Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Генетический полиморфизм гена-онкосупрессора и функционально связанных с ним генов CCR5 и XRCC1 при раке легкого

Актуальность проблемы. Рак легкого (PJ1) занимает лидирующие позиции в структуре онкологической заболеваемости мужчин, которые болеют почти в 7 раз чаще, чем женщины. Статистические данные констатируют ежегодное увеличение числа диагностируемых случаев рака легкого, в России ежегодно от этого заболевания погибает свыше 60000 человек (Мерабишвили В.М., Дятченко О.Т., 2000, Имянитов Е.Н., 2006). Ведущими факторами формирования PJI являются избыточная экспозиция к повреждающим факторам внешней среды и нарушения в системе поддержания стабильности клеточного генома. Общим атрибутом и пусковым моментом канцерогенеза является дисбаланс процессов пролиферации, дифференцировки клеток, апоптоза и репарации, детерминированный не только генетическими (наличие мутаций) и эпигенетическими нарушениями, изменяющими функции онкогенов и генов-супрессоров, но и вариабельностью функционирования патогенетически значимых генов, обусловленной генетическим полиморфизмом (Malik, Brown, 2000; Singletary, 2003; Yokota, Kohno, 2004; Hunter, Crawford, 2006).

Особое место в картине нарушений при злокачественных новообразованиях (ЗНО) различных локализаций, в том числе и при PJ1, занимают повреждения гена онкосупрессора р53, локализованного на 17 хромосоме. р53 регулирует экспрессию генов клеточного цикла и апоптоза, инициирует репарацию поврежденной ДНК, тем самым контролируя геномную стабильность клетки (Копнин Б.П., 2000; Fan et al., 2000; Rom et al., 2000). Для гена p53 установлено 19 полиморфизмов, при этом полиморфизмы 3, 6 интронов и 4 экзона считаются вовлеченными в канцерогенез (Avigad et al., 1997; Wu et al., 2002; van Heemst, 2005). Наиболее широко изучен полиморфизм в кодирующем участке гена р53 (4 экзон, Arg72Pro полиморфизм), есть сведения о его ассоциации со злокачественными новообразованиями различных локализаций (Wu et al., 1995; Sjalander et al., 1996; Biros et al., 2001; Jain et al., 2005). Исследования роли полиморфизма интронов гена р53 в риске PJ1 немногочисленны. Интронные полиморфизмы, благодаря своему участию в регуляции сплайсинга мРНК, экспрессии генов и ДНК-белковых взаимодействий, при определенных условиях также могут оказывать влияние на функциональную активность белков. Полиморфизм 6 интрона гена р53, представлен заменой гуанина на аденин в сайте рестрикции MspI эндонуклеазы и влияет на уровень экспрессии белка р53 (Barel et al., 1994). Дупликация 16 п.н. в 3 интроне может приводить к ингибиции перехода р53 из стрессовой конформации в латентную, в которой р53 стимулирует репарацию ДНК (Liang, 2005).

Высокая частота индивидуальных полиморфизмов в низкопенетрантных генах может обеспечивать достаточно солидный вклад этих генов в популяционный атрибутивный риск в сочетании с экспозицией к патогенетически значимым факторам внешней среды (Пальцев М.А. и др., 2004; Jong et al., 2002; Newman et al., 2005). При этом аиализ генотипических комбинаций функционально связанных генов может существенно повысить эффективность исследований, поскольку затрагивает сразу несколько сигнальных путей, вовлекаемых в патогенез рака (Имянитов Е.Н., Хансон К.П., 2003; Onay et al., 2006). В работе Wu et al. (2002) выявлена ассоциация комбинаций, содержащих минорные аллели генотипов гена р53 по 3 локусам (3 и 6 интрон, 4 экзон) с PJI для лиц европеоидной расы, которую авторы связывают со снижением апоптотической и репарационной активности в клетках с такими генотипами. Аналогичные данные получены для РМЖ и других ЗНО (Sjalander et al., 1996; Mitra et al., 2006; Schabath et al., 2006; Onay et al., 2006). Изменения в генах, модулирующих активность р53, также могут быть сопряжены с нарушением его функции. Так, в наследственных высоко агрессивных формах РМЖ при нарушении в генах репарации BRCA1 и BRCA2 часто встречаются мутации р53. Функциональная неполноценность р53 отмечена в случае изменений в генах ATM, PTEN и СНЕК2, которые вовлекаются в регуляцию активации р53 (Lacroix, Leclercg, 2005).

Manes et al. в 2003 году было показано, что для осуществления эффективного апоптоза модифицированных клеток необходимо согласованное взаимодействие онкосупрессора р53 с белком-рецептором хемокинов CCR5. Авторы выявили, что носительство вариантного аллеля CCR5del32 ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при раке молочной железы у пациенток при отсутствии соматических мутаций в гене р53 в клетках опухоли, что объясняется нарушением передачи апоптоз-индуцирующего сигнала трансформированным клеткам. CCR5 является одним из важных поливалентных хемокиновых рецепторов, определяющих инфильтрацию иммуноцитов в очаги воспаления и опухоль, и тесно связан с развитием Thl клеточно-опосредованного иммунного ответа, а также вовлечен в регуляцию подвижности и пролиферации опухолевых клеток (Azenstein et al., 1999; Mira et al., 2001; Luboshits et al., 2002). Мы не встретили в доступной нам литературе сведений об исследовании связи сочетаний полиморфизмов генов р53 и CCR5 с РЛ.

Белок р53 инициирует сборку комплекса эксцизионной репарации ДНК посредством активации транскрипции гена XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group 1) (Marintchev et al., 2003). XRCC1 является связующим белком, который формирует комплекс эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER) путем индивидуального взаимодействия с каждым компонентом, соединяя ДНК-полимеразу ß, ДНК-лигазу Ша и ПАРП на поврежденном сайте ДНК (Caldecott et al., 1994). Arg399Gln полиморфизм 10 экзона гена XRCC1 затрагивает его центральный домен, необходимый для активации BER. Есть указания, что данный полиморфизм связан с повышенным риском возникновения рака молочной железы (Duell et al., 2001), рака поджелудочной железы (Duell et al., 2006), рака легкого (Залесский В.Н. и соавт., 2005; Park et al., 2002; Casse et al., 2003). Можно полагать, что полиморфизм обоих генов вносит сочетанный вклад в нарушение процессов репарации ДНК, однако таких данных в литературе не найдено.

Комплексное изучение полиморфизма генов р53, CCR5 и XRCC1 может выявить биологические взаимодействия их полиморфных вариантов, вносящих ■существенный вклад в раннее возникновение злокачественных опухолей в условиях экспозиции к экзогенным и эндогенным генотоксическим факторам.

В настоящее время полемизируется вопрос об антагонистическом плейотропизме генов, накоплены доказательства, что гены опухолевых супрессоров, защищая организм от рака в раннем периоде онтогенеза, могут промотировать фенотип старения, включая поздний рак (Campisi et al., 2005). Сведения о взаимосвязи полиморфизма данных генов с формированием РЛ в зависимости от возраста немногочисленны и неоднозначны (Taioli, Bonassi, 2004; Szymanowska et al., 2006). Отсутствуют данные о вкладе комбинаций вариантных генотипов гена р53 по интронным и экзонным полиморфизмам в сочетании с генотипами других функционально связанных с ним генов, в частности, CCR5 и

Х11СС1 в риск РЛ. Все сказанное определяет актуальность изучения сочетанного вклада полиморфизма генов р53, ССЫ5 и Х11СС1 в риск возникновения и прогрессию РЛ в европеоидной популяции Сибири с учетом основных патогенетически значимых факторов риска.

Цель исследования: Изучить ассоциации аллельных вариантов гена-онкосупрессора р53, гена хемокинового рецептора ССЯ5, гена репарации ДНК ХЯСС1 с раком легкого и с клинико-морфологическими особенностями течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить ассоциации полиморфных вариантов генов р53, ССЫ5, ХЯСС1 с различными гистологическими формами РЛ.

2. Оценить взаимосвязь интронного (3 и 6 интрон) и экзонного (4 экзон) полиморфизмов гена р53 и различных их комбинаций с РЛ в зависимости от возраста и курения.

3. Оценить распределение сочетаний генотипов гена хемокинового рецептора СС115 с комбинацией генотипов гена р53 (3 интрон-4 экзон-6 интрон) у больных РЛ.

4. Оценить частоту встречаемости аллельных вариантов гена репарации ДНК ХЯСС1 в сочетании с комбинацией генотипов (3 интрон-4 экзон-6 интрон) гена р53 у больных РЛ.

5. Провести анализ ассоциаций исследуемых полиморфизмов генов р53, ССЯ5, Х11СС1 с клинико-морфологическими особенностями злокачественного процесса.

Научная новизна. Впервые в России изучена ассоциация комбинаций вариабельных генотипов взаимосвязанных генов р53, ССЯ5, ХН.СС1 с раком легкого.

Получены новые данные о взаимосвязи комбинаций генотипов гена р53 (3 интрон-4 экзон-6 интрон) с НМРЛ в зависимости от возраста. Показано, что риск НМРЛ повышается при носительстве w/dupl6-Arg/Pro-w/m комбинации гена р53 для лиц зрелого возраста, \у/\у-Аг^А^-\у/\у комбинации гена р53 - для лиц пожилого возраста, при этом модифицирующее влияние фактора курения установлено только для индивидуумов зрелого возраста.

Не выявлено ассоциации минорных аллелей генов хемокинового рецептора CCR5 и репарации XRCC1 с риском формирования HMPJI.

Показано, что вариантные генотипы гена рецептора хемокинов CCR5 пе модифицируют выявленную взаимосвязь комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 w/dupl6-Arg/Pro-w/m с HMPJI для лиц зрелого возраста. Показан сочетанный вклад гетерозиготных генотипов генов р53 и XRCC1 w/dupl6-Arg/Pro-w/m(Arg/Gln) в риск формирования HMPJI для лиц зрелого возраста. Мажорный генотип Arg/Arg гена XRCC1 нивелирует рисковую значимость комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 для лиц зрелого возраста.

Комбинация гетерозиготных генотипов w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 ассоциирована с более высокими показателями общей выживаемости больных HMPJI, чем комбинация гомозиготных генотипов по мажорных аллелям гена р53.

Установлена ассоциация w/del32 генотипа гена CCR5 на уровне тенденции и комбинации гетерозигот w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 с мелкоклеточной формой РЛ.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные ассоциации комбинаций гетерозиготных и мажорных генотипов гена р53 с HMPJI для лиц зрелого (40-59 лет) и пожилого возраста (60-74 лет), соответственно, указывают на различие механизмов вовлечения р53 в формирование HMPJI в разные периоды онтогенеза человека.

Установленная ассоциация w/dup 16-Arg/Pro-w/m комбинации гена р53 и ее сочетания с гетерозиготным генотипом гена репарации XRCC1 с HMPJI для курящих лиц зрелого возраста свидетельствует о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев формирования групп повышенного риска HMPJI.

Данные о связи комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 w/dup 16-Arg/Pro-w/m с более высокими показателями общей выживаемости больных HMPJI указывают на возможность использования этих параметров в качестве дополнительных критериев прогноза. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости изучения полиморфизма гена р53 по указанным локусам на более представительной выборке, для обоснования возможности генотипирования р53 в качестве дополнительного прогностического критерия HMPJI.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В условиях патогенетически значимых экзогенных влияний (курение) сочетанное носительство функционально измененных генотипов, содержащих минорные аллели по интронным и экзонному полиморфизмам гена р53 и в399А полиморфизму гена репарации XR.CC!, способствует формированию немелкоклеточной формы РЛ у лиц зрелого возраста.

2. Носительство комбинации функционально полноценных генотипов шЛу-А^/А^-луЛу (мажорные аллели) по интронным и экзонному полиморфизмам гена р53 повышает риск возникновения НМРЛ в пожилом возрасте.

3. Комбинация гетерозиготных генотипов гена р53 по 3, 6 интрону и 4 экзону w/dupl6-Arg/Pro-w/m ассоциирована с более высокими показателями общей выживаемости больных НМРЛ, чем комбинация гомозиготных генотипов

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы здравоохранения регионов Сибири, г.Красноярск (2005); научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Иммунология на рубеже веков: к 75-летию со дня рождения академика РАМН Н.В. Васильева», г. Томск (2005); четвертой Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине г. Новосибирск (2006); 16 ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества, г. Мюнхен (2006); региональной конференции молодых ученых имени акдемика РАМН Н.В. Васильева, г.Томск (2007); 12 ежегодном конгрессе Международного сообщества по изучению рака легкого, г. Сеул (2007).

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 23 печатных работах, отражающих основные положения диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Выявленное повышение частоты гетерозиготных генотипов гена р53 по 4 экзону (54%, Arg72Pro полиморфизм) и по 6 интрону (29%, Mspl полиморфизм) по сравнению с контрольной группой (42%, р<0,000 и 15%, р<0,001, соответственно) свидетельствует о их вкладе в риск HMPJI для курящих индивидуумов зрелого возраста (40-59 лет). Наличие гомозиготного генотипа по мажорным аллелям 4 экзона гена р53 ассоциировано с HMPJI для курящих лиц пожилого возраста (60-74 лет).

2. Генотипирование гена XRCC1 по полиморфизму Arg399Gln и гена CCR5 (CCR5del32 полиморфизм), не выявило различий в частоте встречаемости различных генотипов между группой больных HMPJI и популяционным контролем, что свидетельствует об отсутствии ассоциации этих полиморфизмов с HMPJI.

3. Риск возникновения HMPJI в зрелом возрасте повышается для курящих носителей комбинации гетерозиготных генотипов w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 (р<0,002). Риск HMPJI в пожилом возрасте повышается для носителей комбинации гомозиготных генотипов по мажорным аллелям гена р53 w/w-Arg/Arg-w/w (р<0,001) независимо от фактора курения.

4. Показан сочетанный вклад гетерозиготных генотипов генов р53 и XRCC1 w/dup 16-Arg/Pro-w/m(Arg/Gln) в риск формирования HMPJI для лиц зрелого возраста. Сочетание комбинации гетерозиготных генотипов р53 с мажорным генотипом Arg/Arg гена XRCC1 не ассоциировано с HMPJI в зрелом возрасте

5. Установлена ассоциация w/del32 генотипа гена CCR5 (р=0,07) и комбинации гетерозигот w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 (р<0,02) с мел ко клеточным раком легкого.

6. Комбинация гетерозиготных генотипов w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 ассоциирована с более высокими показателями общей выживаемости больных HMPJI по сравнению с комбинацией гомозиготных генотипов по мажорным аллелям w/w-Arg/Arg-w/w (р<0,04).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование генетического полиморфизма важно не только для прогноза возможных генетических или канцерогенных эффектов, но и для определения доли генетической компоненты в общей заболеваемости населения, в частности, мультифакториальной патологией, которая составляет более 50% всех нозологических форм.

Для изучения вклада генетической составляющей в патогенезе РЛ наиболее широко используются методы ассоциативного анализа, основанные на исследовании полиморфных вариантов генов в выборках больных и здоровых. Такие исследования дают возможность установить вовлеченность в патогенез заболевания конкретных генов и на основе этого в дальнейшем выявить группы лиц с риском развития РЛ. При исследовании ассоциации сравнивают распределение частот аллелей и генотипов функционально взаимосвязанных генов, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении аллелей и генотипов свидетельствует об ассоциации полиморфизма гена с заболеванием. Для того, чтобы изучить ассоциацию полиморфизма функционально взаимосвязанных генов р53, CCR5 и XRCC1 с НМРЛ и МРЛ, был использован стандартный для качественных данных непараметричекий критерий %2, при помощи которого в группах сравнения оценивали различия частот генотипов и их комбинаций.

В настоящее время активно изучают полиморфизм 4 экзона гена р53 в разных популяциях с целью изучения его взаимосвязи с ЗНО, однако в литературе нет однозначных данных о связи данного полиморфизма с РЛ, несмотря на большое число публикаций. На популяции Западной Сибири полиморфизм 4 экзона детально изучен Ляховичем В.В. и соавторами (1997), ими показана ассоциация Arg аллеля с РЛ и РЖ (рак желудка), однако эти данные не согласуются с результатами работ, проведенных на других популяциях. Можно полагать, что генетические полиморфизмы в зависимости от географических и экологических условий, расовой (этнической) принадлежности могут предрасполагать, либо, наоборот, препятствовать возникновению ЗНО различных локализаций.

Роль интронного полиморфизма гена р53 в риске ЗНО изучена недостаточно, единичные работы посвящены интронному полиморфизму гена р53 при PJL Считается, что интроны не могут влиять на функциональную активность белка, так как они являются некодирующей частью ДНК. В тоже время, учитывая тот факт, что интроны не присутствуют в зрелой мРНК, а подвергаются вырезанию во время сплайсинга, им отводится важная роль при различных стрессовых влияниях на клетку, когда необходимо в короткие сроки синтезировать белок р53. Таким образом, возможно, что изменение длин интронов влияет на скорость синтеза белков, а однонуклеотидные замены приводят к сдвигу рамки считывания, что может повлечь к неправильному вырезанию границ интронов из мРНК и, как следствие, к синтезу дефектного белка.

Результаты наших исследований свидетельствуют о роли интронного и экзонного полиморфизма гена р53 в риске HMPJI. Так, нами была установлена ассоциация Arg/Arg генотипа (р<0,000) с НМРЛ для лиц пожилого возраста. Наши результаты находятся в согласии с данными ряда зарубежных авторов (Wang et al., 1999; Papadakis et al., 2002; Jain et al. 2005; Siddique et al., 2005). Выявленная нами рисковая значимость генотипа Arg/Arg может быть объяснена данными, приведенными в работах Zollner et al. (2004), которые свидетельствуют о том, что мажорные аллели, которые являются благоприятными на ранних этапах онтогенеза, оказываются «вредными» в периоде позднего онтогенеза человека.

Установлена взаимосвязь Arg/Pro генотипа 4 экзона (р<0,004), w/m генотипа 6 интрона (р<0,001) и w/dupl6 генотипа 3 интрона (на уровне тенденции, р=0,06) с риском НМРЛ для курящих лиц зрелого возраста. Таким образом, мы показали значимость исследования интронного полиморфизма гена р53. Далее с целью повышения информативности нашего исследования мы изучили, как влияет сочетанное носительство этих вариантных генотипов гена р53 на риск НМРЛ, а также провели анализ в зависимости от основных патогенетически значимых факторов РЛ: возраста и курения. Согласно нашим данным, у больных раком легкого и здоровых лиц наиболее распространенными комбинациями генотипов трех локусов являются: w/w-Arg/ Arg -w/w (наличие мажорных генотипов), w/w-Arg/Pro-w/w (гетерозиготность по 4 экзону Arg/Pro) и w/dup 16-Arg/Pro-w/m (гетерозиготность по всем исследуемым полиморфизмам).

При сравнении частот встречаемости указанных сочетаний в группах больных с учетом возраста и фактора курения, нами была установлена ассоциация комбинации гетерозигот (w/dup 16-Arg/Pro-w/m) с HMPJT для курящих индивидуумов зрелого возраста (40-59 лет), что может быть обусловлено нарушением функции гена р53. Основанием для такого заключения служат данные Wu et al. (2003), который, исследуя комбинации генотипов гена р53, выявил, что по мере увеличения числа минорных аллелей в гене р53 по трем изучаемым локусам, происходит нарушение функции белка р53, что выражается снижением апоптотического индекса и эффективности репарации ДНК в лимфобластоидных клеточных линиях, полученных от здоровых людей. Таким образом, вариабельность систем апоптоза приводит, вероятно, к субоптимальному функционированию систем программируемой клеточной гибели, и как следствие -к неполноценной элиминации мутированных клеток, что может иметь решающее значение при наличии влияния генотоксических факторов риска, каким в нашем случае является интенсивное курение. Установлено, что бенз(а)пирен, акролеин и др. компоненты табака являются генотоксикантами, в частности показано, что бенз(а)пирен диол эпоксидные - ДНК аддукты индуцируют мутации в различных генах, включая р53 (Alexandrov et al., 2002; Feng et al., 2006). Таким образом, в условиях действия неблагоприятных экологических факторов нарушается гомеостаз систем организма по причине вариабельности функционирования генов поддерживающих стабильность генома.

Установленная нами ассоциация с НМРЛ для лиц пожилого возраста(старше 60 лет) комбинации (w/w-Arg/Arg-w/w) мажорных генотипов гена р53 (р<0,000), являющихся функционально неизмененными, может быть объяснена с позиции возрастных изменений, характерных для данной группы больных. Накопленные в литературе данные свидетельствуют о том, что пожилой возраст характеризуется снижением иммунной реактивности организма. Таким образом, в пожилом возрасте, наличие длительного воздействия неблагоприятных экологических факторов на фоне снижения эффективности работы репаративных систем клетки, накопление генетического груза (мутации, хромосомные перестройки) определяют риск развития ЗНО. А так же при старении может изменяться не только структура генов, но и направление их функционирования. Полагают, что изменения хроматина могут играть главную роль в связанных с возрастом изменениях регуляции экспрессии генов (Анисимов В.Н., 1996; Vijg, 2000; Vijg, Dolle, 2002). Показано, что р53, несущий Arg аллель, характеризуется не только повышенной чувствительностью к мутациям, но и способностью блокировать р73 гомолог, который становится неспособным дублировать апоптотическую функцию р53, поврежденную в случае мутации р53. Таким образом, с возрастом увеличивается вероятность мутации в генах и потери контроля стабильности генома, что на фоне длительной экспозиции к повреждающим факторам экзогенной и эндогенной природы способствует повышению риска злокачественной трансформации. В целом полученные нами данные в определенной степени подтверждают высказанную недавно гипотезу об антагонистической плейотропии генов онкосупрессоров, в первую очередь, гена р53, согласно которой нормально функционирующий белок р53 защищает от рака в раннем периоде жизни, промотируя одновременно фенотип старения и связанный с ним поздний рак. Защита от неоплазий у молодых организмов связана с активным апоптозом либо индукцией фенотипа клеточного старения: оба эти процесса предотвращают пролиферацию и снижают риск злокачественной трансформации. Оборотной стороной такой активности является ускоренное накопление стареющих клеток в тканях, что наряду с дисфункцией теломеразы характеризуется резистентностью к апоптотическим сигналам, а также проканцерогенными изменениями стромальных клеток. В частности, возрастная зависимость ряда ЗНО, с одной стороны, обусловлена накоплением мутаций в эпителиальных клетках, а с другой, -связанным со старением изменением стромального микроокружения, которое становится способным формировать и поддерживать опухолевый фенотип. Такое микроокружение характеризуется повышением экспрессии факторов роста эпителия, провоспалительных цитокинов, ремодулирующих экстраклеточный матрикс молекул (Faragner, 2000; Krtolica, Campisi, 2002; Campisi, 2005).

Нами также была выявлена одна из комбинаций, которая вероятно является примером оптимального сочетания аллелей. Так, частота распределения комбинации диких генотипов по 6 и 3 интрону с гетерозиготой по 4 экзону (w/w-Arg/Pro-w/w) не различалась значимо в группах наблюдения независимо от факторов риска и прогрессии РЛ, то есть такая комбинация генотипов не обладает рисковой значимостью в плане НМРЛ. Это подтверждает предположение о том, что определенные сочетания гомо- и гетерозигот могут играть решающую роль в поддержании полноценной функциональной активности белка.

Ген р53, являясь стражем генома, функционирует в тесной взаимосвязи с другими генами. Поэтому актуальным является изучение множественного полиморфизма генов, приводящего к определенным их вариациям, которые формируют индивидуальную предрасположенность каждой личности к развитию того или иного заболевания.

В 2003 году испанскими исследователями Manes et al. было показано, что для осуществления эффективного апоптоза модифицированных клеток РМЖ необходимо согласованное взаимодействие белка-рецептора хемокинов CCR5 и р53. Ими установлено, что больные РМЖ, несущие делеционный аллель CCR5del32, который кодирует экспрессию неполноценного рецептора, и имеющие нормальный (немутантный) ген р53 в опухолевых клетках, имели сниженные показатели выживаемости по сравнению с носителями «диких» типов изучаемых генов, однако связи этого аллеля с риском формирования РМЖ не выявлено. Проведенный нами частотный анализ распределения генотипов гена CCR5 у пациентов с НМРЛ не выявил значимых различий со среднестатистической популяцией Западно-Сибирского региона.

Есть основания считать, что функциональная активность гена репарации XRCC1 может напрямую зависеть от полиморфизма гена р53, так как он координирует активацию транскрипции генов, необходимых для запуска репарации того или иного повреждения ДНК. Белок р53, связывая компоненты комплекса TFIIH генов группы ERCC (Excision Repair Cross Complementing), в которую входит XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group 1), стимулирует тем самым эксзиционную репарацию ДНК (Gueven et al., 2000; Zhou et al.,2001; Offer et al., 2002). Литературные сведения о связи Arg399Gln полиморфизма XRCC1 с РЛ достаточно противоречивы, хотя есть указания на рисковую значимость минорных аллелей. В наших исследованиях не выявлен вклад минорного аллеля гена репарации XRCC1 (генотипы Arg/Gin или Gln/Gln ) в риск возникновения НМРЛ, полученные нами данные согласуются с работами других авторов (Ratnasinghe et al., 2001; Stern et al.,2001). Полиморфизм гена XRCC1 широко изучается в сочетании с полиморфизмом целого ряда других генов репарации ДНК (ERCC1, ХРС, XPD, XPF, BRCA2 и XRCC3), оценивается вклад комбинаций генов в риск развития лимфопролиферативных заболеваний, рака пищевода, рака легкого, рака предстательной железы, карциномы головы и шеи. Так, установлено, что риск развития рака предстательной железы возрастает при сочетанном носительстве генотипа Asn/Asn 312 кодона гена XPD и Gln-аллеля 399 кодона гена XRCC1 (Rybicki et al., 2004). Однако полученные данные достаточно противоречивы и требуют более детального изучения.

Таким образом, при изучении отдельного вклада полиморфизма генов CCR5 и XRCC1 мы не установили их ассоциации с НМРЛ независимо от факторов риска, а также не выявили связи с прогрессией. Наши данные согласуются с мнением Имянитова E.H. (2006) о том, что каждый полиморфизм в отдельности обладает лишь весьма умеренным эффектом, поэтому роль нормальных вариаций генома в патологии с трудом поддается изучению. Эффективность исследований может быть повышена при оценке сочетаний связанных между собой патогенетически значимых генов. Поэтому мы оценили ассоциацию вариантных генотипов генов CCR5 и XRCC1 в сочетании с комбинациями полиморфизмов гена р53 с риском НМРЛ в зависимости от возраста.

Мы показали, что рисковая значимость w/dup 16-Arg/Pro-w/m комбинации гена р53 у больных НМРЛ зрелого возраста сохраняется как при сочетании с w/w генотипом гена CCR5 (р=0,006), так и в сочетании с w/del32 генотипом (р=0,05). Следовательно, иосительство гетерозиготных генотипов гена р53 определяет риск НМРЛ для лиц зрелого возраста независимо от статуса гена, регулирующего его транскрипционную активность. Таким образом, можно полагать, что снижение индексов апоптоза, выявленное в работе Wu et al. (2003) для носителей комбинации гетерозигот (w/dup 16- Arg/Pro-w/m) гена 53, не взаимосвязано с полиморфизмом гена хемокинового рецептора. По-видимому, рисковая значимость данной комбинации в существенной мере обусловлена наличием минорных аллелей по 6 интрону, так как данный полиморфизм влияет на уровень экспрессии р53 (Biros et al., 2004). Вероятно, что изменение экспрессии белка р53 приводит к нарушению его способности останавливать клеточный цикл и запускать апоптоз.

Установлена ассоциация w/dupl6-Arg/Pro-w/m комбинации генотипов гена р53 при сочетании с Arg/Gln генотипом гена репарации с HMPJI для лиц зрелого возраста (р<0,005). В тоже время при сочетании с мажорным генотипом Arg/Arg гена XRCC1 комбинация гетерозиготных генотипов р53 не ассоциирована с РЛ. По-видимому, нормально функционирующий белок XRCC1 может нивелировать рисковую значимость этой комбинации для индивидуумов зрелого возраста, показанную нами выше. Известно, что Arg399Gln полиморфизм 10 экзона затрагивает центральный домен BRCT-1 (breast cancer susceptibility protein-1) гена репарации XRCC1, необходимый для активации системы эксцизионной репарации оснований (BER). Можно полагать, что снижение эффективности процессов репарации для носителей Arg/Gln (w/dupl6-Arg/Pro-w/m) комбинации генотипов происходит за счет сочетанного вклада минорных аллелей генов р53 и XRCC1, а так же свидетельствует о том, что данное сочетание генотипов является неблагоприятным с точки зрения риска формирования НМРЛ для лиц зрелого возраста.

В продолжение изучения ассоциативных связей генов, мы установили, что ассоциация w/w-Arg/Arg-w/w комбинации генотипов гена р53 с НМРЛ в пожилом возрасте оставалась значимой при сочетании с w/w генотипом гена CCR5 (р<0,01) и Arg/Arg генотипом гена репарации (р<0,01), характеризующимися неизмененной активностью своих белковых продуктов. Следует отметить, что роль цитокинов и хемокинов, в частности, в процессах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии далеко неоднозначна. Показано, что клетки рака молочной железы экспрессируют хемокины и хемокиновые рецепторы (Allinen, 2004). СС хемокин RANTES продуцируется клетками рака молочной железы, и на них экспрессируется его рецептор CCR5, при этом у больных выявлена прямая корреляция высокого уровня RANTES в крови и в опухоли с более агрессивным течением РМЖ (Luboshits et al., 1999; Azenshtein et al., 2002). Авторы связывают это с аутокринной стимуляцией пролиферации опухолевых клеток, однако важную роль может играть и повышение их инвазивного потенциала при наличии высокой экспрессии CCR5, которую можно ожидать у носителей нормального генотипа.

Одной из причин ЗНО может являться накопление повреждений ДНК с возрастом, обусловленное снижением эффективности систем репарации. В ряде работ установлена положительная корреляция между продолжительностью жизни и скоростью репарации ДНК (Burkle et al., 2002). Большинство повреждений ДНК репарируется, но не все. Когда скорость репарации не достигает скорости индукции повреждений, происходит увеличение спонтанных повреждений ДНК с возрастом (Vijg, 2000). Эффективность репаративных систем ДНК не снижается с возрастом (Likhachev et al., 1990). Однако нельзя исключить, что при старении репарационные системы ДНК становятся более подвержены ошибкам, приводящим к усилению индукции мутаций.

Изучение роли генетической компоненты в формировании повышенного риска заболевания, дает возможность расширить представления о так называемых приобретенных заболеваниях, приводит к появлению новых концепций механизмов развития болезни на фойе влияния на организм патогенетически значимых факторов внешней среды.

Установленная нами ассоциация комбинации гетерозиготных генотипов w/dup 16-Arg/Pro-w/m гена р53 с HMPJI может служить дополнительным критерием для оценки индивидуального генетического риска при наличии фактора курения для лиц зрелого возраста.

Исход заболевания, одним из объективных оценочных критериев которого является продолжительность жизни больного, зависит от целого ряда факторов: распространенности процесса, гистологической структуры опухоли, применяемого лечения, чувствительности опухоли к цитостатической терапии и уровня резистентности организма больного к побочным эффектам агрессивной противоопухолевой терапии. Для того, чтобы оценить возможную связь изучаемых комбинаций полиморфизмов гена р53 с исходом, мы провели однофакторный анализ общей выживаемости больных HMPJI в зависимости от носительства разных комбинаций его генотипов по методу Каплана- Майера. При этом необходимо отметить, что исследуемые группы были сопоставимы по полу, возрасту, распространенности, локализации и гистотипу опухоли, а также по эффективности проводимой терапии. Была выявлена ассоциация комбинации гетерозиготных генотипов (vv/dup 16-Arg/Pro-w/m) гена р53 с более высокими показателями общей выживаемости больных HMPJI по сравнению с комбинацией гомозиготных генотипов по мажорным аллелям (w/w-Arg/Arg-w/w) (р<0,04). В последние годы достаточно четко показано, что гены, вовлекаемые в формирование злокачественной опухоли, как правило, связаны с ее прогрессией и ответом на лечение, таким образом, внося вклад в исход заболевания (Zpits et al., 2006). Согласно нашим результатам, комбинация гетерозиготных генотипов является неблагоприятной в плане повышения риска НМРЛ у курящих лиц зрелого возраста, однако при этом связана с более благоприятным исходом. На первый взгляд явная противоречивость данных перестает быть таковой при более подробном рассмотрении механизмов участия гена р53 в формировании, прогрессии и реакции опухоли на химиотерапию. Как уже упоминалось выше, наличие минорных аллелей способствует снижению апоптотической способности клеток (Wu et al., 2003), что может повышать риск РЛ в условиях высокой канцерогенной нагрузки, каковой является длительное интенсивное курение, приводящей к накоплению клеток с мутантным р53 на фоне сниженной способности к их элиминации путем апоптоза. С другой стороны, вероятен вклад этой комбинации генотипов в чувствительность к химиотерапии, которая, как правило, проявляет противоопухолевый эффект посредством индукции р53-зависимого апоптоза опухолевых клеток. Поскольку, судя по литературным данным, около 70% опухолей легкого содержат мутантный р53, не способный нормально запускать апоптоз, важным становится функционирование его I гомологов, р73, в частности, активация которого может происходить в случае наличия Pro аллеля, однако ингибируется Arg аллелем (Yuan et.al., 2006). Последнее может объяснить возможную более низкую эффективность химиотерапии у носителей мажорного генотипа Arg/Arg, так как активация транскрипционной функции гомологов р53 может частично компенсировать утрату его апоптогенной функции.

Использование производных платины является одним из наиболее распространенных подходов к лекарственной терапии НМРЛ. Применение препаратов данной группы далеко не всегда сопровождается выраженным лечебным эффектом, при этом пациенты зачастую страдают от побочных последствий проводимого лечения. Определенную значимость для предсказания эффективности терапии имеет и изучение полиморфизмов генов, вовлеченных в метаболизм препаратов или влияющих на чувствительность к ним опухолевых клеток (Lenz, 2004). De facto генетический полиморфизм, являясь стандартным критерием популяции, постоянен, в отличие от белковых фракций и профилей экспрессии, синтез и функционирование которых зависит от многих факторов, включая посттранскрипционный и посттрансляционный контроль (Hunter & Crawford, 2006).

Полученные нами данные об ассоциации w/dup 16-Arg/Pro-w/m комбинации гетерозиготных генотипов гена р53 с более высокими показателями общей выживаемости больных HMPJI являются новыми и позволяют предположить, что это может быть обусловлено лучшей отвечаемостью на проводимую химиотер апию.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в условиях патогенетически значимых экзогенных влияний (курение) сочетанное носительство функционально измененных генотипов, несущих минорные аллели генов р53 и XRCC1 способствует более раннему возникновению НМРЛ. В то же время носительство комбинации функционально полноценных генотипов (мажорные аллели) генов р53, CCR5, XRCC1 ассоциировано с НМРЛ в пожилом возрасте.

А так же установлено, что комбинация гетерозиготных генотипов гена р53 (w/dup 16-Arg/Pro-w/m) ассоциирована с НМРЛ с более высокими показателями общей выживаемости больных.