Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Роль структурных особенностей генов ренин-ангиотензивной системы, эндотелиальной NO-синтазы и р53 в развитии основных факторов риска цереброваскулярной патологии и в формировании инфаркта мозга

На правах рукописи

_ Кольцова Евгения Александровна

Роль структурных особенностей генов ренин-шгиотеизиновой системы, эндотелиальной А'О-синтазы ир53 в

поюмтни плипоииу Ао».*тпплт? пмр^а иапй^плоомлч'ттопплтг

м * * ■ »1 »1 V1 ■ и •-/ 11 ири V«*»« V ^ V/ »-> V1 % д«' л л V/ * а

I

патологии и в формировании инфаркта мозга

14.00.13-нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической невролог Российского Государственного медицинского университета.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор

Скворцова Вероника Игорев

Лимборская Светлана Андреев

Официальные оппоненты

Стулин Игорь Дмитриевич - доктор медицинских наук, заведующий кафедр неврологии и нейрохирургии Московского Государственного медт стоматологического университета.

Авакян Гагик Норайрович - доктор медицинских наук, профессор кафед неврологии и нейрохирургии РГМУ

Ведущая организация: Московская медицинская академия имени И. М. Сечено

Защита состоится « «_2002 г. в «_«_часов на заседай

Диссертационного совета Д 20807201 в Российском государственном медицинск университете (117997 г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственнс медицинского университета

Автореферат разослан « «_2002г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Джанашия Платон Харитонович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы

Ингемический инсульт является одной из важнейших проблем лнну1чсской неврологии, поскольку опрелеляет уровень основных оказателей здоровья населения - средней продолжительности жизни, Зшей смертности и инвалидизации (Е.И. Гусев, 1991; Е.И. Гусев, В.И. кворцова, 1997, 2001; К. Asplund, 1998). Половина всех инсультов риходится на трудоспособный возраст, что усиливает социальную тчимость проблемы.

Исследования последних десятилетий достоверно установили роль аслсдственной предрасположенности, как одного из важнейших и гзависимых факторов риска, в развитии ишемического инсульта (Е.Ф. авиденкова, 1967; J.F. Diaz, 1986; L.M. Brass, 1992; P. Jousilahti, 1997).

Достигнуты успехи в понимании молекулярно-генетических механизмов гализации ишемического повреждения мозга в рамках моногенных дологических состояний (M. Natowicz, 1987; J.P. Kraus, 1993; H.S. Markus, Э98; A. Hassan, 2000). Исследования молекулярно-генетических основ ормирования сложных признаков - мультифакториальных полигенных юолеваний, в том числе пшемнческих инсультов, до сих пор малочисленны фрагментарны, причем в большинстве работ не учитывался тгогснстический вариант инсульта, хотя известно, что это синдром, веющий различные механизмы развития. Единичные работы посвящены теку связи мс>гслу п о л i i л ! о п ш h з м о м генов систсмы гемостаза (Corra! .]., Ш: Nishiuma S., 1998), атерогенеза(С.К. Couder, 1993; J. Kuusislo, 1995;), .■нин-ангиотензнновой системы (A. Caíto. 1996; J.J. Lin, 1999), /Vü-сиитаз L Yahashi, 1998; L. IIou, 2001) и риском развития ишемического инсульта, айдена тесная связь между D/D полиморфным вариантом гена ииотензип-превращающеш фермента и высоким риском лакунарных исультов (U.S. Markus, 1995), М235Т полиморфизмом гена (гиотензиногена, артериальной гипертензией и инфарктом миокарда (Т. atsuya, 1995). Наличие 4а-аллеля гена eNOS рассматривается как ¡зависимый фактор риска развития ишемического инсульта в китайской )пуляции (L. Нои, 2001).

В то же время трансформация гсмодипамических. клеточных и элекулярных изменений в стойкий морфологический дефект определяется ; только возможностями коллатерального кровообращения и ¡активностью сосудов мозга, но и особенностями индивидуальной ^вствительности вещества мозга к ишемии, фоновым состоянием

нейротрофического обеспечения, особенностями реагировани нсйроиммуноэндокршшой системы (В.И. Скворцова, 1999;Е.И. Гусев, В1 Скворцова, 2001; М. Fisher, 1996). В связи с этим особый интере представляет изучение наследственных факторов индивидуально чувствительности вещества мозга к ишемии, среди которых наибольшу] значимость имеют генетические механизмы апоптоза и антиапоптозно защиты (В.И. Скворцова, 2001; R. Clark, 1993; М. Chopp, 1996).

Наиболее рациональной моделью для изучения наследственно предрасположенности в развитии ишемического инсульта является ег атеротромботическая форма (J. Bogousslavsky, 1991), поскольку развиваете на фоне длительно текущей ишемии мозга и определяет перестройк метаболизма и экспресии генов.

В связи с вышесказанным особую значимость приобретают исследовани посвященные раскрытию молекулярно-генетических основ ишемическог повреждения мозга, изучению наследственной предрасположенности атеротромботическому ишемическому инсульту, возможности] прогнозирования индивидуального риска инсульта на основе семейног анамнеза, что и определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задач!

Цель работы

Изучение роли структурных особенностей генов ренин-ангиотензиново системы, эндотелиалыюй М>синтазы и маркера апоптоза - гена р53 развитии основных факторов риска цереброваскулярной патологии, а такж в формировании различных форм ишемической болезни головного мозга

Задачи исследования

1. Анализ частоты встречаемости основных факторов риск цереброваскулярной патологии у больных с хронической ишемическо болезнью мозга, с атеротромботическим ишемическим инсультом, а такж у их сибсов.

2. Сравнительный клинико-генетический анализ полиморфизмов гено ренин-ангиотензиновой системы (ангиотензин-превращающего фермент и ангиотензшюгена) у больных с хронической ишемической болезнью мозп с атеротромботическим ишемическим инсультом и у их сибсов.

3. Сравнительный клинико-генетический анализ полиморфизма ген эндотелиалыюй NO-синтазы у больных с хронической ишемическо; болезнью мозга, с полушарным ишемическим инсультом и у их сибсов.

4. Анализ структурных особенностей гена р53 у больных хронической ишемической болезнью мозга, с полушарным ишемическш

гнсультом и у их сибсов, проведение клинико-генетичсских сопоставлений.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное сибсовое клииико-генетическое !сследованпе двух групп пациентов с атеротромботическим ишемичсским шеультом и длительной (не менее 7-10 лет) хронической ишемической юлезныо мозга без развития церебральных инфарктов. Сопоставлена [астота встречаемости основных факторов риска сосудистой патологии тзга у пациентов двух групп, у сибсов, а также у пробандов и сибсов. выявлено достоверное преобладание частоты артериальной гипертензии и ■ахарного диабета у больных с ишемическим инсультом по сравнению с их доровыми сносами. Анализ семейного фона выявил, что в семьях больных ишемическимн инсультами по сравнению с семьями больных с роничсской ишемической болезнью мозга достоверно чаще встречаются [нфаркты мозга.

Проведен анализ структурных особенностей генов ангиотензин-[ревращагощего фермента, ангиотензиногена, эндотелиальнойМ?-синтазы [ р53 у пациентов с различными клиническими формами ишемической

олезни мозга, а также у их сибсов. На основании молекулярно-генетических ! клинических сопоставлений показано, что полиморфизм ни одного из сследованных генов не является фактором, определяющим клинический ариант течения ишемической болезни мозга (хроническая ишемнческая олезнь или инсульт), однако выявлены полиморфные варианты генов, оусловлнваюшпс развитие таких факторов риска цепсороваскуляпной атолопш, как стенозы магистральных артерий головы (полиморфный ариант D/D гена АПФ) и сахарный диабег (вариант 4а/4Ь гена ндотелиальной Л'О-синтазы). Выявлена взаимосвязь между олиморфизмом гена одного из маркеров апоптоза - белкар53 и размерами нфаркта мозга.

Практическое значение работы

Выявление генетических маркеров риска цереброваскулярных

аболевапий расширяет возможности первичной профилактики шемического инсульта, позволяет разработать новые подходы к испансеризации практически здоровых лип из групп риска с елеааправленным и комплексным их обследованием и превентивным ечением.

Изучение генетических основ повреждающего действия ишемии озволяет выявить новые мишени для лечения инсульта. Выявленная

взаимосвязь между полиморфизмом гена белкар53 и размерами инфаркта мозга доказывает перспективность использования нейропротскторов. реализующих свое действие через торможение процессов апоптоза и активацию синтеза нейротрофичсских факторов.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в клиническую практику неврологической клиники Российского государственного медицинского университета и неврологических отделений ГКБ № 20 г. Москвы.

Апробация работы

Официальная апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры функциональной и клинической неврологии с курсами нейрохирургии, лабораторной, функциональной и нейролучевой диагностики РГМУ и Лаборатории молекулярных основ генетики человека Института молекулярной генетики РАН.

Основные положения и результаты исследования доложены и обсуждены на совместных конференциях кафедры фундаментальной и клинической неврологии с курсами нейрохирургии, лабораторной, функциональной и нейролучевой диагностики РГМУ и Института Молекулярной генетики РАН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 134 страницах. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания общей характеристики больных и мстодое исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, включающегс 24 отечественных и 176 зарубежных источников. Работа иллюстрированг 17 таблицами и 15 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Общая характеристика больных и методов исследования

В основу работы положены результаты исследования 110 больных (славян из московской популяции) с ишемической болезнью головного мозга, поступивших в неврологическую клинику РГМУ (ГКБ № 20 г. Москвы) зг

;риод 1998 - 2001 гг, а также 119 их сибсов.

Все пациенты были разделены на две группы. В первую группу включили > больных (16 мужчин, 53 женщины; средний возраст 68,4+2,7 лет) с ¡ротидным атеротромботическим ишсмическим инсультом, а также 75 их ¡бсов (13 мужчин, 62 женщины; средний возраст 71,2+2,4 лет).

Во вторую группу были включены 41 больной (8 мужчин, 33 гнщины; средний возраст 71,5+4,3 лет) с хронической ишемической >лезныо мозга давностью не менее 7-10 лет, не имевших инсультов в гамнезе, в том числе "немых" (но данным МРТ головного мозга), а .кже 44 их сибса (10 мужчин, 34 женщины; средний возраст 73,4+3,8 -г)-

Методы исследования

1. Клинический метод

Для верификации диагноза использовали тщательное изучение щивидуального и семейного анамнеза у пробандов и сибсов. Исследовали (матический и неврологический статусы у пациентов и их сибсов по щепринятой методике.

Ишемичестсий характер инсульта подтверждался клиническими штериями, данными исследования спинно-мозговой жидкости (СМЖ), а .кже МРТ головного мозга.

Атеротромботический вариант развития инсульта устанавливался на :новании особенностей клиники развития заболевания, результатов ^следовании гсмопсологпп. уровня лпнидок коовп, данных рентгенографии удного отдела аорты, офтальмоскопии, улыразвуковойдопплерографии.

Давность хронической ишемической болезни мозга устанавливалась на :новашш сбора анамнеза, данных амбулаторных карт. Всем больным )оводили КТ или МРТ головного мозга для исключения "немых" (фарктов.

2. Составление и анализ родословных

У пациентов обеих групп тщательно собирали семейный анамнез, эставляли родословные по общепринятой методике. Путем анализа »дословных получали данные о частоте встречаемости в семьях сердечно-1судистой патологии (ИБС, инфаркт миокарда, артериальная гипертензия), :реброваскулярных заболеваний (инсульт, транзиторная ишемическая ака), эндокринных и обменных нарушений (ожирение, сахарный диабет).

3. Молекулярно-геиетичсские методы

Для генетического исследования у больных и их сибсов бралась кровь с добавлением ЭДТА в соотношении 1:10. Экстракция геномной ДНК производилась из лейкоцитов незамороженной крови по стандартной методике. Прямая ДНК-диагностика полиморфных сайтов осуществлялась путем амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) участков генов ангиотензин-превращающего фермента, ангиотензиногена, эвдотелиальной АФ-синтазы, р53 с последующей их обработкой эндонуклеазами и электрофорезом в агарозном геле.

4. Статистический анализ был выполнен на персональном компьютере - «Pentium - 2» с использованием пакета статистических программ STATISTIKA-5.0. Обработка материала включала применение непараметрических методов: F-тест Фишера, критерий х2> ранговая корреляция Спирмена.

Результаты собственных наблюдений и их обсуждения

1. Результаты клинико-генеалогического исследования больных.

Все 69 больных из первой группы поступили в клинику в течение первых трех суток с момента развития острого нарушения мозгового кровообращения. Среди пациентов в 33 (48%) наблюдениях имело место поражение левого, в 36 (52%) - правого полушария головного мозга.

Несмотря на проводимую терапию, включавшую сосудистые, антиагрегантные, гипотензивные препараты, нейропротекторы, ноотропные средства, лечение сопутствующих заболеваний, в 9 (13%) наблюдениях имел место летальный исход на 10 - 30 день заболевания. У 10 (14%) больных неврологическая симптоматика регрессировала практически полностью ("немой" инсульт). У 50 (72%) пациентов сохранялся различной степени выраженности неврологический дефект, у 28 (40%) из них оставшийся неврологический дефицит привел к ограничению возможности самообслуживания.

Под наблюдением находились три пары монозиготных близнецов. Интересно отметить, что у монозиготных близнецов из двух пар ишемический инсульт развился с интервалом в несколько месяцев.

Все больные из второй группы поступили в клинику по плановым путевкам из поликлиник с диагнозом хронической ишемической болезни мозга (дисциркуляторная энцефалопатия II-III стадий) давностью не менее 7-10 лет. У всех пациентов выявлено атеросклеротическое поражение

осудов, подтвержденное дополнительными методами исследования осмотр глазного дна, ультразвуковая допплерография, R-графия грудного одела аорты, уровень холестерина крови); Никто из пациентов этой группы re имел инсультов в анамнезе и у них не зарегистрировано "немых юстинсультных кист" при визуализирующих методах исследования (КТ [ли МРТ головного мозга). Лишь у трех сибсов из этой группы имел место анемический инсульт в анамнезе. Под наблюдением находились три пары аизненов (две монозиготных, одна дизиготиых). Близнецы из всех пар традали хронической ишсмической болезнью головного мозга.

Результаты сравнительного анализа встречаемости основных факторов щека цереброваскулярной патологии у пациентов из двух групп и их сибсов юказали, что у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом ;оетоверно чаще, по сравнению с пациентами с хронической ишемической юлезнью мозга, встречаются артериальная гипертензия (¿?=0,0001) и иперхолестеринемия (р=0,002). У сибсов больных с ишемическим шеультом, по сравнению с сибсами больных с хронической ишемической юлезныо мозга, достоверно чаще встречаются гиперхолестеринемия р=0,001), хотя практически никто из них не имел инсультов в анамнезе таблица 1).

Таблица 1

Частота встречаемости основных факторов риска цереброваскулярной патологии у пациентов и их сибсов

J руппм Артериальная Стенозы Сахарный Гинерхолес ИЬС

гипергензия МАГ диабет 11 типа теринсмия

Ьольные с инсультом, 62 27 29 37 50

л =69 (90%) (39%) (42%) (51%) (72,5%)

Больные с ДЭ,

п ~41 28 1! 11 12 28

(68%) (27%) (27%) (29%) (68%)

¿Ф) 13,291 2,736 1,954 9,188 0,385

(0,0001)* (0.098) (0,162) (0,002)* (0,535)

Сибсы больных с 57 22 17 32 47

ипсулыом, п =75 (76%) (29%) (23%) (37%) (63%)

Сносы больных с ДЭ,

п -44 13 9 *7 П 1 J 1

(64%) (29%) (20%) (16%) (70%)

/(р) 2,881 0,024 0,119 10,268 0,808

(0,090) (0,876) (0,731) (0,001)* (0,369)

Примечание: * - различия между группами достоверны (р<0,05)

Был проведен сравнительный анализ частоты встречаемое™ артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, сахарноп диабета, стенозов магистральных артерий головы и инфаркта миокард; между больными из двух групп и их сибсами. Получено достоверно! увеличение в группе больных частоты артериальной гипертензии (х*—3,891 /7=0,049) и сахарного диабета (х,2=5,339,р =0,021). Сравнение больных < хронической ишемической болезнью мозга с их сибсами не показал« статистически значимых различий.

Полученные данные подтверждают факт, что у подавляющей большинства больных с атеротромботическим ишемическим инсультом 1 развитии заболевания, наряду с фактором атеросклероза сосудов головногс мозга, принимала участие артериальная гипертензия, а также указывают на важную роль сахарного диабета в формировании ишемии головногс мозга.

2. Анализ семейного фона больных с различными формами ишемической болезни головного мозга

Были изучены особенности семейного фона больных из двух групг (таблица 2). Генеалогический анализ проведен в 110 семьях (2355 человек) в 69 семьях больных с каротндным ишемическим инсультом(1380 человек и в 41 семье больных с хронической ишемической болезнью головногс мозга (975 человек).

Подтверждена важная роль наследственных факторов в развитш ишемической болезни головного мозга. Частота инфарктов мозга в семья> больных с ишемическими инсультами была достоверно выше по сравнении: с семьями больных с хронической ишемической болезнью мозга (х^=80,971 р=0,0001).

Таблица 2

Семейный анамнез больных с ишемической болезнью головного мозга

Семьи Артериальная Инфаркт Сахарный Ишемический

гипертснзия миокарда диабег II типа инсульт

Больных с 938 364 580 386

инсультом, (68%) (26,4%) (42%) 28%

«=1380

Больных с ДЭ, 536 273 273 117

«=975 (55%) (28.2%) (12%)

Х*<Р> 40,663 0,683 0,040 80,971

(0,0001)* (0.409) (0,841) (0,0001)*

Примечание: * - различия между группами достоверны (р<0,05)

3. Клшшко-генетические исследования у больных с различными формами ишемической болезни мозга

3.1. Полиморфизм гена ангиотензнн-иревращающсго фермента

(АГ1Ф) у больных с ишемической болезнью головного мозга и их

сибсов

Исследовали инсерционно-делеционный полиморфизм (//О) в 16-м 1нтроне гена ангиотензин-иреврашающего фермента у пациентов из двух Т'УПП И ИХ сибсов, .г Л С' I ¡Г.к" миг. ЛЛЛеЛс:П И полиморфных ПЛрИЛНТОВ 1редставлено в таблице 3.

Анализ сопряженности с помощью критерия показал, что во всех -руппах преобладал гетерозиготный 1/В генотип (рис. 1), тоща как различий з распределении генотипов между группами больных, сносов, а также между Зольными п сносами мы не обнаружили (таблица 3).

Таблица 3

Распределение аллельных вариантов инссрционно -делеционного полиморфизма гена АПФ у больных с ишемичсским инсультом, хронической ишсмнчсской болезнью мозга и их сибсов

Группы больных Полиморфные варианты гена АПФ

1/1 I/D D/D I аллель Dаллель

Больные с ишемическим инсультом, п = 68 16 (23,5%) 33 (48,5%) 19 (27,9%) 65 (47,8%) 71 (52,5%)

Больные с ДЭ, п =40 11 (27,5%) 21 (52,5%) 8 (20%) 43 (54%) 37 (46,3%)

Г(Р) 0,105 (0,746) 0,320 (0,572) 1,343 (0,246) 0,500 (0,479) 0,500 (0,479)

Сибсы больных с ишемическим инсультом, « = 73 23 (31,5%) 36 (49,3%) 14 (19%) 82 (56%) 64 (43,8%)

Сибсы больных с ДЭ, п =44 11 (25%) 23 (52,2%) 10 (22,7%) 45 (51%) 43 (48,9%)

¿(р) 0,883 (0,347) 0,080 (0,777) 0,271 (0,602) 0,322 (0,571) 0,322 (0,571)

Рисунок 1

Распределение полиморфных вариантов гена АПФ у больных с ишемической болезнью мозга и их сибсов

60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00%

D/D

ч -ш шшт

I/D

0 Больные с ишемическим инсультом 0 Сибсы больных с ишемическим инсультом В Больные с ДЭ

Н Сибсы больных с ДЭ

*** -достоверность различий между частотой генотипов (/;<0,001) Под наблюдением находились 6 пар близнецов (4 монозиготных, 2 дизиготных) Интересно отметить, что у монозиготных близнецов из трех пар ишемический инсульт произошел с интервалом в несколько месяцев, при этом никто из них не имел D/D генотипа АПФ.

При анализе полиморфизма гена АПФ в зависимости от представленности основных факторов риска: уровня артериального

щвления, холестерина крови, наличия сахарного диабета II типа, [шемической болезни сердца, инфарктов миокарда в анамнезе не было толучепо статистически значимых различий в распределении ///, T/D, D/D юлиморфных вариантов между группами пациентов, а также между вольными и их сибсами (/>>0,05).

Изучение зависимости между инсерционно-делеционным юлиморфизмом гена АПФ и развитием гемодинамически значимых тенозов (более 70%) МАГ в исследованных группах пациентов показало, то в обеих группах достоверно чаще стенозы встречались у лиц с D/D-енотипом (х'?=Ю,043, />=0,002), тогда как различий в распределении юлиморфизма АИФ между группами не обнаружено. Аналогичные данные 1ыли получены при анализе распределения полиморфных вариантов гена 1ПФ у сибсов с гемодинамически значимыми стенозами МАГ (таблица 4).

Таблица 4

Распределение аллельных вариантов инсерционно — делециоииого полиморфизма гена АПФ у больных с ишемическим инсультом и хронической ишемической болезнью мозга в зависимости от выраженности стеноза МАГ

Группы больных Полиморфный вариант гена А11Ф

/'У I/D D/D

Больные с шпсмичсским инсультом п стенозом МАГ более 70%. я = 27 5 (19%) 8 (29%) 14 (52%)

Больные Д'З и стенозом МА1 более 70%, п - 11 2( 18%) 3 (27%) 6 (55%)

Г(Р) 0,0001 (1,000) 0,025 (0,875) 0,080 (0,777)

Сибсы больных с инсультом, имеющие ек*ноч МА!' бо/к-е 71)%., «-27 5(2?%) 7(32%) 10(45%)

Сибсы больных с ДЭ, имеющие стеноз МАГ более 70%, п= 11 2(15%) 4(31%) 7(54%)

г<р) 1,592(0,207) 0,0001(1,000) 1.280(0,258)

Больные с инсультом и стенозом МАГ менее 70%, п = 41 11 (27%) 25 (61%) 5 (12%)

Больные с ДЭ и стенозом МАГ менее 70%, л = 29 9(31%) 18(62%) 2 (7%)

¿(Р) 0,219(0,640) 0,0001(1,000) 0,549(0,459)

Отсутствие достоверных различий в распределении полиморфных вариантов АПФ между группами позволило выделить пациентов и сибсов со стенозами МАГ в отдельную подгруппу. У пациентов с гемодинамически значимыми стенозами (всего 38 человек) частота встречаемости D/D генотипа составила 53% (20 человек), I/D генотип - 29% (11 человек), 1/1 генотип - 18% (7 человек). У сибсов с гемодинамически значимыми стенозами (всего 35 человек) частота встречаемости D/D генотипа составила 49% (17 человек), I/D генотипа - 31% (11 человек), ///генотипа - 20% (7 человек). В группах пациентов и сибсов с гемодинамически значимыми стенозами МАГ доля D/D генотипа оказалась достоверно выше (х2= 10,934, р=0,0001) по сравнению с другими генотипами АПФ (рис. 2).

Рисунок 2

Частота встречаемости стенозов МАГ у больных и сибсов с различными полиморфными вариантами гена АПФ

D/D I/D 1/1

*** -достоверность различий между частотой генотипов (р<0,001) Мы провели сравнение частоты встречаемости полиморфных вариантов гена АПФ между исследуемыми группами и данными по Московской популяции в целом. В группах больных с ишемическим инсультом О/В-генотип встречался достоверно реже по сравнению с контролем из старшей возрастной группы (х2=9,269,/>=0,002).

Отсутствие различий распределения полиморфных вариантов гена ангиотензин-превращающего фермента, определяющего степень выраженности атеросклеротического поражения сосудов, между группами больных с острым ишемическим инсультом и хронической ишемической болезнью мозга, а также максимальная частота этого полиморфизма в группе "долгожителей" (без инсульта в анамнеза) свидетельствуют о том, что атеросклероз сам по себе является лишь фактором, предуготовливающим

льнейшее развитие патологического процесса. Выбор же органа-мишени, также пути, по которому будет развиваться патологический процесс, роятно, определяется иными факторами.

3.2. Полиморфизм гена АТГ у больных с игаемической болезнью головного мозга и их снбов

Исследовали миссенс-мутацию {М235Т-замена метиошша на треонин >35 кодоне) гена апгиотензиногена в двух группах больных и их сибсов 1блица 5).

Таблица 5

Распределение М/Т — аллельных вариантов гена АТГ у больных с иемическим инсультом, хронической ишемической болезнью мозга

и их сибсов

Группы больных Полиморфный вариант гена АТГ

Т/Т м/м М/Т 7" аллель Mаллель

Больные с ишемическим инсультом. п - 67 9 (13,4%) 14 (21%) 44 (65,6%) 62 (46,3%) 72 (53,7%)

Больные с ДЭ, п -41 4 (9,8%) 8 (19,5%) 29 (70,7%) 37 (45%) 45 (55%)

Г (р) 0,070 (0,79!) 0,005 (0,942) 0,111 (0,739) 0,001 (0.981) 0,001 (0,981 )

Сибсы больных с ишемическим инсультом, и = 71 4 (5,6%) 21 (29,6%) 46 (64,8%) 54 (38%) 88 (62%)

Сносы больных с ДЭ, п = 4? 4 (<->%) 6 (14%) 33 (77%) 41 (48%) 45 (52%)

X (Р) 0,133 (0,715) 2,804 (0,094) 1,281 (0,258) 1,673 (0,196) 1,673 (0,196)

Достоверных различий в частоте встречаемости аллелей между группами

льных получено не было ff=0,001 ;/?=0.981).

Анализ распределения полиморфных вариантов АТГ с помощью итерия у/показал, что достоверно в двух группах больных преобладали герозиготные М/Т генотипы, достоверных различий в распределении ютипов между группами, а также между больными и их сибсами не лучено (рис. 3).

При анализе распределения М/Т полиморфизма гена АТГ в зависимости

от уровня артериального давления, холестерина крови, наличия сахарно1 диабета II типа, ишемической болезни сердца, инфарктов миокарда анамнезе и стенозов магистральных артерий головы во всех группа достоверно преобладал гетерозиготный М/Т- генотип, что отражало общ» закономерности распределения генотипов в группах.

Рисунок

Распределение полиморфных вариантов гена АТГу больных с ишемической болезнью мозга и их сибсов

80%

60%

40%

20%

L

м/м

М/Т

т/т

ЕЗ Больные с ишемическим инсультом ОСибсы больных с ишемическим инсультом В Больные сДЭ

ЙСибсы больных с ДЭ

*** -достоверностьразличий между частотой генотипов (р<0,001) Результаты исследования показывают, что М/Т полиморфизм геи ангиотензиногена не является значимым фактором риска ишемическо болезни мозга, а также фактором, определяющим клинический вариант с течения.

3.3. Полиморфизм гена эндотелиальной АгО-синтазы (eNOS) у больных с ишемической болезнью головного мозга и их сибсов

Особый интерес представляло изучение мшшеателлита eNÜS4b/4a reí эндотелиальной Aü-синтазы - фермента, непосредственно определяюще1 функцию эндотелия и состояние микроциркуляторного русла.

В группах пациентов и сибсов достоверно преобладал 4Ь аллель (/>=0,00: и 4b/4b генотип (р=0,001) (рис. 4), не отличаясь при этом от частот встречаемости в основной популяции (К. Miahara, 1994). Различий распределении генотипов между группами пациентов и между больными их сибсами обнаружено не было.

15

Рисунок 4

Распределение полиморфных вариантов гена еЛЮБ у больных с ишемической болезнью мозга и их

сибсов

80% ; 70%-60% -5 50%-: 40%-30%] 20%-] 10%) 0%^

4а/4а

4Ь/4а

4Ь/4Ь

ВБольные с I

ишемическим : инсультом

НСибсы больных' с ишемическим : инсультом '

□ Больные с ДЭ |

ШСибсы больных • с ДЭ !

*** -достоверность различий между частотой генотипов (р<0,001) При анализе полиморфизма гена еИОБ в зависимости от уровня ериального давления, холестерина крови, наличия ишемической болезни

дна, стенозов магистральных артерий головы, инфарктов миокарда в мнезе в группах больных и сибсов преобладал 4Ь/4Ь генотип, отражая иую картину распределения генотипов в фуппах. Анализ распределения 4Ь полиморфизма гена сМОБ у больных сахарным диабетом II типа :азал, что, несмотря на фоновое преобладание в группах генотипа 4Ь/4Ь, ацнентов с сахсфным диабетом доминирует генотип 4п/4Ъ (у; — 1 ^,п94: 1,0001), несущий 4а аллель, ассоциированный, по результатам ряда работ, тском развития атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта жарда (таблица 6).

диалогичные данные были получены при анализе сносов, страдающих арным диабетом. Различии в распределении полиморфизма сА'05 между ппами, а также между больными и сибсами обнаружено не было.

Таблицг

Распределение аллельных вариантов гена eNOS у больных с ишемическим инсультом, хронической ишемической болезнью моз и сахарным диабетом, а также их сибсов, страдающих сахарным

диабетом

Группы больных ' Полиморфный вариант гена еЛГ05

4а/4а 4а/4Ь 4Ь/4Ь

Больные с ишемическим инсультом и сахарным диабетом, п = 29 1 (3%) 18 (63%) 10 (34%)

Больные с ДЭ и сахарным диабетом, я = 11 1 (9%) 7 (64%) 3 (27%)

¿<Р) 2,216(0,137) 0,0001 (1,000) 0,849 (0,357)

Сибсы больных с ишемическим инсультом и сахарным диабетом, и= 17 1 (6%) 12 (70%) 4 (24%)

Сибсы больных с ДЭ и сахарным диабетом, « = 29 1 (11%) 5 (56%) 3 (33%)

¿(р) 1,029(0,310) 0,111(0,739) 1,570(0,210)

Отсутствие достоверных различий в распределении генотипов меж группами позволило объединить пациентов и сибсов с сахарным диабет в отдельную подгруппу. В группах пациентов и сибсов с сахарным диабет доля 4а/4Ъ генотипа оказалась достоверно выше (уЛ-18,045, р—0,0001) сравнению с другими генотипами еАЮБ (рис. 5).

РисуНО!

ЛППйпйПаиоа пплмклпгЬииу гэлпияитпо грия еЫО^ у

..........—ст"— ..—-----.с..« — ^

больных и сибсов с сахарным диабетом II типа

70% 60% 50% 40% 30% 20% ( 10%] о%:

□ Больные диабетом

□ Сибсы с диабетом \;

4а/4а

4а/4Ь

4Ь/4Ь

*** -достоверность различий между частотой генотипов (/><0,001)

Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что ишсателлит 4а/4Ь гена еИОБ не является фактором, определяющим звитие атеротромботического ншемического инсульта. Однако сительство генотипа 4а/4Ъ может принимать участие в формировании парного диабета, как одного из факторов риска, лежащего в основе кроангиопатии и цереброваскулярной недостаточности.

3.4. Полиморфизм гена р53 у больных с ишемической болезнью головного мозга н их снбсов Исследовали полиморфизм генар53 (точковую замену в сайте узнавания "триктазьт) (таблица 7).

Таблица 7

Распределение аллельных вариантов генар53 у больных с иемическим инсультом, хронической ишемической болезнью мозга

и их си б сов

Группы больных _Полиморфные варианты гена р53

1 о/о от Я'К О аллель Л' аллель

Больные е ишечическим 13 34 20 60 74

инсультом, (19%) (51%) (30%) (45%) (55%)

» = 67

Больные с ДЭ, 9 19 13 37 45

и -41 (22%) (46%) (32%) (45%) (55%)

Г(р) 0.005 0,061 0,0001 0,008 0,008

<т\ п 1И (и. 1 /л (0.990) (0.927) (0,927)

Сносы больных с 14 34 23 62 80

ишемическим инсультом, (20%) (48%) (32%) (44%) (56%)

п -71

Сибсы больных с ДЭ, 10 16 16 36 48

п -42 (24%) (38%) (38%) (43%) (57%)

Х~<Р> 0.076 0,667 0,169 идюш 0,0001

(0,783) (0,414) (0,681) (0,983) (0,983)

Статистический анализ результатов показал отсутствие достоверных шичий в частоте встречаемости О и Я аллелей между группами больных,

ноке между больными и их сносами (р>0,05). Во всех ¡руппах преобладал ерозиготпый О/К генотип, тогда как различий в распределении генотипов «лу группами больных, сносов, а также между больными и сибсами чаружено не было (рис. 6).

РиСуНО!-

Распределение полиморфных вариантов гена р53 у пациентов с ишемической болезнью мозга

О/О

О/Я

я/и

ЕБольные с инсультом □ Сибсы больных

с инсультом И Больные с ДЭ

й Сибсы больных с ДЭ

Был проведен анализ зависимости объема очага ишемическо повреждения от полиморфного варианта гена р53 в группе больных инсультом. Все пациенты в зависимости от объема очага ишемическо инсульта были разделены на 3 группы: с малыми размерами очага - до мм3, с очагами среднего размера - от 40 до 90 мм3, с большими размера! очага - более 90 мм3.

Статистический анализ показал, что имеется тесная зависимость меж генотипом и объемом инфаркта. У больных с малым размером очага (до мм3) достоверно чаще встречался О/О полиморфный вариант, чем О/Я и Я варианты гена/>53 (/2= 12,288;/)=0,0001). У больных с размерами очага 40 до 90 мм3, напротив, О/О полиморфный вариант встречался достовер реже, чем О/Я Сг=17,869;/>=0,0001) и Ш (^=6,572;/7=0,01) варианты ге р53. У больных с большими размерами очага инфаркта О/О генотип определялся, тогда как доминировал гетерозиготный О/Я генот] (^=102,312; /7=0,0001) над Я/Я полиморфным вариантом (рис. 7).

Зависимость объема ишемического очага от полиморфного варианта гена р53

80%/'

I

60% г

40% >'/

0% г

до 40 мм

40-90 мм

>90 мм

19

Рисунок 7

1И0/0!

'□о/я

П гЯ/Н

*** - достоверность различий между частотой генотипов Полученные данные доказывают участие процессов апоптоза в эмировании очага ишемического повреждения. Размеры ишемического га достоверно зависят от полиморфного варианта и, следовательно, от

национальной активности гена-регулятора апоптоза -р53, являющегося невым маркером повреждения, поскольку его экспрессия индуцируется рушением ДНК под влиянием оксидантного стресса и, в свою очередь, 1сняст транскрипцию ряда генов, включая Ьах. Кроме того, участие щеесов апоп тоза в формировании инфаркта мозга доказывает важность юльзования в комплексе тспапнн ишемического инсульта ропротекторов, реализующих свое действие через торможение процессов птоза и активацию синтеза нейротрофнческих факторов у больных с моральной ишемией.

ВЫВОДЫ

1. Комплексное клинико-генеалогическое исследование больных каротидным атеротромботическим ишемическим инсультом и хроническо ишемической болезнью мозга установило: достоверное преобладани частоты встречаемости артериальной гипертензии (х7=13,291,р=0,0001) гиперхолестеринемии (%2=9,188, />=0,002) у больных с ишемически] инсультом по сравнению с пациентами с хронической ишемическо болезнью мозга.

2. Комплексное сибсовое клинико-генетическое исследование 11 больных с различными формами ишемической болезни мозга и 119 и сибсов установило: достоверное преобладание частоты артериально гипертензии (х2=3,891,/7=0,049) и сахарного диабета II типа (y/=5,33i р-0,021) среди больных с атеротромботическим ишемическим инсульто: по сравнению с их здоровыми сибсами; достоверное увеличение частот] гиперхолестеринемии (%г=10,268, /7=0,001) среди сибсов больных ишемическим инсультом по сравнению с сибсами больных с хроническо ишемической болезнью мозга.

3. Анализ семейного фона показал достоверное увеличение частот] инфарктов мозга в семьях больных с ишемическими инсультами п сравнению с семьями больных с хронической ишемической болезнью мозг (Хг=80,971, р=0,0001).

4. Анализ инсерционно-делеционного полиморфизма ген ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) установил, что D/D геноти является фактором, достоверно связанным с развитием одного из факторо риска инсульта - гемодинамически-значимых атеросклеротических стенозо МАГ, но не сцеплен с клиническим вариантом ишемической болезн головного мозга (ишемический инсульт или хроническая церебральна ишемия). Напротив, показано достоверное преобладание доли D/D генотип у "долгожителей", не имеющих инсульта в анамнезе, по сравнению больными, перенесшими атеротромботический ишемический инсуль (Хг=9,269, /7=0,002).

5. Анализ полиморфных сайтов М235Т гена ангиотензиногена н выявил какой либо корреляции с клиническими вариантами течени ишемической болезни головного мозга, а также с наличием основны факторов риска цереброваскулярной патологии.

6. Анализ распространенности 4а/4Ь минисателлита ген эндотелиальной МЗ-синтазьг {eNOS) в исследуемых группах установил, чт генотип 4а/4Ь может участвовать в формировании сахарного диабета II тиг как одного из факторов риска, лежащего в основе развития микроанпюпати

как результат, цереброваскулярной недостаточности. В то же время, шморфизм гена еМОЗ не является достоверным фактором риска развития емического инсульта.

7. На основании молекулярно-генетических и МРТ-морфометрических гоставлений выявлена взаимосвязь между полиморфизмом гена р53 — юго из маркеров тканевого повреждения по механизму апоптоза и мерами очага церебрального инфаркта. Установлена сценленность О/О отипа с малыми размерами очага инфаркта, О/Я генотипа-с обширным емическим поражением головного мозга, что подтверждает участие щессов программированной клеточной гибели в формировании очага см1псского повреждения и доказывает перспективность использования ¡ропротекторов, реализующих свое действие через торможение процессов ¡птоза и активацию синтеза нейротрофичсских факторов в комплексе генсивной терапии игпемического инсульта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Рекомендуется проводить регулярную диспансеризацию целенаправленную профилактику инсульта среди лиц, имеющ наследственную предрасположенность к факторам риска ишемическс инсульта.

2. Целесообразно включить молекулярно-генетическую диагностику 1 полиморфизма гена АПФ в комплекс обследования больных ишемической болезнью мозга (дисциркуляторной энцефалопатией) р выявления группы риска по развитию атеросклеротических стеноз МАГ и своевременной превентивной терапии ишемического инсуль

3. Рекомендуется использовать нейропротекторы, блокирующие процес апоптоза и стимулирующие синтез защитных нейротрофическ факторов, в комплексе интенсивной терапии ишемического инсулы

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скворцова В.И., Лескова H.H., Кольцова Е.А. Значение следственной предрасположенности в развитии полушарного 1емического инсульта. Материалы научно практической конференции в 'язани 16- 17.09.1999г.

2. Кольцова Е.А., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский I1.A., ндратьева Е.А. Инсерционно-делсционный полиморфизм гена гнотензин-превращающсго фермента у больных с ишсмическнм сультом. Юбилейная научная коференция с международным участием, священная 140-летию кафедры душевных болезней военно-медицинской 1демии "Современные подходы к диагностике и лечению нервных и гхичсских заболеваний" С. Петербург. 2000; 302.

3. Скворцова В.И., Лимборская С.А., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., ндратьева Е.А. Ассоциация полиморфизма гена АПФ и полушарного [емического инсульта. Проблемы инсульта: перспективные идеи и новые пения. Материалы Главного военного клинического госпиталя. 2000; 172 74.

4. Скворцова В.И., Лимборская CA., Сломинский П.А., Кольцова Е.А., ндратьева Е.А. Полиморфизма гена АПФ у больных ишсмической тезнью мозга. Актуальные вопросы современной генетики. Сборник ^чных трудов (доклады и материалы научно-практической конференции клинической генетике, проведенной 18 января 2001 г. в связи с ¡0-летием

М Wlpbl f\.il! Uli 1 Ltl^i 1 НЛП I. 1УИЛ.ЛМ. 1 , 1WVJ — Iii.

5. Кольцова E.A., Сломинский 1 I.A., Кондратьева Е.А. Лимборская С.А., вориова В.И. Полиморфизм гена АПФ и ишемнческая болезнь мозга, териалы VIII Всероссийского съезда неврологов. Казань 21 -24.05.2001;

к

(). Скворцова В.И.. Кольцова h.A., Лимборская С.А., Сломинский H.A., ндратьева Е.А. Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего рмента у больных ишемической болезнью мозга. Журн. Неврол. и 1хиатр. им С.С. Корсакова. Инсульт, 2001; вып. 3:9-11.

7. В.И. Скворцова, Е.А. Кольцова, А.Ю. Боцина. Генетика ишемического ;улыа Жури. Неврол. н психиатр. и.м С.С. Корсакова. Инсульт, 2001; вып. .0- 18.

8. В. И. Скворцова, С. А. Лимборская, П. А. Сломинский, Е. А. Кольцова, [. Тупицина, А.Ю. Боцина. Изучение роли миссенс-мутации (М235Т) гена -иотензиногена (АТГ) в развитии ишемической болезни мозга, лекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2002; 5: 12- 16.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - ангиотензин-превращающий фермент

АТГ - ангиотензиноген

ДЭ - дисциркуляггорная энцефалопатия

МАГ - магистральные артерии головы

МРТ - магнитно-резонансная томография

ПКГ - программированная клеточная гибель

СМЖ - спинномозговая жидкость

УЗДГ - ультразвуковая допплерография

cNOS - эндотслиальная ЛгО-синтаза

I/D - инсерционно-делеционный полиморфизм