Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль точечных мутаций CTAR-доменов гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в модификации сигнальных путей клетки

На правах рукописи

003448928

ДИДУК СЕРГЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

РОЛЬ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ СТАЯ-ДОМЕНОВ ГЕНА ЬМР1 ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР В МОДИФИКАЦИИ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ

КЛЕТКИ

14.00.14. - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2008

МОСКВА - 2008

003448928

Работа выполнена в лаборатории вирусного канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.Э. Гурцевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корр., РАМН

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

ГНЦ Институт Иммунологии ФМБА РФ, г. Москва

Защита состоится « » с^/П ¿ifr. s 2008 г. в /Г часов на заседании диссертационного ученого совета (Д.001.017.01) ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН по адресу 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан « ль » ccrit^u..^ с/ь-Л 2008 г.

Ф.Л. Киселев Н.Д. Львов

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение молекулярных механизмов канцерогенеза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) - одна из приоритетных задач современной онковирусологии. ВЭБ относится к семейству герпесвирусов, имеет убиквитарный характер распространения в человеческой популяции и является этиологическим агентом ряда злокачественных заболеваний человека, чем обусловлен большой интерес к его изучению. Показано, что ведущую роль в возникновении лимфомы Беркита, лимфомы Ходжкина, недифференцированного рака носоглотки и других, ассоциированных с вирусом заболеваний, играет активация его латентных генов, ответственных за иммортализацию и трансформацию инфицированных этим вирусом клеток [Robertson and Kieff, 1995; Young and Rickinson, 2004].

Среди генов латентной инфекции особое место занимает LMP1. Продукт этого гена, латентный трансмембранный белок 1 (LMP1), является конститутивно активированным аналогом клеточного рецептора фактора некроза опухоли TNF-R1 [Mosialos et al, 1995]. Активируя различные клеточные сигнальные каскады, LMP1 действует как вирусный онкоген, осуществляя трансформацию В-лимфоцитов человека и фибробластов грызунов [Wu et al., 2006; Shair et al., 2007]. Другой не менее значимой уникальной особенностью этого гена является его ярко выраженный полиморфизм. Известно, что различные варианты ВЭБ, несущие специфические мутационные перестройки в LMP1, персистируют в географически ограниченных регионах и часто с их присутствием связывают увеличение доли ВЭБ-ассоциированных заболеваний как, например, недифференцированного рака носоглотки в странах Юго-Восточной Азии [Sandvej et al., 1997; Edwards et al, 1999; Walling et al, 1999].

Установлено, что нуклеотидные замены и делеции гена LMP1, с которыми принято связывать повышение трансформирующей способности кодируемого им белка, наиболее часто выявляются в его С-концевой терминальной области. Ранее также показано, что эти события приводят к нарушениям в аминокислотных последовательностях LMP1, которые служат сайтами связывания этого вирусного белка с белком-рецептором ß-TrCP/HOS, комплекса SCF (skpl - Cullinl - F-box) ЕЗ убиквитин лигазы (SCF(1"TrCP"1IÜS) _ системы целенаправленной деградации белков. В

результате указанных событий наблюдается усиление трансформирующей активности LMP1, что показано в экспериментах in vitro [Tang et al., 2003]. Ряд выявляемых мутаций в этом гене, возможно, ответственен за понижение цитотоксичности, иммуногенности и времени полужизни LMP1, что позволяет предположить их важную роль в повышении его трансформирующего потенциала.

Изучение функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций в данном гене, определение их роли в изменении ключевых сигнальных каскадов клетки представляется актуальной научной и практической задачей, решение которой, вероятно, позволит определить важность этих генетических перестроек в усилении процесса канцерогенеза in vivo, опосредованного этим вирусом. Полученные данные, в свою очередь, позволят расширить наши знания и приблизиться к пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза и сопутствующих ему опухолевых заболеваний человека.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли часто выявляемых мутаций в CTAR-доменах гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в модификации ключевых сигнальных путей клетки.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Создать генетические конструкции на основе ретровирусного вектора с использованием коллекции мутантов полноразмерного гена LMP1, имеющих нарушения в ß-TrCP/HOS-мотивах, ответственных за взаимодействие белка с убиквитин-протеосомальной системой клетки;

2. Получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие продукты исследуемых вариантов гена на базе клеток Mv-l-Lu, Rat-1, NRK-49F, трансформированных LMP1 ретровирусными конструкциями;

3. Провести анализ вариантов LMP1 с мутациями, инактивирующими HOS-мотивы, на их способность активировать в полученных клеточных линиях ряд ключевых сигнальных путей, включая NF-kB, АР-1 и PI3K-Akt;

4. Проверить способность исследуемых вариантов гена вызывать индукцию окиси азота (N0) в инфицированных ими клетках, а также определить форму NO-синтазы, что имеет принципиальное значение для функциональной активности LMP1.

Научная новизна н практическая значимость исследования

Убиквитин-протеосомальная система целенаправленной деградации клеточных белков, как известно, имеет первостепенное значение в таких жизненно важных процессах в клетке, как регуляция клеточного цикла, дифференцировка, развитие клеточного ответа к стрессовым факторам и ряду других. За последние годы неоднократно показано взаимодействие различных вирусных белков с компонентами убиквитин-протеосомапьной системы, в том числе и латентных белков герпесвируса Эпштейна-Барр. Однако процесс взаимодействия LMP1 с белком-рецептором р-TrCP/HOS ЕЗ убиквитиновой лигазы все еще остается мало изученным. Известно, что нарушение связывания убиквитинового комплекса

scfP-TiCP/HOS

с молекулой LMP1

приводит к усилению трансформирующей активности этого белка in vitro, и нарушению регуляции активности NF-kB, значение которого в процессах клеточной трансформации активно изучается в последние годы.

В данной работе впервые показана роль конкретных мутаций исследуемого гена в нарушении сигнальных каскадов клетки, их участие в индукции активных форм азота, а также влияние на структурные компоненты цитоскелета. Для исследования внутриклеточных изменений, вызванных отдельными мутациями в гене LMP1, а также их сочетаниями нами создана чувствительная экспериментальная модель. На базе этой модели осуществляли анализ функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций гена LMP1 во внутриклеточных процессах.

Практическое значение исследования состоит в изучении тонкого механизма усиления трансформирующей активности мутантных молекул LMP1, опосредованной влиянием этого белка на регуляцию сигнальных путей клетки. Данные, полученные в ходе этого исследования, будут иметь принципиальное значение в поиске подходов эффективной профилактики заболеваний, вызываемых герпесвирусом Эпштейна-Барр. Исследование сложных взаимодействий белка LMP1 с убиквитин-протеосомальной системой является ключевым в понимании проблемы деградации «опухолевых» форм белка в инфицированной клетке, что также имеет большое значение для поиска новых терапевтических подходов при лечении вызываемых вирусом патологий.

Апробация работы

Диссертация апробирована 18 июня 2008 года на совместной научной конференции лабораторий вирусного канцерогенеза, иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, биохимии опухолей, методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на 16-ой и 17-ой международных конференциях "AIDS, Cancer and Public Health" 2007, 2008 (Санкт-Петербург, Россия), Всероссийской научно-практической конференции "Отечественные противоопухолевые препараты" 2007, 2008 (Москва, Россия), 8-ой международной школе-конференции "Immunology and viral infection" 2007 (Москва, Россия), 5-ой Российско-немецкой конференции "Human herpesvirus infections" 2008 (Москва, Россия), третьем европейском конгрессе по вирусологии 2007 (Нюрнберг, Германия), 20-ом симпозиуме Европейской ассоциации по изучению рака (EACR) 2008 (Лион, Франция).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 2 научные статьи и 11 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков и 1 таблицу. Состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования, Обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Список используемой литературы содержит 230 литературных источников, из них 1 отечественный и 229 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Плазмиды. При проведении исследования использовали векторные конструкции pSG5-LMPl-B95-8 и pSG5-LMPl-Cao на основе эукариотического экспрессирующего вектора pSG5, содержащего ранний промотор и энхансер SV40, а также ß-глобиновый интрон, обеспечивающий процесс сплайсинга клонированных эукариотических генов. Кроме того, нами использовались варианты полноразмерного

гена LMP1 находящиеся в составе вектора pSG5, имеющие точечные замены в HOS сайтах, а именно: одиночные (G212S, S350A, S366T), двойные (G212S/S350A, G212S/S366T) и тройную (Triple, G212S/S350A/S366T). Для анализа активации транскрипционного фактора NF-kB использовали репортерную плазмиду kB-ConA-Luc, предоставленную F. Grasser (Хомбург, Германия). Для проведения анализа активации INK сигнального пути использовали уил2-люциферазную репортерную плазмиду (API-Luc), любезно предоставленную М. Rowe (Кардиф, Англия).

Клеточные линии. В работе использовали клеточную линию Phi-NX-Ampho (Phoenix-А), дериват эмбриональных клеток почки человека НЕК293, а также крысиные фибробласты Rat-1, фибробласты почки крысы NRK-49F и клетки эмбрионального легкого норки Mv-1-Lu.

Моноклоналъные антитела. В ходе проведения исследования применяли моноклональные антитела к белку LMP1 - S12, протеинкиназе-В - PKBa/Aktl, фосфорилированной форме протеинкиназы-В - PKB-pSer473, а также специфические антитела к паксиллину и ß-катенину.

Методы. При проведении исследований использовали следующие методы: выделение ДНК, электрофорез нуклеиновых кислот, трансформация бактериальных штаммов, клонирование ДНК, трансфекция, трансдукция, аналитический электрофорез белков, иммуноблотинг, денситометрический анализ, люциферазный анализ, флуоресцентная микроскопия, нитрат/нитритный анализ, статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программы GraphPad Prism.

Результаты исследования

1. Создание чувствительной клеточной модели на основе клеток крысиных фибробластов Rat-1, адекватной для изучения свойств LMP1

Известно, что в молекуле LMP1 имеются два аминокислотных, так называемых, HOS-мотива: канонический DSGxxS в позиции 210-215 (область CTAR1) и криптический DSGxx... в позиции 349-351 (область CTAR2). Эти мотивы служат сигналом для убиквитинирования ряда клеточных белков, таких как ингибитор IkB, ß-катенин, рецептор I типа а-интерферона и других. Ранее показано, что прототипный вариант LMP1-B95-8, не имеющий мутаций в HOS-сайтах, способен

взаимодействовать с белком-рецептором ß-TrCP/HOS, что приводит к феномену «сквэлчинга», т.е. ингибированию активации сигнального пути, которое связано с истощением в клетке одного из компонентов убиквитин-протеосомальной системы (HOS-рецептора). Подобный эффект отсутствует в клетках, которые экспрессируют варианты LMP1 с мутациями, нарушающими HOS-мотивы, что влечет за собой усиление трансформирующего действия, оказываемого соответствующими белками LMP1 на клетку [Tang et al., 2003].

Изучение функциональной значимости наиболее часто выявляемых мутаций в гене LMP1, способных влиять на взаимодействие вирусного белка с белком рецептором убиквитин-протеосомальной системы, вероятно, поможет определить их роль в усилении процесса канцерогенеза in vivo, опосредованного этим вирусом. Полученные данные, в свою очередь, позволят расширить наши знания и приблизиться к пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза и сопутствующих ему опухолевых заболеваний человека.

В данном исследовании мы анализировали полноразмерные варианты LMP1 с различными часто встречающимися в этом гене отдельными мутациями и их сочетаниями, которые приводят к нарушениям в HOS-сайтах молекулы LMP1. В качестве контролей использовали, соответственно, прототипный вариант LMP1-B95-8 и высокотуморогенный LMPl-Cao. На базе созданной нами адекватной экспериментальной клеточной модели все варианты LMP1 исследовали на активацию ряда наиболее важных клеточных сигнальных путей, а также индукцию и внутриклеточное накопление окиси азота.

1.1. Получение генетических конструкций на базе ретровирусного вектора и коллекции ß-TrCP/HOS-мутантов гена LMP1

На первом этапе работы полноразмерные варианты гена с одиночными (G212S, S350A, S366T), двойными (G212S/S350A, G212S/S366T) и тройной (Triple, G212S/S350A/S366T) мутациями, локализованными в HOS-сайтах, включая контрольный вариант LMP1-B95-8, заклонированные в эукариотический экспрессирующий вектор pSG5 по EcoRI сайтам, вырезали с помощью одноименной рестриктазы. Высокотуморогенный вариант LMPl-Cao, также используемый в качестве контрольного варианта, рестрицировали по сайту BamHI, что связано с его первоначальным клонированием в вектор pSG5 по этому сайту рестрикции. Далее

проводили клонирование вырезанных фрагментов в ретровирусный вектор рВаЬе-риго по соответствующим сайтам. Для определения ориентации всех переклонированных вариантов гена ЬМР1 очищенные плазмидные ДНК рестрицировали по НтсШ! и М1и1 сайтам. При правильной ориентации вставок в векторе рВаЬе-риго вырезались фрагменты 0,5 кЬ (при клонировании по ЕсоШ сайту) и 2,5 кЬ (при клонировании по ВатН! сайту) (рис.1).

! 12345 678М

Рис.1. Тест на ориентацию LMP1-содержащих фрагментов в pBabe-puro: 1 - LMP1-B95-8; 2 -LMP1-G212S; 3 - LMP1-S350A; 4 - LMP1-S366T; 5 - LMP1-G212S/S350A; 6 - LMP1-G212S/S366T; 7 - LMPI-Triple; 8 - LMP-Cao; 9 - маркер MW. С 1 по 7 - правильная ориентация EcoRJ фрагментов; 8 - правильная ориентация BamHI фрагмента (положение соответствующих фрагментов указано пунктирными стрелками).

Переклонирование полноразмерных вариантов гена из эукариотического экспрессирующего вектора в ретровирусный проводили для исключения хорошо известного эффекта гиперэкспрессии LMP1, который наблюдается при трансфекции этого гена в составе эукариотических векторов в различные типы клеток и часто приводит к ошибочным результатам.

1.2. Получение клеточных линий, стабильно экспрессирующих исследуемые

варианты LMP1

После наработки переклонированных в pBabe-puro HOS-мутантов гена LMP1, а также его контрольных вариантов LMP1-B95-8 и LMPl-Cao, нами проводилась трансфекция клеточной линии Phi-NX-Ampho (Phoenix-A, деривата клеток НЕК293). Клетки данной линии содержат генетические конструкции (RSV-Gag-Pol-PolyA и CMV-env-PolyA), что позволяет обеспечить используемые в эксперименте векторные

конструкты соответствующей «упаковкой», содержащей компоненты оболочки амфотропного вируса мышей. При транзиторной трансфекции клеток Phoenix-A ретровирусными векторами, несущими соответствующие вставки гена LMP1, формируется высокий титр вирусов (до 107 на мл), которые продуцируются трансфецированными клетками в культуральную среду. Далее полученными ретровирусными стоками мы трансдуцировали различные клеточные линии. В качестве индикаторных клеток использовали три клеточных культуры: хорошо известная линия эмбрионального легкого норки Mv-1-Lu; фибробласты почки крысы NRK-49F и эмбриональные крысиные фибробласты Rat-1 (рис.2). Следует отметить, что выбор этих линий не случаен. Так, клетки Mv-1-Lu содержат в большом количестве рецепторы TGFP и транскрипционные факторы Smad, которые участвуют в передаче сигналов от рецептора в ядро, что делает эту клеточную линию высокочувствительной к действию факторов, нарушающих прохождение антипролиферативного сигнала [Mori et al., 2003]. Поскольку в исследование HOS-мутантов входила проверка нарушения такой регуляции, использование данной клеточной линии в качестве модели полностью соответствовало поставленным задачам. Кроме того, эта клеточная линия обладает хорошим «флэт-фенотипом», позволяющим легко идентифицировать фокусы морфологически измененных клеток (рис. 2а). Что касается двух других клеточных культур, то их выбор был обусловлен, в первую очередь, чувствительностью этих клеток к трансформирующим свойствам LMP1 и их реактивностью к трансформирующему действию карбоксильного домена белка [Moorthy et al., 1993]. В контексте данного эксперимента, а именно в связи с изучением точечных мутаций CTAR-областей карбоксильного домена вышесказанное представляется особенно актуальным.

В ходе двухнедельной селекции трансдуцированных клеточных линий выяснилось, что клетки Mv-1-Lu имеют высокую чувствительность к экспрессии белка LMP1, что находит свое отражение в значительном проценте гибели этих клеток. По-видимому, наблюдаемый эффект связан с хорошо известным цитопатическим действием, оказываемым белком LMP1 на некоторые клеточные линии. Что касается двух других используемых в нашей работе линий, то в связи с тем, что явных отличий между ними выявить не удалось, для дальнейшего изучения характеристик белка LMP1 мы решили использовать клетки Rat-1.

Рис. 2. Клеточные линии, используемые в работе. А - клетки эмбрионального легкого норки Му-1-Ьи; Б - эмбриональные крысиные фибробласты 11аь1; В - фибробласты почки крысы Н1Ж-49Р. Фенотип клеток до (слева) и после (справа) траисдукции.

Экспрессию исследуемых вариантов ЬМР1 и их контрольных вариантов в трансдуцированных клетках ЯаЫ проверяли с помощью иммуноблотинга со специфическими антителами к области повторов молекулы. Во всех трансдуцированных клеточных линиях нами обнаружены продукты экспрессии вариантов ЬМР1, соответствующего размера (63 кДа). Как видно на рисунке 3, экспрессия белка во всех линиях происходит примерно на одинаковом уровне.

63 кДа

í ! - . „»»ч

Рис.3 Экспрессия LMP1 после трансдукции клеток Rat-1 (иммуноблотинг с мАТ S12)' 1 -pBabe-puro (контроль); 2 - LMP1-G212S, 3 - LMP1-S350A; 4 - LMP1-S366T; 5 - LMP1-G212S/S350A; 6 -LMP1-G212S/S366T, 7-LMPl-Tnple, 8 -LMPl-Cao; 9 -LMP1-B95-8

2. Функциональный анализ сигнальной активности клеточных линий, стабильно экспрессирующих исследуемые варианты гена

2.1. Оценка влияння мутаций в каноническом и криптическом HOS-мотивах LMP1 на активацию транскрипционного фактора NF-kB

Ранее показано, что в случае Triple-варианта LMP1, имеющего три мутации в HOS-сайтах, наблюдается инактивация этих сайтов и как следствие отмена связывания вирусного белка LMP1 с белком рецептором p-TrCP/HOS SCF комплекса ЕЗ убиквитин лигазы (HOS-рецептором), что в свою очередь нарушает регуляцию транскрипционного фактора NF-kB. Исходя из этих данных, наша задача состояла в оценке уровня активации NF-kB вариантами LMP1, несущими двойные и одиночные мутации, которые, как известно, также нарушают аминокислотную последовательность HOS-сайтов. В связи с этим клеточные линии, постоянно экспрессирующие LMP1 с одиночными, двойными и тройной мутациями, а также соответствующие контрольные варианты гена (В95-8 и Cao), анализировали на их способность влиять на активацию транскрипционного фактора NF-kB (рис 4).

Рис. 4. Стимуляция активности транскрипционного фактора NF-kB вариантами белка LMP1 в клеточных линиях крысиных фибробластов Rat-1.

В ходе исследования выявлено, что варианты полноразмерного LMP1, несущие двойные мутации в HOS-сайтах (G212S/S350A, G212S/S366T), усиливают активацию NF-kB на 20-30% по сравнению с прототипным вариантом LMP1-B95-8, тогда как Triple-вариант вызывает активацию NF-kB, близкую к уровню, вызванному экспрессией туморогенного варианта LMPl-Cao. В то же время у вариантов, имеющих единичные замены (G212S, S350A, S366T) в CTAR областях LMP1, активация NF-kB практически не отличалась от таковой для прототипного варианта LMP1-B95-8.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что все исследуемые варианты LMP1 способны активировать NF-kB. Кроме того, уровень активации этого транскрипционного фактора вариантами LMP1 с двойной и тройной мутациями, вызывающими нарушение процесса связывания HOS-рецелтора с обоими HOS-мотивами, оказался значительно выше такового, индуцированного контрольным

вариантом LMP1-B95-8, а также вариантами с единичными мутациями. Полученные данные свидетельствует о важной роли обоих HOS-сайтов в активации транскрипционного фактора NF-kB.

2.2. Оценка влияния мутаций в каноническом и криптическом HOS-мотивах LMP1 на активацию транскрипционного фактора jun/AP-1

Сигнальный каскад c-jun N-терминальной киназы (JNK/AP-1) инициируется множеством различных факторов, таких как температурный шок, ионизирующая радиация, ростовые факторы и т.д. Экспрессия в клетке белка LMP 1 также приводит к индукции стресс-активируемой протеинкиназы (SAPK) [Kieser et al., 1997; Eliopoulos et al., 1998; Lam et al., 2002].

Используя _/мгс2-люциферазный репортерный вектор, мы сравнивали уровни активации транскрипционного фактора АР-1 между вариантами LMP1, имеющими HOS-мутации в CTAR-областях молекулы, и контрольными вариантами: прототипным LMP1-B95-8 и высокотуморогенным LMPl-Cao (рис. 5).

1,2

В95-8 212 350 366 212/350 212/366 Triple Cao

Рис. 5. Стимуляция активности транскрипционного фактора jun/АР-i вариантами белка LMP 1 в клеточных линиях крысиных фибробластов Rat-1.

В ходе эксперимента выявлено, что все варианты ЬМР1, несущие НОЭ-мутации, вызывают примерно одинаковый уровень активации ^ип2-люциферазного репортера, близкий к уровню вызванному ЬМР1-В95-8, что свидетельствует об отсутствии влияния мутаций в НОЗ-сайтах на активацию этого транскрипционного фактора.

При определении люциферазной активности наличие экспрессии ЬМР1 в анализируемых клеточных линиях подтверждали с помощью иммуноблотинга с использованием моноклональных антител 812, специфичных к области повторов белка (рис. 6). В этом эксперименте, как и в случае измерения активности №-кВ, эффективность трансфекции проверяли с помощью р5У-|3§а1.

1234 5 6789

Рис. 6. Экспрессия LMP1 после трансдукции клеток Rat-1 иммуноблотинг с мАТ S12. 1 -pBabe-puro (контроль); 2 - LMP1-B95-8; 3 - LMP1-G212S; 4 - LMP1-S350A; 5 - LMP1-S366T; 6 - LMP1-G212S/S350A; 7 - LMP1-G212S/S366T; 8 - LMPl-Triple; 9 - LMPl-Cao.

2.3. Оценка влияния мутаций в каноническом и криптическом HOS-мотивах LMP1 на активацию сигнального пути PI3K-Akt

j Недавно в ряде зарубежных исследований показана активация

фосфатидилинозитол-3-киназного сигнального пути (PI3K-Akt) областью СТАЮ белка LMP1 [Dawson et al., 2003; Mainou et al., 2005]. Учитывая тот факт, что исследуемые нами HOS-мутации также локализованы в CTAR-областях LMP1, мы проанализировали их возможное влияние на активацию PI3K-Akt. Денситометрический анализ иммуноблотинга, проведенного нами со специфическими антителами к протеинкиназе В (Akt/PKB) и ее фосфорилированной форме (p-Akt, Ser-473), выявил более высокое содержание p-Akt в клетках, экспрессирующих гуморогенный вариант LMPl-Cao, которое оказалось в 1,4 раза выше, по сравнению с исследуемыми вариантами LMP1, имеющими одну, две или три замены (рис. 7, 8).

14

12345 6 7 89

Рис. 7. Активация Akt/PKB-протеинкиназы вариантами LMP1, несущими мутации в HOS-_сайтах: 1 - pBabe-puro (контроль); 2 - LMP1-B95-8; 3 - LMPl-Cao; 4 - LMPl-Triple; 5 -LMP1-G212S; 6 - LMP1-S350A; 7 - LMP1-S366T; 8 - LMP1-G212S/S350A; 9 - LMP1-G212S/S366T. Вестерн-блот анализ с использованием антител, специфичных к LMP1 (S12), общему Akt (Akt/PKB), фосфорилированной форме Akt (p-Akt) и ß-катенину. ß-катенин использовался в качестве контроля нанесения.

, еоо

pBabe В95-8 Сао Triple 212 350 366 212/350 212/366

Рис. 8. Количественный анализ общей и фосфорилированной формы Akt, проведенный с использованием программы ImageJ.

Таким образом, на основе полученных данных можно сделать вывод о том, что исследуемые аминокислотные замены в белке LMP1 не оказывают значимого влияния на активность фосфотидилинозитол-3-киназы.

2.4. Оценка влияния мутаций в каноническом и критическом HOS-мотивах LMP1 на цитоскелет трансформированных клеток Rat-1

Известно, что LMP1 оказывает плейотропное действие на различные биологические процессы, в том числе и на регуляцию малых G-белков Rho/Rac-семейства, что приводит к изменению структурных компонентов цитоскелета. Более того, как показано ранее, в данном процессе задействован С-терминальный цитоплазматический домен молекулы LMP1 [Liliental et al., 2000; Dawson et al., 2003]. Поскольку исследуемые нами мутации локализуются в карбоксильном домене этого белка и приводят к нарушению HOS-сайтов, мы проанализировали возможное участие этих мутаций в изменении структурных компонентов цитоскелета.

.. j / ¥ шШ Мшу f, .Г • V- V 'N u 1 'О : ■ с Vf .'>-,]■■

в ^ к ч . : • г tf ; М ' . ' V -'* ' 1. » --- ■ - лее*. ;--- -,(/ ■ - ' . : :f . j t ; ' . ' 4 "A 4

Рис. 9. Фибробласты ЯаМ, эксирессирующие различные варианты ЬМР1. А - рВаЬе-риго, Б - ЬМР1-В95-8, В - ШР1-Тпр1е, Г - ЬМР1-Сао. Стресс-фибриллы (актиновый цитоскелет) ориентированны вдоль длинной оси клетки. Иммунофлуоресцеитная микроскопия. Масштаб - 10 мкм.

Используя методику прижизненной окраски актиновых структур клетки, мы наблюдали образование многочисленных стресс-фибрилл в клетках ЯаМ при экспрессии прототипного варианта ЬМР1-В95-8 и варианта ЬМР1-Тпр1е имеющего нарушения в обоих НОЗ-сайтах (рис. 9Б, 9В). Кроме того, в этих клетках с помощью метода иммуно-флуоресцентной микроскопии и специфических антител также удалось выявить образование длинных штриховых контактов паксиллина, расположенных ближе к основанию ламеллы (рис. 10Б, 10В).

/ ? * ; г" ' ^ ; i .i« < -,. » 1 Ч * ,, '

Б V Î4. V |>ч г * * . 'êJm >■«•■■ ¡V

Рис. 10. Фибробласты Rat-1, экспрессирующие различные варианты LMP1. А - pBabe-puro, Б - LMP1-B95-8, В - LMP1-Triple, Г - LMPl-Cao. Фокальные контакты (окрашивание на паксиллин), ориентация вдоль длинной оси клетки. Иммунофлуоресцентная микроскопия. Масштаб - 10 мкм.

В случае экспрессии варианта LMPl-Cao в клетках Rat-1 удалось обнаружить лишь отдельные тонкие пучки актиновых филаментов в цитоплазме клеток, а также формирование точечных контактов паксиллина (рис. 9Г, ЮГ). Во всех случаях

клеток, трансформированных вариантами LMP1, актиновые пучки, а также паксиллины были ориентированны вдоль длинной оси клетки (рис. 9,10).

Таким образом, анализируя полученные данные, можно говорить об отсутствии влияния мутаций в HOS-мотивах молекулы LMP1 на изменения актиновых филаментов и паксиллина в трансформированных клетках.

2.5. Оценка уровня накопления N0 при экспрессии вариантов LMP1 с инактивироваиными HOS-мотивами

Как известно, молекула LMP1 способна вызывать активацию синтеза индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и продукцию N0. Являясь активной формой азота, N0 наряду с цитокинами влияет на клеточные эффекторные системы, контролирующие пролиферацию, апоптоз и дифференцировку, а также ее устойчивость к стрессовым воздействиям. В ранее опубликованных работах показаны различия в уровнях активации iNOS и образования N0 между прототипным вариантом LMP1-B95-8 и высокотрансформирующим вариантом LMPl-Cao [Yu et al., 2002]. Эти различия, вероятно, связаны с наличием у последнего так называемой Сао-делеции 10 а.к. в его CTAR2 области. Вышесказанное позволяет предположить, что в усилении внутриклеточного образования N0 также могут участвовать и другие часто встречающиеся мутации этой области гена, а именно, G212S и S366T. Для определения влияния этих аминокислотных замен на продукцию N0 использовали клетки Rat-1, стабильно экспрессирующие варианты LMP1 с изучаемыми H0S-мутациями, а также контрольные варианты белка (LMP1-B95-8 и LMPl-Cao). Концентрацию нитратов/нитритов измеряли в 3-дневной культуральной среде.

Из данных, представленных на рисунке 11 видно, что количество выделяемого в культуральную среду N0 клетками, экспрессирующими LMP1 с единичными и двойными заменами в HOS-сайтах, существенно не отличается от накопления N0 контрольным прототипным вариантом LMP1-B95-8 (12-12,5 нмоль/мл среды и 13,1 нмоль/мл среды, соответственно). В то же время содержание N0 в культуральной среде клеток, экспрессирующих Triple-вариант и контрольный высокотуморогенный вариант LMPl-Cao, оказалось существенно ниже (9,7 и 6,4 нмоль/мл среды, соответственно). Эти опыты показали, что мутации, приводящие к инактивации H0S-сайтов молекулы LMP1, влияют на количество накопления N0 в клетке.

Рис. 11. Накопление нитратов/нитритов в культуральной среде клеточных линий КаМ, экспрессирующих НОБ-мутанты ЬМР1 (количество N0 определялось через 3 суток после посева).

2.6. Оценка динамики накопления NO при экспрессии вариантов LMP1 с инактивированными HOS-мотивами

Анализ динамики накопления N0 клеточными линиями, экспрессирующими отличающиеся по туморогенности варианты LMP1-B95-8, LMPl-Cao, а также LMP1-Triple, показал, что в течение 3 дней количество окиси азота увеличивалось линейно и выходило на плато к 4-м суткам. На графике (рис. 12) также видно, что в культуральной среде клеточных линий, экспрессирующих варианты LMP1-Triple и LMPl-Cao, образование N0 происходило медленнее, чем в случае варианта LMP1-В95-8. Полученные данные свидетельствуют о влиянии мутаций, инактивирующих HOS-мотивы молекулы LMP1, как на скорость генерации N0 в клетке, так и на количество его накопления в культуральной среде.

Для подтверждения того, что внутриклеточный синтез N0 осуществляется в результате активации именно индуцибильной формы NO-синтазы (ÍNOS), нами

использовался дексаметазон (Dex), который является ингибитором этого фермента. Как видно на рис. 13, обработка в течение трех дней этим ингибитором клеток, экспрессирующих разные варианты LMP1 (В95-8, Cao и Triple), привела к снижению уровня синтеза N0: в случае прототипного варианта - на 60%, а при экспрессии Triple и Cao - на 44% и 46%, соответственно.

14

12 3 4

Рис. 12. Динамика накопления N0 в течение 4 суток клетками 1, экспрессирующими варианты 1.МР1.

Добавление дексаметазона вызвало у клеток небольшой цитотоксический эффект. Тем не менее, такое действие ингибитора не отразилось на экспрессии ЬМР1, о чем свидетельствуют данные иммуноблотинга (рис. 14).

Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о влиянии мутаций, инактивирующих НОБ-мотивы молекулы ЬМР1, на индукцию ¡N03, и как следствие, на генерацию N0 в клетке. Кроме того, выявлено влияние этих генетических изменений на скорость и количество накопления окиси азота в культуральной среде.

63 кДа

Рис. 14. Экспрессия LMP1 в клетках Rat-1 после добавления дексаметазона (Dex) иммуноблотинг с мАТ S12. 1 - LMP1-B95-8; 2 - LMPl-B95-8+Dex; 3 - LMPl-Triple; 4 -LMP 1 -Triple+Dex; 5 - LMPl-Cao; 6 - LMPl-Cao+Dex.

Рис. 13. Ингибирование продукции NO дексаметазоном (Dex) в клеточных линиях Rat-1, экспрессирующих разные варианты LMP1.

□ 1 день H 2 день

□ 3 день

гЪ

Triple+Dex Cao Cao+Dex

ВЫВОДЫ

1. Создана чувствительная клеточная модель на основе клеток крысиных фибробластов ЯаЫ и ретровирусных конструкций НОЗ-мутантов ЬМР1 для изучения функциональной значимости мутаций этого гена и определения их роли в изменении ключевых сигнальных каскадов клетки;

2. Показано, что только при наличии двойных (G212S/S350A, G212S/S366T) и тройной (G212S/S350A/S366T) мутаций, приводящих к нарушению обоих HOS-мотивов в CTAR1 и CTAR2 областях LMP1, происходит увеличение активации транскрипционного фактора NF-kB. Полученные данные подчеркивают значимость точечных мутаций, выявляемых в этих областях, для функциональной активности LMP1;

3. Установлено, что исследуемые мутации, локализованные в каноническом и криптическом HOS-мотивах CTAR-областей LMP1, не влияют на уровень активации транскрипционного фактора АР-1;

4 Обнаружено, что исследуемые варианты LMP1, несущие различный набор мутаций в HOS-мотивах белка, как и прототипный вариант LMP1-B95-8, приводят к незначительной активации протеинкиназы-В (PKB/Akt);

5. Анализ внутриклеточной генерации окиси азота (N0) выявил снижение уровня N0 в фибробластах Rat-1, трансдуцированных вариантами LMPl-Cao и LMP1-Triple с нарушениями в обоих HOS-мотивах, что может способствовать выживаемости и усилению туморогенных свойств трансформированных ими клеток;

6. Показано, что синтез N0 в клетках, экспрессирующих различные варианты LMP1 (LMP1-B95-8, LMPl-Triple, LMPl-Cao), происходит за счет активации индуцибельной формы NO-синтазы (iNOS), при этом более высокая скорость накопления окиси азота обнаружена при экспрессии прототипного варианта LMP1-B95-8.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. [Павлиш О.АI, Дидук C.B., Смирнова К.В., Щербак JI.H., Гончарова Е.В., Шалгинских H.A., Архипов В.В., Кичигина М.Ю., Степина В.Н., Белоусова Н.В., Османов Е.А, Яковлева Л.С., Гурцевич В.Э. Мутации гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр у российских больных лимфоидной патологией и здоровых лиц. Вопр. вирусол., 2008, №1, с. 10-16.

2. Дидук С.В , Смирнова К.В., ¡Павлиш О.А|, Гурцевич В.Э Роль функционально значимых мутаций гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в активации клеточных сигнальных путей. Биохимия, 2008, №10, с. 1414-1421.

3 Дидук С.В, Смирнова К В., Шалгинских Н.А. Сиквенсный анализ последовательностей гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр у больных лимфопролиферативными заболеваниями в России. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал, 2007, №1, с. 5.

4. Гурцевич В.Э, Гончарова Е В., Щербак JI.H., Дидук С В., Смирнова К.В., Шалгинских Н.А., Кичигина М Ю., Степина В.Н., Яковлева JI.C., Павлиш О А. Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) как представитель В-лимфотропных герпесвирусов приматов: генетические варианты гена LMP1 в образцах ВЭБ российского происхождения. Материалы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», 2007, с. 170-182.

5. Pavlish О .A., Diduk S.V., Smirnova K.V., Scherback L.N., Goncharova E.V., Shalginskykh N.A, Kichigina M.Yu., Arkhipov V.V., Belousova N.V., Stepina V.N., Osmanov E.A., Yakovleva L.S., Gurtsevitch V.E. Epstein-Barr virus LMP1 gene variants in russian patients with limphoproliferative disorders Abstracts of 16-th International Conference "AIDS, Cancer and Public Health". In Russian journal AIDS, cancer and public health, 2007, V. 11, № l,p. 123.

6. Diduk S V , Smirnova K.V., Pavlish O.A., Gurtsevitch V.E. Conservative mutations of latent membrane protein 1 (G212S/S350A/S366T) in Epstein-Barr virus-mediated activation signal pathways Abstracts of the Third European Congress of Virology, 2007, p. 244.

7. Diduk S.V., Smirnova K.V., Gurtsevitch V.E. The significance of some mutations of EBV LMP1 gene for strengthening its oncogenic potential. Abstracts of the 8th John Humphrey Advanced Summer Program In Immunology, 2007, p.52.

8 Gurtsevitch V., Smirnova K., Diduk S., Goncharova E., Scherback L., Stepina V., Yakovleva L. Molecular epidemiology of the Epstein-Barr virus (EBV) LMP1 genetic variants of Russian origin. Abstracts of 5th Russian-German Conference "Human herpesvirus infection", 2008, p. 10.

9. Двдук C.B., Смирнова К.В., Гурцевич В.Э. Влияние мутаций гена LMP1 на внутриклеточную генерацию активных форм азота как важнейшего фактора в усилении трансформирующей активности вируса Эпштейна-Барр. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». Российский биотерапевтический журнал, 2008, №1, с. 9.

10. Дидук С В., Смирнова К.В , Гурцевич В.Э. Влияние мутаций области CTAR гена LMP1 герпесвируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) на его трансформирующую активность. Тезисы 16-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье». Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье, 2008, Т. 12, №2, с. 90.

И. Diduk S.V., Smirnova K.V., Gurtsevitch V.E. Nitnc oxide production in Rat-1 cells induced by Epstein-Barr virus LMP1 gene with mutations in canonical and cryptic HOS recognition sites. Abstracts of the 17th International Conference "AIDS, Cancer and Public Health". In Russian journal AIDS, cancer and public health, 2008, V. 12, № 2, p. 42.

12. Diduk S., Smirnova K., Gurtsevitch V. Activation of some signaling pathways in Rat-1 cells induced by Epstein-Barr virus LMP1 gene with mutations m HOS recognition sites. European Journal of Cancer, Suppl., European Association for Cancer Research (EARC) 20 Meeting, 2008. Lyon, France, V. 6, № 9, p. 148.

13. Gurtsevitch V., Smirnova K., Diduk S., Goncharova E., Scherback L., Stepina V., Yakovleva L. LMP1 gene variants of Russian origin from patients with EBV-associated pathologies and health individuals. European Journal of Cancer, Suppl., European Association for Cancer Research (EARC) 20 Meeting, 2008. Lyon, France, V. 6, № 9, p. 50.

Подписано в печать 19.09.08 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № 594_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Изучение молекулярных механизмов канцерогенеза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) - одна из приоритетных задач современной онковирусологии. ВЭБ относится к семейству герпесвирусов, имеет убиквитарный характер распространения и является этиологическим агентом ряда злокачественных заболеваний человека, чем и обусловлен большой интерес к его изучению. Показано, что ведущую роль в возникновении лимфомы Беркита (ЛБ), лимфомы Ходжкина (ЛХ), недифференцированного рака носоглотки (нРНГ) и других заболеваний играет активация латентных генов ВЭБ, ответственных за трансформацию и иммортализацию инфицированных этим вирусом клеток.

Среди генов латентной инфекции особое место занимает ген BNLF1 (обозначаемый также как IMP У), кодирующий латентный мембранный белок LMP1, который является конститутивно активированным аналогом клеточного рецептора фактора некроза опухоли TNF-R1. Активируя различные клеточные сигнальные каскады, LMP1 действует как вирусный онкоген, осуществляя трансформацию В-лимфоцитов человека и фибробластов грызунов. Другой уникальной особенностью этого гена является его ярко выраженный полиморфизм. Различные варианты ВЭБ, имеющие специфические мутационные перестройки в LMP1, персистируют в географически ограниченных регионах и часто с их присутствием связывают увеличение доли ВЭБ-ассоциированных заболеваний как, например, недифференцированного рака носоглотки в странах Юго-Восточной Азии.

Недавно установлено, что наиболее частые «опухолевые» замены и делеции в гене LMP1 происходят в его С-концевой терминальной области. Эти события приводят к повреждению сайтов связывания белка LMP1 с белком-рецептором (З-ТгСР/HOS, являющегося обязательным компонентом комплекса SCF (skpl - Cullinl - F-box) ЕЗ убиквитин лигазы, (sCFp"TrCP/HOS) - системы целенаправленной деградации белков. В результате указанных событий происходит усиление трансформирующей активности LMP1, что показано в экспериментах in vitro. Ряд других часто выявляемых мутаций в этом гене, возможно, ответственны за понижение цитотоксичности, иммуногенности и времени полужизни белка, что также вероятно приводит к повышению его трансформирующего потенциала.

Изучение функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций в данном гене, их влияние на сигнальные каскады клетки представляется актуальной научной и практической задачей, решение которой вероятно позволит определить роль этих генетических перестроек в усилении процесса канцерогенеза in vivo, опосредованного этим вирусом. Полученные данные, в свою очередь, позволят расширить наши знания и приблизиться к пониманию механизмов ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза и сопутствующих ему опухолевых заболеваний человека.

Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли часто выявляемых мутаций в CTAR-доменах гена LMP1 вируса Эпштейна-Барр в модификации ключевых сигнальных путей клетки.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Создать генетические конструкции на основе ретровирусного вектора с использованием коллекции мутантов полноразмерного гена LMP1, имеющих нарушения в P-TrCP/HOS-мотивах, ответственных за взаимодействие белка с убиквитин-протеосомальной системой клетки;

2. Получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие продукт исследуемых вариантов гена на базе клеток Mv-l-Lu, Rat-1, NRK-49F, трансформированных LMP1 ретровирусными конструкциями;

3. Провести анализ вариантов LMP1 с мутациями инактивирующими HOS-мотивы, на их способность активировать в полученных клеточных линиях ряд ключевых сигнальных путей клетки, включая NF-kB, АР-1 и PI3K-Akt в полученных клеточных линиях;

4. Проверить способность исследуемых вариантов гена вызывать индукцию окиси азота (N0) в инфицированных ими клетках, а также определить форму NO-синтазы, что имеет принципиальное значение для функциональной активности LMP1.

Научная новизна. Убиквитин-протеосомальная система целенаправленной деградации клеточных белков, как известно, имеет первостепенное значение в таких жизненно важных процессах в клетке, как регуляция клеточного цикла, дифференцировка, а также развитие клеточного ответа к стрессовым факторам и ряду других. За последние годы неоднократно показано взаимодействие различных вирусных белков с компонентами убиквитин-протеосомальной системы, в том числе и латентных белков герпесвируса Эпштейна-Барр. Однако процесс взаимодействия LMP1 с белком-рецептором (3-TrCP/HOS ЕЗ убиквитиновой лигазы все еще остается мало изученным. Известно, что нарушение связывания убиквитинового комплекса

SCFP-TrCP/HOS с молекулой LMP1 приводит к усилению трансформирующей активности этого белка in vitro, и повреждению нормальной регуляции NF-kB, сигнальной функции LMP1, значение которой, в процессах трансформации активно изучается в последние годы.

В данной работе впервые показана роль конкретных мутаций исследуемого гена в нарушении клеточных сигнальных каскадов, их участие в индукции активных форм азота, а также влияние на стрктурные компоненты цитоскелета. В настоящем исследовании для выявления подобных внутриклеточных изменений вызванных LMP1 -мутантами нами создана чувствительная экспериментальная модель. На базе этой модели осуществляли анализ функциональной значимости наиболее часто встречающихся мутаций гена LMP1 во внутриклеточных процессах.

Практическое значение исследования состоит в изучении тонкого механизма усиления трансформирующей активности мутантных молекул LMP1, опосредованной влиянием этого белка на регуляцию сигнальных путей клетки. Данные, полученные в ходе этого исследования, будут иметь принципиальное значение в поиске подходов эффективной профилактики заболеваний, вызываемых герпесвирусом Эпштейна-Барр. Исследование сложных взаимодействий белка LMP1 с убиквиггин-протеосомальной системой является ключевым в понимании проблемы деградации «опухолевых» форм белка в инфицированной клетке, что также имеет большое значение для поиска новых терапевтических подходов при лечении вызываемых вирусом патологий.

ВЫВОДЫ

1. Создана чувствительная экспериментальная клеточная модель на основе клеток крысиных фибробластов Rat-1 и ретровирусных конструкций HOS-мутантов LMP1 для изучения функциональной значимости мутаций этого гена и определения их роли в изменении ключевых сигнальных каскадов клетки;

2. Показано, что при наличии двойных (G212S/S350A, G212S/S366T) и тройной (G212S/S350A/S366T) мутаций, приводящих к нарушению обоих HOS-мотивов в CTAR1 и CTAR2 областях LMP1, происходит увеличение активации транскрипционного фактора NF-kB. Полученные данные подчеркивают значимость точечных мутаций, выявляемых в этих областях, для функциональной активности LMP1;

3. Установлено, что исследуемые мутации, локализованные в каноническом и криптическом HOS-мотивах CTAR-областей LMP1 не влияют на уровень активации транскрипционного фактора АР-1;

4. Обнаружено, что исследуемые варианты LMP1, несущие различный набор мутаций в HOS-мотивах белка, как и прототипный вариант LMP1-B95-8, приводят к незначительной активации протеинкиназы-В (PKB/Akt);

5. Анализ внутриклеточной генерации окиси азота (NO) выявил снижение уровня NO в фибробластах Rat-1, трансдуцированных вариантами LMPl-Cao и LMP1 -Triple с нарушениями в обоих HOS-мотивах, что может способствовать выживаемости и усилению туморогенных свойств трансформированных ими клеток;

6. Показано, что синтез N0 в клетках, экспрессирующих различные варианты LMP1 (LMP1-B95-8, LMP1-Triple, LMPl-Cao), происходит за счет активации индуцибельной формы NO-синтазы (iNOS), при этом более высокая скорость накопления окиси азота обнаружена при экспрессии прототипного варианта LMP1-B95-8.