Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Синтез и противовирусная активность N-бензилзамещенных урацилов и их аналогов

На правах рукописи

005535636

ПАРАМОНОВА МАРИЯ ПЕТРОВНА

СИНТЕЗ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ Г^-БЕНЗИЛЗАМЕЩЕННЫХ УРАЦИЛОВ И ИХ АНАЛОГОВ

Специальность 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

24 ОКТ 2013

Пятигорск - 2013

005535636

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Новиков Михаил Станиславович, доктор фармацевтических наук, доцент. Официальные оппоненты:

1. Оганесян Эдуард Тоникович - доктор фармацевтических наук, профессор, ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, заведующий кафедрой органической химии (14.04.02).

2. Маршалкин Михаил Федорович - доктор химических наук, профессор, Пятигорский филиал Северо-Кавказского Федерального Университета, заведующий кафедрой охраны окружающей среды и химии (02.00.03).

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России.

диссертационного совета Д.208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан «

Защита состоится «

с ^»/¿^//^2013 г. ь-/р_

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета

Компанцева Евгения Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Вирус широко распространен в человеческой популяции. СПИД относится к особо опасным, медленно прогрессирующим болезням иммунной и центральной нервной системы (Tibayrenc М., 2010). К настоящему времени СПИД явился причиной смерти более 20 млн. человек (Gallo R.C., 2003). Сейчас в мире насчитывается не менее 34 млн. ВИЧ-инфицированных людей, что ставит ВИЧ-инфекцию в один ряд с самыми значительными пандемиями в человеческой истории (UNAIDS, 2011). Несмотря на усилия ВОЗ и правительств многих стран по профилактике и лечению СПИД, во многих регионах, в том числе и в России, наблюдается неуклонный рост заболеваемости.

ВИЧ инфицирует, прежде всего, клетки иммунной системы (Т-лимфоциты, макрофаги и дендритные клетки) и некоторые другие типы клеток, содержащие рецептор CD4. Инфицированные ВИЧ CD4+ Т-лимфоциты постепенно гибнут (Wain-berg М.А.,2008; Etienne L., 2011). В результате этого субпопуляция CD4+ Т-лимфоцитов медленно сокращается и, вследствие этого, клеточный иммунитет снижается. По достижении критического уровня количества CD4+ Т-лимфоцитов организм становится восприимчивым к оппортунистическим инфекциям. В отсутствии высокоэффективной комплексной антиретро-вирусной терапии летальный исход наступает в течение 7-10 лет после инфицирования (Jaffar S., 2004).

Следует особо отметить тот факт, что цитомеголовирусная инфекция (ЦМВ-инфекция) является одной из основных причин заболеваемости и смертности у пациентов с нарушениями функций иммунной системой (Lin D.Y., 2002). Известно, что цитомегаловирусом (ЦМВ) инфицировано до 90% взрослого городского населения, однако у здоровых людей эта инфекция обычно протекает бессимптомно. При ослабленном иммунитете этот вирус представляет серьезную угрозу для жизни пациентов, особенно у больных СПИДом, реципиентов трансплантации органов, а также у новорожденных с врожденной ЦМВ инфекцией. ЦМВ способен проникать через плаценту и инфицировать плод, что ведет к мертворождению и врожденным уродствам (Pereira, L., 2011).

Анти-ЦМВ лекарственные средства, которые в настоящий момент используются в клинике для лечения ЦМВ-инфекции, включают ганцикловир, цидофовир и фоскарнет. Однако их использование в клинике сопровождается множеством нежелательных эффектов. В частности, эти препараты проявляют заметную токсичность, имеют низкую биодоступность и при длительной терапии возникают резистентные варианты вируса (Bedard, J., 1999).

Степень разработанности темы. На сегодняшний день, нет эффективного лекарственного средства, способного полностью удалить вирус из организма. Несмотря на то, что разработаны различные лекарственные препараты, которые позволяют продлить и улучшить качество жизни ВИЧ-инфицированных людей, ЦМВ инфекция остается серьезной проблемой для таких пациентов (Springer, К. L., 2004). Следует также подчеркнуть, что особо остро стоит проблема создания противовирусных средств, способных одновременно подавлять репродукцию различных вирусов, в частности ВИЧ-1 и ЦМВ. По этим причинам поиск новых высокоэффективных противовирусных средств является одной из важнейших и актуальных проблем современной фармации.

В настоящее время в комплексной терапии ВИЧ-инфекции и вызываемого ею синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) широко применяются не-нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) (Volberding Р., 2013). Эти ингибиторы связываются с вирусным ферментом в гидрофобном «кармане», удаленном от активного центра обратной транскриптазы (ОТ) примерно на 10 А. Однако, несмотря на достаточно интенсивный поиск ненуклеозидных ингибиторов репликации ВИЧ-1, данная проблема продолжает оставаться в ряду наиболее актуальных и значимых. Это связано с относительно высокой токсичностью препаратов, а также с высокой изменчивостью вируса, которая обуславливает появление лекарственно-устойчивых штаммов в ходе длительной терапии. В этой связи поиск новых противовирусных препаратов, эффективных как в отношении диких штаммов, так и в отношении клинически наиболее важных мутантных изолятов для лечения ВИЧ-инфекции и СПИД, является чрезвычайно актуальной задачей.

Цели и основные задачи исследования. Целью настоящего диссертационного исследования является разработка на основе производных урацила новых противовирусных агентов, эффективно ингибирующих репродукцию ВИЧ-1 и ЦМВ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• разработать простой и эффективный метод синтеза хлорацетанилидов, являющегося исходным для синтеза 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропи-римидин-1-ил)-Лг-фенилацетамидов;

• разработать простые и эффективные методы синтеза 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1 -ил)-Л^фенилацетамидов и их изомерных аналогов - 2-(3-бензил-2,4-диохси-3,4-дигидропиримидин-1 (2Я)-ил)-ДЦ)енилаце-тамидов;

• разработать методы синтеза 1-циннамил-производных 3-бензилурацила -ряда соединений, содержащих при атомах азота несимметричные заместители;

• разработать простой и эффективный метод синтеза 1-[ю-(фенокси)-алкил]урацилов;

• изучить физико-химические и спектральные свойства синтезированных соединений;

• изучить противовирусную активность синтезированных соединений in vitro в отношении вирус-специфических ферментов и на клеточных культурах, на основе данных скрининга выявить основные закономерности структура-противовирусная активность.

Научная новизна. В результате проведенных исследований были открыты новые классы ненуклеозидных ингибиторов репродукции ВИЧ-1 и ЦМВ, в основе которых лежит ядро урацила.

Разработан новый способ синтеза хлорацетанилидов, отличающийся простотой и эффективностью от описанных в литературе методов.

Осуществлен синтез ранее не описанных в литературе 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1-ил)-Л'-фенилацетамидов и их изомерных аналогов - 2-(3-бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1 (2//)-ил)-Лг-фенилацет-амидов, являющихся потенциальными анти-ВИЧ-1 и анти-ЦМВ агентами.

Синтезированы новые анти-ВИЧ-1 агенты - 1-циннамил-производные 3-бен-зилурацила.

Разработаны условия и осуществлен синтез 1-[а>-(фенокси)алкил]урацилов путем конденсации 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинов с 1-бром-со-(фенок-си)алканами.

Обнаружено, что некоторые 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропири-мидин-1-ил)-Лг-фенилацетамиды проявляют мощную анти-ЦМВ активность в культуре HEL клеток, в то время как их структурные изомеры - 2-(3-бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1 (2//)-ил)-Аг-фенилацетамиды активны в отношении ВИЧ-1 как в культуре МТ-4 клеток, так и в отношении ОТ ВИЧ-1.

Показано, соединения ряда 1-циннамил-З-бензилурацила являются эффективными ингибиторами репродукции ВИЧ-1 в культуре МТ-4 клеток и ОТ ВИЧ-1 как дикого типа, так и некоторых клинически важных мутантаых вариантов ОТ. Кроме того, найдено, что соединения данного ряда проявляют заметную активность в отношении ЦМВ в культуре HEL клеток.

Найдено, что 1-[ш-(фенокси)алкил]-производные урацила являются мощными ингибиторами репродукции ЦМВ в культуре HEL клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Все целевые соединения были исследованы в ФГБУН Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) (Москва) с целью выявления ингибиторной активности в отношении вирусного фермента обратной транкриптазы (ОТ) ВИЧ, и в Pera Институте Медицинских Исследований (Левен, Бельгия) для выявления противовирусной активности на клеточных культурах в отношении широкого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

На основании скрининга и обнаруженных закономерностей структура-активность в ряду новых производных урацила выявлены структуры, которые в ближайшем будущем могут послужить для дальнейшего дизайна соединений на основе урацила, обладающих мощной противовирусной активностью, с целью создания на их основе отечественных лекарственных средств для лечения ВИЧ-инфекции и СПИД, а также ЦМВ инфекции.

На основании результатов исследования составлено информационное письмо «Синтез и противовирусная активность N-бензилзамещенных урацилов и их аналогов» (протокол № 2 от 12.04.2013 г.), материалы которого внедрены Волжским политехническим институтом (филиалом) ФГБОУ ВПО «ВолгГТУ» для проведения научных исследований и синтезу новых соединений гетероциклического ряда студентами и аспирантами кафедры химии и общей химической технологии (акт внедрения от 14.05.2013 г.).

Результаты диссертационного исследования внедрены в ФГБУН Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва) для проведения научных исследований в лабораториях института (акт внедрения № 12312-9311 от 06.09.2013 г.), а так же включены в материалы лекций и используются в учебных и научно-исследовательских процессах кафедры общей и органической химии ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ РФ.

Методология и методы исследования. На основе тщательного анализа литературных данных о строении и закономерности структура-противовирусная активность ряда известных ННИОТ были выявлены структурные особенности данных соединений и разработана общая концепция создания новых ННИОТ. Опираясь на данную концепцию, определены этапы синтеза целевых соединений, целесообразность проведения которого подтверждена методом компьютерного моделирования с использованием пакета программ AutoDock Vina 1.1.2. Выбор оптимальных методов синтеза целевых соединений осуществлен в соответствии с поставленными задачами с учетом анализа источников релевантной научной литературы.

При проведении диссертационного исследования были использованы современные методы очистки и разделения сложных смесей, основанные на тонкослойной хроматографии с использованием пластин с закрепленным слоем сорбента и препаративной колоночной хроматографии. Для доказательства строения синтезированных целевых соединений использовались современные спектральные методы - *Н и |3С ЯМР спектроскопия и различные варианты масс-спектрометрии, включающие методы электронного удара и масс-спектрометрию высокого разрешения.

Положения, выдвигаемые на защиту

1. Некоторые 2-(3-бензил-2,6-диоксо-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-1 -шО-Л^-фенил-ацетамиды проявляют мощную высокоселективную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток.

2. 2-(3-Бензил-2,4-диокси-3,4-дигидропиримидин-1(2Д)-ил)-Аг-фениладетамиды демонстрируют высокую активность в отношении ВИЧ-1 как в культуре МТ-4 клеток, так и в отношении ОТ ВИЧ-1.

3. 1-Циннамил-производные 3-бензилурацила являются эффективными ингибиторами репродукции ВИЧ-1 в культуре МТ-4 клеток и ОТ ВИЧ-1 как дикого типа, так и некоторых клинически важных мутантных вариантов ОТ, а также проявляют заметную ингибиторную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток.

4. 1-[ш-(Фенокси)алкил]-производные урацила показывают мощную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов исследования определяется выбором методов, обеспечивающих получение надежных и однозначных результатов. Основные фрагменты диссертационной работы докладывались и обсуждались на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград 2012), ежегодных научных конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2011-2012). Материалы диссертационной работы отражены в 9 публикациях: 3 статьи в иностранных журналах, включенных в перечень ВАК, 4 статьи и 2 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице, состоит из введения, литературного обзора, 4 глав экспериментальных исследований, заключения, списка литературы. Работа иллюстрирована 40 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы включает 184 наименования, из которых 175 из иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Анализ литературных данных позволил выявить общие структурные закономерности ингибиторов ОТ ВИЧ-1 нового поколения. Они состоят из 3-х колец А, В, С, которые соединены между собой линкерами Ьь Ь2 (рисунок 1).

Рисунок 1 - Структурные закономерности ингибиторов ОТ ВИЧ-1 нового поколения.

Выделены ключевые аминокислоты кармана

На основании этого, мы предположили, что соединения, общая формула которых представлена на рисунке 2, могут проявлять ингибиторную активность в отношении ОТ ВИЧ и показывать заметную противовирусную активность на клеточных культурах.

Синтез 1-бензилурацилов, содержащих в положении 3 ацетанилидный

фрагмент

Синтез целевых 3-ацетанилид-производных 1-бензилурацила включает стадии получения 1-бензилурацила 2 и хлорацетанилидов 3-8. Конденсация эквимо-лярных количеств 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидина (1) с соответствующими бензилгалогенидами была осуществлена при кипячении в растворе 1,2-дихлор-этана в присутствии каталитических количеств иодида калия и ДБ-18-КР-6. При этом образовывались исключительно И1 -бензил-производные урацила 2, выход которых составил 67-85% (рисунок 3).

n +

х

N 081 Ме., 1

И

ДБ-18-Кр-6 1,2-Днхлорэт»и 67-85%

1ЧН

Л,

I 2

Рисунок 3 - Схема синтеза 1-бензилурацилов (Я= Н, 2,5-Ме2,3,5-Ме2,4-Г-Ви; На1=С1, Вг)

В литературе описан ряд способов получения хлорацетанилидов. Наиболее часто используется конденсация хлорацетилхлорида с анилинами в растворе апро-тонного растворителя в присутствии К2С03, триэтиламина или пиридина в качестве основания. Однако, при использовании основания в синтезе хлорацетанилидов, появляется возможность протекания побочных реакций, что может заметно понижать выход хлорацетанилидов. Нами были разработаны условия и осуществлен синтез хлорацетанилидов путем конденсации К-триметилсилил-производных анилина с хлорацетилхлоридом в растворе безводного 1,2-дихлорэтана, без использования основания (рисунок 4). Выход целевых продуктов составил 82-98%.

а"

гг^Ч-'г< 111 гмдс, гда,а -----

о

1 ,2-Дихлорэтан 82-98%

Ч^^ о

3-8

Рисунок 4 - Схема синтеза хлорацетанилидов (Л= Н, 2-Ме, 4-Ме, 3,4-Ме2, 3,5-Ме2, 4-РЬО)

Синтез целевых соединений 9-18 был осуществлен путем обработки соответствующего 1-бензилурацила 2 эквимолярным количеством хлорацетанилида 3-8 в растворе ДМФА в присутствии К2С03. В результате образовывались 1-бензил-З-ацетанилидпроизводные урацила, выход которых составил 73-96%. 1-(Дифенилме-тил)урацил в аналогичных условиях образуется с выходом 96% соединение 19 (рисунок 5).

о

& СеД>

КгСО,, ДМФА 73-96%

Рисунок 5 - Схема синтеза 1-бензил-З-ацетанилидпроизводных урацила (Р!= Н, 2,5-Ме2, 3,5-Мег, 4-1-Ви; К2= Н, 2-Ме, 4-Ме, 3,4-Ме2, 3,5-Ме2, 4-РЬО)

Синтез 3-бензилурацилов, содержащих ацетанилидный фрагмент в положении 1

Далее нами были синтезированы изомеры 1-бензил-З-ацетанилидпроизвод-ных урацила 9-19, содержащие ацетанилидные фрагменты у первого атома азота урацила, а 3,5-диметилбензильный фрагмент у третьего атома азота, соответственно (рисунок 6).

Рисунок 6 - Схема синтеза 1-ацетанилид-З-бензил производных урацила (Я= Н, 2-С1, 2-ОСНз). Условия и реагенты: а) этилбромацетат, Ь) 3,5-диметилбензилбромид, с) ЫаОН, ЕЮН, (1) ЭОСЬ, е) анилин, пиридин.

Исходный 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидин (1) конденсировали с эк-вимолярным количеством этилбромацетата при кипячении в безводном растворе 1,2-дихлорэтана. При этом образовывался этиловый эфир (урацил-1-ил)уксусной кислоты (20), который алкилировали 3,5-диметилбензилбомидом. Образующийся эфир подвергали щелочному гидролизу в водно-спиртовой среде, что вело к [3-(3,5-диметилбензил)урацил-1-ил]уксусной кислоте с выходом 67%. Полученную карбоновую кислоту превращали в хлорангидрид действием тионилхлорида и затем обрабатывали соответствующим анилином. При этом образовывались целевые амиды 24-26 с выходом 67-78%.

Следующим этапом явилась модификация структур соединений 24-26, которая заключалась в замене амидного фрагмента у атома азота в положении 1 пири-мидинового цикла трех-углеродным мостиком, содержащим ненасыщенную С=С-связь. Соединения данного ряда были синтезированы в два этапа, как это показано на рисунке 7.

Исходный 1-циннамилурацил (27) был получен путем конденсации 2,4-бис-(триметилсилилокси)пиримидина (1) с эквимолярным количеством циннамилбро-мидапри кипячении в 1,2-дихлорэтане, выход которого составил 90%. Затем 1-цин-намилурацил (27) в растворе ДМФА и в присутствии К2СОэ обрабатывали соответ-

Синтез 1-циннамил-З-бензил-производных урацила

ствующими бензилгалогенидами, что вело к образованию целевых 1-циннамил-З-бензил-производных урацила 28-33, выход которых находился в пределах 71-81%. В аналогичных условиях было получено 3-(1-нафтилметил)-производное 34.

1? о

и-Дя^т.«, Ц- у ДМФА,1С,СО, |

•л-» ш> Ссс

71-81

27 28-33 34

Рисунок 7 - Схема синтеза 1 -циннамил-3-бензил-производных урацила (Я = Н, 3,5-Ме2,3,5-С12, 3,5-Вг2, З-Вг-5-Ме, 3,5-Р2; На1 = С1, Вг)

Синтез 1-[5-(фенокси)пентил]урацилов

Дальнейшее направление структурного дизайна ННИОТ ВИЧ-1 вытекало из общих структурных закономерностей строения ингибиторов и влиянии кольца В на проявление вирусингибиторных свойств. В настоящее время известно несколько классов ННИОТ в которых отсутствует среднее кольцо В. Причем все они продемонстрировали противовирусную активность в наномолярных концентрациях. Синтез соединений 37-47, 49-51,53-66 представлен на рисунке 8.

ОБ1Ме, н

ОН О^Х^На! Оу^О

«Л2_Л У^ьигг0-^......

К,СО,, »цетоя 160-170 еС

35 36 1 37-47,49-51,53-66

Рисунок 8 - Схема синтеза 1-[со-(фенокси)алкил и -алкенил]производных урацила (Я1 = Н, СНз, Вг, I; Я2= Н, СН3, ;-Рг, г-Ви, г-Ат, РЬ, СИ, С1, Вг, л-РЮОС, Ж>2; X = (СН2)„, (г)-СН=СН, (Е)-СН=СН; п=1,2, 3, 4, 6; На1= Вг, С1)

Исходный фенол 35 обрабатывали избытком 1,5-дибромпеятана в присутствии К2С03 при кипячении в растворе ацетона, что вело к соответсвующим 1 -бром-5-(фенокси)пентанам 36, выход которых был равен 53-81%. Целевые 1-[5-(фенок-си)петил]производные урацила, были получены конденсацией эквимолярных количеств бромидов 36 с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинами 1. Поскольку конденсации 1 -бром-5-(фенокси)пентанов 36 с 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримиди-нами 1 в литературе описано не было, нами впервые подобраны условия для данной реакции. Наилучшие результаты были достигнуты при нагревании эквимоляр-

12

ных количеств исходных 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинов 1 и бромидов 36 при 160-170 °С в течение 1 часа, что вело к целевым 1-[5-(фенокси)пентил]ура-цилам 37-47,49-51 и 53-56, выход которых составил 72-88%.

Для изучения влияния свободной карбоксильной группы на противовирусную активность, нами было синтезировано соединение 48, содержащее карбоксильную группу и соединение 52, содержащее свободную аминогруппу.

ГТ°

Г

48 52

По аналогии были синтезированы 1-[со-(фенокси)алкил и -алкенил]производ-ные урацила, отличающиеся длиной и природой линкера, связывающего урацил с феноксильным фрагментом 57-66. Выход целевых продуктов составил 70-80%.

Биологическая активность

Ингибиторная активность целевых соединений в отношении вирусного фермента обратной транкриптазы (ОТ) ВИЧ была выполнена в ФГБУН Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, РАН (Москва). Противовирусная активность на клеточных культурах в отношении широкого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов была выполнена в Pera Интитуте Медицинских Исследований (Левен, Бельгия). Для оценки антиретровирусного потенциала целевых соединений производных урацила нами был проведен ряд экспериментов по молекулярному докингу. Расчеты выполнены с помощью пакета AutoDock Vina 1.1.2, комплексы PDB: 1JLC, PDB: 3DYA, PDB: ЗМ8Р.

При изучении противовирусной активности 1-бензил-З-ацетанилид-произ-водных урацила 9-19 в отношении вируса ВИЧ-1 было обнаружено, что данные соединения не проявили выраженной анти-ВИЧ активности. Результаты молекулярного докинга для целевого соединения 16 представлены на рисунке 9.

Было обнаружено, что расстояние между атомом кислорода в положении 4 пиримидинового цикла и атомом кислорода карбонильной группы лизина 101 составляет 2,7 ангстрема, т.е. меньше дистанции Ван-дер-Ваальса. Такое взаимодействие является электростатически невыгодным, что является вероятной причиной отсутствия анти-ВИЧ активности данных соединений.

13

Рисунок 9 - Предсказанная конформация связывания соединения 16 с обратной транскриптазой ВИЧ (РОВ: ЗОУА)

Однако, несмотря на отсутствие анти-ВИЧ активности некоторые 1 -бензил-3-ацетанилид-производных урадила проявили выраженную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток, сравнимую с действием ганцикловира (таблица 1).

Таблица 1 - Анти-ЦМВ активность 1-бензил-З-ацетанилид-производных урацила в

культуре HEL клеток

J7,18 гянцикловир

Соединение R AD-169 Davis ЦК*, цМ

ИКЯ цМ ИС ИК»цМ ИС

17 Н 9 11 4 25 100

18 3,5-Ме2 3 33 8 13 100

Гянцикловир - 7 29 8 25 200

ИКМ (ингибирующая концентрация) - концентрация вещества, обеспечивающая подавление репликации вируса на 50%;

ЦК» (цитотоксическая концентрация) - концентрация вещества, при которой наблюдается подавление роста 50% клеток.

ИС (индекс селективности) - отношение ЦК» к ИКЖ

Кроме того, соединения 17 и 18 проявили заметную активность в отношении другого представителя семейства НегремгШае - вируса вариселлы-зостер (ВВЗ). Соединения блокировали репродукцию ВВЗ (штамм ОКА) в культуре НЕЬ клеток в концентрации ИК50 15.3 цМ (соединение 17) и 25.2 цМ (соединение 18), что усту-

пает защитному действию ацикловира (ИК50 3.56 цМ), используемого для лечения инфекций, вызванных этим вирусом. Однако следует отметить тот факт, что му-тантный штамм ВВЗ (07-1) дефицитный по тимидинкиназе, который устойчив к действию ацикловира, чувствителен к действию 1-бензил-З-ацетанилид-производ-ных урацила: ИК50 20.0 цМ (соединение 17) и 17.7 цМ (соединение 18). Это позволяет сделать предположение, что соединения 17 и 18 являются ненуклеозидными ингибиторами репродукции ВВЗ.

Дальнейшими направлением исследований стал синтез изомерных аналогов, отличающихся расположением карбонильной функции в среднем ядре (рисунок

При проведении экспериментов по молекулярному докингу, было показано отсутствие влияния между атомом кислорода в положении 4 пиримидинового цикла и атомом кислорода карбонильной группы лизина 101 (рисунок 11), что наблюдалось в случае 1-бензил-З-ацетанилид-производных урацила.

Рисунок 11 - Предсказанная конформация связывания соединения 24 с обратной транскриптазой ВИЧ (РОВ; ЗОУА)

Анти-ВИЧ активность 1-ацетанилид-3-(бензил)производных урацила была исследована в культуре МТ-4 клеток и в отношении вирусного фермента ОТ ВИЧ-

10).

О

1. Исследования показали, что 1-ацетанилид-3-(бензил) производные урадила проявляют ингибиторные свойства как в отношении ОТ ВИЧ, так и в культуре МТ-4 клеток в микромолярном диапазоне концентраций.

Дальнейшая модификация структуры заключалась в замене ацетанилидного фрагмента у атома азота в положении 1 пиримидинового цикла трех-углеродным ненасыщенным мостиком, который связывает с остатком урацила фенильное кольцо:

Аналогичным образом были выполнены эксперименты по молекулярному докингу и предсказана модель связывания соединения 32 с ОТ. Найдено, что данное соединение проявляет высокую степень пространственного подобия с хорошо известным высокоактивным ингибитором ряда бифениловых эфиров (рисунок 12).

Рисунок 12 - Предсказанная конформация связывания соединения 32 с обратной транскриптазой ВИЧ (РОВ: ЗОУА) Результаты биологических исследований показали, 1-циннамил-З-арилметил

производные урацила проявили заметную анти-ВИЧ-1 активность в культуре МТ-4

клеток в микромолярных концентрациях и доказали механизм своего действия в

качестве ННИОТ при ингибировании рекомбинантной ОТ. Анти-ВИЧ-1 активность

1-циннамил-З-арилметил производных урацила представлена в таблице 2.

Наибольшую активность проявили соединения, содержащие 3,5-дизамещен-

ный бензильный фрагмент в положении Введение объемного нафтилметиль-

ного заместителя в положение К3 вело к значительному падению анти-ВИЧ-1

активности как в культуре клеток, так и в отношении ОТ.

Таблица 2 - Анти-ВИЧ-1 активность 1-циннамил-З-арилметил производных урацила в культуре МТ-4 клеток и в отношении ОТ ВИЧ-1

Соединение И ЦК„(цМ) вич-1011В) д икий штамм К,

и к™ (ИМ) ИС

28 Н 160 7,85 20 29

29 3,5-Ме2 257 1,27 202 0,55

30 3,5-С1 49 1,99 24 0,67

31 3,5-ВГ2 231 1,72 134 0,31

32 З-Вг-5-Ме 100 1,36 73 0,31

33 3,5-Р2 31 8,4 4 12

34 - 293 13 22 6,6

Невирапнн >4 0,048 >400 7,2

Наиболее активные соединения циннамил-производных урацила 29, 30, 31 и 32 были исследованы в отношении мутантных вариантов ОТ ВИЧ-1. Анализ инги-бирующей активности в отношении мутантных вариантов ОТ показал, что 1-цин-намил-3-арилметил производные урацила сохраняют выраженную активность в отношении Ы001 и 0190А мутантной ОТ. Они также ингибируют ОТ с КЛОЗК, VI06А или У181С мутациями, хотя в более высоких концентрациях. Однако при их тестировании в отношении К103М/У181С мутантной ОТ ВИЧ, только З-бром-5-метил производное 32 проявило анти-ВИЧ активность в отношении двойного мутанта (таблица 3).

Таблица 3 - Анти-ВИЧ активность 1-циннамил-З-арилметил производных урацила в отношении мутантной ОТ ВИЧ

ОТ ВИЧ-1

29 (3,5-Ме2) 30 (3,5-С1) 31 (3,5-ВГ2) 32 (З-Вг-5-Ме) Невирапип Эфавиренц

Дпкий тип ВИЧ-1 0,55 0,67 0,31 0,31 7,2 0,01

1Л001 0,76 0,92 0,36 0,24 273 0,08

K103N 12 15,5 9,4 6,9 >2000 0,58

У106А 2,9 11 4,2 2,3 >2000 0,05

У181С 75 43 25 20 >2000 0,03

С190А 0,4 0,55 0,3 0,18 >2000 0,06

K103N/Y181C >100 >100 >100 85 >2000 0,14

Помимо анти-ВИЧ активности, некоторые циннамил-арилметил производные урацила проявили заметную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток, сопоставимую с ганцикловиром.

Дальнейшее направление дизайна ННИОТ ВИЧ-1 показано на рисунке 13.

Рисунок 13 - Направление дизайна ННИОТ

Однако соединения данного ряда не проявили выраженной анти-ВИЧ активности. Возможные причины низкой активности выявлены с помощью экспериментов по молекулярному докингу (рисунок 14, 15). Во-первых, данные соединения не способны к образованию водородной связи с главной цепью фермента. Во-вторых, полярный остаток урацила находится в гидрофобном окружении, что невыгодно энергетически.

46

Рисунок 14 - Предсказанная конформация связывания соединения 46 с обратной транскриптазой ВИЧ (РОВ: ЗМ8Р)

Тф2»

>

1.у«101

РЕТТ2

Н

о^ о

50

Рисунок 15 - Предсказанная конформация связывания соединения 50 с обратной транскриптазой ВИЧ (РОВ: ПЬС).

Однако, несмотря на отсутствие анти-ВИЧ активности соединения данного ряда проявили выраженную анти-ЦМВ активность в культуре НЕЬ клеток. Активность некоторых соединений была сопоставима с действием ганцикловира, как это показано в таблице 4.

Таблица 4 - Анти-ЦМВ активность 1-[<в-(фенокси)алкил]урацилов в культуре НЕЬ

клеток

Соединение Ri R2 n AD-169 Davis ЦК» цМ

HK„(iM ИС ИК»цМ ИС

40 Н 4-СН, 3 >20 >5 >20 >5 >100

42 н 4-i-Pr 3 25 4 15 6,6 > 100

43 н 4-t-Bu 3 14 2,9 12 3,3 40

45 н 4-Ph 3 >20 - 54 ND

46 н 4-CN 3 8,9 na 5,5 18,2 100

47 н 4-п-РЮОС 3 45 га 45 2,2 > 100

50 н 4-Br 3 9,4 10,6 12 8,3 > 100

52 н 4-NH2 3 55 1,8 55 1,8 > 100

53 Вг 4-Br 3 36 2,8 67 1,5 > 100

54 I 4-Br 3 13 7,7 20 5 > 100

56 СН3 4-Br 3 8,9 11,2 9,0 11,1 > 100

64 Н 4-Br 6 12,0 8,3 8,9 11,2 > 100

Ганцикловир 7,0 28,6 8,3 24,1 200

Изучение зависимости структура-активность показало, что решающую роль в проявлении ингибиторных свойств соединений играет природа заместителя в пара-положении феноксильного заместителя. В частности, обнаружено, что полярные заместители, как правило, давали слабоактивные или полностью неактивные соединения. В ряду алкильных заместителей прослеживается зависимость анти-ЦМВ активности от размера заместителя: Н (37) к СН3 (40) < /-Рг (42) < <-Ви (43). Введение в качестве заместителя фенила вело к малоактивному соединению 45. В то же время, 4-циано- (соединение 46) и 4-бром-производное (соединение 50) проявили мощную анти-ЦМВ активность сравнимую с действием ганцикловира. Интересно отметить, что замена атома брома на атом хлора дает полностью неактивное соединение 49. Вероятно, это связано с электростатическим взаимодействием между галоген- или СЫ-заместителем и соответствующей функциональной группой белков, например, карбонильной группой, так как кислородсодержащее соединение 48 было неактивным.

Нами также было изучено влияние заместителя в положении 5 остатка урацила. Показано, что введение галогена ведет к понижению ингибиторной

активности (соединения 53 и 54), в то время как метальная группа (соединение 56) практически не изменяет уровень активности.

Изучение в ряду аналогов соединения 50 влияния длины мостика, связывающего ароматический фрагмент с остатком урацила, показало, что производные урацила с тремя (58), четырьмя (61) и шестью (63) СН2-группами в составе линкера являются неактивными в отношении ЦМВ в субтоксических концентрациях, в то время как восьми-метиленовый аналог 64 проявил существенную анти-ЦМВ активность, сравнимую с действием ганцикловира.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования было синтезировано 56 новых соединений — производных урацила, содержащих различные заместители при атомах азота, изучена их противовирусная активность как на клеточных культурах, так и в отношении вирус-специфических ферментов, изучены их физико-химические свойства, их структура доказана с помощью современных спектральных методов исследований: 'Н и 13С ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения.

На основании полученных результатов работы были сделаны следующие выводы:

1. Изучение закономерности структура-противовирусная активность в ряду синтезированных соединений показало, что некоторые соединения относятся к новому поколению ненуклеозидных ингибиторов вирусной репродукции, способных ингибировать не только дикие штаммы, но и большинство наиболее важных с клинической точки зрения мутантных изолятов.

2. Разработан новый способ синтеза хлорацетанилидов, отличающийся простотой и

эффективностью от описанных в литературе методов.

3. Синтезировано 14 производных урацила, содержащих ацетанилидный фрагмент в боковой цепи. Показано, что положение ацетанилидного заместителя играет определяющую роль в направлении противовирусного действия. Найдено, что некоторые соединения данного ряда проявили мощную анти-ВИЧ-1, анти-ЦМВ активность и заметную активность в отношении ВВЗ.

4. Синтезировано 7 производных урацила, содержащих циннамильный заместитель

у атома азота в положении 1 урацильного остатка. Показано, что соединения данного ряда обладают мощной анти-ВИЧ-1 и анти-ЦМВ активностью.

5. Разработаны условия и осуществлен синтез 1-[со-(фенокси)алкил]урацилов путем

конденсации 2,4-бис(триметилсилилокси)пиримидинов с 1-бром-со-(фенокси)-алканами.

6. Синтезировано 30 производных урацила, содержащих ю-(фенокси)алкильный и -

алкенильный заместитель у атома азота в положении 1 урацильного остатка. Обнаружено, что большинство соединений данной группы проявляют мощную активность в отношении ЦМВ.

По результатам работы выявлены высокоактивный анти-ВИЧ агент, два ингибитора репликации ЦМВ, а также ингибитор двойного действия, активный относительно ВИЧ и ЦМВ. Данные соединения представляют большой интерес в качестве потенциальных противовирусных средств. Они требуют дополнительных исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Synthesis and anti-HCMV activity of l-[co-(phenoxy)alkyl]uracil derivatives and analogues thereof / M. S. Novikov, D. A. Babkov, M. P. Paramonova [et al.J // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2013. - Vol. 21, № 14. - P. 4151-4157.

2. N',N3-disubstituted uracils as nonnucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase / M.S. Novikov, V. T. Valuev-Elliston, D.A. Babkov, M. P. Paramonova [et al.] // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2013. - Vol. 21, № 5. - P. 1150-1158.

3. A highly facile approach to the synthesis of novel 2-(3-benzyl-2,4-dioxo-l,2,3,4-tetrahydropyrimidin-l-yl)-N-phenylacetamides / M. S. Novikov, D. A. Babkov, M. P. Paramonova [et al.] // Tetrahedron Letters. - 2013. - Vol. 54, № 6. - P. 576-578.

4. Бабков, Д. А. Синтез производных 1-циннамилурацила как потенциальных противовирусных агентов / Д. А. Бабков, М. П. Парамонова // Вестник ВолгГМУ: приложение (Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»). -Волгоград, 2012. - С. 6-7.

5. Парамонова, М. П. Синтез и противовирусная активность 1-[со-(фенокси)алкил]-производных урацила / М. П. Парамонова, Д. А. Бабков // Вестник ВолгГМУ: приложение (Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств»), -Волгоград, 2012. - С. 59-60.

6. Противовирусные Агенты. VI. Синтез новых 1-циннамил-З-бензил производных урацила / М. П. Парамонова [и др.] // Волгоградск. научно-медицинский журнал. - 2011. - Т. 4. - С. 25-29.

7. Противовирусные Агенты. III. Синтез новых 1-бензил-З-ацетанилид-производ-ных урацила / М. П. Парамонова [и др.] // Волгоградский научно-медицинский журнал. - 2011. - Т. 3,-С. 11-14.

8. Противовирусные агенты. И. Синтез производных 1-[5-(фенокси)пентил]ураци-ла / М. П. Парамонова [и др.] // Волгоградский научно-медицинский журнал. -2011.-Т. 2. - С. 17-21.

9. Противовирусные агенты. I. Синтез 1-[со-(3,5-диметилфенокси)алкил]-производных урацила / Д. А. Бабков, М. П. Парамонова [и др.] // Волгоградский научно-медицинский журнал. - 2011. - Т. 2. - С. 15-17.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЗ - вирус вариселла-зостер

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ГМДС - гексаметилдисилазан

ДМФА - диметилформамид

ИОТ - ингибитор обратной траскриптазы

НИОТ — нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы

ННИОТ - ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы

ОТ ВИЧ - обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ТМС-производные — триметилсилил-производные

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЦМВ — цитомегаловирус

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ПАРАМОНОВА МАРИЯ ПЕТРОВНА

СИНТЕЗ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ N-БЕНЗИЛЗАМЕЩЕННЫХ УРАЦИЛОВ И ИХ АНАЛОГОВ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «_»_2013 г. Формат бумаги 60x84 1/24

Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 150 экз. Заказ №_

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (400131, г. Волгоград, Площадь Павших Борцов, 1)

Копировальный центр «Эстамп & к» (г. Волгоград, Центральный район, ул. Мира, д 11) 24