Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль слияния клеток при репаративной регенерации коры головного мозга

На правах рукописи

КОНСТАНТИНОВА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

РОЛЬ СЛИЯНИЯ КЛЕТОК ПРИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА (ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ, МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ И ЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОПТ ?П1П

Москва - 2010

004611257

Работа выполнена в лаборатории регуляции репаративных процессов УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, лауреат государственной премии СССР доктор биологических наук

Пальцын Александр Александрович Романова Галина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН

Кошелев Владимир Борисович Боголепова Ирина Николаевна

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов

Защита состоится 2010 года в IV ч. на заседании

Диссертационного совета Д 001.003.01 при УРАМН НИИ общей патологии патофизиологии РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института по адресу 125315, 1 Москва, ул. Балтийская, д. 8

Автореферат разослан _ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Скуратовская Лариса Николаевн

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По представлению Европейской базы данных ЗДВ (HFA-DB) (Европейское региональное бюро Всемирной организации здравоохранения), психические расстройства, болезни нервной системы и органов чувств составляли в РФ в 2006 г - 1514 человек на 100000 населения. Инсульт в РФ занимает второе место среди причин смертности и первое место среди причин инвалидизации. Ежегодно им заболевает свыше 450 тыс. чел. (Верещагина Н.В. и др., 2002; Гусев Е.И. и др, 2003; Яхно H.H., Виленский B.C., 2005).

Инсульт и другие цереброваскулярные болезни - ведущая причина заболеваемости и смертности в США (March B.J., 2009), среди причин смертности в других индустриально развитых странах инсульт занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Green A.R., 2008).

В последние годы значительно расширились исследования по регенерации нервной системы и после открытия на рубеже XX и XXI вв. нейральных стволовых клеток в головном мозге (Reynolds В.А., et al., 1993; Weiss S., et al., 1996; Morshead C.M., et al., 1998; Weiss S, van der Kooy D., 1998; Johansson C.B., et al., 1999; Gage F.H., 2000; Kornack D.R., Rakic P., 2001) и костном мозге (Brazelton T.R., et al., 2000; Mezey E., et al., 2000; Blau H.M., et al., 2001) существенно повысился интерес к изучению стволовых клеток. Эти исследования по регенерации нервной системы преимущественно осуществляются как поиск доказательств нейроногенеза в постнатальном периоде. На эту тему опубликовано много работ, описывающих обнаружение тех или иных признаков пролиферации нейронов у взрослых млекопитающих. Роль стволовых клеток и нейральных, в частности, стали рассматривать в однообразном только клеточно-заместительном плане. При упрощенном понимании роли стволовых клеток, казалось, что это открытие ведет к немедленному решению многих медицинских проблем. Все больше стало появляться работ по применению стволовых клеток с лечебной целью в эксперименте и клинике. Мы упомянем только работы неврологической направленности (Скворцова В.Н. и др., 2008; Rossi F.M. et al., 2000; Nakatomi H. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002). Немало сообщений и опровергающих эти работы. Некоторые из них оказались терапевтически не эффективны. Но даже если отмечалось лечебное действие, его без специального подтверждения, нельзя объяснять непременно нейроногенезом. Это мнение выражали и сами авторы обсуждаемых работ (Скворцова В.Н. и др., 2008; Teng Y. et al., 2002). Такие результаты, на наш взгляд, являются серьезным мотивом для тщательного всестороннего изучения феномена - нейральная стволовая клетка.

В начале XXI-ого века феномен слияния привлек исследовательский интерес тем, что изменил представления о трансдифференцировке, трансдетерминации или пластичности не только нейральных, но и прочих стволовых клеток. Под

трансдифференцировкой и пластичностью подразумевается способность стволов клеток взрослого организма превращаться в дефинитивные клетки друге зародышевого листка. Такая трактовка воспринималась с доверием до 2002-2003 ] когда сразу в нескольких публикациях (ОизБош Е. й а1., 2002; Тегаёа N. е* а1., 20 е! а1., 2002; А1уагег-Оо1ас1о М. й а1., 2003; УаБзПороиЬз в. ег а1„ 2003; Wг X. й а1., 2003) было заявлено, что слияние стволовой клетки с дифференцировав клеткой различных тканей - событие не редкое и увеличивающееся при поврежден данной ткани. По этой причине «классическое» доказательство пластичности присутствие в дифференцированной клетке маркера стволовой - может иметь и дру: объяснение. Стволовая клетка не превратилась в дефинитивную, создав при эт самостоятельно маркеры дифференцировки, а просто слилась с дифференцированной в результате получила уже готовые маркеры, не пройдя соответствующего гг развития и собственной выработки этих маркеров.

Вышеперечисленные теоретические фундаментальные исследования и медив социальная значимость проблемы определяют актуальность исследования механизм регенерации нервной системы и, в первую очередь, нейронов коры. Знания в эт области расширят возможности профилактических и лечебных мероприятий д коррекции и восстановления нарушенных функций ЦНС при нейродегенеративн! заболеваниях.

Цель исследования: определить происходят ли слияния региональных клет в префронтальной коре головного мозга (в норме и при создании ишемического оча: и каково значение этих слияний для репаративной регенерации.

Задачи исследования:

1. При ишемическом повреждении префронтальной коры головного мо; крыс изучить выраженность слияний в поврежденной и неповрежденной зов префронтальной коры.

2. Разработать методики определения слившихся клеток (дикарион< гетерокарионов) и проверить достоверность слияния методами электронной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с различными флуорохромны зондами, а также иммуноцитохимическим методом.

3. Выяснить регенераторное значение слияния клеток коры пут количественного определения числа слияний при нарушении и восстановлен функции префронтальной зоны коры.

4. Провести авторадиографическое исследование с целью определ! жизнеспособность слившихся и одноядерных клеток и способность клеток коры пролиферации.

5. Определить биологическую роль появления в нейроне второго ядра.

Научная новизна. Впервые экспериментально доказан факт слияния региональных клеток в префронтальной зоне коры головного мозга и образование двуядерных клеток. При слиянии двух нейронов возникали дикарионы. При слиянии нейрона с олигодендроцитом образовывались гетерокарионы. При образовании гетерокариона происходило перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейрональном направлении с повышением дисперсности хроматина и с последующим преобразованием ядра олигодендроцита в ядро нейрона. Взаимосвязь структуры и функции указывает на то, что перепрограммированное ядро олигодендроцита функционировало как ядро нейрона. Слившийся с олигодендроцитом нейрон получает второй набор генов от олигодендроцита, становится тетраплоидным или, по крайней мере, гипердиплоидным и может выполнять повышенную, скорее всего, удвоенную функциональную нагрузку.

Получены данные, указывающие, что наряду с описанной Д.С. Саркисовым внутриклеточной регенерацией путем самостоятельной гиперплазии ультраструктур, нейрон может также внутриклеточно регенерировать, получая эти структуры извне от слившегося с ним ядра олигодендроцита. Приобретенный второй комплект генов может обеспечить увеличение числа любых необходимых структур. Морфологические данные подтверждаются результатами функциональных исследований, показавшими, что улучшение условно-рефлекторной деятельности животных происходит вместе с увеличением числа слияний в префронтальной коре. Показано, что функциональные возможности стволовых нейральных клеток шире, чем было известно ранее. Если раньше роль нейральных и других стволовых клеток представлялась, как только заместительная, то наши данные свидетельствуют, что стволовая клетка через прогенитора, например, олигодендроцита, может не замещать утраченную клетку, а отдавать сохранившейся клетке свое ядро и обеспечивать, таким образом, своеобразную внутриклеточную пролиферацию генов.

Впервые обнаружено, что иногда вслед за объединением цитоплазмы происходило и объединение ядер. В таком случае двуядерный дикарион превращался в одноядерный синкарион. В единственном ядре синкариона содержание ДНК повышается и может доходить до восьми гаплоидных наборов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа фундаментальная. Полученные знания могут быть использованы для оценки скорости и полноты регенерации при действии различных повреждающих факторов и терапевтических агентов. Накопление знаний в области регенерации ЦНС в дальнейшем может дать возможность рационально влиять на частоту слияния клеток и тем направлять в желаемое для врача русло ход физиологической и репаративной регенерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нейроны префронтальной зоны коры (поля Рг1, Рг2) могут сливаться олигоденроцитами.

2. Улучшение условно-рефлекторной деятельности и статистичеа достоверное увеличение числа дикарионов в префронтальной коре указывают I регенеративное значение слияния клеток.

3. В случае слияния образуется двуядерный гипердиплоидный нейрон дикарион. При слиянии нейрона и олигодендроцита, ядро последнего подвергает перепрограммированию в нейрональном направлении с резким усиление дисперсности хроматина, размера ядра и, в конце концов, становится неотличимым I ядра нейрона. Следовательно, нейрональный дикарион образуется через стади гетерокариона. Принцип единства структуры и функции подсказывает, ч' завершившее перепрограммирование бывшее ядро олигодендроцита начина экспрессировать нейрональные гены.

4. Появление дикарионов и образование синкарионов свидетельствуют повышении плоидности нейронов коры в онтогенезе.

5. Слияние олигодендроцитов (прогениторных клеток) с нейронами последующим внутриклеточным перепрограммированием ядер первых по образ! вторых, показывает, что биология стволовых клеток не ограничивается наращивани! числа клеток при развитии и восстановлением их количества при регенерации. Э особенно целесообразно в поддержании гомеостаза ЦНС. Стволовая клетка образует новой дефинитивной клетки. Сложная задача компенсации повреждения и. утраты нейрона, отличающегося индивидуализированным багажом памяти, решает организмом при помощи стволовой клетки путем создания второго ядра поврежденной клетке. Второе ядро обеспечивает гиперплазию ультраструкт} материализующих память.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на: V конференц; молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки прогресс клинической медицины» в форме устного доклада (2008 г, Москв; Заседании Ученого совета НИИОПП РАМН совместно с Бюро ОБМН РАМ посвященном 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, академи АМН СССР и РАМН Доната Семеновича Саркисова (2009 г, Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи из них 3 в БЭБи] 1 тезисы в Вестнике РАМН.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и спис литературы. Работа изложена на 142 страницах компьютерного текста, содержит

таблицы и 70 рисунков. Библиографический указатель включает 34 отечественных и 119 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на 50 нелинейных крысах-самцах весом 200-250 г. Животные выращены и содержались в виварии НИИОПП РАМН при свободном доступе к воде и корму и при 12-и часовом световом режиме (с 7 до 19 ч.). Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 267 от 19.06.03 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации».

Исследование двигательной активности крыс в автоматизированном «открытом поле» проводили до операции, на 7-ые, 35-ые и 56-ые сутки после ишемии префронтальной коры мозга, вызванной фототромбозом сосудов.

Выработку условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) осуществляли по методике (Буреш Я. и др., 1991), оценивая латентный период (ЛП) перехода крысы из светлого в темный отсек челночной камеры Биотест РК-5201. Сохранение рефлекса проверяли на 7, 35 и 56-е сутки после ишемического повреждения префронтальной зоны коры.

Двусторонний фокальный ншемнческий очаг в префронтальной зоне (поля Frl и Fr2) коры головного мозга крыс создавали по стереотаксическому атласу (Paxinos G., Watson С., 1998) методом фотоиндуцируемого тромбоза сосудов коры головного мозга (Watson B.D. et al., 1985).

Для светового н электронно-микроскопического исследования готовили срезы (1 мкм), полученные на 7-е, 35-е и 57-е сутки после двустороннего фототромбоза, после стандартной обработки материала для эпоксидных смол. Окрашивали толуидиновым синим, крезиловым фиолетовым и двухцветной окраской спиртовыми растворами метиленового синего и основного фуксина, и просматривали в световом микроскопе ВХ51 Olympus, снабженным фотокамерой Color View II для регистрации полученных изображений, и программой компьютерного анализа Cell F. Ультратонкие срезы (70нм) контрастировали стабилизированными растворами уранилацетата и лимоннокислого свинца, просматривали и регистрировали изображения в электронном микроскопе Leo 912АВ Omega.

Радиоавтографический анализ в световом микроскопе. Исследования проводились на 7- сутки после ишемического инсульта. Крысу под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг) декапитировали, извлекали мозг и вырезали для исследования кусочки мозга, непосредственно прилегавшего к зоне некроза с захватом некротизированной ткани. Кусочки немедленно помещали в теплую (t=+37°C)

питательную среду Игла MEM объемом - 5 мл с введенным в нее радиоактивнь: изотопом (тимидином-Н3 или уридином-Н3) в концентрации 2 мкКи/мл для тимидш и 10 мкКи/мл для уридина. Промежуток времени между декапитацией и помещение ткани в среду был не более 5 минут. Далее проводили инкубацию, стандартну обработку материала для световой и электронной микроскопии и экспонирова! срезы на стеклах под слоем эмульсии для авторадиографии Amersham ЕМ-1 в течен] 2-х недель. Срезы окрашивали толуидиновым синим, затем perucTpupoBaj изображения.

Для гистологического исследования на различных сроках пос. ишемического поражения просматривали срезы префронтальной зоны кор заключенные в парафин и окрашенные по Нисслю крезиловым фиолетовым i стандартной методике.

Цитофотометрическое исследование. Депарафинированные срезы толщин< 20 мкм окрашивали цитохимическим флуоресцентным красителем Ethidium bromii (Sigma). Для исследования использовали фильтр (510-550нм длина воль возбуждения, 590нм длина волны испускания). Программа Cell F дает возможное делать снимки в режиме растянутого фокусного расстояния - Extended Focal Imagii (EFI). Для фотометрии отбирали ядра в срезе, которые резко изображены в EFI, э значит, что такие ядра полностью вошли в EFI изображение. При помои инструментов программы Cell F мы обводили периметр ядер нейронов и компьют измерял суммарную цветовую яркость обведенных ядер.

Конфокальная микроскопия. Исследования проводили на срезах моз интактных крыс в инвертированном микроскопе Nikon Eclipse ТЕ 2000-U конфокальным модулем Cl. Объектив с масляной иммерсией Plan Fluor 40.0x/l.j Возбуждение флуоресценции - лазеры с длинами волн 488нм и 543нм. Бы. испытаны 2 сочетания ядерных и мембранных флуорохромов: 1) Ethidium bromi (Sigma) для выявления ядер с эмиссией в красном участке спектра и FM 1-431 (Invitrogen) для выявления мембран с эмиссией в зеленом участке спектра; SybrGreen (Syntol) для выявления ядер с эмиссией в зеленом участке спектра и I (Invitrogen) для выявления мембран с эмиссией в красном участке спектра. Бы. построены гистограммы по двум каналам на интересующих нас участках и результатам компьютерного анализа можно с точностью определят истинные слияш Иммуноцитохимическое исследование. Срезы мозга (префронтальная кор интактных крыс блокировали в 1% растворе бычьего сывороточного альбумш окрашивали первичными антителами mouse anti-neuronal nuclei (NeuN) (Chemicon) концентрации 1:500 разведенные в antibody diluent with background reduci components (Dako), через сутки срезы помещали во вторичные антитела Alexa Flu 488 goat anti-mouse (Invitrogen) в концентрации 1:500. После отмывки на срезы капа

раствор красителя DAPI (Sigma) в концентрации 1:1000, разведенного в ФБ на 10 минут при комнатной температуре с защитой от света, подсушивали и заключали в среду предотвращающую выгорание Fluoromount (Sigma). Для контроля окраски использовали такой же протокол, но без первичных антител. Готовые препараты просматривали под микроскопом Olympus ВХ51 при помощи двух флуоресцентных фильтров (кубов) для DAPI (соотношение возбуждение/испускание - 358/461нм) и для Alexa Fluor 488 (соотношение возбуждение/испускание - 495/519нм).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы BIOSTAT с использованием критериев Стьюдента и непараметрического критерия Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. ДОКАЗАТЕЛЬСТВА СЛИЯНИЯ КЛЕТОК В КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА

При исследовании полутонких (толщина - 1мкм) срезов, приготовленных из блоков, залитых в эпоксидную смолу по стандартной методике, практически не возникают ошибки, обусловленные перекрыванием структур. Определение по положению клеточной мембраны невозможно - она не видна, т.к. слишком тонка (7-9 нм) для визуализации в эпоксидных срезах под световым микроскопом. Задача определить наблюдаем мы слияние или лишь похожее на него расположение клеток, сводилась к выяснению в одной ли цитоплазме расположены «подозреваемые» ядра. Задача непростая, учитывая плохую окрашиваемость эпоксидных срезов вообще и срезов мозга, в частности. Преодолеть эту трудность мы пытались созданием двух оригинальных методов окрашивания нервной ткани, залитой в эпоксидную смолу. Нам удалось значительно повысить четкость выделения цитоплазмы, но нередко при подсчете числа дикарионов мы не были полностью уверены, что видим слияние и решение приходилось принимать по такому принципу: этот случай больше похож на истинное слияние, чем на псевдослияние и, чтобы не совершить большей ошибки я отношу его к слиянию. Несомненно, при этом допускались ошибки. Их старались уменьшить стандартизацией критериев, которыми руководствовались и «слепым» анализом. Несмотря на указанные недостатки, исследование полутонких срезов мы избрали как метод количественного анализа нашего материала. Он позволял изучать достаточно большие по объему выборки материала (сотни слияний).

Исследование электронно-микроскопических срезов. Электронная микроскопия, конечно, при условии качественно приготовленного препарата, дает в руки исследователя оба главных ориентира, по которым можно отличить слияние от похожего на него расположения клеток - границу цитоплазмы и клеточную мембрану. На электронограмме (цветная вставка 1, рис. I) показан дикарион 2-х нейронов, отчетливо видны граница цитоплазмы, а также сохранившийся фрагмент клеточной мембраны (отмечен стрелками), расположенный между нейронами, но разделяющий

их не полностью по всей протяженности их соприкосновения, а лишь на некоторой ( части. Главным объектом наших исследований было слияние нейрона олигодендроцитом (цветная вставка 1, рис. 2). Также электронная микроскош позволила обнаружить редкие случаи слияний олигодендроцитов друг с другом.

Исследование в конфокальном микроскопе. Все исследования конфокальном микроскопе проводились на интактных крысах. Луч лазера вызыва! быстрое выгорание флуоресцентно окрашенных препаратов. По этой причт конфокальный микроскоп, по-видимому, непригоден для серьезных количественнь исследований. Задача, по существу, сводилась к следующему: средствал конфокальной микроскопии (сканирование, 3-х мерное изображение, возможное рассмотреть препарат в разных плоскостях и со всех сторон и, наконе компьютерный анализ построением гистограмм) установить имеется ли между ядраи предполагаемого дикариона материал, окрашенный мембранным флуорохромо Положительный ответ (есть мембранный флуорохром) означает, что рассматривали две отдельные одноядерные клетки; отрицательный ответ свидетельствует < истинном слиянии. Наша работа - это первый опыт применения конфокальш микроскопии для изучения слияния нейронов. Следовательно, вначале нужно бы; убедиться, что конфокальный микроскоп пригоден для таких исследований. С эт( целью мы начали испытания с отрицательного контроля, т.е. такого расположен] клеток, которое очень похоже на слияние (цветная вставка 1, рис.3): ядра нейрон* почти соприкасаются друг с другом, но все же при сканировании между ними замет: узкая красная полоска мембранного материала (А,Б). Рисунок (В) показывает облас препарата, исследованную путем построения гистограммы, в которой особ внимание обращается на отрезок между сиреневой и зеленой вертикалями на уров прямой х=315. Гистограмма яркости по зеленому и красному каналам (Г) показыва между сиреневой и зеленой вертикалями высокий красный пик (помечен стрелко соответствующий мембранной структуре. Итог: конфокальный микроскоп позвол определить по нескольким параметрам, что исследуемый образец не слияние, а лш похожее на него расположение клеток и доказал таким образом свою пригодность,; крайней мере, для уверенного исключения сомнительных случаев. Полное слиян нейрона с олигодендроцитом. (цветная вставка 1, рис. 4). Рисунок (А) показыва исследуемый участок префронтальной коры, на котором пунктирным квадрат! выделена область, представленная на рисунке (Б) крупно, а стрелкой отмеч анализируемый дикарион. На рисунке (Б) ось х=65, а также сиреневая и зелен вертикали указывают участок тесного расположения ядер, исследованный пут построения гистограмм по зеленому и красному каналам. Гистограммы ( свидетельствуют, что в изучаемом участке нет зеленого пика, т. е. мембранн структуры (зеленая кривая, направленная вниз отражает общий фоновый зелен]

цвет, содержащийся в препарате). Итак, конфокальный микроскоп дает возможность уверенно определять истинные слияния (дикарионы). Начало слияния нейрона и олигодендроцита. В электронограммах мы наблюдали начальные этапы слияния, когда наряду со слившимися областями цитоплазмы двух клеток ещё остаются в зоне соединения фрагменты плазматической мембраны. Такие случаи могут быть выявлены и конфокальным микроскопом с точной дифференциацией целой мембраны от фрагмента. На рисунках 5 (А,Б) (цветная вставка 2, рисунок 5) показаны 2 кадра, которые фиксируют различные моменты последовательного прохождения фокальной плоскости препарата по оси Z, изображающие начало слияния нейрона и олигодендроцита. Фрагмент мембраны, разделяющей эти клетки, виден лишь в (Б), а на (А) мембрана отсутствует. Это подтверждает и построение гистограмм. На рисунке (В) гистограмма рисунка (А) без красного пика, а на рисунке (Г) гистограммы рисунка (Б) с присутствием красного пика, показывающим наличие мембраны. Приведенные выше примеры, на наш взгляд достаточны для иллюстрации того факта, что исследования с применением конфокального микроскопа доказали реальность слияний нейронов коры. Считаем необходимым отметить два факта: 1) Исследование слияний в конфокальном микроскопе очень трудоемко и не может быть применено для анализа достаточных по величине выборок; 2) Небольшая по объему работа с конфокальным микроскопом показала, что приобретенный нами опыт исследования полутонких срезов, позволяет с малым числом ошибок находить истинные дикарионы при первичном обзорном

поиске. Учитывая это можно заключить, что ошибок в количественном анализе нашего эксперимента было допущено немного.

Образование синкарионов. Описаны случаи, когда тенденция к объединению клеток оказывается выраженной значительнее и вслед за слиянием двух цитоплазм и образованием дикариона происходит слияние ядер (Spees J.L. et al., 2003; Ogle B.M. et al., 2005). В результате дикарион превращается в одноядерный синкарион. Содержание ДНК в синкарионе должно быть удвоенным - тетраплоидным. Поэтому мы решили проверить, есть ли в нашем материале синкарионы. Обнаружение синкариона является доказательством слияния клеток. Кора мозга - не печень, в ней не бывает эндомитоза. Следовательно, единственный путь образования гиперплоидного ядра идет через слияние и раннюю стадию гиперплоидии -тетрагоюидный дикарион. Поскольку слияния мы находили как при репаративной, так и при физиологической регенерации, мы решили исследовать присутствие синкарионов в префронтальной коре интактной крысы (цветная вставка 2, рис. 6). Флуоресцентная цитофотометрия показала, что синкарионы у интактных крыс встречаются, хотя и редко, но по величинам суммарной цветовой яркости ядер, представленных на этом рисунке, можно сделать заключение, что демонстрируемый

синкарион октаплоидный (п=8) (ошибка нашего метода, конечно, не превышав величину диплоидного набора). На рисунке суммарная цветовая яркость трех малы ядер в среднем равна 247 ед., а большого (стрелка) 983 ед.

Доказательства слияния нейронов и олигодендроцитов полученные пр иммуноцитофотометрическом исследовании. Иммуноцитофотометрическс исследование было предпринято для всесторонней по возможности разработк проблемы перепрограммирования (о чем написано далее) Были обнаружен немногочисленные олигодендроциты, которые при окраске DAPI имели ядро характерным для олигодендроцита строением хроматина, но в то же время давал явную окраску на специфический нейрональный белок NeuN. Поскольку рядом таким олигодендроцитом всегда обнаруживалось тело нейрона с характерно иммунореактивностью и на DAPI и на NeuN, мы считаем, что появление таю олигодендроцитов объясняется их слиянием с нейроном и перемещением в ядр олигодендроцита белка, специфичного для ядер зрелых нейронов.

2. О СООТВЕТСТВИИ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТ КРЫС СТАТИСТИЧЕСКИ ДОСТОВЕРНОМУ УВЕЛИЧЕНИЮ ЧИСЛ СЛИЯНИЙ КЛЕТОК В ПРЕФРОНТАЛЬНОЙ ЗОНЕ КОРЫ ГОЛОВНОГ МОЗГА

Исследование двигательной активности и сохранения УРПИ

Передние префронтальные отделы неокортекса вместе с гиппокампом игран ключевую роль в интегративной деятельности мозга, связанной с обучением памятью (Лурия А.Р., 2000, Kolb В., 1984). Одной из экспериментальных моделе которая наиболее полно воспроизводит клиническую картину фокально1 ишемического инфаркта мозга, является фотохимический тромбоз кровеноснь сосудов коры. В работах Г.А. Романовой с соавт. было показано, что фотохимичеа индуцируемый двусторонний тромбоз кровеносных сосудов в префронтальнс области коры головного мозга крыс приводит к формированию ишемическо] инфаркта в области повреждения и потере выработанного до ишемии УРП (Романова Г.А. и др., 1998, Романова Г.А., 2003). До начала выработки УРП двигательную активность крыс тестировали в "открытом поле" i автоматизированной установке РОДЭО-1, оценивая горизонтальную двигательну активность животных за 5 мин наблюдения. У беспородных 2-х месячных кры самцов вырабатывали УРПИ ранее описанным методом. Обученными считю животных, не уходивших в темный отсек челночной камеры в течение 300 Обученных животных делили на подопытную и контрольную группы. Двусторонш фокальный ишемический инфаркт префронтальной коры головного мозга крыс - по. Frl и Fr2 согласно стереотаксическому атласу (Paxinos G., Watson С., 1998) создава: методом фотоиндуцируемого тромбоза (Watson B.D., Dietrich W.D., Busto R., 198.'

Плоскость XY YZ

' Щ^' -» - • , V ■ ♦

xz' . .'

т ..... j 1 Ii"

сЗ. Отрицательный контроль слияния. А. 3 -мерная реконструкция препарата. Префронтальная кора. Ядра . йронов тесно прилежат друг к другу, но между ними сохраняется ЦПМ. Тонкая полоса мембранного материала рашена в красный цвет как и нейрошшь вокруг ядер (окраска флуоресцен тным зондом Dil); Б. Конфокальная верная сканирующая микроскопия (КЛСМ). микрофотография плоскостей XY, XZ YZ стрелкой помечена мбранная структура по оси Z; В. микрофотография препарата, стрелкой помечена прямая х=315; Г. :тограммы яркости по зеленому и красному каналам по оси х=315.

пел. :?лек1рииш рамми дикариона ^два ядра ::йрона в объединившейся цитоплазме). Участок :хранной ЦПМ отмечен стрелками (ув. хЮООО).

Рис.2. Гетерокарион, образующийся с лиянием нейрона (внизу) и олигодендроцита (слева вверху). Между клетками (указано стрелками) нет ЦПМ. Цитоплазмы соединены (ув.

:.4. Полное слияние нейрона и олигодендроцита. А. КЛСМ, микрофотография препарата префронтальной >ы, исследуемая область обозначена пунктирной линией. Флуоресцентные зонды ИМ 1-43РХ (мембранный), !г (ядра); Б. микрофотография анализируемой области, прямая х=65. Флуоресцентные зонды ИМ 1 -43РХ лбранный), Е1Вг (ядра); В. гистограммы яркости по зеленому и красному каналам по осих=-65.

Рис.5. Начало слияния нейрона и олигодендроцита. А. KJ1CM, последовательное прохождение по оси Z плоскостей препарата. Начало слияния - между ядрами нейрона (темно зеленым) и олигодендроцита (ярко зеленого цвета) нет мем бранного материала (красный цвет). Флуоресцентные зонды Dil (мембранный), Sybr Green (ядра); Б. между ядрами нейрона и олигодендроцита появился остаток ЦПМ (красный цвет); В. гистограммы яркости по зеленому и красному каналам. Отсутствие красного пика на участке ограниченном вертикальными прямыми указывает на то, что в анализируемой области нет мембранного материала; Г. гистограммы. Красный пик указывает на то, что мембранный материал присутствует в анализируемой зоне, ограниченной вертикальными линиями.

■

ЖIЩ

Рис.6. Флуоресцентная цитофотометрия связывания с ДНК специфического красителя - этидия бромида. Суммарная цветовая яркость трех малых ядер равна 247 ед., а большого

и

13

■Т*

■ ' Ш

% 1 А

Рис.7. А. Синтез ДНК в макрофаге (включение Н -Т). Зона некроза, 7-е сутки. Полутонкий срез (1 мкм). окраска крезиловым фиолетовым прочным (ув. хЮОО); Б. То же место, что и на А. но съемка в отраженном свете. Зерна серебра, над ядром макрофага, отражая падающий свет, светятся (ув. хЮОО).

Рис.8. А. Синтез РНК в макрофагах (включение Н'-У). Зона некроза, 7-е сутки. Полутонкий срез (1 мкм), окраска крезиловым фиолетовым прочным (ув. хбОО): Б. То же место, что и на А, но съемка в отраженном свете. Зерна серебра, над ядрами макрофагов, отражая падающий свет, светятся (ув. хбОО).

Рис.9. А. Синтез РНК в нейронах (включение Н'-У). Зона пенумбры, 7-е сутки после фототромбоза, грубые деструктивные изменения глии и нейропиля, некоторые нейроны полностью утратили цитоплазму. Полутонкий

срез (1 мкм), окраска крезиловым фиолетовым прочным (истинное ув. х 1 ООО); Б. То же место, что и на А, но съемка в отраженном свете. Свечение зерен серебра над ядрами нейронов (истинное ув. х 1 ООО).

Рис.10. А. Синтез РНК (включение Н'-У) в ядрах псевдояикариона (в центре). Зона пенумбры, 7-е сутки. Полутонкий срез (1 мкм). окраска крезиловым фиолетовым прочным (истинное ув. хЮОО); Б. То же место, что и на А, но съемка в отраженном свете (истинное ув.х 1000).

Рис. 11. Электронограммы псевдодикариоиов двух нейронов. 7-е сутки после фототромбоза, зона пенумбры. А. Эухроматин лизирован, гетерохроматин в виде хлопьев, выраженный лизис цитоплазматических структур. Стрелками отмечен участок отсутствия ЦПМ; Б. Между нейрональными ядрами «образования» отсутствует ЦПМ, ядерная оболочка нижнего ядра частично лизирована и в нем особенно заметен лизис эухроматина (ув. х 10000).

Рис. 15. Электронограмма дикарионов. А. Слияние (мембраны между ядрами нет) олигодендроиита и нейрона (ув. х18000); Б. Дикарион на заключительной стадии перепрограммирования. Нижнее ядро - ядро нейрона «хозяина», верхнее - ядро бывшего олигодендроиита перепрограммированное в нейрональное (ув. х25000).

А Б В Г

Рис. 12. КЛСМ, 3-х мерная реконструкция объема препарата. Флуоресцентные зонды Dil (мембранный), SybrGreen (ядра) а - ярко окрашенное ядро олигодендроиита на переднем плане; б. в - кадры поворота препарата вокруг своей оси слева направо: г ядро олигодендроиита относительно ядра нейрона на заднем плане.

Рис.13.

Электронограмма дикариона (нейрон и олигодеидроцит), ЦПМ частично лизирована (напротив ядра олигодендроиита - сверху). В последнем нуклеоплазма занята дисперсным хроматином, хромоцентры невелики (ув. х 18000).

Рис.14. Слияние двух олигодендроцитов с нейроном.

Разница в строении ядер олигодендроцитов указывает на то, что в момент фиксации препарата они находились на разных этапах

перепрограммирования. Полутонкий срез (1 мкм), окраска крезил о в ым фиолетовым прочным (истинное ув. х 1000).

Рис.16. Иммуноцитохимическая окраска. А.

Окраска красителем DAP1, префронтальная кора. В центре крупное ядро нейрона с дисперсным хроматином и ядро меньшего размера - ядро олигодепдроцпта с конденсированным хроматином. EFI (истинное ув. хЮОО): Б. Окраска красителем Alexa Fluor 488. префронтальная кора. То же место, но под фильтром для Alcxa Fluor 488. В центре две метки маркера зрелых нейронов NeuN, олигодеидроцит иммунореактивен на NeuN. EFI (истинное ув. х 1000).

Рис. 17. Иммуноцитохимическая окраска. А.

Окраска красителем DAP1, префронтальная кора. В центре крупное ядро нейрона с дисперсным хроматином и ядро меньшего размера - ядро олигодендроиита с конденсированным хроматином. EF1 (истинное ув, хЮОО); Б. Окраска красителем Alexa Fluor 488, префронтальная кора. То же место, но под фильтром для Alexa Fluor 488. В центре две метки маркера зрелых нейронов NeuN, олигодеидроцит

А

Б

Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением введения красителя Bengal Rose. Проверку сохранения выработанного рефлекса проводили на 7-е, 35-е и 56-е сутки после фототромбоза (в каждой группе п = 5 и п = 3 на 35-ые сутки).

Все животные контрольной группы на раннем сроке (7-е сутки) соответствовали критерию обученности, ЛП УРПИ был более 300с. На 56-е сутки полное сохранение выработанного УРПИ отмечено у одной крысы контрольной группы, ЛП УРПИ был равен 300с, и у 2-х обнаружен памятный след рефлекса (ЛП УРПИ 105с и 212с). У двух крыс не сохранился выработанный ранее рефлекс (ЛП УРПИ 40с и 25с).

Тот факт, что часть контрольных животных забывала на 56-е сутки выработанный УРПИ осложнял оценку функционального состояния подопытных животных. Сокращение

ЛП в опыте в равной мере могло быть связано как с неполным восстановлением после инсульта, так и с утратой полученных до инсульта навыков. Чтобы внести большую определенность в результаты функциональных исследований на 56-е сутки решили испытать действие однократного подкрепления УРПИ в обеих группах у всех животных с ЛП УРПИ меньше 300с (по 4 крысы в каждой группе). В контроле после подкрепления ЛП УРПИ повысился у 3-х животных до максимальной величины -300с, а у последней крысы проявился в виде памятного следа (150с). Крысы подопытной группы на 7-е сутки забывали УРПИ, на 56- е сутки полное сохранение УРПИ отмечено лишь у одной крысы из этой группы, а у другой - памятный след (120с). Из 4-х крыс опытной группы, получивших однократное подкрепление, максимальный ЛП УРПИ обнаружен у 3-х, а у 4-ой крысы ЛП УРПИ - 106с.

Результаты проверки ЛП УРПИ, полученные после однократного подкрепления рефлекса на 56-е сутки, указывают на то, что крысы способны вырабатывать рефлекс на этом сроке после ишемического поражения. Тогда как в ранее проведенной работе Г.А. Романовой с соавт. показано, что крысы не способны вырабатывать УРПИ на ранние сроки после фототромбоза (Романова Г.А. и др., 2002).

Таким образом, функциональное исследование свидетельствует о том, что на 56-е сутки после очагового ишемического повреждения префронтальной коры когнитивные способности (память или способность к обучению) улучшаются и становятся равными показателям контрольной группы. Средние показатели этого эксперимента отображены в таблице №1.

Таблица 1

Средние показатели двигательной активности и ЛП УРПИу крыс с двусторонним ишемическим повреждением префронтальной коры головного мозга и ложнооперированных животных.

СРОКИ ОПЫТ КОНТРОЛЬ

ИССЛЕДОВАНИЯ Двигательная ЛП УРПИ Двигательная ЛП

активность активность УРПИ

До фототромбоза 207,4 300 186,6 300

7-е сутки после 140,4 41,6* 150,6 300

операции

56-е сутки после 132 92 148,4 136,4

операции 261,2 - 270

57-е сутки после

операции и

однократного

подкрепления

Представлены средние значения по группам, п=5. Звездочкой отмечен достоверное отличие (вероятность ошибки р<0,05) по сравнению с дооперационны уровнем, с показателями опыта на 57-е сутки после однократного подкрепления и ложнооперированными животными.

Морфологическое исследование обнаружило у животных с сохранившимс рефлексом статистически достоверное увеличение числа слияний клеток префронтальной зоне коры головного мозга (табл. 3 см. ниже).

На связь восстановления рефлекса с увеличением числа слияний указывают и только вышеприведенные данные по группам животных. О том же свидетельствует сопоставление ЛП УРПИ с частотой слияний у каждой отдельной крысы. П стандартной схеме был проведен эксперимент с более коротким сроком наблюдени после ишемического поражения префронтальной коры - 35 суток. Результат показан таблице 2.

Таблица 2

ЛП УРПИ и средняя площадь среза, содержащая одно слияние в мкм2

№ животного ЛП УРПИ до фототромбоза ЛП УРПИ на 7-е сутки ЛП УРПИ на 35-е сутки Sep на 1 дикарион по всему исследованному участку коры (мкм2)

1 300 2 33 1.375.869

2 300 31 160 1.095.235

3 300 19 300 459.598

Из таблицы 2 видно, что с увеличением частоты слияний (уменьшение площади среза на одно слияние) увеличивается и величина ЛП УРПИ.

Морфологическое и цитохимическое исследование проводили на 7-е, 35-е и 57-е сутки. На 7-е сутки область инсульта состояла из центрального участка некроза, окружающей его зоны, так называемой полутени - пенумбры, на периферии области инсульта пенумбра без резкой границы переходила в нормальную ткань коры. В участке некроза нервная ткань была бесструктурна, имела вид плотного или мелкозернистого детрита. Гемостаз в участке некроза и пенумбре выражался заполнением просвета сосудов эритроцитами, чаще расположенными свободно с узкими промежутками, иногда «спрессованными» в плотные агрегаты. В участке некроза часто встречались эритроциты, расположенные вне сосудистой стенки. В некротизированной ткани и на границе с пенумброй обнаруживали большое число макрофагов с признаками интенсивной функции. Это были крупные клетки с многочисленными большими фагосомами. Радиоавтографическое исследование показало, что макрофаги интенсивно размножались (цветная вставка 3, рис.7) и синтезировали РНК (цветная вставка 3, рис.8). Встречались слияния макрофагов. Часто наблюдали следующее явление: в расположенном среди детрита в утратившем цитоплазму ядре макрофага совершается синтез ДНК - все стадии синтетического процесса. В зоне некроза на ранние сроки совершаются интенсивные процессы восстановления. Эти процессы совершаются макрофагами и выражаются в устранении детрита, расчистке пространства, занятого мертвым материалом для развертывания в нем восстановительных процессов и заполнения живыми клетками. По этой причине зона некроза на позднем сроке уменьшалась, а иногда не обнаруживалась. На 57-е сутки в области инсульта находили пролиферат, занятый соединительнотканными и глиальными клетками.

В пенумбре регенераторные процессы уже развивались в нервных клетках, имевших существенные деструктивные изменения. Дегенеративные изменения нейронов не подавляли а, возможно, стимулировали синтез РНК в них. По крайней

мере, мы можем представить доказательства высокого уровня синтеза РНК поврежденных нейронах (цветная вставка 3, рис.9). Глиоциты с резко выраженным дегенеративными изменениями синтезировали не только РНК, но и ДНК.

Первые находки, похожие на слияния, были обнаружены в пенумбре. В это зоне с выраженными деструктивными изменениями встречались образования л общим очертаниям похожие на трехъядерную (трикарион) или двухъядерну] (дикарион) клетку, получающуюся в результате слияния. По значительны повреждениям структур окружающей ткани, малому числу, а, порой, и отсутствш органелл в цитоплазме «образования», оно представляется не результатом слияни нейронов или нейрона и глиоцита, а случайно созданной процессом деструкци полостью с двумя ядрами. Этот псевдодикарион ещё не слияние, но уже регенераци: что доказывается радиоавтографом (цветная вставка 3, рис.10). Рисунок 1 убедительно доказывает, что в разрушенной полости (вообще без цитоплазматически ультраструктур с пустыми пространствами, занятыми, по-видимому, отечно жидкостью) оба ядра нейронов синтезируют РНК, а значит они жизнеспособны на 7-сутки эксперимента. Электронно-микроскопическое исследование обнаруживало дикарионы (псевдодикарионы), созданные, скорее всего, не слиянием, а деструкцие тканей (цветная вставка 3, puc.l I).

У нас нет достаточных данных для однозначной трактовки жизнеспособное! этих образований и соответственно их значения в регенерации. На основании одног лишь структурного исследования может создаться впечатление, что псевдодикарион нежизнеспособны, но синтез РНК в них доказывает, что они были живы, по крайне мере, в момент фиксации.

Для выяснения регенераторного значения слияния клеток нам необходимо был сопоставить функциональные изменения со слияниями, и для этого найти какой-т способ количественного выражения последних. Чтобы выразить результат количественно, определяли под микроскопом подсчетом при увеличении хЮОО числ слияний в срезе и при помощи программы для анализа изображения Cell F вычислял площадь среза. Разделив последнюю цифру на первую получаем среднюю площа/: среза на одно слияние (удельная плотность слияний в мкм2). Понятно, что пр выбранном методе определения плотности слияний, получаемые нами величинь занижены сравнительно с истинным числом слияний на анализируемой площади. М обнаруживаем дикарионы только в том случае, когда в плоскость среза попадают об ядра, и не замечаем дикариона, срезанного по одному ядру. Результат количественного анализа эксперимента приведены в таблице 3. Статистическг оценка проводилась по критерию Вилкоксона (Урбах В.Ю., 1964). Таблица показывает, что к 57-м суткам эксперимента происходит статистически достовернс повышение удельной плотности слияний как в опыте, так и в контроле сравнительно

7-и сутками. Здесь речь идет об истинных слияниях, поскольку на этом сроке псевдодикарионы не встречаются. Следовательно, как физиологическая регенерация (контроль), хотя нельзя полностью исключать воздействия ложной операции, так и репаративная (опыт) морфологически выражаются увеличением числа дикарионов в коре. В опыте плотность слияний была выше, чем в контроле, хотя различие не достигло статистически значимой величины. Обнаруженная на отдаленном сроке (57 суток) после ишемического повреждения префронтальной коры способность животных к восстановлению выработанного до ишемии рефлекса морфологически выразилась достоверным увеличением плотности слияний клеток сравнительно с тем периодом (7 суток), когда рефлекс был утрачен. О том же свидетельствует способность вырабатывать рефлекс на 57-е сутки после фототромбоза, тогда как на 11-е сутки после операции выработать рефлекс не удается (Романова Г.А. и др., 2002). Этот факт дает нам основание сделать вывод, что одним из механизмов регенерация нейронов префронтальной коры после её ишемического повреждения может быть слияние может быть слияние клеток - образование дикарионов.

Таблица 3

Средняя площадь среза (Sep), на которой находится 1 дикарион в ранний и поздний сроки после ишемического повреждения.

Обозначения I группа II группа

7 суток после инсульта, рефлекс утрачен 57 суток после инсульта, рефлекс частично восстановлен

опыт контроль опыт контроль

Число животных (п) 5 3 5 5

Число исследованных блоков 20 23 26 22

Sep на 1 дикарион по всему исследованному участку коры 982872мкм2 937749мкм2 81389мкм2 113920мкм2

Sep на 1 дикарион в периинфарктной зоне (пенумбре) 146971мкм2

Статистически достоверны (р<0,01): 1)большая частота слияний в периинфаркт-ной зоне (пенумбре) сравнительно с остальными участками коры в опыте и контроле через 7 суток после инсульта; 2)болыиая частота слияний в опыте и контроле через 57 суток сравнительно с частотой слияний в опыте и контроле через 7 суток после инсульта.

3. ПЕРЕПРОГРАММИРОВАНИЕ

Демонстрацию примеров из нашего материала начинаем с препарат полученного в конфокальном микроскопе. В отличие от плоских картин срезо конфокальный микроскоп дает возможность рассмотреть перепрограммируемое ядр и ядро, по образцу которого происходит перепрограммирование, объемно со все сторон и в движении. На рисунках (цветная вставка 4, рис.12) изображен начальны момент слияния олигодендроцита с нейроном. Во всех фазах вращения препарата i мониторе компьютера, во всех 4-х представленных картинках видно, что слияние у» осуществилось и между ядрами нет мембранных структур. Однако, ядра рези различаются по строению хроматина. В ядре нейрона дисперсность хромата? настолько высока, что ядро кажется полупрозрачным. Ядро олигодендроцита плотнс с гиперконденсированным хроматином, непрозрачно, намного меньше ядра нейрон Из-за высокой концентрации ДНК ядро олигодендроцита гораздо ярче окрашеь флуорохромом (Sybr Green), чем ядро нейрона. Все показанное и сказаннс представляет нам большую разницу структуры ядер в момент слияния перед начало перепрограммирования.

Ранний этап этого процесса демонстрируется рисунком (цветная вставка рис.13). Нейрон и олигодендроцит фиксированы в начальный момент слияния. С этом свидетельствуют еще не лизированные фрагменты клеточной оболочки. Хотя f этом рисунке лишь начало слияния, уже достаточно отчетливо проявляете начинающееся перепрограммирование слившегося олигодендроцита. Это пок несомненно, ядро олигодендроцита. И, в то же время, в нем заметны изменеш морфологии, сближающие его с ядром нейрона. Хроматин ядра не такой черный началась деконденсация хроматина, хромоцентры мельче. Самое заметное и самс «пронейрональное» изменение - появление обширных пространств в ядре, занять дисперсным хроматином. До начала перепрограммирования в ядре олигодендроцитов основная масса хроматина конденсирована, дисперсно! хроматина мало и значительные пространства нуклеоплазмы не содержат хроматш вообще. Дисперсность хроматина в ядре олигодендроцита ещё грубее, чем в нейрон поэтому он кажется темнее (контроль - в этом же рисунке), но движение структурнь изменений в нейрональном направлении, несомненно.

На следующем рисунке (цветная вставка 4, рис.14) виден нейрон, с которы слились два олигодендроцита. Слияние их произошло явно не одновременно. Ядр нижнего олигодендроцита, слившегося с нейроном, очевидно, раньше верхнего, уя прошло начальные этапы по пути перепрограммирования. Оно по строению гораз/ ближе к строению ядра нейрона, нежели ядро верхнего олигодендроцита, еще ? изменившегося по сравнению с ядрами несливающихся олигодендроцитов.

Для электронно-микроскопической иллюстрации заключительной стадии перепрограммирования мы демонстрируем 2 рисунка (цветная вставка 4, рис.15 А,Б) олигодендроцит (сверху) слился с нейроном, имеющим извилистую ядерную мембрану и тонкодисперстный хроматин (Д). Ядро олигодендроцита значительно изменилось, сравнительно с обычными ядрами этих клеток. Слой гетерохроматина этого ядра сравнительно тонкий, расположен по ядерной мембране и в виде хромоцентра посредине ядра. Все свободное от гетерохроматина пространство ядра занято дисперстным хроматином. Следовательно, есть достаточные основания считать, что ядро олигодендроцита (А) прошло больший путь морфологической перестройки в направлении ядра нейрона и имеет с ядром нейрона большее сходство, чем ядро с рисунка (13). Верхнее ядро имеет гладкую мембрану и более крупнозернистый дисперсный хроматин, от этого нуклеоплазма кажется темнее (цветная вставка 4, рис.15 Б). Нижнее ядро - с изрезанной ядерной мембраной и тонкодиспергированным хроматином имеет, светлую нуклеоплазму. Ядра с гладкой и извитой мембраной примерно одинаково часто встречаются в одноядерных нейронах, но их совмещение в дикарионе указывает, что дикарион образовался сравнительно недавно и ядра ещё не успели стать совершенно идентичными, что наблюдается, например, в двуядерных гепатоцитах. Морфологическое различие ядер позволяет понять историю образования этого дикариона. Нижнее - ядро старого нейрона «хозяина», с которым слился некогда олигодендроцит. К моменту фиксации препарата ядро олигодендроцита полностью перепрограммировалось и стало неотличимо от ядер нейронов вообще, но от ядра нейрона-хозяина некоторые отличия остались.

Важнейший момент перепрограммирования - внутриклеточная перестройка ядра олигодендроцита в ядро нейрона. Мы регистрировали морфологическую идентичность перепрограммированного ядра с ядром нейрона, но такое изменение структуры в результате перепрограммирования закономерно сочетается с соответствующим (нейрональным) изменением функции. Мы провели иммуноцитохимическое исследование на присутствие двух наиболее показательных с нашей точки зрения, антител: ОАР1 и ЫеиК ОАР1 метит все ядра, количественно связываясь с ДНК и хорошо отражая структуру хроматина, благодаря чему можно, хотя и не абсолютно безупречно определять вид представленной ядром клетки. ИеиЫ - самый популярный, самый специфичный маркер нейронов. Функционирует, как считается, только в зрелых нейронах.

Срезы вначале просматривали с фильтром для БАР1. Фотографировали близко расположенные друг к другу пары: нейрон-олигодендроцит (судя по структуре ядер). Затем рассматривали эти пары с фильтром для КеиЫ. Чаще всего это были рядом расположенные клетки, может быть и дикарионы, но определенно сказать об этом было невозможно, поскольку олигодендроцит под фильтром для ЫеиЫ «выглядит»

пустым пространством. В нескольких случаях вторая клетка пары, со строение хроматина явно более грубым, чем у нейрона проявляла в разной степей выраженную иммунореактивность на NeuN. На рисунке (цветная вставка 4, рис. 16) центре кадра снятого с фильтром DAPI (А) типичное круглое, крупное с дисперсны хроматином ядро нейрона. Под ним гораздо меньшее по величине и с ярки конденсированным хроматином ядро олигодендроцита. На том же участке срез снятым с фильтром для NeuN, представляется следующая картина (В). На рисунке (1 олигодендроцит не исчез, как исчезают под этим фильтром все олигодендроцитЕ Олигодендроцит остался вполне заметным на том же месте, вплотную примыкая нейрону. А заметен он благодаря удивительной особенности - он том иммунореактивен на NeuN, хотя, конечно, в гораздо меньшей степени, чем нейрон нг ним. Более правдоподобным нам кажется следующее объяснение - олигодендровд слился с нейроном. И, хотя он находится в самом начале процес( перепрограммирования, в его ядро проникло некоторое количество NeuN и дат вполне заметную реакцию со специфическим антителом. Это позволяет сделать д! важных вывода: 1) Проникновение NeuN в олигодендроцит служит ещё одни доказательством реальности слияния клеток; 2) NeuN, попав в ядро лишь начинающе перепрограммироваться, не меняется в нем структурно (иммунология, может быт самый чувствительный метод определения структурных изменений), находит в не подходящие условия для экспрессии.

На рисунке (цветная вставка 4, рис.17) один и тот же участок среза, снятый разными фильтрами как на предыдущих рисунках. Рисунок (А) снят с фильтром DAP В центре кадра на небольшом расстоянии друг от друга типичный по строени хроматина круглый нейрон, а ниже и чуть правее почти такой же величин олигодендроцит с заметно большей дисперсностью хроматина, чем на рисунке (16А И по величине ядра и по строению хроматина олигодендроцит на рисунке (17j прошел больший путь перепрограммирования, чем олигодендроцит на рисунке (16А Рисунок (17Б), снятый с фильтром для NeuN, показывает, что большему сходсте хроматина олигодендроцита на рисунке (16А) с хроматином нейрона соответствует значительно большее содержание в нем NeuN при съемке его в соответствующе части спектра, представленной на рисунке (17Ь'). Олигодендроцит на рисунке (I7i практически не отличается по иммунореактивности от нейрона. Следовательн можно констатировать, что с углублением структурной перестройки олигодендроци-в нейрональном направлении, увеличивается возможность содержания и, конечн

функции в нем такого типичного нейронного белка, как NeuN.

***

Перепрограммирование придает феномену слияния клеток регенераторш действие, особенно эффективное и целесообразное в ЦНС в условиях структура

функциональной специфики мозга. Регенерация в обсуждаемом варианте осуществляется внутриклеточно. Перепрограммирование происходит в цитоплазме нейрона. Поскольку перепрограммирование идет в нейрональном направлении в ходе его происходит внутриклеточная гиперплазия специфических ультраструктур - генов, дерепрессированных по нейрональному образцу. Новые тела нейронов не образуются. Но образуются новые ядра нейронов, новые нейрональные геномы, что по компенсаторному эффекту близко к появлению новых клеток, а в условиях структурно-функциональной организации мозга, даже предпочтительнее. Новые ядра и геномы появляются в предсуществующих телах нервных клеток, в адекватной цитоплазме с уже развитыми отростками и синапсами. Таким образом, новые геномы могут сразу при своем появлении включаться в специфическую функцию, поддержать её, если она ослаблена перегрузкой или возрастным истощением. Содержание двух геномов в нервной клетке создает «материальную базу» для гиперплазии ультраструктур и соответствующего усиления функции, если это понадобится для обеспечения физиологической или репаративной регенерации.

ВЫВОДЫ

1. Нейроны префронтальной зоны коры головного мозга могут сливаться с олигодендроцитами (образуя гетерокарионы). Могут создаваться и трикарионы. Часто встречаются двуядерные нейроны - дикарионы.

2. Через 7 суток после двустороннего ишемического инсульта, память крыс нарушается - у них исчезает выработанный до повреждения УРПИ. В контроле в этот срок УРПИ полностью сохраняется. К 56-ым суткам наблюдается положительная тенденция в улучшении памяти подопытных животных, а после подкрепления рефлекса ЛП становится равным как в опыте, так и в контроле. К моменту восстановления функции регистрируется статистически достоверное морфологическое изменение в префронтальной зоне коры - увеличение количества слившихся клеток.

3. После слияния олигодендроцита с нейроном происходит перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейрональном направлении: ядра становятся структурно неразличимыми, а в ядре перепрограммируемого олигодендроцита может экспрессироваться нейрональный белок - ЫеиЫ.

4. Дикарионы увеличивают число нейрональных геномов в коре и этим обеспечивают репаративную регенерацию.

5. Регенерация путем слияния клеток обусловливается внутриклеточной гиперплазией ультраструктур (генов) без увеличения числа нейронов.

6. При регенерации слиянием клеток новый нейрональный геном появляется в предсуществующем нейроне. Геном оказывается в естественном для его экспрессии

окружении и может взаимодействовать с уже имеющимися структурами и веществам нейрона.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пальцын A.A., Колокольчикова Е.Г., Константинова Н.Б. Теория регенерации Д.С. Саркисова и учение о стволовых клетках. // Патогенез,- 2007.- Т.5.- №1-2.-С.34-37.

2. Пальцын A.A., Колокольчикова Е.Г., Константинова Н.Б., Романова Г.А., Шакова Ф.М., Кубатиев A.A.. Образование гетерокарионов как способ регенерации нейронов при постишемическом повреждении коры мозга крыс. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2008.- №10.- С.467-470.

3. Константинова Н.Б., Шакова Ф.М. Морфологическое изучение регенерации префронтальной (когнитивной) зоны коры головного мозга крыс // Тезисы V конф. молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»,- Вестник РАМН, Приложение.-2008,-№6.- С.209-210.

4. Пальцын A.A., Константинова Н.Б. Метод окрашивания полутонких срезов ткани мозга. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2009.- №5,- С.598-600.

5. Пальцын A.A., Константинова Н.Б., Романова Г.А., Шакова Ф.М., Квашенникова Ю.Н., Кубатиев A.A. Роль слияния клеток в физиологической и репаративной регенерации коры головного мозга. // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед.- 2009.- №11,- С.580-583.

Подписано в печать 22.09.2010г. Формат 60x84/16 Печать цифровая. Усл.п.л.2 Тираж 100 экз. Заказ № 225. Отпечатано в ООО «Реглет» 125315 г. Москва, Ленинградский проспект, д.74 к.1 Тел: 790-47-77; 661-60-89

Актуальность проблемы

По представлению Европейской базы данных ЗДВ (HFA-DB) (Европейское региональное бюро Всемирной организации здравоохранения), психические расстройства, болезни нервной системы и органов чувств составляли в РФ в 2006 г — 1514 человек на 100000 населения. Инсульт в РФ занимает второе место среди причин смертности и первое место среди причин инвалидизации. Ежегодно им заболевает свыше 450 тыс. чел. (Верещагина Н.В. и др., 2002; Гусев Е.И., и др., 2003; Яхно Н.Н., Виленский Б.С., 2005).

Инсульт и другие цереброваскулярные болезни - ведущая причина заболеваемости и смертности в США (March В .J., et al., 2009), среди причин смертности в других индустриально развитых странах инсульт занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний (Green A.R., 2008).

Из нейродегенеративных заболеваний, по-видимому, самыми распространенными являются болезнь Альцгеймера и паркинсонизм. Болезнью Альцгеймера страдают в мире примерно 10% людей старше 65 лет и более 45% тех, кому за 85 (Гаврилова С.И., 2001). Исследования показали, что в возрасте 65-74 лет паркинсонизм встречается у 15% лиц, а в возрасте старше 85 лет - более чем у 50%. (сайт — www.humbio.ru)

В последние годы значительно расширились исследования по регенерации нервной системы и после открытия на рубеже XX и XXI вв. нейральных стволовых клеток в головном мозге (Reynolds В.A., Weiss S., 1992; Luskin М.В., 1993; Weiss S. et ah, 1996; Morshead C.M. etah, 1998; Weiss S, van der Kooy D., 1998; Johansson C.B. et ah, 1999; Gage F.H., 2000; Kornack D.R., Rakic P., 2001) и костном мозге (Brazelton T.R. et ah, 2000; Mezey E. et ah, 2000; Blau H.M. et ah, 2001) существенно повысился интерес к изучению стволовых клеток. Эти исследования по регенерации нервной системы преимущественно осуществляются как поиск доказательств нейроногенеза в постнатальном периоде. На эту тему опубликовано много работ, описывающих обнаружение тех или иных признаков пролиферации нейронов у взрослых млекопитающих. Роль стволовых клеток и нейральных, в частности, стали рассматривать в однообразном только клеточно-заместительном плане. При упрощенном понимании роли стволовых клеток, казалось, что это открытие ведет к немедленному решению многих медицинских проблем. Все больше стало появляться работ по применению стволовых клеток с лечебной целью в эксперименте и клинике. Мы упомянем только работы неврологической направленности (Скворцова В.Н. и др., 2008; Rossi F.M. et al., 2000; Nakatomi H. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002;). Немало сообщений и опровергающих эти работы. Некоторые из них оказались терапевтически не эффективны. Но даже если отмечалось лечебное действие, его без специального подтверждения, нельзя объяснять непременно нейроногенезом. Это мнение выражали и сами авторы обсуждаемых работ (Скворцова В.Н. и др., 2008; Nakatomi Н. et al., 2002; Teng Y. et al., 2002;). Такие результаты, на наш взгляд, являются серьезным мотивом для тщательного всестороннего изучения феномена — нейральная стволовая клетка.

В начале XXI-ого века феномен слияния привлек исследовательский интерес тем, что изменил представления о трансдифференцировке, трансдетерминации или пластичности не только нейральных, но и прочих стволовых клеток. Под трансдифференцировкой и пластичностью подразумевается способность стволовых клеток взрослого организма превращаться в дефинитивные клетки другого зародышевого листка. Такая трактовка воспринималась с доверием до 2002-2003 гг., когда сразу в нескольких публикациях (Gussoni Е. et al., 2002; TeradaN. et al., 2002; Ying Qi-L. et al., 2002; Alvarez-Dolado M. et al., 2003; Vassilopoulos G. et al., 2003; Wang X. et al., 2003) было заявлено, что слияние стволовой клетки с дифференцированной клеткой различных тканей - событие не редкое и увеличивающееся при повреждении данной ткани. По этой причине классическое» доказательство пластичности - присутствие в дифференцированной клетке маркера стволовой — может иметь и другое объяснение. Стволовая клетка не превратилась в дефинитивную, создав при этом самостоятельно маркеры дифференцировки, а просто слилась с дифференцированной и в результате получила уже готовые маркеры, не пройдя соответствующего пути развития и собственной выработки этих маркеров.

Вышеперечисленные теоретические фундаментальные исследования и медико-социальная значимость проблемы определяют актуальность исследования механизмов регенерации нервной системы и, в первую очередь, нейронов коры. Знания в этой области расширят возможности профилактических и лечебных мероприятий для коррекции и восстановления нарушенных функций ЦНС при нейродегенеративных заболеваниях.

Цель исследования

Цель настоящего исследования: определить происходят ли слияния региональных клеток в префронтальной коре головного мозга (в норме и при создании ишемического очага) и каково значение этих слияний для репаративной регенерации.

Задачи исследования

1. При ишемическом повреждении префронтальной коры головного мозга крыс изучить выраженность слияний в поврежденной и неповрежденной зонах префронтальной коры.

2. Разработать методики определения слившихся клеток (дикарионов, гетерокарионов) и проверить достоверность слияния методами электронной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с различными флуорохромными зондами и иммуноцитохимическими маркерами.

3. Выяснить регенераторное значение слияния клеток коры путем количественного определения числа слияний при нарушении и восстановлении функции префронтальной зоны коры.

4. Провести авторадиографическое исследование с целью определить жизнеспособность слившихся и одноядерных клеток и способность клеток коры к пролиферации.

5. Определить биологическую роль появления в нейроне второго ядра.

Научная новизна

Впервые экспериментально доказан факт слияния региональных клеток в префронтальной зоне коры головного мозга с образование двуядерных клеток. При слиянии двух нейронов возникали дикарионы. При слиянии нейрона с олигодендроцитом образовывались гетерокарионы.

При образовании гетерокариона происходило перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейрональном направлении с повышением дисперсности хроматина и с последующим преобразованием ядра олигодендроцита в ядро нейрона.

Взаимосвязь структуры и функции указывает на то, что перепрограммированное ядро олигодендроцита функционировало как ядро нейрона. Слившийся с олигодендроцитом нейрон получает второй набор генов от олигодендроцита, становится тетраплоидным или, по крайней мере, гипердиплоидным и может выполнять повышенную, скорее всего, удвоенную функциональную нагрузку.

Получены данные, указывающие, что наряду с описанной Д.С. Саркисовым внутриклеточной регенерацией путем самостоятельной гиперплазии ультраструктур, нейрон может также внутриклеточно регенерировать, получая эти структуры извне от слившегося с ним ядра олигодендроцита. Приобретенный второй комплект генов может обеспечить увеличение числа любых необходимых структур.

Морфологические данные подтверждаются результатами функциональных исследований, показавшими, что улучшение условно-рефлекторной деятельности животных происходит вместе с увеличением числа слияний в префронтальной коре. Показано, что функциональные возможности стволовых нейральных клеток шире, чем было известно ранее. Если раньше роль нейральных и других стволовых клеток представлялась, как только заместительная, то наши данные свидетельствуют, что стволовая клетка через прогенитора, например, олигодендроцита, может не замещать утраченную клетку, а отдавать сохранившейся клетке свое ядро и обеспечивать, таким образом, своеобразную внутриклеточную пролиферацию генов.

Впервые обнаружено, что иногда вслед за объединением цитоплазмы происходило и объединение ядер. В таком случае двуядерный дикарион превращался в одноядерный синкарион. В единственном ядре синкариона содержание ДНК повышается и может доходить до восьми гаплоидных наборов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа фундаментальная. Полученные знания могут быть использованы для оценки скорости и полноты регенерации при действии различных повреждающих факторов и терапевтических агентов. Накопление знаний в области регенерации ЦНС в дальнейшем может дать возможность рационально влиять на частоту слияния клеток и тем направлять в желаемое для врача русло ход физиологической и репаративной регенерации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нейроны префронтальной зоны коры (поля Frl, Fr2) могут сливаться с олигоденроцитами.

2. Улучшение условно-рефлекторной деятельности и статистически достоверное увеличение числа дикарионов в префронтальной коре указывают на регенеративное значение слияния клеток.

3. В случае слияния образуется двуядерный гипердиплоидный нейрон - дикарион. При слиянии нейрона и олигодендроцита, ядро последнего подвергается перепрограммированию в пейрональном направлении с резким усилением дисперсности хроматина и, в конце концов, становится неотличимым от ядра нейрона. Следовательно, нейрональный дикарион образуется через стадию гетерокариона. Принцип единства структуры и функции подсказывает, что завершившее перепрограммирование бывшее ядро олигодендроцита начинает экспрессировать нейрональные гены.

4. Появление дикарионов и образование синкарионов свидетельствуют о повышении плоидности нейронов коры в онтогенезе.

5. Слияние олигодендроцитов (прогениторных клеток) с нейронами с последующим внутриклеточным перепрограммированием ядер первых по образцу вторых, показывает, что биология стволовых клеток не ограничивается наращиванием числа клеток при развитии и восстановлением их количества при регенерации. Это особенно целесообразно в поддержании гомеостаза ЦНС. Стволовая клетка не образует новой дефинитивной клетки. Сложная задача компенсации повреждения или утраты нейрона, отличающегося индивидуализированным багажом памяти, решается организмом при помощи стволовой клетки путем создания второго ядра в поврежденной клетке. Второе ядро обеспечивает гиперплазию ультраструктур, материализующих память.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на:

• V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в форме устного доклада (2008 г, Москва);

• Заседании Ученого совета НИИОГГП РАМН совместно с Бюро ОБМН РАМН, посвященном 85-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РФ, академика АМН СССР и РАМН Доната Семеновича Саркисова (2009 г, Москва).

ВЫВОДЫ

1. Нейроны префронтальной зоны коры головного мозга могут сливаться с олигодендроцитами (образуя гетерокарионы). Могут создаваться и трикарионы. Часто встречаются двуядерные нейроны — дикарионы.

2. Через неделю после двустороннего ишемического инсульта, вызванного фототромбозом, память крыс нарушается - у них исчезает выработанный перед созданием инсульта УРПИ. В контроле в этот срок УРПИ полностью сохраняется. К 56-м суткам после инсульта наблюдается положительная тенденция в улучшении памяти подопытных животных, а после подкрепления рефлекса ЛП становится равным как в опыте, так и в контроле. К моменту восстановления функции регистрируется статистически достоверное морфологическое изменение в префронтальной зоне коры -увеличение содержания слившихся клеток.

3. После слияния олигодендроцита с нейроном происходит перепрограммирование ядра олигодендроцита в нейропальном направлении: ядра становятся структурно неразличимыми, а в ядре перепрограммпруемого олигодендроцита может экспрессироваться нейрональный белок — NeuN.

4. Дикарионы увеличивают число нейрональных геномов в коре и этим обеспечивают репаративную регенерацию.

5. Регенерация путем слияния клеток обусловливается внутриклеточной гиперплазией ультраструктур (генов) без увеличения числа нейронов.

6. При регенерации слиянием клеток новый нейрональный геном появляется в предсуществующем нейроне. Геном оказывается в естественном для его экспрессии окружении и может взаимодействовать с уже имеющимися структурами и веществами нейрона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большое число методических ошибок, обнаруженных в исследованиях постнатального нейроногенеза у млекопитающих (обзор литературы), не изменив доминирующего мнения о том, что способ регенерации мозга — нейроногенез, побудило меньшую часть занятых в этой области цитологов искать и другие способы регенерации. Мы, зная множество веских доказательств теории регенерации Д.С. Саркисова, и не встретив ни одного убедительного возражения против неё, решили исследовать феномен слияния клеток в мозге in vivo. Если можно так выразиться о биологическом феномене, то феномен слияния по своей идеологии близок к внутриклеточной регенерации Д.С. Саркисова. Кроме того, слияние обнаруживалось лишь в единственном виде нейронов Следует отметить, что до нашей работы регенераторное значение слияния не было доказано, оно (на основании трансгендерных экспериментов) лишь предполагалось (Alvarez-Dolado М. et al., 2003; Weimann J.M. et al., 2003) - в клетках Пуркинье, причем очень редко. Эти, скажем прямо, не обнадеживающие исходные данные не изменили нашего решения исследовать слияние клеток в ЦНС. В этом решении нас поддерживала мысль, что все имеющиеся до нашей работы сведения о слиянии стволовых или более высоких степеней дифференцировки клеток in vivo в любых органах и мозге, в том числе, получены в трансгенных экспериментах. Иными словами, исследовалось слияние с местными клетками только клеток костного мозга, причем в условиях крайне искусственных с тяжелыми воздействиями на реципиентов (летальное облучение, затем пересадка костного мозга и массивные дозы иммунодепрессантов для подавления реакции трансплантат — против хозяина). В таких условиях обычно не живут и не болеют ни люди, ни животные. Кроме того, летальное облучение в значительной степени, а, может быть, и полностью подавляет активность региональных стволовых клеток, которые имеют в регенерации органа существенное, а, скорее всего, решающее значение, каким бы образом эта регенерация не осуществлялась.

Для изучения отдельных моментов биологии стволовых клеток, вопросов развития и регенерации метод трансгенных пересадок оказался полезным, позволил получить ценную информацию. Но для исследования вопросов регенерации, ориентированных в качестве конечной цели на внедрение в клинику, трансгендерный метод неприемлем. Поэтому наша работа была осуществлена морфологическими и цитохимическими методами.

Чтобы получить возможность сопоставления морфологических и функциональных данных, эксперимент был организован так, как это описано в главе 4. При первом просмотре полутонких срезов контрольных животных было обнаружено, что слияние не такое уж редкое событие: в среднем его можно найти в каждом срезе. Такая частота вначале настораживала и казалась наиболее верным свидетельством ошибки. Ведь мы смотрели полутонкие срезы, которые до нас видели сотни, морфологов, и никто из них не описал слияния нейронов друг с другом или с глиальной клеткой. Чтобы не исследовать, а, тем более, не опубликовать артефакт, мы попытались разработать методику окраски перикариона в эпоксидном срезе. Результаты наших поисков в этом направлении представлены в главе 2. Эти результаты нельзя признать полностью удовлетворительными. Оба предложенных нами метода окраски не так четко, как хотелось бы, отделяли перикарион от нейропиля, кроме того, перикарион казался более узким, чем в парафиновых срезах, окрашенных по Нисслю. Но, все-таки, предложенные приемы окраски гораздо лучше выявляли цитоплазму нейрона, чем наиболее популярный из «старых» методов окраски - толуидиновым синим. Это позволило использовать такой критерий слияния, как пребывание двух ядер в одной цитоплазме. Соблюдение этого критерия и стало основным приемом оценки истинности слияния в наших количественных исследованиях (глава 4). Мы поняли, что этот критерий достаточно надежен, когда проверили действительность слияния клеток в коре всеми, имеющимися у нас в то время методами: электронной микроскопией, конфокальной микроскопией, флуореметрией (глава 3).

Всё, что до сих пор говорилось о слиянии клеток, одинаково относится и к контрольной, и к подопытной группе животных, т.е. и к физиологической, и к репаративной регенерации. Однако последняя (репаративная) имеет и ещё один с большой долей вероятности связанный со слиянием момент. Имеется в виду образование большого числа «псевдодикарионов» в пенумбре. Значительная степень деструкции «псевдодикарионов» - свидетельство того, что они образованы не конструктивными (как классические слияния), а деконструктивными, разрушительными процессами. Однако мрачное начало не означает неотвратимо печального конца, т.е. гибели «псевдодикариона». Вспомним, что разрушение есть пусковой момент и движущая сила всякой регенерации, даже физиологической. Наши радиоавтографические данные показали, что даже грубые дегенеративные изменения «псевдодикариона» совместимы с сохранением их жизнеспособности. Таким образом, обнаружив такое явление, как возникновение «псевдодикарионов» мы в рамках этой работы не закрыли вопроса о возможности их превращения в истинные дикарионы.

Главным итогом работы считаем два доказательства того, что слияние клеток представляет собой форму регенерации нейронов ЦНС.

Первое доказательство — возрастное увеличение содержания дикарионов и сочетание функциональных проявлений регенерации с достоверным повышением числа слияний в коре. Статистически достоверное повышение содержания дикарионов через 57 суток после инсульта произошло в подопытной и в контрольной группах животных. В опыте содержание дикарионов было больше, чем в контроле, но разница с контролем не достигала статистической достоверности. Восстановление функции происходило только в опыте, в контроле функция не нарушалась. Поэтому отсутствие статистически достоверной разницы между опытом и контролем может быть воспринято как факт, снижающий убедительность утверждения о том, что слияния обеспечивают регенерацию и количественно выражают её развитие. Однако мы настаиваем на своем утверждении, а отсутствие достоверной разницы между опытом и контролем объясняем следующим образом. В контроле содержание дикарионов на 57-е сутки достоверно превышало таковое на 7-е сутки. Следовательно, в контроле тоже происходила регенерация — физиологическая, поскольку нарушения функции не было. Регенерация всегда компенсирует утрату. В контроле это была возрастная утрата нейронов (животные за время эксперименте стали в 2 раза старше), возможно, усиленная обучением условному рефлексу и стрессом ложной операции. Последняя, т.е. ложная операция явно выдвигается из рамок физиологической регенерации и ещё раз подчеркивает условность нашего деления на подопытную и контрольную группы. Заметим в качестве «лирического отступления», что во всех экспериментах по регенерации деление на опыт и контроль всегда условно. Оно не может быть и строго академично уже потому, что всякая регенерация есть реакция на разрушение. Хотя, конечно, деление на физиологическую и репаративную регенерацию необходимо — без него распадается вся система медицины. Таким образом, сравнивая опыт и контроль, мы определяли достоверность различия не между регенерацией и отсутствием её, а между двумя выборками, в которых физиологическая регенерация была представлена в равной степени, но в подопытной выборке физиологическая регенерация была усилена репаративной.

Локализуется процесс репаративной регенерации не всегда на месте повреждения, но часто в отдалении от него, а может происходить даже и в другом органе (Саркисов Д.С., 1970, 1993). В нашем случае повреждена была часть когнитивной зоны коры. Учитывая многочисленные связи, взаимодействие нейронов, выполняющих одну функцию, можно уверенно сказать, что процесс регенерации распространился на всю когнитивную зону. При вырезании образцов для анализа на 57-е сутки мы соблюдали только одно условие - образец должен быть из префронтальной зоны с минимальным захватом бывшей пенумбры, где возможна ошибка за счет «псевдодикарионов». Крыса животное маленькое и выполнить это условие трудно. В такой ситуации репаративное увеличение числа слияний могло не проявиться статистически значимо, «затерявшись» среди индивидуальных, а, возможно, и топографических колебаний частоты слияний у разных животных и в разных участках когнитивной зоны.

Второе доказательство - перепрограммирование ядра олигодендроцита после слияния с нейроном (глава 5). В результате этого процесса строение ядра олигодендроцита изменяется, становится похожим на строение ядра нейрона и, в конце концов, два ядра становятся одинаковыми. Принцип связи структуры и функции (частный случай закона единства материи и движения) подсказывает, что и функционально ядра становятся одинаковыми. Мы обнаружили, что в перепрограммируемом по образцу нейрона ядре олигодендроцита ещё до окончания процесса перепрограммирования может экспрессироваться классический нейрональный маркер NeuN. В результате слияния клеток появляются двуядерные или полиплоидные (см. главу 3) нейроны. Слияние клеток — внутриклеточная форма регенерации. Перепрограммирование ядра олигодендроцита происходит внутриклеточно — в цитоплазме нейрона. Количество нейронов при таком способе регенерации не увеличивается, но увеличивается число нейронных ядер, число нейронных геномов. Добавочные геномы могут располагаться в разных ядрах (дикарион) или в одном ядре (синкарион). Оба варианта создают гиперплазию первичных ультраструктур клетки — генов, а гены обеспечивают гиперплазию всех других структур и соответствующее возрастание функциональных способностей нейрона. Восхищает биологическая рациональность такого способа регенерации, соответствие этого способа структурно-функциональной организации ЦНС и нейрона, в частности.

Нейрон единственная клетка организма, обладающая свойством памяти, материализованном в многочисленных связях с другими нейронами.

Как может компенсировать утрату такой клетки новый нейрон, идея образования которого отстаивается сегодня большинством нейробиологов? Дифференцировавшийся из нейробласта нейрон - маленькая с двумя-тремя короткими отростками, лишенными синапсов, клетка (D'Amour К.А., Gage F.H., 2003; O'Shea K.S., 2003; Wurmser A.E. et al., 2004; Wang L. et al., 2009). В культуре эмбриональных нейральных клеток, да еще при нокауте проапоптозного гена р53, эмбриональные нейроны накапливаются в настолько большом количестве, что соприкасаются во многих точках. При этом удлиняются их отростки и связывают клетки друг с другом (Armesilla-Diaz A. et al., 2009). Но, ведь это всё происходит в условиях очень далеких от условий, складывающихся во взрослом мозге. Даже самые горячие апологеты нейроногенеза отмечают малочисленность «вновь образованных» постнатально нейронов.

Как же такая одиночная клетка может не в эмбриональном, а во взрослом, сформированном мозге, в плотном хитросплетении клеточных тел, сосудов и отростков вырастить свои отростки и образовать необходимое (измеряемое тысячами) количество синапсов? И в топографическом и во временном аспектах выполнение такой задачи представляется нереальным.

При регенерации путем слияния, новый нейрональный геном появляется в уже предсуществующей клетке, он с момента появления находится в адекватной цитоплазме с набором всех необходимых для функции факторов, тело клетки имеет многочисленные отростки и синапсы. В таких условиях новый геном может практически с момента появления осуществлять специфическую функцию нейрона и даже существенно усиливать её, вводя в действие вновь появившиеся гены. Данная ситуация создает возможность, хотя бы частично, компенсировать отсутствие утраченного нейрона. Полная компенсация гибели такой клетки, как большой нейрон, вероятно, недостижима. Ещё раз напоминаю — мы ведем речь о крупных нейронах коры.

Всё вышесказанное — попытка объяснить биологический смысл слияния олигодендроцита с нейроном. А как объяснить многочисленные находки слившихся нейронов? На этот счет у нас есть только предположение. Дикарион нейронов — это бывший гетерокарион олигодендроцита и нейрона после завершения перепрограммирования. Это мнение поддерживается тем фактом, что мы не заставали дикарион нейронов в начале слияния, когда сохраняется ещё остаток разделявшей клетки мембраны. В гетерокарионах такие случаи обнаруживаются часто. В рис.4 есть фрагмент мембраны между нейронными ядрами, но расположен он не типично, в среднем участке зоны соединения клеток, не будучи связан, как бывает в гетерокарионах, с окружающей два ядра клеточной мембраной. Мы не знаем, как объяснить присутствие этого фрагмента: тем, что остатки мембраны сохраняются в цитоплазме дольше, чем длится перепрограммирование или тем, что обсуждаемый дикарион фиксирован не в момент заканчивающегося слияния двух клеток, а в момент начинающегося разделения их.

Возможно, нижеследующие строки некоторые читатели сочтут более уместными в обзоре литературы. Но мы даем их здесь, после изложения основного собственного материала, что поможет представить нашу мысль гораздо короче, а, может быть, и понятнее, консолидировапее с общим статусом современной нейробиологии.

Мы излагаем свое отношение к проблеме «нейроногенез у взрослых млекопитающих» именно здесь, после того как представлены наши результаты по слиянию клеток и их обсуждение. В такой компоновке текста работы, наша позиция по проблеме нейроногенеза, как нам представляется, будет выглядеть вполне объективно, без предпочтения какой-либо точки зрения, в том числе и своей.

Мы не станем приводить, по-существу, неисчерпаемую литературу, относящуюся к роли гиппокампа в механизме запоминания и обучения ,наряду с кортикальной частью мозга. Причем в гиппокампе (приведем только несколько работ последних лет) эта роль связывается с нейроногенезом в субгранулярной зоне, с последующей миграцией вновь образованных нейронов в зубчатую извилину и встраиванием их в местные нейрональные сети, образованием синапсов (Burgess N., Maguire Е., 2002; Zhao Ch. et al., 2006; Wiltgen В., Silva J., 2007; Ageta PI. et al., 2008; Toni N., et al., 2008; Kitamura T. et al., 2009). Отсутствие нейроногенеза в патологически измененном гиппокампе, задерживает передачу памяти в кору, превращение контекстной памяти в ассоциативную (Teng Е. et al., 1999; Shors Т., Squire L.R., 2001; Maviel Th. et al., 2004). Нейроногенез в гиппокампе обеспечивает антидепрессантный эффект (Santarelli L., et al., 2003). Эти данные вместе с нашими наблюдениями - есть еще одно подтверждение мысли Доната Семеновича, о том что все органы регенерируют по разному, соответственно своей структурно-функциональной специфике и сложности.

Основным положением теории регенерации Д.С. Саркисова является то, что регенерируют все живые объекты. Но регенерируют по разному, соответственно их структурно-функциональному своеобразию. Всё, что мы пишем, относится к большим нейронам коры, называемым ещё пирамидными, хотя очень часто они ни по форме ни по тинкториальным свойствам не соответствуют этому названию. Возможно, что мелкие и более простые по структуре нейроны молекулярного и зернистого слоев регенерируют иначе и даже путем постнатального нейроногенеза, как это доказывается для промежуточных нейронов обонятельных луковиц и зубчатой извилины гиппокампа (см. литературный обзор).

На наш взгляд, идею регенерации путем слияния клеток поддерживают и данные наших предшественников, изучавших слияния в мозге трансгендерным методом. Напомним, что единственным видом нейронов, с которыми, хотя и редко, сливались пересаженные костномозговые клетки, оказались нейроны Пуркинье. Наши наблюдения показали, что в предшествующих исследованиях и не могли быть обнаружены слияния, поскольку они происходят между нейронами и местными прогениторами, например, олигодендроцитами. Всё, что мы писали о соответствии формы регенерации слиянием структурно-функциональной организации нейронов и малой вероятности регенерации морфологически сложных нейронов путем постнатального новообразования, в особой степени относится к таким крупным и структурно сложным нейронам, как нейроны Пуркинье. В них способность к слиянию настолько выражена, что проявляется даже в условиях трансгенного эксперимента, не выявляющего слияний других нейронов.

В последние годы появились экспериментальные данные, что синцитиальную теорию строения нервной системы, забытую после работ Рамон-и-Кахаля, нельзя считать абсолютно неверной. Синцитиальные связи между нейронами встречаются и усиливаются в условиях патологии (Сотников О.С. и др., 2009; Сотников О.С., Парамонова Н.М., 2010; Sotnikov O.S. et al., 2010). Эти данные тоже отражают тенденции нейронов к прямому несинаптическому соединению друг с другом.

Следует подчеркнуть, что регенерация путем слияния клеток имеет неисчерпаемый резерв, позволяющий поддерживать её в течение всей жизни. Резерв геномов, необходимых для пожизненного образования дикарионов, создается обнаруженном во многих исследованиях (Baumann N., Pham-Dinh D., 2001; Bhardwaj R.D. et al., 2006) обновлением популяции глиальных клеток в постнатальном периоде. У нас есть и собственные данные, доказывающие пролиферацию глиоцитов и, в частности, олигодендроцитов у взрослых грызунов (глава 4).

Снимок, демонстрирующий синтез ДНК в олигодендроците (рис. 34), и наши результаты по перепрограммированию обнаружили ещё одну из многочисленных методических ошибок в исследованиях постнатального нейроногенеза. Главное доказательство нейроногенеза — это присутствие в цитохимически идентифицированном нейроне какого-либо маркера пролиферации: тимидина, 5-бромдезоксиуридииа, маркера, внесенного ретровирусом и др. На нашем рис. 34 олигодендроцит в начале синтетического периода (метка локализуется около ядерной мембраны). Завершив синтетический период, он наберет ещё больше метки и, наконец, разделится. При этом метка в нем уменьшится наполовину, но полностью не исчезнет и останется в клетке навсегда. Такой меченый олигодендроцит может слиться с нейроном. Претерпев перепрограммирование, меченое ядро олигодендроцита становится меченым ядром нейрона, как по структуре, так и по функции. Находясь в нейрональной цитоплазме и экспрессируя нейрональные гены, в том числе и все цитохимические маркерные гены нейрона, ядро, о котором идет речь, будучи найденным, в срезе, конечно, будет признано образованным de novo нейроном. Исследования нейроногенеза проводят по парафиновым срезам. Поэтому, даже если срез пройдет через оба ядра дикариона, он не будет опознан. Если же срез пройдет через одно меченое (маркером пролиферации) ядро, то сочетание (колокализация) в одной клетке маркера пролиферации и маркера нейрона будет сочтено «непоколебимым» (и все же, как мы теперь знаем, ошибочным) доказательством постнатального нейроногенеза.

Самое печальное и смешное в захватившем почти весь мир экспериментальной неврологии порыве к нейроногенезу заключается в том, что порыв, сконцентрировавший в себе огромный научный потенциал и огромные финансовые и технические ресурсы, обусловлен не какими-то научными фактами, а чисто умозрительным представлением-мечтой, что вводя нейральные стволовые клетки или манипулируя клетками-предшественницами можно легко устранять неврологические расстройства. Об этом прямо говориться в сравнительно недавней и в техническом отношении прорывной работе L.N. Manganas с соавт. (Manganas L.N. et al., 2007). Авторы идентифицировали метаболический биомаркер нейральных клеток — предшественниц и смогли следить за его изменениями в живом мозге человека и крысы по результатам протонной магнитно-резонансной спектроскопии. Все отмеченные изменения авторы трактуют исключительно в понятиях нейроногенеза, игнорируя тот факт, что такие же изменения ими регистрируются и при глиогенезе.

Наша работа показывает, что нейральпая стволовая клетка, конечно, через клетки предшественницы, выполняет важнейшую биологическую роль - пожизненный глиогенез и тем обеспечивает регенерацию нервной системы, пополнение числа нейрональных геномов. Поэтому манипуляции клетками-предшественницами - разработан метод направленного выращивания в культуре пре-олигодендроцитов (Zhang S.C. et al., 1998; Glaser Т. et al., 2004) или какие-то иные воздействия, способствующие слиянию клеток, могут оказаться терапевтически более действенными, нежели введения в мозг или спинномозговую жидкость стволовых клеток.

Д.С. Саркисов постоянно подчеркивал недальновидность и ошибочность противопоставления внутриклеточной регенерации и регенерации путем деления клеток. Конечно, эти формы регенерации не существуют изолированно. Уже, хотя бы потому, что внутриклеточная регенерация эволюционно древняя (существует у одноклеточных организмов) и универсальная (существует во всех живых объектах) является фундаментом, на котором надстраивается регенерация путем размножения клеток. Описанная нами регенерация нейронов путем слияния клеток -замечательный пример взаимосвязи указанных двух форм регенерации. Конечно, слияние клеток - это внутриклеточная регенерация по её основному определению: происходит без увеличения числа клеток и материально обеспечивается гиперплазией внутриклеточных структур (в нашем случае первично генов, а следственно и всех остальных структур клетки). Под такое определение полностью подходит и полиплоидия гепатоцитов. Но, полиплоидия гепатоцитов — это внутриклеточная регенерация «в чистом виде». Пролиферация генов при ней происходит путем внутриклеточного копирования генов, ранее содержавшихся в клетке. При регенерации путем слияния клеток дополнительные гены вносятся в клетку «пришедшим» ядром. В нейроне они не появляются de novo, а лишь дерепрессируются.

Полиплоидия нейронов отличается по механизму возникновения от полиплоидии гепатоцитов. Первоосновой «прихода» добавочных ядер в нейроны является размножение стволовых клеток, что обеспечивает текущий в течение всей жизни глиогенез.