий, в частности рН. Изучение изменения состояния плазмалеммы эритроцитов путем определения их осмотической устойчивости под воздействием плазмы венозной и артериальной крови показало следующее. Осмотическая устойчивость эритроцитов в артериальной плазме на 7.6% (Р<0.01) была ниже, чем в венозной. Влияние артериальной плазмы на венозные и артериальные эритроциты также существенно различалось. Так, осмотическая устойчивость венозных эритроцитов на 4.7% (Р<0.1) была выше, чем артериальных. Прослеживалось противоположное действие плазмы на эритроциты, т.е. венозная плазма активно воздействовала на артериальные эритроциты, а артериальная плазма - на венозные эритроциты. Полученные результаты указывают, что биохимический обмен кислорода вызывает .конформационный переход в плазмалемме эритроцитов с изменением их эластических свойств.

В следующих сериях экспериментов мы исследовали влияние гуморальных факторов на активность Ка,К-АТФазы, поскольку этот фермент очень тонко реагирует на гормональный фон. В норме активность этой АТФазы у артериальных эритроцитов была выше, чем у венозных. Так, у эритроцитов артериальной крови активность этого фермента была равна 1.42 + 0.11 мкМ р1/4 на 1 мл клеток, в то время как у эритроцитов венозной крови - 0.94 + 0.06 мкМ -р\/ч на 1 мл клеток (Р< 0.05). Венозная плазма понижала активность фермента у артериальных эритроцитов, а артериальная плазма повышала активность На,К-АТФазы у венозных эритроцитов. Так, высокая активность На,К-АТФазы

эритроцитов рртгрпальной гсровн в контроле ( 1.42 -г 0.11 мкМ ri/ч :;а 1 мл :с;оток) после v.:nzy(>zv,;i-i в плазме, полученной из кетосчой ::г,отт, снижалась до еол:г::шь: 1.12 + 0.G-) м;;М Pi/н на i мл тлеточ ( Р<0.02), а низкая активность эритроцитов вено-злой л^оби ( О.Г'41 -г- 0.056 мкМ Pi/ч на I мл клеток) после ин;су-бг.цни в плазме, полученной пз артериальной крови, нопротнз, возрастала до 1.С9 -г 0.04 мкМ Pi/'ч на 1 мл клеток (Р<0.01). Было выявлено, что ко только окспгснацлл является главным переглючагещнм элементом в но .¡ененнн активности Na,K-АТФазы, т.к. искусственная окси:. чглдил увеличивает активность фермента венозных эритроцитов, причем до более высокого уровня по сравнению с артериальными эритроцитами (до 1.54 + 0.14 мкМ Pi/ч на 1 мл клеток). При действии уабаика, являющегося специфическим инактиватором Na.K-АТФазы, происходило снижение оксигенации эритроцитов.Было установлено, что перфузат вен обладал способностью подавлять окси-генацию: клеточная взвесь контрольной пробы 0.717 + 0.049 Ед. и опытной пробы 0.660 + 0.053 Ед. (р<0.05). Полученные данные свидетельствуют о присутствии в сосудистом перфузате фактора, вызывающего десорбцию кислорода. Исследование действия антигипоксантов 0-12 (37.1 мкМ}; 0-SS (38.3 мкМ), гутам н-на сукцинат (37.6 мкМ), эмоксипина (37.7 мкМ) и оксипина (37.4 мкМ) (инкубация 30 мин, 36Х) на активность ИаД-АТФазы мембран эритроцитов венозного русла показало, что во всех случаях .с высоким уровнем значимости отличия действие вышеперечисленных веществ подавляло активность фермента. По всей видимости данный вид воздействия вызывает повышенную де-оксигенацню эритроцитов. Но если бы процесс был однонаправленным, то не следовало бы ждать физиологического эффекта перечисленных веществ, как антигипоксантов,.т.к. иншбирова-ние работы Ка,К-АТФазы приводит к уменьшению оксигенаци-и. По всей видимости, механизм их действия имеет мембрано-тропный рецепторный характер реализации и в процессе оксигенации эритроцитов антигипоксант конкурентно вытесняется регулятором адсорбции (А).

Кислородная насыщаемость эритроцитов находилась в зависимости от действия эндотелиальных факторов. Так, если в венозных эритроцитах содержание оксиге'моглобина (в отн.ед.)

составляло 0.-'/75т 0.037, а в венозных оксигеннрованкых 0.717 + .1049 (?<0.01), то после инкубации эритроцитов в перфузате вен и окспгснацпи, содержание оксигемоглобина составило 0.06С6 + 0.052 (Р<0.05). Другими словами, перфузат вены вызвал торможение охеигепации. Предполагается, что реализация действия регуляторов осуществляется по схеме, включающей Ка,К-АТФазу, Ма-Н ООМСН, -АТФазу и Са-каналы, воздействие Са + т на мембрану и аффиннитет гемоглобина к Са. Нами было обнаружено, что содержание свободного кальция в цитозоле венозных оксигенированных и артериальных эритроцитов выше, чем у венозных. Содержание кальция коррелировало со степенью оксигенации. Методом иммобилизации гемоглобина на 5Н-сефарозу был установлен очень высокий аффиннитет гемоглобина к кальцию, а именно: НЮ - 0.019, НЪ - 0.011; НЬ коммерческий - 0.004.

Электрофоретиче.ские исследования и биохимическая идентификация предполагаемых белков (А) и (Д) показали, что они являются гемсодержащими белками с высокой пероксида-зной активностью, но не являются изоферментами пероксида-зы.

Адсорбция эритроцитами липидов и редуцирующих Сахаров

Межмембранный обмен гликопротеидами, липидами и гли-колипидами существенно сказывается на иммунологических свойствах эритроцитов, их адгезивных и реологических характеристиках, а также активности ионтранспортных систем. Межмембранный обмен осуществляется посредством обмена с приме-мбранным адсорбционным слоем как микросредой клетки. Компонентный состав примембранного слоя в свою очередь определяется адсорбентными свойствами плазматической мембраны. • • •

На данном этапе исследований изучали содержание углеводов, общих липидов в адсорбционном слое эритроцитов в норме и при действии веществ, выбранных по принципу мишени воздействия, т.е. 3.4-бензпирена (80 нМ), встраивающегося между липидами мембраны; колхицина (8 мМ) - ингибитора цито-скелета, ионов свинца (1.2 мМ), действующие на интегральные

глул; мембраны (даип конечные концентрации из расчета на -;а цир,'сули?уюшсм кротзи).

Углеводный эналгз показал следующее. Содержание реду-пруюш.их сахароз в гдеорбцнопном слое колебалось от 244 до >6 мкг/мл. Важной особенностью являлось то, что наолгодало-ь стойкое отличие в содержании редуцирующих сахароз в адсо-бцпонном слое ЭАК и ЭВК. Это отличие прослеживалось и з лаз?.', s хро вн. Пру дсЛстлпп ацетата сз:шца на кровь кг к in vive, ах и in vitro наблюдали увеличение содержания 'редуцирующих ахаров в адсорбционном слое как ЭАХ, так и ЭЕ Б целом глеводный анализ показал, что в адсорбционном слое содержи-ся большое количество углеводов , иногда превышающее их □держание в плазме. При действии химических веществ, изме-яющих адсорбентные свойства мембраны, происходило пере-аспределение редуцирующих Сахаров между цитоплазмой, ме-|браной, адсорбционным слоем и плазмой . Эти "потоки" мо-пи иметь разнонаправленный характер, но примембранный дсорбционный слой проявлял свойства индивидуального обра-ования, способного к накоплению и отдаче редуцирующих са-аров взаимодействующим подсистемам плазмы или мембра-ы. Содержание общих липидов в адсорбционном слое колеба-ось от 0.2 до 1.7 г/л. При действии колхицина как ш vivo, так и i vitro, наблюдали некоторое понижение общих липидов в "шуе" ЭАК с 0.70 до 0.50 г/л и у ЭВК с 0.80 до 0.70 г/л. При действии ,4-бензпирена была зарегистрирована обратная картина в усло-иях in vitro артериальных эритроцитов с 0.52 до 0.85 т/л, вено-ных эритроцитов с 0.50 до 0.70 г/л, in vivo у артериальных эри-роцитов с 0.52 до 0.85 г/л, венозных эритроцитов - с 0.50 до 0.98 /л. Видимо эффект увеличения содержания общих липидов в шубе" при действии 3.4-бензпирена связан с его встраиванием в [ипидный слой мембраны, чем, по всей видимости, вызывало-ь перераспределение липидов. Таким образом, исследование бщих липидов и редуцирующих Сахаров адсорбционного слоя юзволили прийти к заключению о том, что "шуба" - это полико-тонентное структурное образование, реагирующее на вне-иние воздействия изменением состава посредством изменения дсорбентных свойств плазматической мембраны и входящее в

со:лс::пьте г?затшоде:5стзпя с плазмоЛ кроим, мембраной и цито-

Ацсорбция эритроцитами белка При денстзии колхицина содержание белка в плазме кро-ал артериального русла существенно не отличалось от контроля (данные приставлены в относительных единицах по оптическим измерениям (Т%) без перерасчета па количество), в то же время в юзнои плазме возрастало с 49.43 Ед. до 49.5-9 Ед.(Р<0.1), а артерно-венозная разница сохранялась : в артериальной плазме 51.73 Ед., в венозной 49.99 Ед.(Р<0.01). При действии колхицина адсорбционный слой "разрушается", о чем свидетельствовало уменьшение белка в смывах физраствором, причем как в случае артериальных эритроцитов, так и в случае венозных, но в последнем случае выявилась только тенденция. Так, содержание белка в смыве с эритроцитов артериальной крови в контроле было 5.204 Ед., в опыте- 4.529 Ед(Р<0.02), в смыве с венозных эритроцитов контроль 5.207 Ед., опыт 4.809 Ед. (Р=0.2). Наблюдали тенденцию (Р<0.3) превышения в содержании белка в смыве с эритроцитов венозной крови над таковым в артериальной крови. При действии колхицина возрастала протеолитическая активность мембранных протеаз 'эритроцитов венозной крови : в контроле 0.007 Ед.а., в контроле 0.010 Ед.а. (Р =0.1). В случае артериальной крови отличий не было обнаружено. При воздействии З.^бензпирена, влияние которого на плазматическую мембрану основано на встраивании в липидный бислой, также изменялись адсорбентные свойства эритроцитов. Содержание белка в плазме артериальной крови в контроле и опыте не различалось, но в венозной крови отличие было достоверным и равно 45.53 Ед.- контроль, 41.88 Ед.- опыт (Р<0.1). Артерио-венозные различия по содержанию белка в плазме не зарегистрированы. Отличия в содержании белка в смывах 0.14 М КаСГс эритроцитов артериальной крови составляли 6.823 Ед,- контроль, 5.453 Ед,- опыт (Р<0.2) и, в случае венозной крови, 6325 Ед.- контроль, 7.245 Ед,- опыт (Р<0.2); арте-риовенозная разница 1.792 Ед., Р=0.1. В смывах 0.6 М КаС1 с эритроцитов артериальной и венозной крови отличия по содержанию белка по сравнению с опытом не достоверны, однако арте-рио-венозная разница существенна - 0.619 Ед. Протеолнтиче-

екая активность в плазме артериальной крови увеличивалась с 0.576 ед в контроле до 0.656 ед в опыте (Р<0.1). Е то же время, протеолитическая активность иммобилизованных на мембране эритроцитов протеаз уменьшалась в артериальной крови с 0.016 ед в контроле до 0.013 ед в опыте (Р<0.1); в венозной крови с 0.016 ед в контроле до 0.012 ед в опыте (Р = 0.02). Важным, на паш взгляд, фактом, является ингибирование активности мембранной На,К-АТФазы в случае эритроцитов артериальной хэови с 1.126 мкМ Р1/ч на 1 мл клеток в контроле и 0.839 мкМ Р1/ч на 1 мл клеток в опыте ГР<0.1) и в случае эритроцитов венозной крови с 1.072 мкМ Р1/ч на 1 мл клеток в контроле и до 0.785 мкМ К/ч на 1 мл клеток в опыте (Р<0.01). Действие колхицина полностью ингибировало активность т,К-АТФазы эритроцитов как венозного, так и артериального русла. Таким образом, полученные данные указывают на то, что действие колхицина и 3.4 -бензпнрена приводят к изменению конформации мембраны и, видимо через микроокружение, ингибированию Иа,К -АТФазы и изменению адсорбентных свойств мембраны. Изменение свойств адсорбента приводит к десорбции белка , и, следовательно, увеличению его содержания в плазме и уменьшению содержания в смывах. Одновременно десорбируются протеазы и повышается протеолитическая активность в плазме на фоне уменьшения активности иммобилизованных на плазмалемме эритроцитов протеаз. Не исключено воздействие микроокруже-"ния фермента на его активность и в случае протеаз.'Другими словами, "шуба" это не только структурное образование, необходимое в процессах массопереноса, но и функциональная единица, активно изменяющаяся и оказывающая воздействие на взаимодействующие с ней системы - мембрану и плазму путем ферментативного катализа. Исходя из этого, мы в данной серии исследований изучали активность пероксидазы и каталазы крови собак стандартными методами и электрофоретически исследовали изоферменты пероксидазы. Активность ферментов выражали в относительных единицах изменения оптической плотности ( измеренной на СФ-26 за 1 мин в объеме образца 50 мкл). Результаты исследований были следующие. Пероксида-зная активность плазмы составляла 27.2 ед., в первом смыве 0.14 М ИаС1 эритроцитов артериального русла 35.2 ед., во втором 3.0 ,

в третьем 0.18 и в четвертом 0.04 ед. Можно сделать вывод, что ферменты с пероксидазной активностью находятся в непрочной адсорбционной связи с эритроцитами. Каталазная активность плазмы 45.6 ед., в первом смыве 11.2, во втором 12.0, в третьем 1.0, и в четвертом 0.20 ед. Полученные данные прямо указывают, что адсорбционный слой обладает высокой ферментативной активностью.В следующей серии исследований изучали компонентный состав адсорбционного слоя методом дискэлектрофо-реза, лзоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в присутствии ЗББ. Исследования проводили на крови собак. Забор крови осуществляли под общим гексеналовым наркозом (40 мг/кг) из бедренных вен и артерий. Кровь стабилизировали гепарином 50 Е/ мл. Схема эксперимента следующая. Кровь це-трифугировали при 400 в 10 мин, плазму и лейкоциты отбрасывали, э. эритроциты ресуспензировали в физрастворе до 50% показателя гематокрита. После 10 минутной инкубации операцию повторяли 2-3 раза, а супернатант (физиологический смыв) брали на анализ, конечное ресуспензирование осуществляли в 0.6 М №С1 (гипертонический концевой смыв). В некоторых случаях ресуспензирование в 0.6 М >1аС1 осуществляли на первом этапе после освобождения от плазмы (гипертонический смыв). Таким образом исследовали структуру адсорбционного слоя по степени прочности ассоциации с мембраной. Обозначения: физиологические смывы - Ф1,Ф2 и тд., гипертонический смыв в начале - Г, в конце - Гконц. Установлено, что АС ЭАК и ЭВК отличались как по количеству белка, так и по компонентному составу и структуре, т.е. плотности упаковки по слоям от периферии к мембране. Количество белка в АС ЭВК превышало таковое в ЭАК, однако по количеству прочноассоциированного белка ЭАК превосходят ЭВК. Компонентный состав АС ЭАК и ЭВК претерпевает существенные изменения при действии фе-нилшдразина, колхицина и кровопотери как в количестве компонентов, относительной электрофоретической подвижности (ОЭП), изоэлектрической точке, так и по количеству тех или иных компонентов в зонах. Был исследован компонентный состав лимфы, как звена массопереноса в системе внутренней среды. Забор проб осуществляли из лодыжечного, бедренного и грудного лимфатических протоков собак в покое, при стимуля-

ции мышечного сокращения (электростимуляция 80 В, длительность импульса 0.5 мс) и при внутривенной инфузии аутопла-змы. Результаты исследований показали, что как в количестве белка в целом, так и в компонентном составе лимфы при мышечном сокращении происходили волнообразные изменения, аналогичные изменениям в АС ЭАК и ЭВК, что говорит в пользу высхазываемого предположения о роли АС эритроцитов в массообмене при артерио-венозном переходе. Также были показаны существенные отличия в компонентном составе доузло-вой и послеузловой лимфы и различие их реакции на инфузию нативной и денатурированной аутоплазмы. Это позволяет сделать вывод о трехсистемной организации лимфатической системы. Инфузия плазмы, как модель освобождения белков АС эритроцитов, также вызывала волну в лимфообразовании.

Полученные данные свидетельствовали о том, что адсорбционный слой и изменения его параметров являются источником и инициатором массопереноса. Существуют конкурентные отношения за центры связывания между адсорбатами, и, видимо, активные (в понимании физиологического воздействия) компоненты имеют преимущество в связывании Видимо, биорегуляторы, а также патогенные белки, включая токсины, необходимо определять и устранять в адсорбционном слое эритроцитов.

На основании представленных в главе экспериментальных 'данных мы пришли к заключению, что эритроцит' является объемным адсорбентом и ионообменником; в результате изменения адсорбентных свойств эритроцитов происходит процесс массообмена, и, в частности, его звена - лимфообразования. Генеральным переходом состояния адсорбентных свойств эритроцитов является переход их из артериального в венозное русло. Переход состояний регулируется гуморальными факторами. Высокая изменчивость компонентного состава и, главное, соотношение концентраций разных: компонентов позволяют предположить, что в ряде случаев не присутствие какого-либо регулятора, а изменение компонентного состава и концентрационных соотношений в адсорбционном слое является главной информацией к запуску того или иного процесса в клетке. Это

обеспечивает высокое разнообразие реакций и надежность кодирования и восприятия информации.

Состояние крови артериального и венозного русла и вероятное физиологическое значение их взаимного перехода.Физио-логические показатели клеток артериальной и венозной крови Результаты исследования по ряду физиологических и биохимических показателей эритроцитов артериального РАК) и венозного (ЭВК) русла, лейкоцитов артериального (ЛАК) и венозного (ЛВК) русла и эндотелиоцитов артериального (ЭнАР) и венозного (ЭнВР) русла сведены в таблицы 4,5,6. Как видно из представленных таблиц, по всем исследованным параметрам клеток артериального и венозного русла наблюдались существенные различия. По существу выявлены два состояния системы крови - артериальное и венозное, причем они охватывают не только эритроциты, но и лейкоциты и эндотелиоциты. Выше были показаны различия ЭВК и ЭАК по таким показателям, как адсорбция белка, редуцирующих Сахаров, липидов, компонентному составу АС, реакции на действие колхицина, 3.4-бензпи-рена и ацетата свинца и температуры. Другими словами, АК и ВК - это реципрокные состояния, полярность которых определяет интенсивность массопереноса.

Факторы регуляции состояний крови Разделенные в пространстве и во времени, биохимические процессы в организме осуществляются через внутреннюю среду. и управляются посредством молекулярных регуляторов (Северин, Кочеткова, 1985), большинство из которых полипептидной природы (Кусень, Стойка, 1985). Однако в настоящее время в литературе нет данных, указывающих на наличие молекулярных регуляторов (инициирующих факторов) артерио-веноз-ного перехода. В качестве показателя физиологической реакции на присутствие в среде регуляторных веществ изучали активность Иа,К-АТФазы плазматической мембраны эритроцитов и лейкоцитов. Исследовали компонентный состав белков методом дискэлектрофореза без и в присутствии додецилсульфата натрия и методом изоэлектрофокусирования. Эндотелиа-льные факторы получали путем инкубации сосудов в специальной установке для перфузии, исследовали перфузат. Нами получены данные, свидетельствующие о наличии факторов артерио-

венозного перехода состояний крови (ФАВП). В основе были исследования по перекрестной инкубации эритроцитов и лейкоцитоз в плазме крсви артериального и венозного русла. При перекрестной инк\бацни эритроцитов в плазме (т.е. артериальных клеток з венозной плазме, а венозных - в артериальной плазме при условии выравнивания рН) наблюдали противоположный эффект действия плазмы. Так, высокая активность №,К-АТФа-зы (мкМ ?5/ч на 1 мл тел) артериальных зритрс щтов 1.4 -г 0.1 при преинкубации в венозной плазме падала до величины 1.1 т 0.1 (?<0.02), а низкая активность венозных эритроцитов 0.94 -0.06 в условиях преинкубации в артериальной плазме напротив, возрастала до 1.01 + 0.044 (Р<0.1). При перекрестной инкубации лейкоцитов в плазме ( т.е. клеток артериальной крови в венозной плазме, а венозных в артериальной плазме при условии выравнивания рН, р02 и рСОз в СОз-инкубаторс) наблюдали аналогичную эритроцитам закономерность противоположного действия плазмы артериальной и венозной крови на активность ДНП хроматина.

По всей видимости, образование ФАВП осуществляется в эндотелии кровеносных сосудов, причем факторы перехода артерий, вен и аорты отличаются по своему действию. Так, при инкубации эритроцитов в сосудистом перфузате (изотонический раствор сахарозы) изменялась активность их На,К-АТФазы: до инкубации активность ( мкМ Р1/ч на 1 мл кл) составила 0.79 + 0.11, после инкубации в венозном перфузате 0.18 + 0.08 (Р< 0.001), до инкубации в артериальном перфузате 0.81 + 0.06, после инкубации 0.58 + 0.04 (Р<0.001), до инкубации в перфузате аорты 0.82 + 0.09, после инкубации 1.40 + 0.11 (Р<0.1). Как видно из данных, существует по крайней мере три отличающихся по действию фактора артерио-венозного перехода состояний крови. Возможно,. эндотелий лимфатических сосудов также выделяет фактор, который изменяет действие кровеносных ФАВП и проявляет свое действие при инфекциях, интоксикациях и тд. Однако в данной работе эти вопросы не рассматриваются.

Изоэлектрофокусирование перфузата аорты показало значительный компонентный состав (около 20 зон), представленный белками с различными изоэлектрическими точками, в основном в области рН 3.5-6.5.

Методом диск-электрофореза перфузатов венозных и артериальных сосудов, а также аорты также были обнаружены существенные отличия в компонентном составе. Компонентный состав этих сосудов отличался от состава плазмы, разведенной в 2С0 раз, полученной из артериальной и венозной крови, причем наиболее яркие отличия были в области 20 кД и менее. Это свидетельствует о том, что секретируемые эндотелием белки не являются по своему происхождению плазменными, а, видимо, прочноассоциированы с мембраной эндотелиоцитов и освобождаются в процессе перфузии. В отличии от состава плазмы было появление в перфузате компонентов области 64 кД, 43 кД, 20 кД, и 14.4 кД. Отличия в компонентном составе перфузатов артерий, вен и аорты заключались в присутствии или отсугстви-и тех или иных зон. Так, венозный перфузат характеризовался слабыми минорными зонами 59 кД и 84 кД, и полным отсутствием зон 90 кД, 60 кД, 17 кД и 15 кД. В тоже время, в отличие от артерий и аорты мажорной зоной были представлены компоненты с молекулярной массой 14.4 кД, 30 кД и минорной около 8 кД. Таким образом, вся совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что факторы артерио -венозного перехода состояний крови имеют эндотелиальную природу . По всей вероятности, учитывая молекулярную массу, время жизни, ФАВП относятся к классу интегринов, и, видимо, являются продуктом ограниченного протеолиза гемоглобина с? сохранением гема.

Переход состояний крови из артериального русла в венозное, как фактор массообмена Механизмы массопереноса в организме в целом и транскапиллярный обмен и лимфообразование, в частности, в современной научной литературе освещены недостаточно. Существующие теории, основанные на пассивном переносе веществ в результате разницы в гидростатическом, осмотическом и онкотиче-ском давлениях и теории, основанные на везикулярном переносе (Сазку-Бпи^Ь, 1983) не объясняют всей совокупности экспериментальных данных. Массообмен во внутренней среде организма идет с участием крови, интерстиция и лимфы (Куприянов с соавт., 1983), причем кровь играет активную роль в этой цепи. Однако для того, чтобы обмен в системе кровь-интерстиций-ли-

мфа осуществился, необходим переход состояний крови с изменением основных физико-химических характеристик, что и происходит при артерио-венозном переходе. Суммарная поверхность эритроцитов очень велика, поэтому изменение характеристик этой поверхности играет существенную роль в биологических процессах организма. Как показали исследовг : ;я, ЭАК имеют более высокую осмотическую резистентность н- '..0% чем ЭБ " (Р<0.01), более низкую адгезию - на 5% к яс:.оаь отм -тых эритроцитов на 54% (Р<0.05), а цельной кр ' . на 3% (Р<; Л).При оксигенации происходят существенны изменения концентрации водородных и гидрокс: льных ио з, причем ж отмытых на 0.12 (Р<0.1), так и еотмыты на 0.2 (Р<().'. [). рН сдвигался в щелочную сторону.

(етодом флуоресцентных зондов и методом в; шьного окра нвания метиленовой синью было уст .новлено ¡то при окси .нации изменяется соотношение поло; ителыюг л отрн-цатс ыюго зарядов, причем нарастает отри; ательны ¡арлд, а пол. ч'ительный уменьшается по сравнению : венозн; и эрит-роц- гами. Так, адсорбция аурамина ОО была на 139} )ыше, а тиаз лового желтого на 56% ниже в оксигепированн: :, чем в неок :игенированных венозных эритроцитах. Адсорб; я мепги-ленсиой сини, катионного красителя, возрастала при ;си е'на-ции на 24% (Р<0.1) по сравнению с венозными эрит. Вышеприведенные данные указывают на изменение ил, оЪу-сло! ливающих адсорбцию ,и этим может быть объясн :ы отличия и АС ЭАК и ЭВК.

Данные по действию ФАВП, колхицина, 3.4-бенз нрена и лектинов позволяют сделать вывод о том, что эритроцит является модифицирующимся регулируемым адсорбентом : ионооб-менником, причем рабочая поверхность его - это не ~олько мембрана, но и цитозоль, т.е. эритроцит - объемный а;;сорбент и ионообменник. Генерализованные переходы в эрг.троцитах определяют не только обмен высокомолекулярных компонентов, но и низкомолекулярных ,и ионов. Для доказательства высказанного предположения были проведены исследования по действию ионов свинца (0.6 мМ) на характеристики ЭВК и ЭАК, как модифицирующихся адсорбентов. Действие ионов свинца снижало активность протеаз эритроцитов и устраняло артерио-

венозные отличия. В го же время ( с уровнем значимости Р<0.02), последействия ионов свинца на активность Na,K-AT<í>a-зы наблюдали инверсию артерио-венозных отличий.

Исследование количества белка, ассоциированного с поверхностью эритроцита показало, что свинец вызывает структурные изменения в мембранах эритроцитов, это приводит к изменению их адсорбентных свойств, причем его действие на артериальные и венозные клетки противоположно, промежуточное положение занимают венозные оксигенированные эритроциты. Учитывая то, что количество адсорбированного белка зависит от конформации мембраны, причем в большей степени у артериальных клеток, чем у венозных, т.е. в первом случае удержание белка идет за счет дальнодействующих молекулярных сил, а во втором - силы двойного электричес. ого слоя. Существенному изменению подвергаются ферменты, встроенные в плазматическую мембрану через преобразование микроокружения фермента.

Действие химических экологических факторов реализуется через внутреннюю среду организма. Таким образом, внешняя и внутренняя среды цаходятся.в сложных системных взаимодействиях, которые обусловливают многообразие реакций организма. *

Показано, что действие ряда мембранотропных веществ, таких как колхипин, 5.4-бензпирен и ацетат свинца как in vivo, так in vitro, вызывает перераспределение ионов металлов, таких, как Na, К, Са, Mg, Cu и Zn между цитозолем эритроцитов, адсорбционным слоем и плазмой крови.

Полученные данные свидетельствуют о том, что независимо от механизма действия и мишени агентов типа ацетата свинца, колхицина и 3.4-бензпирена плазматическая мембрана отвечает как кооперативная система и результатом является перераспределение ионов. Причем по отношению к разным ионам эта реакция неоднозначна и выявляются существенные, часто реципрокно направленные процессы для таких пар, как натрий-калий и кальций -магний. Кроме того, выявляются противоположные реакции артериальных и венозных эритроцитов, причем венозные эритроциты показывают более высокую адсорбционную способность, чем артериальные.

Бы::;г-зыиг.ггтгя предположение, что з процессах :,:accor:epe-носа aaaaiyio роль играют ллмплеский потгнц;:г.л элементов л ссотпошглиз лх з системе, что описывсстся термеллнамллол FiiöGca. Кроме того, л направленности переноса существенную роль играет пщратшлп адсорбг :оиный слои. Главным инициатором массоперсноса является артерло-Еелозный переход состояния кровтх, образующий не <влчную золиу массопереноса в системе рлутреннен сс^ды.

■"•зГЗОДЫ

1. Кровь является открыто': термодинамической системой в составе внутренней среды, организованной в цикл: кровь артериального русла - интерстиций - лимфа - кровь венозного русла-кровь артериального русла, с основной функцией - биохимическая интеграция организма и со статистической детерминацией процессов, с высокой степенью структурной кооперативное™ (/\t = 2° С) и реакцией на внешние возмущения (физиологически ного изменения гидродинамического давления и физиолога чески неадекватного действия лазерного излучения) с проявлением переходных процессов.

2. Установлены взаимодействия в системе эритроцит - лей-коцит-эндотелиоцит, опосредованные гуморальными факторами и изменяющие вязко-эластические ( осмотическая и механическая резистентность) и адсорбционные свойства мембраны эритроцитов, митоген-активацию лимфоцитов (Кон А и ФГА, 10 мкг/мл) и активность №,К-АТФазы клеток.

3. Показано, что эритроциты проявляют свойства адсорбента и ионообменника с изменяющейся адсорбцией и активностью иммобилизованных в плазматической мембране ферментов (Na, К-АТФаза, протеазы) при действии на них мембрано-тропных веществ ( колхицин (2-8 мМ), фенилгидразин (75 мг/кг), ионы свинца (1.2 мМ), 3,4-бензпирен (80 нМ), адреналин (5-10 мкМ), ацетилхолин (1.48 мкг/мл), Кон А и ФГА (10 мкг/мл), уабаин (80 мМ)), а также при и окси- и деоксигенации.

4. Обнаружено, что адсорбционный слой эритроцитов, имеющий в своем составе белки, липиды, редуцирующие сахара и ферменты (каталазы, протеазы, пероксидазы) - претерпевает изменения в количестве прочно- и слабоассоциированных с мембраной белков и компонентному их составу при переходе эри-

троцчтов из артериального в венозное русло, при крозопотерях (20 Тэ) и введении фенилгидразина (7.5мг/кг).

5. Адсорбционный слои оказывает влияние на реализацию действия адреналина (5-10 мкМ), что проявляется в изменении активности На,К-АТФазы и Mg-АТФазы в зависимости от величины адсорбционного сдоя.

6. Доказано, что массоперепос в системе кровь - интерсти-ций - лимфа при мышечном сокращении проявлялся в волнообразном изменении компонентного состава и содержании белка в лимфе, разнонаправленное™ переноса белков с рззлично-й злектросЬоретическои подвижностью.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Методики иссл. ;ования гематолимфатического барьера, (соавт. РА. Гареев, лА. Мурзамадиева).-Алма-Ата: Гылым,-1991.-136 с.

2.Электробиолюминисценция органов и тканей некоторых периментальных животных. Сб. Свет гелий-неоновых лазеров в биологии и медицине. Алма-Ата, 1970.С.72-75. (Соавт. Инюшина Т.Ф. Семыкин В А.)

3.Изучение электробиолюминисценции крови. Ж. Бюлл. экспе риментальной биологии, 1971, N.2.C.37-38. (Соавт. Инюши-н В.М.)

4.К анализу динамики изменения РОЭ в магнитном поле. Материалы Всесоюзного симпозиума "Влияние искусственных магнитных полей на живые организмы", Баку, 1972.С30

5.Кислородтранспортная функция эритроцитов. Рук. деп. в ВИНИТИ 01.03.91, N. 901-В91.15С.

6.Влияние адсорбционного слоя из компонентов плазмы на гу моральную регуляцию эритроцитов. Рук. деп. в ВИНИТИ 01.03.91, N.904-B91.12C. (Соавт. Хайбуллина АЛ.)

7.Системная реакция клеток на гуморальные факторы. Ру-кдеп. в ВИНИТИ 01.03.91, N.903-B91.14C.(CoaBT. Хайбуллина А_А)

8.Структурные параметры крови в норме, патологии и при действии света ОКГ. Материалы 111 научно-теоретической конференции молодых ученых АН КазССР, Алма-Ата, 1974.С.215-216.

9.К гемодинамике кровотока. Сб. Солнце, электричество, жизнь. Алма-Ата, 1974.С.203(Соавт. Беклемишева С.?.)

М.Способ определения резистентности эритроцитов к физико-химическим факторам, Ж. Лабораторное дело, М., 1975, N.4.0243-244. (Соавт. Чекуров П.Р. Березина О А.)

11. Радиационное повреждение эритроцитоз и лути их репарации. Сб. Радиационно-стимулированные процессы. Алма-Ата, 1980. С.134-143.(Соавт. Шабаев В.П. Ишошин З.М.)

12. Осмотическая устойчивость эритроцитоз з зависимости от их концентрации. Физиологический журнал СССР, 1ХУ1, Ленинград, 1980.С.1837-1839.(Соавт. Шабаев В.П.)

13. Осмотическая резистентность эритроцитов л осле острой кровопотери. Библиографический указатель ВИНИТИ, N.11, б/о 82, 1980, "Депонированные рукописи". (Соавт. Азлеева С.И.)

14. Камеры для культивировавния и исследования клеток. Ж. Цитология, т.ХХП, Ленинград, 1980.С366-363.(Соавт. Шабаев

B.П.)

15. Некоторые вопросы эритропоэза. Сб. Физиология и биохимия лимфатической системы. Алма-Ата, Наука. 1Р86.С24-30

16. К вопросу кислородного обмена.Сб. Физиология и биохимия лимфатической системы. Алма-Ата, Наука. 1956.С.15-23

17. Роль эритроцитов в окислительных процессах организма. Сб. I Съезд физиологов Казахстана, Алма-Ата. 1988.С.45

18. Изменение компонентного состава белкез. адсорбиро ванных на мембране эритроцитов в результате охеигенации и деок сигенации. Сб. Физиология и биохимия гематс-лимфатиче-ских взаимодействий, Алма-Ата,1988.С.5-1б . . ,

19. Гемолитическая активность в зависимости от гематокри-та и возможный механизм ее регуляции. Сб. Физиология и биохимия гемато-лимфатических взаимодействий, Алма-Ата,1988.

C. 16-23(Соавт. Авдеева С.И.)

20. Некоторые химические факторы устойчивости к гемоли ■ зу. Известия АН КазССР, серия биологическая, 1989, N.1.0.62-66 (Соавт. Шабаев В.П.)

21. Артериовенозные отличия в содержании лейкоцитов. Известия АЛ КазССР, серия биологическая, 1959, Хо.С.8б-88(Со-авт. Полевая Л.Г.)

22. Роль артерио-венозного, реципрокного состояния эритроцитов в регуляции некоторых функций организма. Тез. докл. Всесоюз. конф. "Проблемы нейрогуморальной регуляции деятельности висцеральных систем". -Л., 1987. С.133 (со авт.Володина И.В., Стеценко И.В.).

23. Артериальное и венозное состояния эритроцитов как фактор биохимического обмена. В кн.: Вопросы образования и трансформации состава лимфы. Рук. деп. в ВИНИТИ 03.09.87, N6494-BS7. С. 11-19 (соавт. Стеценко И.В.).

24. Протеолитическая активность эритроцитов в зависимости от их возраста. Там же. С.73-82 (соавт. Стеценко И.В.).

25. Изменение состава белков, адсорбированных на поверхности плазматической мембраны эритроцитов. В кн.: Регуляция образования и транспорта лимфы. Рукдеп. в ВИНИТИ 17.10.88, N7472-B88. С.4-17 (соавт. Стеценко И.В.).

26. Некоторые физиологические и биохимические показатели эритроцитов в зависимости от их возраста. Там же. С.95-106 (соавт.Стеценко И.В.).

27. Факторы артерио-венозного перехода состояний крови. Рук. деп. в ВИНИТИ 14.02.89, N931-B89. 9С. (соавт. Сте ценко И.В.).

28. Артерио-венозный переход состояний эритроцитов при кровопотере. Рук. деп. в ВИНИТИ 14.02.89, N932-B89. 15С. (соавт. Стеценко И.В.).

29. Влияние гуморальных факторов эндотелия артериальных и венозных сосудов на активность Ыа,К-АТФазы эритроци-тов.Тез. докл. 4 Всесоюз. сипм. "Венозное кровообращение и лимфообращение". Алма-Ата, 1989. С.105 (соавт. Стеценко И.В.).

30. Действие ионов свинца на показатели, характеризующие интенсивность массобмена эритроцитов. В кн.: Механизмы гемато-лимфатической циркуляции веществ. Рукдеп. в ВИНИ ТИ 13.02.90, N828-B90. С.11-19 (соавт. Стеценко И.В.).

31. Изменение концентрации ионов некоторых металлов в крови при действии ацетата свинца, 3,4-бензпирена, колхицина. Там же. С.20-30 (соавт. Стеценко И.В., Кайкина И.И.).

32. Способ электрофоретического разделения полинонов Ав.св. N.1239578 1985-1986 (Соавт. Фурсов О.В.)

33. Камера для культивирования клеток Ав.св. N. 684064 19771979 (Соавт. Шабаев В.П.)

34. Устройство для регистрации свечения объектов в токах высокой частоты. Аз. св. N. 601651 1976-1977 ( Соавт. Воробьев НА., Семыкин ВА.,Глушко В.П.,Инюшин В.М.)

35. Устройство для изоэлектрофокусирования Ав. св. N 1061032 1982-1983 (Соавт.Полимбетова Ф.А,Романюта В.И.)

36. Способ определения каталазной активности гемсодержа-щих ферментов Ав. св.К1549228 1986-1989 (Соавт.Романюта В.И.)

37. Способ электрофореза ферментов Ав.св. N.1187461 19831985 (Соавт. Романюта В.И.)

За. Способ определения активности пероксидазы. Ав. св. N1207270 1983-1985 (Соавт. Романюта В.И.)

39. Способ определения активности протеаз. Ав. св. N 442276 (Соавт.Фурсов В.И.)

40. Устройство для электрофореза. Ав.св. N. 410931

N Ф эакции эритроцитов ПАРАМЕТРЫ

1 ■? А 5

1 10 25 35 62 100 ЭЛЕКТРОСОПРОТИВЛЕНИЕ ОМ/СМ

2 10 30 63 105 195 электросопротивление он/см

3 20 50 110 200 320 г>яэкость отн.еэ.

Л 32 50 70 130 230 вязкость оти.еб.

5 60 67 75 80 90 Н1 . я

6 7.37 7.37 7.37 7.38 7.39 Рн

7 7.29 7.33 7.34 7.29 7.33 Рн

8 3.40 3.69 3.73 3.58 3.65 индуцироионкый ГЕМОЛИЗ

9 3.27 3.42 3.24 3.32 3.36 индуцированный гемолиз

10 1.196 0.840 0.947 0.868 0.853 активность п*.к—ато>азы

11 1.455 0.816 .1.368 0.925 0.740 активность На.к—атфазм

12 0.276 0.270 0.220 0.222 0.271 сл. ассоц. белок г/мл кл

13 0.270 0.346 0.278 0.238 0.250 сл. ассоц. белок г/мл кл

14 0.036 0.029 0.036 0.059 0.043 пр. ассоц. белок г/мл кл

15 0.039 0.031 0.052 0.027 0.036 пр. ассоц. бЕЛОК г/мл кл

16 1.35 1.47 0.96 2.53 2.00 актианость протсаз, отн.Ед.

IV 1.06 1.47 1.00 2.82 1.47 активность протсаз, отн.сй.

16 1.679 1.664 1.645 1.525 1.514 ассоц. 6елок г/мл кл 1

19 1.670 1.390 1.712 1.466 1.495 ассоц. 6елок г/мл кл 2

П^сЗотк&лсии 9&НИЫС о уровнем оиачимооти отличия о 1 фракцией < 0.1 ' Инкубация эритроцитов 6 жутоллаамс

КРОВОПОТЕРЯ тйб.2

N Ф эакции зрит роцитов ПАРАМЕТРЫ

1 2 ' 4 5

1 7.333 7.410 7.412 7.403 7.392 Рн ®

2 7.287 7.318 7.310 7.333 7.330 Рн ®

3 0.293 0.286 0.217 0.281 0.251 сл,. ассоц. БЕЛОК ® Г/МЛ КЛЕТОК

4 0.336 0.378 0.333 0.327 0.392 сл.. ассоц. БЕЛОК (в) г/мл КЛЕТОК

5 0.052 0.064 0.026 0.067 0.055 по.ассоц.БЕЛОК (я) г/мл КЛЕТОК

Б 0.060 0.064 0.053 0.046 0.042 по.ассоц.БЕЛОК (в) г/мл КЛЕТОК

7 1.342 1.522 1.556 1.389 1.219 ассоц. БЕЛОК» (3) г/мл КЛЕТОК

8 1.441 1.316 1.323 1,195 1.451 ассоц. БЕЛОК 2 '(В) г/мл КЛЕТОК ^

9 2.280 2.640 2.0^0 2.080 1.860 активность ^ поотЕаз отн.Ед.

10 2.220 1.980 2.020 2.160 2.320 активность ® поотЕаз отн.Ед.

I

I

I \

фенилгиЭразин тдБ.з

N Ф ракции эритроцитов ПАРАМЕТРЫ

1 2 3 4 5

1 0.242 *0.230 *0.225 0.120 0.175 сл.ассоц.БЕЛОК Г/МЛ КЛЕТОК

2 0.300 *0.350 *0.250 0.132 *0.250 ся.ассоц.БЕЛОК Г/МЛ КЛЕТОК

3 0.061 0.036 0.032 0.039 0.050 пр.ассоц.БЕЛОК Г/МЛ КЛЕТОК

4 0.043 0.036 0.033 0.033 0.046 пр.ассоц.БЕЛОК Г/МЛ КЛЕТОК

5 1.330 1.650 1.580 1.380 1.450 активность ГЮОТЕаЗ ОТН.ЕЙ.

Б 1.670 1.280 1.280 *1.610 1.140 , активность поотЕаз отн.Ед.

Представлены данные с уровнем значимости отличия с первой Фракцией менее 0.1 * - более 0.2.

Четные номера строк — кровь венозного русла, нечетные — артериального русла.

ПАРАМЕТРЫ ЭЯК эвк Р ЕП.ИЗМЕР.

вязкость отмытых . КЛЕТОК 100 43.2 CO.Ol X

иаакосп. неотмытых КЛЕТОК 100 93 <0.05 X

КОЛИЧЕСТВО СЛАБОАССОЦИ ИРОВАННОГО ВЕЛКА 0.101* 0.012 0.133Î 0.012 <0.05 г/мл клеток

ОСМОТИЧЕСКИЙ ГЕМОДИЗ 36 ± 3 29 £ 3 <0.01 X

ИНДУЦИРОВАННЫЙ ГЕМОЛИЗ 11.3Î0.2 10.8±02 <0.03 X

АКТИВНОСТЬ IJPOTEA3 1.4410.18 2.04Î0.14 <0.05 ОТН. ЕД.

АКТИВНОСТЬ К» ,К—ATtPaou 1.417S0.11 0.941Î0.03 <0.05 мкМ Pi/ч на 1 мл клеток

СОДЕРЖАНИЕ С»++ В КЛЕТКЕ 0.47510.07 0.273±0.07 <о.оз мкМ/п

РЕЯКЦИО На К-АТФааи НА АДРЕНАЛИН 1.612/1.70» 1.613/1. язе 1.312/0.9(4 ■ ili, мкМ Pi/ч и« t мгНЬ

РЕАКЦИЯ lia, К-ЯТФавы НА АЦЕТИЛХОЛИН 1.612/О.Э72 1.Э12/1.04 <0.01 <О.Ой мкМ Pi/ч на 1 мгВЬ

РЕАКЦИа На.К-АТФаои НА АДРЕНАЛИН И АЦЕТИЛХОЛИН 1.£12/1.233 1.312/1.200 <0.15 <0.01 мкМ Pi/ч на 1 мпНЬ

так л Параметры эритроцитов артсрильного (ЭЯК) ......... и венозного (ЗВК) русла |

АРТЕРИО — ВЕНОЗНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ

ПАРАМЕТРЫ единицы измерения ЛАК Л В К

Содержание лейкоцитов x 100 133 Р<0Л01

Активность Ыа.К-АТФаоы мкМ Р1/ч на 1 мл клеток 0.805 ± ОЛб 0.243 ± 0Д4 Р<0.001

Реакция Иа.К-АТФазы на ФГД мкМ Р»/ч на 1 мл клеток 0.В0Б / 0.44 0.243 / 0.02 Р<ао1 р<0.001

Активность ДНП хроматина лейкоцитов собак отн. ед. 79.0 ± 3.1 50.0 ± 2Л Р<0Л01

— ii— крыс отн. ед. 303.0 ± 9.1 П3.0 ± 4.2 РС0.001

— ii— кроликов отн. ед. шао ± 9.2, 116.0 ± 6.1 РС0-001

Реакция активности ДН11 на действие ФГА "• отн. сд. 79.0 У 69.0 5ао / 59.0 Р<0.001

— II— на иммуниоацию отн. сд. 1В0 / 256 116 / 297 Р< 0.0 2

ТАБЛИЦА—5 АРТЕРИ0-ВЕН03НЫЕ РАЗЛИЧИЯ ОНДОТЕЛИОЦИТОВ

ПАРАМЕТРЫ единицы измерения ЭнАК ЭнВК

Активность протеаа, 1 скорость отн. сд. 1.50 0.90 Р<0Л1

2 скорость отн. еО. 1.30 0.В4 Р<0.05

3 скорость отн. сд. 1.29 0.74 Р<0.05

Активность Ыа.К-АТФаоы мкМ Р1/4 на I мл псрФУэата 0.014 0.036 Р<0.01

ТАБЛИЦА—б