Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Синтез, строение, свойства и биологическая активность новых производных ароиламидинов и N-арилбензамидинов.

На правах рукописи

КУВАЕВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АРОИЛАМИДИНОВ И ЛГ-АРИЛБЕНЗАМИДИНОВ

14.04.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 СЕН 2013

005532»^

Санкт-Петербург - 2013

005532823

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре органической химии.

Научный руководитель: Яковлев Игорь Павлович

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Куклин Владимир Николаевич

доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии ГБОУВПО СПХФА Минздрава России

Смирнова Ирина Геннадьевна кандидат фармацевтических наук, директор СПб ГУЗ «Северо-Западный центр по контролю качества лекарственных средств»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации (614990, г.Пермь, ул. Полевая, 2)

Защита состоится «15» октября 2013 г. в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14, лит.А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197227, Санкт-Петербург, пр:т Испытателей, д. 14).

Автореферат разослан « / ¿5-2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук //])№/[ Марченко Наталья Владимировна

доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Амидины обладают высокой биологической активностью. Амидиновый фрагмент (обычно в составе гетероцикла) входит в структуру многих лекарственных препаратов, например, нафтизина, галазолина, фентоламина, хлордиазепоксида. Многие из амидинов гидросульфонатов используются в химиотерапии.

Производное ацетамидина (фенокаин) широко используется в офтальмологической практике в качестве местного анестезирующего средства. Циклические амидины, выделенные из плодового тела «американского гриба» известны как антибактериальные и ан-тигельминтные средства. Так же известно, что структурные аналога циклических амидинов обладают противопротозойной, антидепрессантной и антишпертензивной активно-

стью.

В то же время методы получения амидинов, известные из литературы, не носят систематического характера, а результаты изучения их строения, на наш взгляд, нельзя считать строго обоснованными, что является несомненным пробелом в изучении этой интересной группы органических соединений, тем более, что многие из них являются исходными веществами в синтезе гетероциклических соединений, таких, например, как гадрок-

сипиримидины, имидазолы.

Поэтому разрабопса эффективных методов получения таких соединений, изучение

их строения, свойств и биологической активности, установление связи «строение-

свойства-биологическая активность» являются актуальными.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка эффективных методов получения ароиламиди-нов, jV-арилбензамидинов и их гадрохлоридов, изучение их строения, свойств и биологической активности.

Для этого надо было решить следующие основные задачи:

1. Изучить реакции арилнитршюв с аммиаком и ариламинами как метод получения

ароиламидинов и W-арилбензамидинов.

2. Осуществить синтез ранее неописанных №арилбензамидинов гадрохлоридов.

3. Доказать строение синтезированных соединений с помощью современных методов анализа: ИК, УФ, ЯМР спектроскопии, масс-шеюрометрии, рентгеноструктурного анализа (РСА).

4 Установить потенциал биоактивности полученных соединений путем компьютерного анализа с помощью программы PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) и оригинальной программы докинга FlexX.

5. Провести изучение некоторых видов биологической активности синтезированных веществ и определить их острую токсичность. Установить взаимосвязь «строение - биологическая активность».

6. Разработать методики качественного и количественного определения полученных биологически активных веществ.

Научная новизна

Получен ряд новых производных ароиламидинов, //-арилбензамидинов и их гидрохлоридов. Доказано их строение, исследованы свойства и биологическая активность. Впервые показано, что:

> Ароиламидинов гидрохлориды удобно получать взаимодействием арилнитрилов с абсолютным этиловым спиртом и сухим хлороводородом в среде безводного бензола или эфира с последующей обработкой полученных промежуточных имидоэфиров спиртовым раствором аммиака.

> Возможность и направление реакции бензонитрила с ариламинами определяется электронной природой заместителя в молекулах последних и является термодинамически контролируемой реакцией, позволяющей получать ^-арилбензамидины с максимальным выходом при 1°=180°С.

> Острая токсичность ароиламидинов, А-арилбензамидинов и их гидрохлоридов (1ЛЭ5о=10-^2650 мг/кг) существенно зависит от электронной природы заместителя в ариль-ном фрагменте.

> Полученные соединения проявляют выраженное антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее действие. 7/-4-Нитрофенилбензамидин обладает антикоагу-лянтной активностью.

Практическая значимость

Разработаны эффективные методы получения новых производных ароиламидинов, Л^арилбензамидинов и их гидрохлоридов. Среди них обнаружена новая группа малотоксичных антимикробных, противовоспалительных и анальгезирующих веществ. Предложены методики стандартизации наиболее перспективного с точки зрения биологической активности - Д^-нитрофенилбензамидина.

Апробация работы

Результаты работы представлены на VI Международной научно-пракгической конференции «Уе<1еску рокгок па гогтеи йвюИей - 2010» (Прага, 2010); Всероссийской кон-

4

ференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии» (Казань, 2010); Научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств (Санкт-Петербург, 2010); Научной конференции студентов и аспирантов (Санкт-Петербург, 2011); VII Международной научно-практической конференции «Naukai inowacja-2011» (Перемышль, 2011); Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации» (Пермь, 2011); П-ой Всероссийской научной конференции студентов „ аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург. 2012); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); Ш-ой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

Основное содержание диссертации представлено в 19 публикациях, в том числе 2 патента, 2 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, рекомендованный ВАК РФ.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России «Получение и изучение фармакологического действия биологически активных веществ (БАВ) с целью создания инновационных лекарственных средств» (номер государственной регистрации НИР;01201252027).

Основные положения, выносимые на защиту:

> Разработка методов синтеза ароиламидинов, tf-арилбензамидинов и их гидрохлоридов.

> Доказательство строения синтезированных соединений с помощью современных методов анализа: ИК, УФ, ЯМР спектроскопии, масс-спектрометрии, РСА.

> Изучение острой токсичности, антимикробной, противогрибковой, противовоспалительной, анальгезирующей и антикоагулянтной активностей полученных ароиламиди-нов, ./У-арилбензамидинов и их гидрохлоридов.

> Методики стандартизации субстанции //-4-нитрофенилбензамидина.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включает 36 таблиц, иллюстрирована 66 рисунками и состоит из введения, обзора литературы по теме исследования и 4 глав собственных исследований, экспериментальной части, заключения, списка литературы и приложений. Список литературы включает 117 источников, в том числе 88 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введевие

Во введении приведены актуальность, цель и задачи исследования, его научная и практическая значимость.

Глава 1 Обзор литературы

В обзоре литературы обсуждаются методы получения различных амидинов и их производных. Особое внимание уделено изучению строения, свойствам и биологической активности этих соединений.

Глава 2 Синтез и строение ароиламидинов, А^арилбензамидинов и их гидрохлоридов

2.1 Синтез ароиламидинов гидрохлоридов

Ранее (Платэ, 1949) было показано, что имидоэфиры взаимодействуют со спиртовым раствором аммиака с образованием соответствующих амидинов гидрохлоридов.

В ходе проведенных нами исследований было установлено, что синтез ароиламидинов гидрохлоридов (П1 а-д) необходимо проводить при точных мольных соотношениях абсолютного этилового спирта и сухого хлороводорода, иначе синтезируемые имидоэфиры не кристаллизуются. Большое значение при проведении обсуждаемой реакции необходимо придавать подбору растворителя, так как исходные нитрилы (I в-д) являются твердыми кристаллическими соединениями. Использовать в качестве растворителя абсолютный этиловый спирт не желательно, при его избытке происходит растворение получаемых

6

имидоэфиров (II в-д), и в дальнейшем выделить их из реакционной массы не возможно. В связи с этим в качестве растворителей нами были использованы бензол или эфир (рисунок

Л—\ HCl (сух.) / \ *NH * HCl У VfeN + С2Н3ОН -- С у ОС2Н5

о А — / Ia-д або. к \=/

Па-д 70-90%

г,—\ NH NH3/C2H5OH /=Л_с/Н »HCl

/ * HC1 V / NH2

V /ОС2Н5 24 часа R^—' 1

П1а-д

Па"Д 59-74%

R= Н (а), 4-СНз (б), 4-С1 (в), 4-N02 (г), 3->Ю2(д)

Рисунок 1 - Схема синтеза ароиламидинов гидрохлоридов 2.2 Синтез N-арилбензамидинов

JV-арилбензамидины (V а-л) были получены обработкой ариламинов (IV а-л) бензо-нитрилом (1а) в присутствии безводного хлорида алюминия (рисунок 2).

nh2

er • ■ fr' ^ crSo

ь iv а-л VM R

R=H (л), Вг-2 (б), Вг-3 (в), Вг-4 (г), СН3-2 Сд), СН3-3 (е), СН3Л (ж), N0,-3 (з), N0,4 (и), ОСНз-4 (к), СООН-4 (л)

Рисунок 2 - Схема синтеза ДГ-арилбензамидинов

Оказалось, что строение ариламинов влияет не только на выход амидинов, но иногда и „а возможность их получения. Так, наличие нитрогруппы в о-положении анилина настолько понижает его реакционную способность, что ожидаемый амидин получить не

удается.

Минимальная температура, при которой возможно получение монозамещенных JV-арилбензамидинов (V а-л) составляет 150°С. Максимальные выходы продуктов (6797%) были получены при температуре 180°С. Увеличение температуры свыше 200 С при-

водит к получению смеси монозамещенных Л^арилбензамидинов (V а-л) и побочных продуктов ДТУ'-дизамещенных амидинов (VI а-з, к, л) (рисунок 3).

180" С

csn

nh2

AlCb

R

IV (а-л)

>200 С

iVr^

nh2

V (а-л) R

NH2

V (а-л)

R-H (a), 2-Br (6), 3-Br (в), 4-Br (г), 2-CH3 (д), 3-CHj (e), 4-CH3 (ж), 3-N02 (з), 4-N02 (и), 4-ОСНз (к), 4-COOH (л)

NH-

VI (а-з, к, л)

Рисунок 3 - Схема синтеза //-арилбензамидинов и ДЛ^'-диарилбензамидинов

Так, если реакцию бензонитрила (1а) с ариламинами (IV а-л) проводить при t°= 230°С соотношение полученных ЛГ-арилбензамидинов (V а-л) и побочных продуктов N,N'-ди-арилбензамидинов (VI а-з, к, л) составляет 80% и 20% соответственно. Повышение температуры до 250°С приводит к увеличению выхода N, N '-диарилбензамидинов до 50%, а увеличение температуры свыше 270°С приводит к осмолению реакционной массы. Смесь амидинов была разделена на колонке с силикагелем (гексан/этилацетат - 9:1).

2.3 Синтез А'-арилбензамидинов гидрохлоридов

Низкая растворимость полученных ЛГ-арилбензамидинов в воде и большинстве органических растворителей является существенным недостатком этих соединений с позиции создания новых лекарств. Наиболее эффективным преодолением этого является изменение баланса липофильно-гидрофильных свойств путем введения в их молекулы различных заместителей, изменяющих биологическую активность веществ, их транспорт и биодоступность в организме или получение солей, обладающих более высокой растворимостью, чем соответствующие ЛГ-арилбензамидины.

Нами было установлено, что JV-арилбензамидины гидрохлориды (VII а-л) можно получить при пропускании сухого хлороводорода через суспензию jV-арилбешамидинов (V а-л) в абсолютном этиловом спирте (рисунок 4).

R=H (a), 2-Br (б), 3-Br (В), 4-Br (r), 2-CHj (д), 3-CH3 (е), 4-CHj (ж), 3-NO, (з), 4-N02 (и), 4-ОСНз (к), 4-СООН (л)

Рисунок 4 - Схема синтеза W-арилбензамидинов гидрохлоридов

2.4 Строение полученных амидинов и их солей ( ^

Строение полученных веществ доказано нами с помощью методов ЯМР Н, С, 15N-HSQC, Ж спектроскопии, РСА. Индивидуальность - методом ТСХ, состав - методом

элементного анализа и масс-спектрометрией.

2 41 Строение ароиламидинов гидрохлоридов

Наиболее характеристичными сигналами в спектрах ЯМР 'Н растворов соединений (III а-д) в ДМСО-Ж являются сигналы протонов групп =Ш2+ и -NH2 (9.29-9.90 м.д.), протонов ароматического кольца (7.25-8.38 м.д.).

Так например, в спектре ЯМР >Н раствора соединения (Шб) в ДМСО-* (рисунокЗ)

наблюдаются сигналы протонов СНз-группы (2.36 м.д.), сигналы протонов групп =NH2 н -NH2 (9.49 и 9.30 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (7.37-7.80 м.д.).

ОЙ"* 019 0.19

cnmW

Рисунок 5 - Спеюр ЯМР 'Н раствора 4-метилбензамидина шдрохлорида (Шб)

в ДМСО- Аб

В спектрах ЯМР ,3С соединений (III а-д) в ДМСО-Л наблюдаются сигналы атома углерода СНпруппы (21.56 м.д.), сигналы атомов углерода бензольного кольца (123.17136.01 м.д.) и сигнал атома углерода амидинового фрагмента (165.92-166.54 м.д.).

Для ИК спектров ароиламидинов гидрохлоридов (П1 а-д) характерны полосы поглощения при 1675-1680 см'1, обусловленные валентными колебаниями связей С=Ы, полосы поглощения в области 3050-3400 см'1, обусловленные валентными колебаниями связей Ы-Н в группах -1ЧН2 и =ИН.

2.4.2 Строение Л^-арилбензамидинов и их солей

Потенциально Л'-арилбензамидины и их гидрохлориды могут существовать в двух таутомерных формах (А, Б).

u X)

R

А

Авторы работ (ZhouLZhangY. // Synth.Commun. 1998. V. 28. P. 3249; Wang I, Xu F., Cai T., Shen Q.H Org. Lett. 2008. V. 20. P. 445-448) отдают предпочтение таугомеру Б без достаточных, на наш взгляд, оснований. Для превращения таутомера Б в таутомер А используется катализатор сложного строения.

R-CN + R/NHj -»- R— Cf -R~4

NHR' NTC

cat= «CH3bSi)2N-^Yl( ^Ytr-NCSKCHabb

N N X A

(снзьз/ Y 4/47 Y (СНз)з

Спектры ЯМР 'Н ДГ-арилбензамидинов (V а-л) в ДМСО-<*6 позволяют говорить о том, что эти соединения существуют преимущественно в //-арилимино-аминной таутомерной форме, так как в спектрах присутствует уширенный сигнал в области ~5.88-6.73 м.д., который можно отнести к протонам группы ОТЬ-

На рисунке 6 представлен спектр ЯМР 'Н //-4-метилфенилбензамидина (Уж) в ДМСО-^б, в котором наблюдаются сигналы протонов СН3-группы (2.28 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (6.75-7.97 м.д.). Наличие одного уширенного сигнала при 6.20 м.д. с интегральной интенсивностью ~2Н может быть связано с тем, что это соединение в растворе ДМСО-<4 существует в преобладающей таутомерной форме А.

6 - Спектр ЯМР 'Н раствора N-4-метилфенилбензамидина (Уж) в ДМСО- d6

Для более строгого доказательства строения ^-арилбензамидинов (V а-л) в растворах нами была использована двумерная корреляционная спектроскопия »№Н8<2С (рисунок 7) которая также свидетельствует о том, что соединения (V а-л) существуют в основном в таутомерией форме А. В спектре 15К-Н8дС ^-4-метилфенилбензамидина (Уж) наблюдается всего один корреляционный пик между сигналом атома азота 15К и сигналом связанных с этим атомом протонов в соответствующих спектрах ЯМР 'Н.

г

J 1

.JlHjl

79 м.д.

20 40 60 ВО 100 120 -140 б, м.Д-

12 11 Ю в

Рисунок 7 - Спектр 15N-HSQC раствора ДГ-4-метилфенилбензамидина (Уж) в ДМСО-А

Основным отличием спектров ЯМР >Н iV-арилбензамидинов гидрохлоридов (УП а-л) в ДМСО-^б от спектров .V-арилбензамидинов (У а-л) является присутствие в слабом поле

трех сигналов в области ~8.66-12.36 м.д„ протонов групп =NH, -NH и протонов HCl.

На рисунке 8 представлен спектр ЯМР Н М-4-метоксифенилбензамидина гидрохлорида (УПк) в ДМСО-^б, в котором наблюдаются сигналы протонов ОСНз-группы (3.82 м.д.), сигналы протонов ароматических колец (7.11-7.97 м.д.). Наличие трех сигналов при 8.82 м.д., 9.84 м.д. и 11.58 м.д. с интегральной интенсивностью -1Н может быть связано с тем, что это соединение в растворе ДМСО-с?« имеет преобладающую ЛГ-ариламино-иминную протонированную форму (Б).

ev-2h.c01.001.1r.eep

щ

03 0.М 2.19 3.23

1,02 о.й'г.ТГ'зЗз до г.11 ц и и и и и

¥

"Ь.........I.........

СМЛ*« 8МЯ (р»Ж1)

316

и___

'М.........1.........г

Т"

Рисунок 8 - Спектр ЯМР 'Н раствора гидрохлорида ЛМ-метоксифенилбензамидина (УПк)

в ДМСО- й6

В спектрах ЯМР 13С соединений (V а-л, VII а-л) в ДМСО-с?б помимо сигналов атомов углерода бензольных колец в области ~114.07-151.78 м.д., сигналов атомов углерода метальных и метокси групп (-16.98-17.98 и 55.59-55.98 м.д.) в слабом поле при -151.15163.92 м.д. наблюдаются сигналы атомов углерода амидинового фрагмента -С=]\т(-М), а также сигналы атомов углерода карбоксильной группы в области -154.14-156.65 м.д.

Строение полученных уУ-арилбензамидинов (V а-л) и ТУ-арилбензамиданов гидрохлоридов (VII а-л) в кристаллическом состоянии было однозначно доказано монокристальным ренттеноструктурным анализом (рисунок 9,10). Полученные результаты свидетельствуют о том, что А^-арилбензамидины существуют в Л'-арилимино-аминой таутомер-ной форме (А), тогда как структура соответствующих солей (VII а-л) больше соответствует протонированной форме (Б). В ходе пррведенных исследований были определены величины длин связей, валентных и торсионных углов.

и

Рисунок 9 - Молекулярное строение ЛГ-4-нитрофенилбензамидина (Уи)

г-'-;.'

Рисунок 10 - Молекулярное строение ЛИ-метилфенилбензамидина гидрохлорида(УПж)

В ИК спектрах амидинов (V а-л, VII а-л) наблюдается полоса поглощения при 16001680 см"1, обусловленная валентными колебаниями связи С=Н а также полосы поглощения, характерные для валентных колебаний связей К-Н в группах -МН2, -КН-Аг и в группе =1Ш в области 3200-3550 см'1.

Глава 3 Биологическая активность полученных соединений

3.1 Острая токсичность

Изучение острой токсичности синтезированных амидинов и их гидрохлоридов проводилось на белых мышах-самцах массой 16-20 г. Расчет средней летальной дозы (Ц>») проводили с помощью пробит-анализа по методу Миллера-Тейтнера. Установлено, что

13

острая токсичность Ы-арилбензамидинов (V а, г, ж, и, л) существенно зависит от электронной природы заместителя в четвертом положении арильного фрагмента. Увеличение акцепторного характера заместителя резко уменьшает токсичность синтезированных ЛГ-арилбензамидинов (1ЛЭ5о = 10-2642 мг/кг), что линейно связано с уменьшением констант основности для этих соединений (рисунок 11).

3 -2 -1 -

О -1——-г--1-1----г--1 1

0 500 1000 1500 2000 2500 3000

Т.Ш0

Рисунок 11 - Зависимость 1Х)5о отрКа ЛГ-арилбензамидинов (V а, г, ж, и, л) Таблица 1 - Токсичность амидинов и их солей

Соединение 1ЛЭ50

Формула Я №

шг сгЧх Ш2 V и ' 2642

СООН Ул 750

Вг Уг 245

Н Уа 76,2

СНз Уж 10

Г'. НС. сг-а VII а, и, ж Ы02 VII и 480

Н VII а 152

СНз VII ж 50

*НС1 Ш а, 6, г Ш2 III г 224

Н III а 589

СНз III б 186

Аналогично, но не так существенно, под влиянием заместителей меняется острая токсичность полученных солей ЛГ-арилбензамидинов ( VII а, и, ж). Токсичность ароилами-динов гидрохлоридов увеличивается при введение в структуру соединения как донорных,

так и акцепторных заместителей (таблица 1).

3.2 Антимикробная, фунгицидная и фунгистатическая активности ароиламидинов, Аг-арилбензамвдинов и их гидрохлоридов

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде - мясопептонном бульоне (МПБ) с последующим высевом на агаризованные среды. В качестве тест-микроорганизмов были выбраны грам-положительные бактерии Staphylococcus aureus штамм Р 209 и грамотрицательные бактерии Escherichia coll АТСС 25922. Штаммы тест-организмов были выбраны в соответствии

с рекомендациями ГФ XI.

Минимальные подавляющие концентрации ароиламидинов гидрохлоридов и iV-арил-бензамидинов находятся на уровне или ниже широко используемых на практике антибиотиков (аминогликозиды 0.2-3.2 мкг/мл (Е. coli) и 0.1-1.6 мкг/мл (St. aureus))-, фторхиноло-ны 0.016-0.500 мкг/мл (Е. coli) и 0.06-0.52 мкг/мл (St. aureus)), что может представлять несомненный интерес, так как токсичность некоторых полученных нами веществ ниже представленных препаратов сравнения (рисунок 12).

Из результатов, представленных на рисунке 12 видно, что наличие акцепторного заместителя в 4 положении арильного фрагмента амидинов приводит к повышению антимикробной активности.

W-Арилбензамидины гидрохлориды не проявляют выраженной антимикробной активности (МПК >100 мкг/мл).

Для определения фунгицидной и фунгистатической активности синтезированных

амидинов исследовали их влияние в различных концентрациях на активные штаммы мик-ромицетов. Из полученных результатов была выявлена достоверная стимуляция роста Pénicillium expansum: jV-4-метилфенилбензамидин (Уж) в принятой концентрации, 4-нитро-бензамидина гидрохлорид (Шг) во всех концентрациях, 4-метилбензамидина гидрохлорид (1П6) в принятой концентрации. Был отмечен фунгистатический эффект для микромицета Aspergillus niger: ЛМ-нитрофенилбензамидин (Уи) во всех концентрациях, iV-4-метил-фенилбензамидан (Уж) в удвоенной концентрации, 4-нитробензамидина гидрохлорид (Шг) в принятой и удвоенной концентрациях, 4-метилбензамидина гидрохлорид (Шб) - во

всех концентрациях.

Фунгицидный эффект отсутствует для всех веществ и доз.

Рисунок

синтезированных амидинов

- фор-

3.3 Противовоспалительная активность

Противовоспалительную активность исследовали на скрининговой модели

малиновый отек лапы у крыс.

Исследуемый нативный раствор вводили крысам внутрибрюшинно в виде водного раствора ароиламидинов гидрохлоридов (III а, б, г) или в виде суспензии в ДМСО : вода (1:5) JV-арилбензамидинов (V а, и) в дозе 1/10 от LD50 (от 7.62 до 264.20 мг/кг). Препарат сравнения - диклофенак - вводили в дозе 25 мг/кг.

Полученные соединения обладают выраженной противовоспалительной активностью (рисунок 13). Большой интерес представляют амидины, которые имеют низкую токсичность и высокую активность по сравнению с препаратом сравнения (диклофенак). 120

60,8

угнетения воспаления через час @ % угнетения воспалення через сутки

Рисунок 13 - Противовоспалительная активность ароиламидинов гидрохлоридов (III а, б, г) и TV-арилбензамидинов (V а, и) в дозе 1/10 от LDS0

3.4 Анальгезирующая активность

Для экспериментальной оценки анальгезирующей активности исследуемых ароила-мидинов гидрохлоридов (Illa, б, г), ЛГ-арилбензамидинов (V а, и, л) и ДГ-арилбензамидинов гидрохлоридов (VII а, и) использовали модель генерации уксуснокислых «корчей» у мышей-самцов. Суспензию исследуемого соединения в дозе 1/10 и 1/50 от LDS0 (от 3.81 до 264.20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно и через 40 минут внутрибрюшинно вводили 0.2 мл 3 %-го раствора уксусной кислоты. Наблюдали за животными 20 минут. В ходе эксперимента регистрировали время начала судорог и количество судорог за временной интервал. Препаратом сравнения являлся метамизол натрия (100 мг/кг).

Из полученных результатов (рисунок 14) следует, что анальгезирующей активностью обладают бензамидина гидрохлорид (Illa), 4-метилбензамидина гидрохлорид (III6) и TV-4-нитрофенилбензамидин (Vh), которые уменьшали число судорог у животных на 86.5%-64.9% по сравнению с контролем. Таким образом, данные соединения обладает выраженным анальгезирующим действием, так как уменьшение количества судорог находится на уровне или чуть ниже препарата сравнения метамизола натрия.

Рисунок 14 - Анальгезирующая активность амидинов и их гидрохлоридов 3.5 Антикоагулянтная активность

Виртуальный скрининг антикоагулянтной активности синтезированных соединений осуществлялся при помощи оригинальной программы докинга ИехХ. Для белков с известной трехмерной структурой и низкомолекулярных молекул лигандов ИехХ точно и быстро предсказывает геометрию белок-лиганд.

В результате вычислительного эксперимента было установлено, что только #-4-нитрофенилбензамидин (Уи) обладает антикоагулянтной активностью.

Несмотря на близкое сходство химической структуры соединений в их взаимодействиях с белком имеются существенные различия (рисунок 15). Связывание Я-4-нитрофенилбензамидина (Уи) в активном центре фермента происходит за счет взаимодействия с боковыми цепями аминокислотных остатков Тгр 60А, Тгр 6(Ю и образования водородной связи с С1у 216 в «Эз кармане фермента», что характерно для многих известных ингибиторов тромбина. Напротив, связывание других соединений (на рисунке 15 рассмотрено на примере ^-З-нитрофенилбензамидина (Уз)) происходит за счет иных групп, ранее не описанных в литературе как характерных для известных ингибиторов. Из чего можно сделать вывод, что остальные бензамидины не будут проявлять активность по отношению к тромбину.

ТугЯА

Рисунок 15 - Антикоагулянтная активность ЛМ-нитрофенилбензамидина (Уи) и ЛГ-З-нитрофенилбензамидина (Уз)

Для экспериментального подтверждения теоретических результатов нами была проверена величина протромбинового времени, характеризующая свертываемость крови у интактных лабораторных крыс после многократного (5-дневного) введения исследуемых соединений. Было установлено, что из всего ряда соединений только ЛГ-4-нитро-фенилбензамидин проявляет (Уи) антикоагулянтную активность, что полностью согласуется с результатами виртуального скрининга.

Глава 4 Методы стандартизации ЛМ-нитрофенилбензамидина (Уи)

Для наиболее перспективного соединения с точки зрения биологической активности ЛГ-4-нитрофенилбензамидина (Уи) были разработаны методики оценки качества и количественного определения. АГ-4-Нитрофенилбензамидин - коричнево-красный порошок, умеренно растворим в хлористоводородной кислоте разведенной 10%, мало растворим в этаноле 96%, н-гексане и ацетоне, практически не растворим в воде Для определения подлинности вещества (Уи) можно использовать качественную реакцию диазотирования с последующим азосочетанием, а также методы ТСХ, УФ, ИК и ЯМР >Н спектроскопии. Отсутствие посторонних примесей целесообразно контролировать с помощью ТСХ и ГЖХ. Количественное определение проводили методами потенциометрического титрования и УФ спектрофотометрии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные итоги диссертационной работы сводятся к следующим основным положе-

ниям:

1. Разработаны новые технологичные методы синтеза ароиламидинов, ЛГ-арил-

бензамидинов и их гидрохлоридов.

2. Ароиламидинов гидрохлориды удобно получать взаимодействием арилнитрилов с этиловым спиртом и сухим хлороводородом в безводном бензоле или эфире с последующей обработкой промежуточных имидоэфиров спиртовым раствором аммиака.

3. Возможность и направление реакции бензонитрила с ариламинами определяется электронной природой заместителя в молекулах последних и является термодинамически контролируемой реакцией, позволяющей получать ^-арилбензамидины с максимальным

выходом при 1°=180°С.

4. Л'-Арилбензамидинов гидрохлориды целесообразно получать взаимодействием

суспензии №арилбензамидинов в абсолютном этиловом спирте с сухим хлороводородом.

5. По данным ЯМР 'Н, 13С, ^-НБОС спектрам, РСА ^-арилбензамидины существуют в Я-арилимино-амино таугомерноной форме, а их гидрохлориды в У-ариламино-

иминной таутомерной форме.

6. Острая токсичность полученных Л^-арилбензамидинов и их солей существенно зависит от электронной природы заместителя в четвертом положении арильного фрагмента. Увеличение электроноакцепторного характера заместителя уменьшает токсичность синтезированных соединений. Токсичность ароиламидинов гадрохлоридов увеличивается при введении в их структуру как донорных, так и акцепторных заместителей.

7. Полученные амндины и их соли проявляют выраженные антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующие действия. jV-4-Нитрофенилбензамидин обладает ан-тикоагулянтной активностью.

8. Разработаны методы стандартизации ЛЧ-нитрофенилбензамидина.

Результаты данного диссертационного исследования могут быть рекомендованы для

внедрения в учебный процесс в курс органической химии для студентов 2 и 3 курсов фармацевтического факультета и факультета промышленной технологии лекарств.

Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного исследования включают в себя следующие основные научно-исследовательские направления, имеющие важное практическое значение: создание лекарственных средств на основе наиболее перспективного с точки зрения биологической активности ЛГ-4-нитрофенилбензамидина. Изучение острой токсичности и биологической активности N, N -диарилбензамидинов. Использование полученных амидинов как синтонов в синтезе новых биологически активных производных гидроксипиримидинов и имидазолов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент №2480452 РФ. Способ получения ЛГ-4-нитрофенилбензамидина.

2. Патент №2481104 РФ. Антимикробное, противовоспалительное и анальгезирующее средство на основе ЛГ-4-нитрофенилбензамидина.

3. Куваева, Е.В. Особенности синтеза iV-арилбензамидинов / Б.В. Куваева, Е.В. Федорова, И.П. Яковлев, Е.Н. Кириллова, Г.В. Ксенофонтова, В.И. Захаров // Известия Санкт-Петербургского государственного технологического института (технологического университета). - Санкт-Петербург, 2012. - № 14(40). - С. 58-61.

4. Куваева, Е.В. Компьютерный прогноз и экспериментальная проверка биологической активности новых производных ЛГ-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.В. Бурякина, Д.Д. Ваулина, Г.В. Ксенофонтова, Т.Л. Семакова II Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012. - С. 105-106.

5. Куваева, Е.В. Влияние строения Л^арилбензамидинов на антимикробную активность / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, C.B. Турина, И.П. Яковлев, А.Э. Потапова // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». - Казань, 2012.-С. 106.

6. Куваева, Е.В. Синтез и противовоспалительная активность производных пирими-дин-4,6-дионов / Е.В. Куваева // Материалы П-ой Всероссийской научной конференции

студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2012. - 4.III - С.15-16.

7. Куваева, Е.В. Установление связи строения-свойства-биологическая активность JV-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Э. Потапова, М.В. Сопова, И.П. Яковлев // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации». - Пермь, 2011. - С.106-107.

8. Федорова, Е.В.Установление связи строения-свойства-биологическая активность некоторых 4,6-дигидроксипиримидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Т.Л. Семакова, Г.В. Ксенофонтова, А.Г. Козьмина // Материалы научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации». - Пермь, 2011. - С.165-167.

9. Куваева, Е.В. Синтез и строение гидрохлоридов ароиламидинов и W-арил-бензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, В.В. Зайцев, И.П. Яковлев, В.И. Захаров, Т.Л. Семакова // Журнал органической химии. - Санкт-Петербург, 2011. - Т.48. - С. 221225.

10. Куваева, Е.В. Влияние температуры на синтез ДГ-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, E.H. Кириллова, В.В. Зайцев // Тезисы докладов Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». - Санкт-Петербург, 2011. - С.18.

> 11. Куваева, Е.В. Синтез моно- и дизамещенных ЛГ-арилбензамидинов / Е.В. Куваева // Материалы Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего». - Санкт-Петербург, 2011. -С.137-138.

12. Федорова, Е.В. Кислотные свойства некоторых 4,6-дигидроксипиримидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.М. Алексеева, Г.В. Ксенофонтова // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Naukaiinowacja-2011». - Перемышль, 2011. -С.43-45.

13. Куваева, Е.В. Изучение основных свойств JV-арилбензамидинов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, В.Ф. Апраксин, И.П. Яковлев, Т.Л. Семакова // Материалы VII Международной научно-практической конференции «Naukaiinowacja- 2011». - Перемышль, 2011. -С.45-47.

14. Куваева, Е.В. Синтез и строение замещенных бензамидинов и ЛГ-арил-бензамидинов / Е.В. Куваева // Тезисы докладов научной конференции студентов и аспирантов. - Санкт-Петербург, 2010. - С.45-46.

15. Куваева, Е.В. Амидины. Синтез и строение / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, И.П. Яковлев, Г.В. Ксенофонтова, Т.Л. Семакова // Материалы научно-практической конференции, посвященной 65-летию факультета промышленной технологии лекарств. - Санкт-

Петербург, 2010. - С.102-105.

16. Куваева, Е.В. Синтез новых производных пиримидин-4,6-дионов / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Г. Козьмина, И.П. Яковлев // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии».

-Казань, 2010. С.99-100.

17. Федорова, Е.В.Особенноста синтеза и строения ариламидинов и Л^-ариламидинов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.В. Ксенофонтова, В.В. Зайцев // Материалы всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Актуальные проблемы органической химии». - Казань, 2010. С.131-132.

18. Федорова, Е.В. Амидины в синтезе пиримидин-4,6-дионов / Е.В. Федорова, Е.В. Куваева, Г.В. Ксенофонтова, М.В. Сопова, В.В. Зайцев, А.С. Сибирякова // Материалы VI Международной научно-практической конференции (^еаескуро^окпаготтетШясМ-

2010». - Прага, 2010. - С.64-66.

19. Куваева, Е.В. Амидины. Синтез и строение / Е.В. Куваева, Е.В. Федорова, А.Г. Козьмина, И.П. Яковлев, Ю.В. Клейменова, О.В. Морозова // Материалы VI Международной научно-практической конференции (^еёескурокгокпагогтегШзюПеИ- 2010». - Прага, 2010.-С.66-68.

На правах рукописи

Куваева Елена Владимировна

СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АРОИЛАМИДИНОВ И ЛГ-АРИЛБЕНЗАМИДИНОВ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Печать Н. В. Андриановой

Подписано к печати 28.06.2013. Формат 60 х 90/16. Бумага тип. Печать ризограф. _Гарнитура «Тайме». Печ. л.1,5. Тираж 100 экз. Заказ 1166_

Санкт-Петербург 2013