Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль трансформирующего ростового фактора (TGF)β в прогрессии гепатокарцином

На правах рукописи

МАКАРОВА МАРИЯ ВИКТОРОВНА

РОЛЬ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО РОСТОВОГО ФАКТОРА (ТСЕ)Р В ПРОГРЕССИИ ГЕПАТОКАРЦИНОМ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2009

003476742

Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический центр имени H.H. Блохина РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук H.JI. Лазаревич Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор П.М. Чумаков

Доктор биологических наук H.A. Глушанкова

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ

Защита состоится « _» 2009 г. в /Л. часов на

заседании диссертационного ученого совета Д.001.017.01 РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «. » ¿¿¿-¿''и?2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор / ' Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Гепатокарцинома (ГК) является пятой по распространенности и третьей по уровню смертности опухолью в мире [Parkin et al., 2005]. Интенсивные эпидемиологические исследования последних лет позволили идентифицировать множество факторов риска возникновения ГК. Однако ключевые молекулярные механизмы, лежащие в основе гепатоканцерогенеза, остаются недостаточно изученными. В ходе прогрессии ГК происходят изменения активности внутриклеточных сигнальных каскадов и нарушения программы экспрессии гепатоспецифических генов. Одними из основных молекулярных изменений сигнальных путей, идентифицированных для ГК человека, являются нарушения активности Wnt/p-катенин сигнального пути, р53, МАРК, JAK/STAT, Ras и TGFp сигнального каскада [Aravalli et al., 2008].

TGFp является плейотропным цитокином, контролирующим различные свойства клеток организма, такие как пролиферация, подвижность, адгезия и дифференцировка. Генетические изменения компонентов TGFJ3 сигнального каскада описаны для опухолей различного происхождения, но его роль в канцерогенезе противоречива, так как TGFP в зависимости от клеточного контекста может проявлять либо свойства опухолевого супрессора, либо онкогенные черты. Считается, что в нормальных клетках и на ранних этапах развития эпителиальных опухолей TGFp подавляет пролиферацию и индуцирует апоптоз, однако на более поздних стадиях прогрессии он индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), усиливает инвазию и метастазирование [Pardali et al.,

Роль ТйРр в возникновении, и развитии ГК также неоднозначна и недостаточно изучена. Т0РР1 является значимым ингибитором пролиферации нормальных гепатоцитов. При повреждении печени ТОРр1 сигнальный каскад активируется, останавливая рост регенерирующих гепатоцитов [ШзэеИ й а1., 1995]. С другой стороны, у пациентов с ГК уровень ТОРр1 в плазме крови и моче повышен [ТБа! е1 а1., 1997; Оогщ й а!., 2008]. Иммуногистохимическими методами было показано, что Тврр! продуцируется в более чем 40% исследованных образцов ГК [АЬои-8Ьа[1у е1 а1., 1999].

У млекопитающих выявлены три белка семейства Тврр (р1, р2 и рЗ), которые высоко гомологичны по аминокислотной последовательности. Однако при инактивации генов Тйрр наблюдаются непохожие эффекты, что, по-видимому, свидетельствует о функциональном различии изоформ Тйрр [Ма^а^е, 1998]. Большинство исследований, проводимых на гепатоцитах, сосредоточено на изучении роли ТОрр1, однако наши результаты свидетельствуют о том, что при прогрессии гепатокарцином може^

2007].

\

усиливаться транскрипция гена Т0РР2. Роль такой активации в гепатоканцерогенезе в настоящее время не изучена.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы являлось изучение роли ТОРР2 в регуляции экспрессии генов, кодирующих ГЯФ и маркеры дифференцировки, а также исследование влияния ТСРр2 на процессы, ассоциированные с прогрессией ГК. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать изменения экспрессии гепатоспецифических генов и генов, продукты которых ассоциированы с прогрессией ГК, в культуре дифференцированной гепатомы человека Нер02 при обработке цитокинами ТСРр1иТОРр2.

2. Провести трансдухцию линии гепатомы НерС2 лентивирусной конструкцией, экспрессирующей ТСРр2. Исследовать влияние гиперэкспрессии гена ТСРр2 на кинетику пролиферации, клоногенную активность, уровни экспрессии гепатоспецифических генов; генов, ассоциированных с ЭМП и ТОРр2-респонсивных мишеней.

3. Исследовать вклад латентной и активной формы ТОрр2 в регуляцию процессов, связанных с активацией ТОРр сигнального пути. Провести трансдукцию лентивирусной конструкцией, экспрессирующей мутантную форму ТОРР2, не подвергающуюся протеолитической деградации, и сравнить эффекты от аналогичной конструкции с нормальным вариантом ТСРР2.

4. Разработать систему для подавления синтеза ТОРР2 в культуре НЗЗ, полученной из низкодифференцированной быстрорастущей ГК мыши. Изучить изменения в кинетике пролиферации, способности к инвазии и профиле экспрессии гепатоспецифических генов в клетках НЗЗ с подавленной продукцией ТОрр2.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В представленной работе впервые проанализированы изменения экспрессии генов в дифференцированной гепатоме человека Нер02 при воздействии рекомбинантных цитокинов ТСРр 1 и ТОРр2. Обработка цитокинами привела к повышению экспрессии генов аЗ субъединицы интегрина, остеопонтина, фибронекгина 1 и Pig-hЗ (ГСрр индуцируемого гена-ЬЗ), активация которых ассоциирована с развитием злокачественного

фенотипа ГК. Кроме того, было показано, что действие обоих цитокинов приводит к снижению экспрессии генов, кодирующих ГЯФ, которые необходимы для поддержания дифференцировки гепатоцитов.

Мы показали, что экзогенная экспрессия TGFß2 в культуре HepG2 вызывает снижение экспрессии ключевых регуляторов гепатоцитарной дифференцировки С/ЕВРа и HNF4a, а также к повышению скорости пролиферации и клоногенной активности этих клеток.

Впервые установлено, что подавление продукции TGFß2 в культуре клеток низкодифференцированной гепатомы НЗЗ индуцирует реэкспрессию эндогенных HNF4a и С/ЕВРа. Кроме того, подавление продукции TGFß2 привело к снижению подвижности и скорости пролиферации этих клеток.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что TGFß2 регулирует экспрессию генов, продукты которых контролируют дифференцировку гепатоцитов, и влияет на такие важные свойства клеток, как пролиферация и подвижность. Эти данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия TGFß2, наблюдаемая в дедифференцированных ГК мыши и человека, способствует развитию злокачественного фенотипа опухолевых клеток. Кроме того, полученные результаты демонстрируют возможность регуляции сети ГЯФ и дифференцировки клеток гепатоцитарного происхождения за счет изменения активности нетканеспецифических сигнальных путей. Эти факты способствуют расширению представлений о фундаментальных основах опухолевого роста и прогрессии злокачественных новообразований. Возможность восстановления дифференцированного фенотипа гепатоцитов при ингибировании TGFß сигнального пути представляется перспективным подходом для разработки новых методов прогноза и терапии ГК. Анализ TGFß-индуцируемых внутриклеточных механизмов будет способствовать развитию методов эффективного подавления продукции TGFß для терапии эпителиальных опухолей различного происхождения.

Апробация работы

Диссертация апробирована 16 февраля 2009 г на совместной научной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов и механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОЩ им H.H. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на международном конгрессе «Исследования заболеваний печени» Европейской ассоциации по исследованию печени (Копенгаген, 2009), международной конференции «Ядерные рецепторы и заболевания печени» (Вена, 2009), конференции «Молекулярные механизмы сигнальной трансдукции и рака» Европейской Федерации Биохимических обществ (FEBS) (Спецес, 2007), на 13

съезде Европейской Конференции по раковым исследованиям (ЕССО) (Париж, 2005), и на конференции «Клеточная сигнализация» Европейской Федерации Биохимических обществ (FEBS) (Дубровник, 2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах и 10 тезисов международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 30 рисунков, 1 таблицу. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 231 источник, в том числе 9 в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее в нашей лаборатории была получена и охарактеризована модель одноступенчатой прогрессии ГК мыши. Модельная система состоит из медленнорастущей высокодифференцированной гепатокарциномы (мГК), вьнцепившейся из нее in vivo быстрорастущей низкодифференцированной гепатокарциномы (6ГК), и полученной из 6ГК клеточной линии ЮЗ [Lazarevich et al., 2004]. Ранее методом гибридизации с кДНК микрочипами были проанализированы спектры экспрессии различных генов в мГК, 6ГК и НЗЗ по сравнению с нормальной печенью взрослой мыши. Было показано, что существенная часть генов, активировавшихся в ходе прогрессии от мГК к 6ГК, оказались TGFP-индуцируемыми, что указывает на вовлеченность этого сигнального пути в прогрессию опухолей печени [Лазаревич, 2004].

При проверке этого предположения методом ОТ-ПЦР было показано, что в ряду нормальная печень, мГК и 6ГК наблюдается активация экспрессии различных TGF[5-респонсивных генов. Важно отметить, что в ходе прогрессии ГК была обнаружена значительная индукция транскрипции гена TGFP2. Уровень экспрессии гена TGFpi во всех опухолях превышал детектируемый в нормальной печени, в 6ГК и НЗЗ по сравнению с мГК он практически не изменился (Рис. 1).

Кроме того, параллельно с активацией экспрессии гена TGFP2, в 6ГК была снижена транскрипция гена HNF4a, который играет ключевую роль в дифференцировке нормальных гепатоцитов в процессе эмбриогенеза и в поддержании гомеостаза нормальной печени во взрослом организме [Лазаревич и Флейшман, 2008].

мГК

6ГК п нзз

тсгр2

ОАРОН

нкР4а

Рисунок 1. Изменение экспрессии генов НОТ4а, ТСГр] и ТСРр2 при одноступенчатой прогрессии ГК. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в мГК, 6ГК, нормальной печени (П), культуре НЗЗ. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к мРНК глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (ОАРБН).

Целью настоящей работы было исследование возможной роли гиперэкспрессии ТОрр2 в прогрессии гепатокарцином. Для этого были использованы две модельные системы: линия дифференцированной гепатомы человека Нерв2 и культура быстрорастущей дедифференцированной ГК мыши НЗЗ, которая описана выше. На первом этапе работы было исследовано влияние индуцируемых ТОрр2 сигнальных путей на экспрессию генов и биологические свойства клеток Нер02. В качестве системы, в которой уровень ТСРР2, наоборот, повышен, мы использовали культуру ГК мыши НЗЗ, в которой с помощью малых интерферирующих РНК была подавлена продукция ТСрр2.

1. Изучение ТСРр -индуцируемых эффектов в клеточной линии НерС2 1.1. Анализ экспрессии генов, ассоциированных с прогрессией ГК, и генов, ответственных за поддержание дифференцированного статуса гепатоцитов, при обработке клеточной линии НерС2 цитокинами ТСРр] и ТСКр2

Для исследования возможного влияния ТОРР на изменение спектра экспрессии генов, определяющих дифференцировку клеток гепатоцитарного происхождения, а также генов, изменение уровней транскрипции которых ассоциировано с прогрессией ГК, клетки Нер02 обрабатывали ТОРР1 и ТОРр2 в концентрации 5 нг/мл в течение 24 или 48 часов. Методом ОТ-ПЦР был проведен анализ экспрессии генов и показано, что действие Тйрр1 и ТОРр2 вызывает усиление экспрессии генов аЗ интегрина, фибронектина 1, остеопонтина и Pig-h3 (Рис. 2). Выбор исследуемых генов был основан на результатах анализа изменения транскрипционной программы при одноступенчатой прогрессии ГК мыши методом гибридизации с кДНК микрочипами. Выбранные гены, во-первых, по литературным данным входили в группу ТОРр-индуцируемых, во-вторых, их активация была ассоциирована с одноступенчатой прогрессией ГК мыши.

Экспрессия генов аЗ интегрина, фибронектина 1, остеопонтина и pig-h3 бьша повышена по сравнению с контролем при обработке как TGFjM, так и TGF¡52 (Рис. 2). Более того, для гена фибронектина 1 была показана экспрессия сплайс-формы, характерной для трансформированных и эмбриональных гепатоцитов, содержащей EDA домен. Праймеры для ОТ-ПЦР были подобраны таким образом, что при электрофорезе продуктов ПЦР выявлялось 2 полосы: нижняя из них соответствовала взрослой изоформе фибронектина (565 пар нуклеотидов - п. н.), лишенной EDA домена, а наличие верхней полосы (720 п. н.) отображало присутствие в исходной пробе мРНК эмбрионального варианта фибронектина (Рис. 2).

-1 TGFp

24h 48 h -II-

Г

TGFß

24h 48h

-II-1

2 3 4

3 4

GAPDH TGFßl TGFß2 аЗ интегрин

720 П.Н- , -

565 n.H. фибронектин

остеопонтин

ßig-ЬЗ

Snail

Рисунок 2. Изменения экспрессии TGFß-зависимых генов, а также генов кодирующих транскрипционные факторы и

гепатоспецифические гены при обработке клеточной линии HepG2 TGFßl или TGFß2. ОТ-ПЦР анализ уровней транскрипции генов,

ассоциированных с прогрессией ГК. Дорожки 1, 3 - обработка TGFßl 24 и 48 ч соответственно, дорожки 2, 4 - обработка TGFß2 24 ч и 48 ч соответственно, дорожка 5 -контроль - HepG2 без обработки цитокинами. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH.

Повышенная экспрессия остеопонтина ассоциирована, по мнению ряда авторов, с развитием метастатического потенциала гепатокарцином, также как и экспрессия ßig-h3 [Gotoh et al., 2002; Tang et al., 2007]. Ранее было показано, что экспрессия аЗ субъединицы

альбумин ApoA-IV

интегрина характерна для незрелых и трансформированных гепатоцитов, и опосредует способность ГК к инвазии [Giannelli et al., 2002].

Необходимо также отметить, что действие TGF01 или TGFp2 активирует эндогенную экспрессию соответствующих генов, что указывает как на авторегуляцию, так и на взаимную регуляцию их транскрипции (Рис. 2).

Исследования, проведенные на модели одноступенчатой прогрессии, показали, что дедифференцировка является ключевым процессом, сопровождающим малигнизацию ГК [Lazarevich et al., 2004]. Дифференцированный фенотип гепатоцитов определяется экспрессией специфических функциональных генов, транскрипция которых в значительной степени регулируется различными ГЯФ.

Принимая во внимание эти факты, логично было предположить, что воздействие TGFP влияет на экспрессию по крайне мере некоторых компонентов регуляторной сети ГЯФ и дифференцировочных маркеров. При анализе уровней транскрипции всего спектра ГЯФ, экспрессирующихся в дифференцированных гепатоцитах, методом ОТ-ПЦР, мы установили, что инкубация HepG2 с TGFpi и TGFP2 вызывает подавление транскрипции генов изоформы HNF4a, характерной для дифференцированных гепатоцитов (HNF4aPl), C/EBPa, HNFla, ОС2, FoxA2, а также основного маркера дифференцированных гепатоцитов сывороточного альбумина (Рис. 2).

Необходимо отметить, что при обработке HepG2 цитокинами TGFpi и TGFP2 произошло координированное изменение активности двух альтернативных промоторов гена HNF4a: активация экспрессии "эмбриональных" изоформ HNF4aP2 (характерных для незрелых и трансформированных гепатоцитов) и подавление уровня экспрессии "взрослых" изоформ HNF4aPl, которые экспрессируются во взрослой печени.

1.2. Изменение экспрессии юоформ HNF4aPl и HNF4aP2 при инпибировании передачи сигнала от рецептора TGFp

Действие TGFP в основном опосредуется активацией рецептора TGFP I типа и рецептора II типа. Фосфорилирование внутриклеточных субстратов происходит в результате действия рецептора I типа. Для того чтобы удостовериться, что эффекты, которые оказывает TGFP2 на экспрессию гена HNF4a, специфичны и связаны именно с активацией TGFp-рецептора I типа, мы использовали ингибитор киназного домена ТрЫ (SB-505124).

В ранее опубликованных работах была определена максимально эффективная для клеток HepG2 доза ингибитора SB-505124, при которой ингибитор специфически подавляет функцию киназного домена TpRI [DaCosta Byfield et al., 2004]. Совместно с Д.В. Альперном были проведены эксперименты в которых, клетки гепатомы HepG2

обрабатывали ингибитором киназного домена SB-505124 в концентрации 1 мкМ вместе с цитокином TGFp2 (5 нг/мл). Клетки инкубировали 24 часа, фиксировали и проводили иммунофлуоресцентное окрашивание специфическими антителами к различным группам изоформ белка HNF4a. Мы обнаружили, что ингибирование киназного домена TpRI блокирует TGFp-зависимую активацию экспрессии HNF4aP2 и подавление экспрессии HNF4aPl (Рис. 3).

Таким образом, можно заключить, что действие, оказываемое TGFP2 на экспрессию двух групп изоформ HNF4a, осуществляется посредством передачи сигнала именно через рецептор TpRI, который способен активировать внутриклеточные каскады белковых взаимодействий, приводящих к изменению уровня транскрипции генов-мишеней.

HepG2

anti-HNF4aP1

anti-HNF4aP2

без TGFg

+TGFB2

без TGFB

+TGFB2

' ' - .

» - <vt *

v 1 S?iV

+SB-505124

ч

-„ ж

' v; * >

.»г»

Рисунок 3. Ингибитор киназного домена ТрМ блокирует ТСГр2-зависимое переключение экспрессии изоформ НОТ4а. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Нер02 при обработке ТОРр2 {5 нг/мл) и/или ингибитором ТрМ. Справа - окраска с помощью антител к Н№4аР2, слева - к Н№4аР1.

1.3. Активация втас! сигнального каскада в клеточной линии НерС2 под действием

тсгрг

Тйрр на поверхности клетки связывается с рецептором II типа, такой комплекс связывает рецептор I типа и фосфорилирует его. Дальнейшая передача сигнала происходит при активации различных внутриклеточных субстратов фосфорилированным рецептором I типа. Классическим сигнальным каскадом, активируемым в ответ на действие цитокинов ТйРр, является Бтас! каскад.

Для того чтобы проверить, активируется ли Smad сигнальный каскад в клетках HepG2 при действии TGF¡5, мы провели трансфекцию генетической конструкцией, в которой репортерный ген люциферазы находится под контролем нескольких Smad-связывающих элементов (CAGA). Через сутки после трансфекции клетки инкубировали с цитокинами TGFpl или TGFp2 еще в течение 24 ч, а затем лизировали и измеряли активность репортерных генов люциферазы в полученных образцах. Полученные результаты указывают на почти 4-х кратное увеличение относительной люциферазной активности при действии как TGFPI, так и TGFP2 (Рис. 4). Таким образом, Smad-зависимый сигнальный каскад функционально активен в клетках культуры HepG2. Возможно, некоторые из наблюдаемых нами эффектов TGFpi и TGFP2 реализуются посредством активации Smad белков.

HepG2 HepG2 + TGF02 HepG2 + TGF01

HepG2

Рисунок 4. Воздействие ТСКр1 и ТСРр2 приводит к индукции активности $та(1 каскада в клетках НерС2. Активность репортерного гена люциферазы в клетках Нер02 под контролем 8пж1-связывающих элементов (ЭВЕ). Нерй2 - контрольные клетки, не подвергшиеся обработке, Нер02+Т0Р(32 - клетки Нер02 после обработки ТйРр2. Обработку цитокином в количестве 5 нг/мл проводили в течение 24 ч через сутки после трансфекции.

Рисунок 5. Подавление

фосфорилирования под

действием ингибитора ТрШ. Иммуноблоттинг лизатов клеток, обработанных ТС¥р2 и ингибитором ТрЫ. Дорожка 1 - Нерй2 после одновременной обработки Тйрр2(5 нг/мл) и ингибитором ТрЫ (1 мкМ) в течение 24 ч, дорожка 2 - Нерй2 после обработки ингибитором Три в течение 24 ч, дорожка 3 - Нер02 после обработки Тврр2 в течение 24 ч, дорожка 4 -контрольная линия Нер02. Верхний ряд - иммуноблоттинг с антителами к общему 8тас52. Нижний ряд - иммуноблоттинг с антителами к фосфорилированной форме ЭтасЕ.

^Httfe '

TGFP2 SB-505124

anti-Smad2

anti-pSmad2

Для подтверждения полученных результатов, а также для того, чтобы проверить, произойдет ли подавление фосфорилирования Smad белков при инкубации с селективным ингибитором TpRI, мы провели сравнение уровней фосфорилированного Smad2 и общего Smad2 в клеточных лизатах HepG2, а также HepG2, обработанной TGFP2, и HepG2, инкубированной со специфическим ингибитором киназного домена TPRI (SB-505124), методом Вестерн-блот анализа (Рис. 5). Иммуноблотгинг с антителами к фосфорилированной форме Smad2, показал, что при обработке HepG2 цитокином: TGFp2 фосфорилирование Smad2 значительно повышается, при этом использование ингибитора SB-505124 полностью предотвращает такое фосфорилирование.

1.4. Изменение экспрессии изоформ HNF4aPl при ингибировании МЕК сигнального

пути

Как уже было отмечено выше, цитокины семейства TGFp могут активировать не только канонический каскад Smad белков, но и другие сигнального пути. В экспериментах на различных клеточных линиях описана TGFp -зависимая активация Erkl/2, INK и р38, PI3K, а также Ras и Rho-подобных малых ГТФаз.

Ранее было описано участие компонентов МАР-киназного сигнального пути в регуляции экспрессии HNF4a [Hatzis et al, 2006]. Авторы сообщают, что в клетках гепатомы человека HepG2 активация МАР-киназного каскада при воздействии форболового эфира (РМА) приводит к снижению экспрессии HNF4aPl.

Учитывая описанные факты, мы решили проверить, активируется ли под действием TGFpi MEK/Erk сигнальный каскад, и участвуют ли компоненты этого сигнального пути в TGFp-зависимой регуляции транскрипции различных групп изоформ HNF4a в исследуемой системе.

Совместно с Д.В. Альперном клетки линии HepG2 обрабатывали специфическим ингибитором МЕК PD 98059 в концентрации 20 мкМ, а также цитокином TGFp2 (5 нг/мл). Ингибитор PD 98059 блокирует MAP киназы и, соответственно, передачу сигнала от рецептора TGFP к киназе Erk, которая фосфорилирует транскрипционные факторы и регулирует транскрипцию генов-мишеней. В качестве положительного контроля фосфорилирования Erk2 киназы использовали клетки HepG2, обработанные форболовым эфиром. Полученные клеточные лизаты анализировали с помощью Вестерн блотгинга со специфическими антителами к фосфорилированным формам Erk2/Erkl (Рис. 6). Таким образом мы показали, что обработка TGFP2 приводит к фосфорилированию Erk2 и этот сигнальный каскад в клеточной линии HepG2 активен.

Для того чтобы проверить, какие из индуцируемых TGFP2 изменений экспрессии групп изоформ HNF4a опосредованы активацией MEK/Erk сигнального каскада,

проводили окрашивание клеток HepG2 специфическими антителами к двум группам изоформ HNF4aP2 и HNF4aPl. Мы обнаружили, что ингибирование киназы Erk приводит к подавлению лишь одного из двух эффектов, оказываемых цитокином TGF(32 на активность промоторов HNF4a, а именно препятствует ингибированию активности промотора Pl. TGFp-зависимая индукция синтеза «эмбриональных» изоформ HNF4aP2 в клетках гепатомь! человека HepG2 при ингибировании MAP киназы МЕК сохраняется (Рис. 7).

HepG2 _

TSFP2 + PD98059 + PMA

anti-phospho-p44/p42 anti-p44/p42 anti-a-tubulin

Рисунок 6. TGFp2 опосредованная активация MEK/Erk сигнального каскада.

Иммуноблоттинг лизатов клеток, обработанных TGF|32, ингибитором МЕК и РМА. Дорожка 1 - контрольная линия HepG2, дорожка 2 - HepG2 после обработки TGFP2 (5 нг/ мл), дорожка 3 - HepG2 после обработки ингибитором МЕК (20 мкМ), дорожка 4 - HepG2 после одновременной обработки TGFP2 и ингибитором МЕК, дорожка 5 - HepG2 после обработки РМА, дорожка 6 - HepG2 после одновременной обработки РМА и ингибитором МЕК. Верхний ряд - иммуноблоттинг с антителами к фосфорилированным формам Erkl/2, средний ряд - с антителами к общему Erkl/2, нижний ряд -иммуноблоттинг с антителами к а-тубулину.

anti-HNF4aP1

anti-HNF4aP2

без TGF[32

+TGF02

без TGF|32

+TGF(32

без TGF(32 +PD 98059

+TGF|32 +PD 98059

без TGFp2 +PD 98059

+TGFP2 +PD 98059

Рисунок 7. Ингибирование киназы МЕК приводит к блокированию ТСРр2-зависимого подавления синтеза Ш\Т4аР1, но не влияет на активацию ШЧР4аР2.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Нерй2 при обработке ТОрр2 (5 нг/мл) и/или ингибитором МЕК (РБ 98059). Справа окраска антителами к НМР4Р2, слева - к Н№4Р1.

Таким образом, действие, которое оказывает индукция TGFP сигнального пути на экспрессию различных групп изоформ гена HNF4a, опосредовано запуском нескольких сигнальных путей. Активность промотора Р1 в исследуемой системе регулируется при участии МАР-киназ, в то время как за регуляцию промотора Р2 отвечают, по всей видимости, другие сигнальные каскады.

1.5. Анализ экспрессии генов в клеточной линии HepG2, гиперэкспрессирующей

TGFP2

Известно, что цитокины семейства TGFp синтезируются в виде гомодимерных предшественников. В результате процессинга во внеклеточную среду секретируется активная форма TGFP, связанная с отщепившимся полипептидом, который называется LAP. Считается, что в таком виде TGFp не связывается со своим рецептором и поэтому неактивен. Однако при воздействии ряда факторов (протеазы, интегрины, изменения рН, активные формы кислорода) TGFP активируется и взаимодействует с рецепторными системами.

Ранее в нашей лаборатории при определении количества TGFP2 в культуральной среде клеточной линии НЗЗ, полученной из быстрорастущей гепатокарциномы, с помощью метода ИФА (иммуноферментный анализ) было обнаружено, что большая часть TGFP2 находится в латентной (непроцессированной) форме.

Для исследования вклада активной и латентной форм TGFp2 в регуляцию процессов, ассоциированных с прогрессией ГК, а также для изучения эффектов долговременного действия TGFP2 нами были получены клеточные линии HepG2, гиперэкспрессирующие нормальную или мутантную формы TGFp2. Одна из использованных в этой работе экспрессиурующих конструкций кодировала нормальный ген TGFP2 человека (pLVTGFp2N), другая - мутантный вариант TGFP2 (pLVTGFp2RG299). Эта мутация, в результате которой аргинин в положении 299 заменен на глицин, приводит к нарушению внутриклеточного процессинга, и во внеклеточную среду секретируется конститутивно латентный белок.

Клеточная линия HepG2 была инфицирована лентивирусами, кодирующими описанные варианты TGFP2. После селекции на блеомицине были отобраны клоны, гиперэкспрессирующие нормальный или конститутивно латентный TGFp2. Для последующих экспериментов были выбраны клоны, экспрессирующие максимальное количество цитокина: клон HepG2 TGFP2 N cil и клон HepG2 TGFP2 R299G с!5, секретирующий мутантную форму TGFP2. В качестве контрольной линии использовали неинфицированные клетки HepG2, продуцирующие TGFP2 в количестве порядка 1 нг/млн клеток (Таб. 1).

Методом ОТ-ПЦР мы исследовали экспрессию некоторых гепатоспецифических

генов и генов, ассоциированных с прогрессией ГК, в клетках HepG2,

гиперэкспрессирующих TGFP2, и в контрольной культуре.

Таблица 1. Количество TGF02 в кондиционированной среде культур HepG2, гиперэкспрессирующих

нормальную или мутантную формы TGFp2. Результаты определения общего количества бежа TGFP2 методом ИФА в кондиционированной среде HepG2, HepG2 TGFP2 N cil и HepG2 TGFP2 R299G cl5. Результаты определения общего количества TGFp2 представлены в нг на 1x106 клеток.

Мы обнаружили, что при гиперэкспрессии как мутантной, так и нормальной форм TGFP2 происходит активация экспрессии транскрипционного фактора Snail и репрессия гена Е-кадхерина, одного из ключевых кадхеринов, обеспечивающих гомотопическую адгезию в эпителиальных тканях (Рис. 8). Snail способен связываться с промоторной областью гена Е-кадхерина, подавляя экспрессию последнего [Cano et al., 2000]. Таким образом, можно предположить, что в исследуемой модели происходит Snail-зависимое подавление экспрессии Е-кадхерина. Snail-зависимая репрессия транскрипции

гена Е-кадхерина индуцирует ЭМП в опухолях эпителиального происхождения, способствуя таким образом приобретению опухолевыми клетками инвазивного фенотипа и способности к метастазированию [Cicchini et al., 2006].

Рисунок 8. Гиперэкспрессия TGFP2 в клеточной линии HepG2 приводит к подавлению экспрессии некоторых

гепатоспецифических генов и генов, ассоциированных с прогрессией ГК. ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов в клеточной линии HepG2, гиперэкспрессирующей нормальную или мутантную формы TGFP2. Дорожка 1 - HepG2 TGFP2 N cil, дорожка 2 - HepG2 TGFP2 R299G с15, дорожка 3 - контроль - HepG2. В качестве контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH.

Кроме того, при гиперэкспрессии TGFp2 в клетках HepG2 было выявлено подавление экспрессии бетагликана (Рис. 8). Бетагликан или рецептор TGFp III типа

TGFß2 h г/106 клеток

HepG2 1.1

HepG2 TGFP2 N cil 13

HepG2 TGFp2 R299G cl5 67

/ д «г ## #

1 GAPDH

1 TGFß2

HNF4a

HNF4ccPl

HNF4aP2

ApoA-rV

Е-кадхерин

Snail

бетагликан

(TpRIII) не имеет внутриклеточного киназного домена и, соответственно, не способен участвовать во внутриклеточной передаче сигнала, но принимает участие в активации и накоплении TGFP на поверхности клеток и модулирует его связывание с сигнальными рецепторами TpRI и TpRII. Сниженная по сравнению с нормальными тканями экспрессия TpRIII или отсутствие таковой описаны в опухолях молочной железы, яичников, легких и поджелудочной железы, более того, это снижение коррелирует с гиперэкспрессией TGFP и со стадией прогрессии опухоли. Ряд авторов предполагает возможную противоопухолевую роль этого белка, так как он способен блокировать действие цитокинов семейства TGFP [Gordon et al., 2007; Hempel et al., 2007; Finger et al., 2008]. Необходимо отметить, что экспрессия генов остепонтина, фибронектина и аЗ субъединицы интегрина, транскрипция которых повышалась при обработке TGFP2 культуры HepG2, при гиперэкспрессия этого цитокина в культуре HepG2 не изменилась.

Повышение продукции TGFP2 вызвало снижение уровня экспрессии некоторых гепатоспецифических генов (Рис. 8). Мы обнаружили снижение суммарного количества HNF4a, что явилось следствием подавления активности обоих промоторов гена HNF4a. Кроме того, подавление экспрессии обеих групп изоформ вызвало снижение экспрессии непосредственной транскрипционной мишени HNF4aPl - гена ApoAFV (Рис. 8).

Рисунок 9. Подавление продукции HNF4a при гиперэкспрессии TGFp2 в клеточной линии HepG2.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток HepG2, гиперэкспрессирующих нормальную и мутантную формы TGFp2. Окрашивание антителами к HNF4a. Сверху (контроль) - HepG2, слева - HepG2 TGFP2 R299G с15, справа -HepG2 TGFP2 N ell.

Подавление синтеза HNF4a в клетках HepG2, гиперэкспрессирующих нормальную и мутантную формы TGFp2, наблюдалось также при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток с помощью антител к общим доменам различных групп изоформ HNF4a. В контрольном препарате HepG2 примерно 77 % клеток демонстрирует ядерную окраску на HNF4a, однако при гиперэкспрессии TGFP2 происходит снижение количества клеток с окрашенными ядрами. В клетках, экспрессирующих нормальную форму TGFP2, окрашенные ядра составляют 20 %, а в клетках, которые экспрессируют мутантную форму TGFP2 - 25 % (Рис. 9).

1.6. Изменение пролиферативных характеристик клеточной линии НерС2 при гиперэкспрессии ТвРр2

Для сравнения кинетики роста клеточной линии Нер02 и ее производных мы использовали метод прямого подсчета клеток. Оказалось, что на 6 день культивирования количество клеток в культурах, гиперэкспрессирующих как нормальную, так и мутантную формы ТСРР2, увеличилось в два раза по сравнению с контрольной культурой Нер02 (Рис. 10А).

Для определения скорости пролиферации использовали метод измерения включения модифицированного нуклеотида - 5-бромдезоксиуридина (5-ВгсШ) в ДНК с последующей иммунофлуоресцентной окраской специфическими антителами к модифицированному нуклеотиду. После окраски проводили подсчет общего количества клеток и клеток, включивших метку, в поле зрения. Результаты этого эксперимента представлены как отношение клеток, включивших метку, к общему количеству клеток. При гиперэкспрессии мутантной .и нормальной форм ТСБр2 количество клеток, включивших 5-ВгсШ, примерно на 15 % и 10 %, соответственно, превышало этот показатель в контрольной культуре Нер02 (Рис. 10Б).

Для изучения способности клеток выживать и формировать колонии в условиях большого разведения был проведен тест на клоногенную активность. Клетки исследуемых линий рассевали при низкой плотности (около 1500 клеток на 3 см чашку) и культивировали в течение 2 недель. После фиксации клетки окрашивали гематоксилином и сравнивали количество выросших макроколоний в экспериментальных и контрольных чашках. Из приведенных фотоизображений видно, что клетки контрольной культуры Нерй2 способны дать начало меньшему количеству клонов, чем культуры, гиперэкспрессирующие нормальную или мутантную формы ТОРР2 (Рис. 11). Таким образом, при повышении продукции ТОБр2 в гепатоме Нерй2 способность клеток выжить и размножиться в условиях большого разведения по сравнению с контрольной культурой НерС2 увеличивается.

Обобщая данные, полученные в двух сериях экспериментов, можно сделать вывод о том, что ТОРр2 вызывает различные эффекты в зависимости от того, в какой форме он связывается с мембранными рецепторами на поверхности клеток Нер02. При инкубации с активным рекомбинантным димером ТОБр2 транскрипция изоформ гена НОТ4а, преобладающих во взрослой печени, снижается, а уровни «эмбриональных» изоформ, наоборот, повышаются. Однако при экзогенной экспрессии гена ТвРр2 в этой же клеточной системе мы наблюдали иную картину: экспрессия гена НОТДа подавляется, причем снижение затрагивает обе группы изоформ. Кроме того, различия выражались не

только в экспрессии изоформ гена HNF4a, но и в спектре экспрессии различных TGFp-индуцируемых генов. Так, например, если в первой экспериментальной системе транскрипция гена Snail не изменилась, но повысилась экспрессия остеопонтина, фибронектина и аЗ интегрина, то во второй модели, наоборот, экспрессия Snail увеличилась, а транскрипция остеопонтина и фибронектина осталась неизменной. Возможно, что эти различия обуславливаются тем, что рекомбинантный TGFP2 представляет собой активный димер, а в клетках HepG2 при гиперэкспрессии цитокина процессинга не происходит. Так как при определении количества TGFp2 с помощью метода ИФА большая часть TGFp2 определяется только после снижения рН образцов (как HepG2 гиперэкспрессирующей нормальный вариант TGFP2, так и мутантный), что указывает на отсутствие в этих образцах активного димера.

Рисунок 10. Гиперэкспрессия ТвРр2 повышает скорость пролиферации НерС2. А.

Сравнение кинетики пролиферации клеток Нерй2, гиперэкспрессирующих нормальную и мутантную формы ТйРр2.' Б. Скорость пролиферации клеток НерС2, гиперэкспрессирующих нормальную или мутантную формы ТОрр2, оцененная по включению 5-ВгсЮ.

HepG2 HepG2 TGF02 N cil HepG2 TGF|32 R299G clS

Рисунок 11. При гиперэкспрессии нормальной или мутантной формы TGFP2 в культуре HepG2 способность образовывать клоны увеличивается. Результаты окраски гематоксилином клонов, выросших через 2 недели культивирования из 1500 клеток линии HepG2, HepG2 TGFP2 N cil, HepG2 TGFP2 R299G.

2. Изучение эффектов, вызванных подавлением продукции TGFf2 в клетках дедифференцированной гепатомы ЮЗ 2.1. Подавление продукции TGFp2 в клеточной линии НЗЗ

Для подтверждения возможной роли TGFP2 в качестве фактора, способствующего прогрессии ГК, необходимо было наряду с моделями, на которых изучались эффекты, индуцируемые TGFp2, рассмотреть модель, в которой можно было бы наблюдать эффекты, обусловленные подавлением активности TGFP2.

В качестве такой модельной системы была выбрана клеточная линия НЗЗ, полученная ранее из быстрорастущего дедифференцированного варианта ГК мыши [Кудрявцева и соавт., 2000]. В культуре НЗЗ повышена экспрессия многих TGFP-индуцируемых генов, экспрессия которых характерна для злокачественных опухолей (EDA+ сплайс формы фибронектина I, остеопонтина, аЗ субъединицы интегрина, Snail, виментина), а экспрессия генов, характерных для дифференцированных гепатоцитов, наоборот, подавлена. Необходимо отметить также, что в ходе одноступенчатой прогрессии повысилась экспрессия гена TGFP2, в то время как экспрессия гена TGFpi не изменилась.

Рисунок 12. Снижение количества ТСГр2 в кондициони-рованной среде НЗЗ-мнТСрр2-1 и НЗЗ-миТСРр2-2. Результаты определения общего количества ТОРр2 методом ИФА представлены в виде процентного соотношения между количеством ТОРР2, секретируемого контрольной культурой, и количеством Тйрр2 в кондиционированной среде линий НЗЗ-миТОрр2-1 и НЗЗ-миТСРр2-2.

Для того чтобы подавить синтез ТОРР2 в культуре НЗЗ, мы использовали лентивирусы, кодирующие два типа малых интерферирующих РНК к гену ТОРр2 (миТСРр2-1 и миТОрр2-2). В качестве контрольной культуры были использованы клетки

НЗЗ, инфицированные тем же вектором, не содержащим миРНК (НЗЗ-рЬБЬ-риго). После инфекции проводилась селекция трансдуцированных клеток на пуромицине .

Уровни секреции белка ТвРр2 в клетках НЗЗ, трансформированных рЬЗЬ-риго-миТСР(32-1 (НЗЗ-миТСРР2-1), рЬ8Ь-риго-миТСрр2-2 (НЗЗ-миТСРр2-2), и в контрольной культуре НЗЗ-рЬ8Ь-риго определяли методом ИФА. На Рис. 12 представлена диаграмма, которая отражает падение уровня продукции ТОРР2 в культурах, экспрессирующих миРНК ТСрр2, в процентном отношении по сравнению с контрольной культурой НЗЗ-рЬЗЬ-риго. Оказалось, что две последовательности миРНК в разной степени подавляют экспрессию ТСРР2: в культуре НЗЗ:миТСРр2-1 регистрировалось примерно трехкратное снижение продукции по сравнению с контролем, в то время как в культуре НЗЗ-миТОРр2-2 произошло подавление лишь в 1.5 раза. Эти данные подтверждают результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к гену ТйРр2 (Рис. 13). Необходимо отметить, что последовательности миРНК Тйрр2 были специфичны и не повлияли на уровень транскрипции гена ТОРр1 (Рис. 13). ■

2.2. Изменения экспрессии генов в клеточной линии НЗЗ, трансфицированной миРНК к ТСРр2

По данным ОТ-ПЦР, в линии НЗЗ-миТОРр2-1, где продукция ТОРР2 максимально снижена по сравнению с контрольными клетками и клетками НЗЗ-миТОрр2-2, наблюдается активация транскрипции гена РЮТ4а, кроме того, повышается уровень экспрессии С/ЕВРа и бетагликана. (Рис. 13)

Уровень транскрипции гена РЮТ4а в культуре дедифференцированной гепатомы НЗЗ при подавлении синтеза Тйрр2 остается достаточно низким и, вследствие этого,

методом ОТ-ПЦР нельзя получить информацию о транскрипции его изоформ.

Рисунок 13. Влияние подавления продукции ТвРр2 на экспрессию генов, регулирующих дифференцировку

гепатоцитов, в клеточной линии НЗЗ.

Результаты ОТ-ПЦР: дорожка 1 - НЗЗ-рЬЭЬ-риго, дорожка 2, 3 - НЗЗ-миТОРр2-1 и НЗЗ-миТОРр2-2, экспрессирующие миРНК к ТОР(32. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к ОАРОН.

Невысокое, но достоверное восстановление экспрессии гена Н№4а при подавлении продукции ТвРр2 в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ, является

важным результатом, указывающем на возможную роль активации гена ТСрр2 в прогрессии ГК. В предыдущих работах нашей лаборатории на различных системах, в том числе при анализе изменения уровней транскрипции генов опухолевых образцах ГК человека, было показано, что снижение экспрессии Н№4а определяет уровень дифференцировки опухолей и коррелирует со стадией прогрессии ГК [Флейшман, 2008]. Также было продемонстрировано, что в культуре НЗЗ ген НЫР4а инактивирован не за счет мутации или делеции, а за счет транскрипционной регуляции, предположительно -репрессором, который связывается с определенным районом в промоторе Р1 этого гена.

2.3. Изменение скорости пролиферации культуры клеток НЗЗ при подавлении продукции ГСРр2

Подавление синтеза ТОРр2 привело к невысокой, но достоверной реэкспрессии Н№4а и С/ЕВРа, факторов, которые не только влияют на дифференцировку, но и участвуют в контроле пролиферации гепатоцитов и некоторых других типов эпителиальных опухолей.

Учитывая эти факты, мы исследовали скорость пролиферации в клетках НЗЗ с помощью метода включения 5-ВгсШ в ДНК. В контрольной культуре НЗЗ-рЦЗГ-риго примерно 70 % клеток были окрашены, а при подавлении синтеза ТйРр2 процент пролиферирующих клеток снизился до 55% в культуре НЗЗ-миТОРр2-1 и 60% в культуре НЗЗ-миТОрр2-2 (Рис.14).

НЗЗ-р[_5[_-риго НЗЗ-миТСРР2-1 НЗЗ-миТСРр2-2

Рисунок 14. Подавление продукции ТвРр2 в культуре НЗЗ приводит к снижению скорости пролиферации клеток. Скорость пролиферации клеточных линий НЗЗ-рЬБЬ-риго, НЗЗ-миТСГр2-1 и НЗЗ-миТОРр2-2, определенная по включению модифицированного нуклеотида 5-Вг(Ш в ДНК.

Таким образом, подавление продукции TGFp2 в культуре НЗЗ привело к снижению скорости пролиферации клеток. Более того, уровень такого снижения коррелировал со степенью подавления продукции TGFp2, то есть в культуре, где миРНК TGFp2 более эффективно подавили синтез TGFp2, замедление пролиферации оказалась более значительным по сравнению с линией H33-mhTGFP2-2, где экспрессировалась менее эффективная последовательность миРНК TGFP2.

Вероятно, эффект подавления пролиферации может быть обусловлен как реэкспрессией HNF4a и С/ЕВРа, так и непосредственно подавлением продукции TGFP2, так как цитокины семейства TGFP, как было отмечено ранее, могут индуцировать клеточный цикл посредством различных механизмов [Detynck and Zhang, 2003; Sato et al., 2008].

2.4. Исследование подвижности клеток НЗЗ при подавлении продукции TGFP2

Поскольку известно, что TGFpi участвует в регуляции инвазии и подвижности различных типов эпителиальных клеток [Hempel et al., 2007], мы решили исследовать, влияет ли подавление продукции TGFp2 на подвижность клеток дедифференцированной гепатомы НЗЗ.

При постановке теста на определение клеточной подвижности мы использовали инвазионные камеры с мембранами, содержащими поры. В верхнюю часть камеры наливали среду без сыворотки с клетками, в лунку плашки помещали среду с 5% содержанием сыворотки. Таким образом, клетки по градиенту концентрации сыворотки проползали через мембрану с порами 8 мкм. Через сутки клетки, которые остались на верхней стороне мембраны, удаляли, а клетки, которые проползли сквозь поры, окрашивали и подсчитывали.

Мы обнаружили, что в культуре H33-mhTGFP2-1, где подавление TGFP2 было наиболее значительным, произошло резкое снижение подвижности клеток: количество клеток, которое прошло через мембрану, было в 7 раз меньше аналогичного показателя для контрольной культуры НЗЗ-pLSL-puro . Подвижность клеток культуры H33-mhTGFP2-2 снизилась в 3 раза по сравнению с контролем (Рис. 15).

Рисунок 15. Подавление продукции ТСГр2 в культуре НЗЗ вызывает снижение подвижности клеток. Результаты представлены в виде процентного отношения количества клеток НЗЗ-миТСРр2-1 и НЗЗ-миТСрр2-2 к количеству контрольных клеток НЗЗ-рЬ5Ь-риго, которые проползли через мембрану (8 мкм) по градиенту сыворотки в среде. Результаты получены в трех независимых экспериментах.

Способность ТОРр1 индуцировать клеточную подвижность была продемонстрирована ранее на культурах клеток карцином яичников и поджелудочной железы [Нетре1 & а!., 2007]. Более того, при воздействии ТОрр1 в этих культурах наблюдалось подавление экспрессии бетагликана, а реэкспрессия этого гена приводила к снижению клеточной подвижности. Так как в исследуемой системе наблюдается снижение подвижности клеток и повышение экспрессии бетагликана, можно предположить, что бетагликан также вносит вклад в изменение клеточной подвижности в этой системе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе было проведено исследование возможной роли TGFP2 в прогрессии ГК. Для этого были использованы две экспериментальные системы: линия дифференцированной гепатомы человека HepG2, в которой не экспрессируются цитокины семейства TGFP, и полученная из низкодифференцированной быстрорастущей ГК мыши культура НЗЗ, в которой нами выявлена гиперэкспрессия TGFP2. Таким образом, обрабатывая цитокином TGFp2 или индуцируя его экзогенную экспрессию в гепатоме HepG2, и, наоборот, подавляя его продукцию в дедифференцированной гепатоме НЗЗ, мы предполагали выяснить вклад TGFp2 в прогрессию ГК.

В клетках дифференцированной гепатомы HepG2 обработка как TGFpl, так и TGFP2 привела к повышению экспрессии генов аЗ субъединицы интегрина, остеопонтина, фибронектина и Pig-h3, для которых показана активация в ходе прогрессии ГК. Кроме того, произошло снижение экспрессии генов, кодирующих ГЯФ, которые определяют дифференцировку гепатоцитов. Одним из таких факторов является HNF4a - центральное звено гепатоспецифической регуляторной сети. При обработке TGFpi и TGFP2 произошло координированное изменение экспрессии двух групп изоформ этого гена: снижение экспрессии группы, характерной для дифференцированных гепатоцитов, и повышение экспрессии «эмбриональных» изоформ. Мы также показали, что внутриклеточные механизмы этих изменений различны: снижение HNF4aPl происходит за счет TGFP-зависимой активации МЕК. - Erk сигнального пути, при этом повышение HNF4aP2 опосредовано другим механизмом.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что большая часть TGFp, который продуцируют клетки дедифференцированной гепатомы мыши НЗЗ, находится в латентной (непроцессированной) форме. Для исследования вклада активной и латентной форм TGFP2 в регуляцию процессов, ассоциированных с прогрессией ГК, а также для изучения эффектов долговременного действия TGFP2 нами были получены клеточные линии HepG2, гиперэкспрессирующие нормальную или мутантную формы TGFP2. Мутация в гене TGFP2 приводила к нарушению процессинга, и в среду секретировался конститутивно латентный белок.

В клетках HepG2, гиперэкспрессирующих нормальный и мутантный вариант TGFp2, произошло снижение экспрессии гена Е-кадхерина и активация транскрипции гена, кодирующего его репрессор - Snail. Кроме того, произошло снижение экспрессии двух групп изоформ гена HNF4a и непосредственной мишени HNF4aPl - гена ApoATV. Необходимо отметить, 4vo гиперэкспрессия TGFp2 привела к ускорению пролиферации и к повышению клоногенной активности этих клеток.

Подавление продукции TGFP2 в клетках НЗЗ привело к реактивации транскрипции генов, экспрессия которых критична для поддержания дифференцировки гепатоцитов и нарушение функции которых описано для ГК - HNF4a и С/ЕВРа. Более того, снижение синтеза TGFP2 привело к снижению таких ключевых для опухолевых клеток характеристик, как скорость пролиферации и подвижность. Все это свидетельствует в пользу того, что при подавлении продукции TGFp2 в культуре НЗЗ произошла частичная реверсия злокачественного фенотипа опухолевых клеток.

Итак, мы показали, что TGFp2 снижает экспрессию генов, продукты которых контролируют дифференцировку гепатоцитов, и усиливает пролиферацию и подвижность клеток, способствуя тем самым развитию более злокачественного фенотипа ГК. Таким образом, разработка методов эффективного подавления продукции этого цитокина как in vitro, так и in vivo представляется перспективным направлением в развитии методов противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1. В клетках гепатомы человека HepG2 воздействие цитокинов TGFpi и TGFP2 вызывает подавление экспрессии факторов, контролирующих дифференцировку гепатоцитов (C/EBPa, HNFla), и активацию генов, продукты которых ассоциированы с прогрессией ГК (остеопонтин, фибронектин и аЗ субъединица интегрина).

2. При обработке TGFpi и TGFp2 в клетках гепатомы человека HepG2 происходит координированное изменение активности двух альтернативных промоторов гена HNF4a: активация альтернативного P2 промотора и подавление основного промотора P1. TGFP-зависимое подавление промотора P1 гена HNF4a опосредованно активацией MAP-киназного сигнального пути.

3. Экспрессия экзогенного TGFP2 в клетках HepG2 снижает экспрессию ключевых регуляторов гепатоцитарной дифференцировки C/EBPa и HNF4a.

4. При гиперэкспрессии TGFP2 происходит ускорение пролиферации и повышение клоногенной активности клеток гепатомы HepG2.

5. При подавлении продукции TGFP2 в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ происходит реактивация эндогенной экспрессии факторов HNF4a и С/ЕВРа.

6. Подавление продукции TGFp2 в клетках НЗЗ вызывает снижение подвижности и скорости пролиферации этих клеток.

7. TGFP2 способен влиять на дифференцировочные, пролиферативные и миграционные свойства опухолевых клеток при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алъперн Д.В., Макарова М.В., Чернобелъская О.А., Флейишан Д.И., Лазаревич H.JI. р53 и TGFP регулируют экспрессию эмбриональной изоформы Гепатоцитарного Ядерного Фактора 4 в клетках гепатомы человека // Российский Биотерапевтический Журнал,- 2008.- Т. 7, №3.-С.56-69.

2. Макарова М.В., Доннер Н.Е., Флейишан Д.И., Морозова О.В., Лазаревич Н.Л. Частичная реверсия злокачественного фенотипа клеток дедифференцированной гепатокарциномы мыши инактивацией трансформирующего фактора роста Р2 // Российский Биотерапевтический Журнал,- 2009 - Т. 3, №3. - С.56-69.

3. Makarova М. V., Donner N.E., Fleishman D.I., Morozova О. К, Lazarevich N.L. Role of TGFB2 in Hepatocellular Carcinoma Progression // 44th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, EASL, Copenhagen, Journal of Hepatology - 2009- V. 50, Sup. 1 - p. 196.

4. Makarova M.V., Alpern D.V., Donner N.E., Lazarevich N.L. Differential regulation of nuclear receptor HNF4a isoforms expression by TGFB in HepG2 Human hepatoma cells // EASL - AASLD Conference «Nuclear receptors and Liver desease», Vienna. - 2009- Abstract book. p. 80.

5. Lazarevich N.L., Fleishman D.I., Chernobel'skaya O.A., Makarova M. V., Alpern D. V., Morozova О. V., Patyutko Yu.L, Engelhardt N. V. Tissue-specific transcription factor network in hepatocellular carcinoma progression // The European Cancer Conference ECCO 13, Paris. - 2005 - Eur. J. Cancer- V.3, Sup.2-p.215.

6. Макарова M.B., Флейшман Д.И., Морозова О.Д., Овчинников Д.А., Лазаревич Н.Л. Активация TGFp сигнального пути при прогрессии гепатокарцином // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, Москва. -2005- - С.45.

7. Makarova M.V., Chernobelskaya О.А., Fleishman D.I., Morozova O.V., Lazarevich N.L. Role of TGF-b signaling in hepatocellular carcinoma progression. FEBS Special Meeting on Cellular Signaling, May 26 - June 1, 2006, Dubrovnik, Croatia. Abstract book, p.146-147.

8. Fleishman D.I., Makarova M. V., Alpern D. V., Shavochkina D.A., Kuznetzova A.A., Morozova O.V., Patyutko Y.I., Lazarevich N.L. Gene expression

alterations in hepatocarcinogenesis. Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer // FEBS/EMBO Special meeting Spetses, Greece. -2007- Abstract book, p 28.

9. Alpern D., Makarova M., Fleishman D., Chernobelskaya 0., Lazarevich N. Expression of HNF4alpha is switched under influence of TGFbeta and p53. // JDRF Center for Beta Cell Therapy in Diabetes Training Course "Transdifferentiation to Beta Cells" United Kingdom, Bath, - 2007 - p. 16-17.

10. Lazarevich N.. Fleishman D., Chernobelskaya O., Makarova M., Alpern D., Kuznetsova A., Shavochkina D., Morozova O., Patyutko Y. Dysfunction of tissue-specific transcriptional network is an important determinant of hepatocellular carcinoma progression // EACR-19 Meeting Proceedings Budapest. - 2006 - Abstract book, p 174.

11. Shavochkina D.A., Fleyshman D.I., Makarova M.V., Kuznetzova A.G., Morozova O. V., Lazarevich N.L. Tissue-specific alterations of gene expression on the initial studies of liver carcinogenesis in mice // Summer School on Nuclear Receptor Signaling. Spetses - 2007 - Abstract book, p 57.

Подписано в печать Grf. 07.0 9 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ f 2 J тпечатано в службе множительной техники РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Выводы

В клетках гепатомы человека НерС2 воздействие цитокинов ТСррі и ТОРР2 вызывает подавление экспрессии факторов, контролирующих дифференцировку гепатоцитов (С/ЕВРа, НИР 1а), и активацию генов, продукты которых ассоциированы с прогрессией ГК (остеопонтин, фибронектин и аЗ субъединица интегрина).

При обработке ТвРрі и ТОРР2 в клетках гепатомы человека Нер02 происходит координированное изменение активности двух альтернативных промоторов гена Н№4а: активация альтернативного Р2 промотора и подавление основного промотора Р1. ТвРР-зависимое подавление промотора Р1 гена РПЧР4а опосредованно активацией МАР-киназного сигнального пути. Экспрессия экзогенного ТСРР2 в клетках НерС2 снижает экспрессию ключевых регуляторов гепатоцитарной дифференцировки С/ЕВРа и РЮТ4а. При гиперэкспрессии ТОРР2 происходит ускорение пролиферации и повышение клоногенной активности клеток гепатомы НерС2. При подавлении продукции ТОРР2 в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ происходит реактивация эндогенной экспрессии факторов РЮТ4а и С/ЕВРа.

Подавление продукции Тврр2 в клетках НЗЗ вызывает снижение подвижности и скорости пролиферации этих клеток.

Тврр2 способен влиять на дифференцировочные, пролиферативные и миграционные свойства опухолевых клеток при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином.

Заключение

Цитокины семейства TGFp оказывают двойственное влияние на клетки различного происхождения. С одной стороны они способны подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз, с другой — на множестве моделей показано, что TGFp, наоборот, активирует клеточный цикл, способствует уклонению от апоптоза, индуцирует ЭМП, усиливает инвазивный фенотип и способствует метастазированию опухолевых клеток.

При действии TGFpi на нормальные гепатоциты происходит индукция апоптоза и подавление пролиферации. Однако трансформация гепатоцитов приводит к тому, что механизмы действия TGFpi изменяются, и часть клеток выживает и претерпевает ЭМП. Кроме того, у пациентов с ГК уровень TGFpi в плазме и моче повышен. Практически все литературные данные о роли TGFp в гепатоканцерогенезе и его функциональной активности в нормальных гепатоцитах сводится к исследованиям свойств TGFpl. Возможная роль TGFP2 в канцерогенезе этого типа тканей практически не исследована.

Целью настоящей работы стало изучение роли TGFP2 в прогрессии ГК. Для этого были использованы две экспериментальные системы: линия дифференцированной гепатомы человека HepG2, в которой не экспрессируются цитокины семейства TGFp, и полученная из низ ко дифференцированной быстрорастущей ГК мыши культура НЗЗ, в которой нами выявлена гиперэкспрессия TGFP2. Таким образом, обрабатывая цитокином TGFP2 или индуцируя его экзогенную экспрессию в гепатоме HepG2, и, наоборот, подавляя его продукцию в дедифференцированной гепатоме НЗЗ, мы предполагали выяснить вклад TGFP2 в прогрессию ГК.

В клетках дифференцированной гепатомы HepG2 обработка как TGFpi, так и TGFP2 привела к повышению экспрессии генов аЗ субъединицы интегрина, остеопонтина, фибронектина и pig-h3, для которых показана активация в ходе прогрессии ГК. Кроме того, произошло снижение экспрессии генов, кодирующих ГЯФ, которые определяют дифференцировку гепатоцитов. Одним из таких факторов является HNF4a - центральное звено гепато-специфической регуляторной сети. При обработке TGFpi и TGFp2 произошло координированное изменение экспрессии двух групп изоформ этого гена: снижение экспрессии группы, характерной для дифференцированных гепатоцитов, и повышение экспрессии «эмбриональных» изоформ. Мы также показали, что внутриклеточные механизмы этих изменений различны: снижение HNF4aPl происходит за счет TGFp-зависимой активации МЕК - Erk сигнального пути, при этом повышение HNF4aP2 опосредовано другим механизмом.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что большая часть TGFP, который продуцируют клетки дедифференцированной гепатомы мыши НЗЗ, находится в латентной (непроцессированной) форме. Для исследования вклада активной и латентной форм TGFP2 в регуляцию процессов, ассоциированных с прогрессией ГК, а также для изучения эффектов долговременного действия TGFP2 нами были получены две клеточные линии HepG2, гиперэкспрессирующие нормальную и мутантную формы TGFP2. Мутация в гене TGFP2 приводила к нарушению процессинга, и в среду секретировался конститутивно латентный белок.

В клетках HepG2, гиперэкспрессирующих нормальный и мутантный вариант TGFP2, произошло снижение экспрессии гена Е-кадхерина и активация транскрипции гена, кодирующего его репрессор - Snail. Кроме того, произошло снижение экспрессии двух групп изоформ гена HNF4a и мишени HNF4aP 1 - ApoAIV. Одновременно произошло снижение экспрессии гена, кодирующего важный регулятор дифференцировки и пролиферации гепатоцитов - С/ЕВРа. Необходимо отметить, что гиперэкспрессия TGFp2 привела к ускорению пролиферации и к повышению клоногенной активности этих клеток.

Для подтверждения роли TGFP2 в прогрессии ГК необходимо было наряду с моделями, на которых изучались эффекты, индуцируемые TGFP2, рассмотреть модель, в которой можно было наблюдать эффекты, обусловленные подавлением активности TGFP2. В качестве такой модельной системы была выбрана клеточная линия ГК мыши НЗЗ, в которой с помощью малых интерферирующих РНК мы подавили продукцию TGFp2.

При подавлении продукции TGFP2 в клетках НЗЗ произошла реактивация транскрипции двух генов, экспрессия которых критична для поддержания дифференцировки гепатоцитов и нарушение функции которых описано для ГК - HNF4a и С/ЕВРа. Более того, снижение синтеза TGFP2 привело к снижению таких ключевых для опухолевых клеток характеристик, как скорость пролиферации и подвижность. Все это свидетельствует в пользу того, что при подавлении продукции TGFP2 в культуре НЗЗ произошла частичная реверсия злокачественного фенотипа опухолевых клеток.

Таким образом, мы показали, что TGFP2 регулирует экспрессию генов, продукты которых контролируют дифференцировку гепатоцитов, и влияет на такие важные свойства клеток, как пролиферация и подвижность. Разработка методов эффективного подавления продукции этого цитокина как in vitro, так и in vivo представляется перспективным направлением в развитии методов противоопухолевой терапии.

Однако необходимо также определить, какие именно внутриклеточные сигнальные пути активируются под действием ТвР(3. Так как, например, исследование активации Бтас! сигнального каскада в описанных системах показало, что этот сигнальный путь функционально активен при обработке клеток НерС2 рекомбинантным цитокином. При этом ни при гиперэкспрессии ТОРр2 в Нер02, ни в клетках НЗЗ активность Бтас! сигнального каскада не детектировалась. Поэтому использование в этих системах низкомолекулярных ингибиторов киназного домена Три, предотвращающих фосфорилирование 8ша<1, вряд ли может оказаться эффективным инструментом для подавления действия ТОРр.

В дальнейшем мы планируем подробно исследовать механизмы активации ТОРр -индуцируемых внутриклеточных сигнальных каскадов в клетках дедифференцированных опухолей, а также детально исследовать механизмы ТОРР - зависимой регуляции гена Н№4а в описанных системах.