Автореферат и диссертация по медицине (14.02.04) на тему:Роль системы матриксных металлопротеиназ в патогенезе профессиональных заболеваний органов дыхания

На правах рукописи

904609654

Фомина Валерия Сергеевна

РОЛЬ СИСТЕМЫ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В ПАТОГЕНЕЗЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ

14.02,04 - медицина труда

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 СЕН 2010

Москва-2010

004609654

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте медицины труда Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Л.П. Кузьмина Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор B.C. Журков

Кандидат медицинских наук U.C. Соркина.

Ведущая организация - МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Защита состоится _2010г. на заседании Диссертационного совета

Д.001.012.01. при НИИ медицины труда РАМИ по адресу: 105275 Москва, проспект Буденного, 31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института медицины труда РАМН

Автореферат разослан_2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Н.Б. Рубцова

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Комплексное и комбинированное воздействие вредных факторов производственной среды, приводит к возникновению и развитию бронхолегочной патологии различного генеза. Болезни органов дыхания от воздействия промышленных аэрозолей занимают ведущее место в структуре профессиональной заболеваемости трудоспособного населения в России. Они характеризуются высокой распространённостью и неуклонным ростом. [Измеров Н.Ф., 2009; Монаенкова А.М., 2002; Милишникова В.В., 2004 и др.] В настоящее время не теряют своей актуальности исследования по изучению механизмов повреждения легочной ткани, изысканию возможностей для ранней диагностики и представлению новых подходов к лечению данной патологии.

В патогенезе бронхолегочной патологии выделяют три ведущие составляющие: хроническое воспаление, дисбаланс в системе «протеолиз - антипротеолиз» и оксидативный стресс. При анализе данных последних лет обращает на себя внимание важность оценки баланса в системе протеолиз-антипротеолиз при заболеваниях воспалительной природы. Проведены многочисленные исследования системы «протеолиз-антипротеолиз» с определением содержания сериновых и цистеиновых протеиназ и их ингибиторов у больных профессиональной патологией бронхолегочной системы. [Л.П. Кузьмина 2003, 2005, 2008, О.В.Чиненная, 2003, О.И. Румянцева, 2005] Данные исследования свидетельствуют о том, что характер развития патологии, клинические проявления и течение заболеваний бронхолегочной системы у работающих определяются не только составом промышленных аэрозолей и длительностью воздействия вредных производственных факторов, но и индивидуальными особенностями организма.

В литературе освещены вопросы участия системы матриксных металлопротеиназ в развитии доброкачественных, злокачественных и хронических заболеваниях легких, таких как ХОБЛ, бронхиальная астма, туберкулез, рак легкого. [М.В. Веселовская 2007; Doomaet et al.2003; Amara et al. 2007; Bechtold et al. 1985; Himno et al. 2003]. Однако, роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе профессиональной бронхо-легочной патологии остается не изученной. Данные по частоте встречаемости полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы-1(ММП-1), являются неоднозначными и противоречивыми.

Система «протеолиз-антипротеолиз» регулируется несколькими генами, их соотношение может предопределять наследственную предрасположенность к тем или иным заболеваниям. Так, в случае наследственных нарушений правильности синтеза одного из звеньев системы возникает дисбаланс ферментов и их ингибиторов.

Протеолитические ферменты вызывают деградацию всех компонентов внеклеточного матрикса паренхимы легких, включая эластин, коллаген, фибронектин, ламинин, протеогликаны. При этом происходит разрушение эластического каркаса тканей и нарушение нормальной архитектоники легких. Тонкие эластические волокна межальвеолярных перегородок разрушаются быстрее, чем их пучки в стенках -формируется эмфизема легких. Возникает обструктивный синдром, в основе которого лежит нарушение равновесия эластического натяжения между легочной паренхимой и бронхами.

Все вышеизложенное определяет актуальность изучения системы протеолиз-антипротеолиз на уровне системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, сериновых протеиназ - нейтрофильной эластазы (НЭ) и а!-ингибитора протеиназ (а! ИП) с использованием молекулярно-генетических и биохимических методов исследования у больных профессиональными заболеваниями органов дыхания для выявления маркеров индивидуальной предрасположенности к развитию профессиональных заболеваний бронхо-легочной системы и оценки выраженности воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани

Диссертационная работа выполнена в рамках госбюджетных тем ГУ НИИ медицины труда РАМН: № 0602 «Разработка дифференцированных систем комплексной профилактики профессиональной и производственно-обусловленной патологии и реабилитации работников современных производств с учетом ведущих факторов риска нарушения здоровья» и № 0904 «Производственные факторы, как триггеры в развитии наиболее распространенных форм общесоматической патологии и роль медицины труда в системе их профилактики»

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение роли системы матриксразрушающих металлопротеиназ и их ингибиторов в патогенезе профессиональных заболеваний бронхолегочной системы для расширения представления о патогенетических механизмах формирования профессиональных заболеваний легких с целью разработки

биохимических критериев оценки риска развития бронхолегочной патологии и для оценки выраженности воспалительных и деструктивных процессов.

Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1. Определить количественное содержание матрикс-разрушающих металлопротеиназ (про-ММР-1, ММР-2, ММР-8) и сериновых протеиназ (НЭ) у больных различными формами профессиональной бронхолегочной патологии и оценить выраженность изменений в зависимости от нозологической формы и тяжести клинического течения.

2. Разработать тест-систему для определения гомо- и гетерозиготных вариантов (инсерций и делеций б2) гена матриксной металлопротеиназы -1. Провести генотипирование ММП-1 у обследованных лиц, с целью установления генетически обусловленной гиперсекреции фермента.

3. Проанализировать состояние антипротеазной системы: определить количественное содержание тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 (ТИМЫ) и а1- ингибитора протеиназ (а1-ИП) биохимическими методами и провести генотипирование а1- ингибитора протеиназ методами ДНК-диагностики с целью оценки их диагностической значимости и выявления возможной взаимосвязи между указанными ингибиторами.

4. Изучить зависимость клинических осложнений различных нозологических форм профессиональной бронхолегочной патологии от наличия полиморфных гипер- и гипосекреторных вариантов генов матриксной металлопротеиназы-1 и а1-ингибитора протеиназ.

5. Научно обосновать выбор наиболее информативных критериев оценки индивидуальной предрасположенности к развитию профессиональных заболеваний бронхо-легочной системы и оценки выраженности воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

состоит в изучении системы протеолиз-антипротеолиз на уровне системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов с использованием молекулярно-генетических и биохимических методов. В результате проведенных исследований

получены новые данные, расширяющие представления о патогенетических механизмах развития профессиональной бронхолегочной патологии. Впервые показано, что наиболее выраженные изменения в системе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов были выявлены в группах больных профессиональным бронхитом и пневмокониозами (силикоз и гиперчувствительный пневмонит).

Впервые разработана тест-система для определения генетического полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-1, на основании знания о характере полиморфизмов инсерций/делеций гуанина (1607с1еЮ) в промоторном участке гена.

Разработан новый способ детекции для выявления дефицитных Б2 аллелей гена а1- ингибитора протеиназ (РЬА8Н-детекция), который позволяет сократить время проведения и стоимость анализа, а также делает более безопасным проведение анализа для персонала.

Изучена зависимость особенностей клинического течения профессиональных заболеваний органов дыхания (выраженность дыхательной недостаточности, наличие пневмосклероза и эмфиземы легких, наличие сочетанной патологии) от наличия полиморфных вариантов генов металлопротеиназы-1 (гетерозиготный вариант 01-инсерция гуанина, гомозиготный вариант 02-делеция гуанина и а1- ингибитора протеиназ (Р1ММ, Р1Мг, Р1М8).

Проведена оценка диагностической информативности биохимических и молекулярно-генетических методов исследования. Показано, что биохимические методы позволяют изучать механизмы формирования воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани, оценить степень выраженности этих изменений.

Применение генетических методов анализа (пиросиквенирование и аллельспецифичная ПЦР-реакция) для выявления полиморфных вариантов генов металлопротеиназы-1 и а 1-ингибитора протеиназ дает возможность проводить скрининговые исследования для оценки риска развития профессиональных заболеваний бронхолегочной системы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Разработана тест-система для определения инсерций (01) и делений (02) гена матриксной металлопротеиназы-1. Разработан комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей протеиназно-ингибиторной системы, включающий определение (инсерции/делеции гуанина гена металлопротеиназы-1), про-фермента

матриксной металлопротеиназы-1, нейтрофильной эластазы, а1- ингибитора протеиназ (определение гипосекреторных Б и Ъ вариантов), тканевого ингибитора металлопротешш-1 для оценки риска развития и прогноза заболевания.

Основными формами внедрения являются:

1. Заявка на патент №2010134590 от 19.08.2010г.

2. Материалы диссертационной работы были использованы при составлении методического пособия для врачей «Определение полиморфизма генетико-биохимических систем для оценки индивидуальной чувствительности организма к воздействию неблагоприятных факторов производственной среды» Методическое пособие (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва 2005г.).

3. Материалы диссертационной работы были использованы при составлении методического пособия для врачей «Проблема индивидуальной чувствительности в медицине труда», Методическое пособие (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва, 2009 г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: проведена на заседании специалистов клинического отдела профессиональных и производственно обуслоатенных заболеваний НИИ Медицины труда РАМН (16.06.2010).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены: На XVII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания. Казань 2007г., на VIII Всероссийском Конгрессе «Профессия и здоровье» Москва 2009 г. В рамках конгресса проводился конкурс молодых ученых, по результатам которого данная работа была удостоена диплома (II место), на симпозиуме «Применение комплексных программ для санаторно-курортного лечения и реабилитации больных профессиональными заболеваниями и пострадавших от производственных травм и несчастных случаев», проведенного в рамках Всероссийского Форума «Развитие санаторно-курортной помощи, восстановительной медицины и медицинской реабилитации» (Москва, 2010 г.)

Всего по теме диссертации опубликовано 7 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на _ страницах

машинописного текста, состоит из введения, глав, обсуждения, выводов, списка

литературы, содержащего _ отечественных и _ иностранных источников.

Иллюстрации представлены таблицами и рисунками.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии важную роль играет нарушение баланса матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, в основе которого лежит изменение их соотношения, а также наличие полиморфных гипо- или гиперсекреторных мутаций генов ферментов и ингибиторов.

2. Сочетание неблагоприятных гетеро- и гомозиготных аллелей генов металлопротеиназы -1 и а1- ингибитора протеиназ характеризуется тяжелым течением и наличием сочетанной бронхолегочной и кожной патологии.

3. Для оценки риска развития, тяжести клинического течения и прогноза профессиональной бронхолегочной патологии целесообразно определение биохимических и молекулярно-генетических показателей системы «протеолиз-антипротеолиз» на уровне ферментов - металлопротеиназы -1, нейтрофильной эластазы и ингибиторов - а 1-ингибитора протеиназ, тканевого ингибитора металлопротеиназ-1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для решения поставленных в работе задач в условиях клиники НИИ Медицины труда РАМН было обследовано 100 человек, имеющих профессиональные заболевания бронхолегочной системы (пневмокониозы - силикоз и гиперчувствительный пневмонит; профессиональный бронхит; бронхиальная астма) и 30 работников производств асбестоцементных изделий (АЦК), не имеющих установленной профессиональной патологии. Результаты биохимических исследований сопоставлялись с группой 40 практически здоровых лиц, не имевших профессионального контакта с производственными факторами, а также хронических и острых заболеваний бронхолегочной системы (по результатам обследований в клинике НИИ Медицины труда РАМН).

Общее клиническое обследование больных проводилось в терапевтическом отделении клиники института. Особое внимание уделялось диагностике болезней органов дыхания. Всем проводилось рентгенологическое исследование органов грудной клетки (рентгенография в прямой и боковой проекциях, увеличенные рентгенограммы, томограммы), исследование функции внешнего дыхания (ЖЕЛ, ОФВ1, ОФВ1/ЖЕЛ), анализ периферической крови.

Для решения поставленных в работе задач у обследованных лиц и лиц контрольной группы был проведен анализ биохимических и молекулярно-генетических

показателей системы протеолиз-антипротеолиз на уровне матриксной металлопротеиназы-1, нейтрофильной эластазы, al-ингибитора протеиназ, тканевого ингибитора металлопротеиназ-1.

В качестве материала для исследований использовалась кровь, взятая из локтевой вены. Содержание в сыворотке крови матриксных металлопротеиназ, нейтрофильной эластазы, ингибитора металлопротеиназ определяли методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «RsD Systems» (США) с оценкой результатов на вертикальном фотометре «Multiscan» с последующей обработкой результатов компьютерной программой «Genesis». Уровень al-ингибитора протеиназ определяли спектрофотометрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Konelab 30i» с использованием тест-систем фирмы «Termo electron corporation».

Молекулярно-генетическими методами проводили генотипирование матриксной металлопротеиназы-1 и al-ингибитора протеиназ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с выявлением гипо- и гиперсекреторных аллелей генов фермента и ингибитора. Для выявления наследственно обусловленного дефицита al-ингибитора протеиназ определяли гипосекреторные его варианты Z или S методом аллельспецифичной полимеразной цепной реакции. Для определения полиморфных вариантов гена al-ингибитора протеиназ был разработан метод флюоресцентной детекции результатов ПЦР. Подобраны флюоресцентные зонды, используемые при детекции продукта ПЦР в модификации FLASH по конечной точке на детекторе флуоресценции «Джин» (Метод разработан совместно с сотрудником лаборатории ПЦР-диагностики Московской станции переливания крови, филиала центра крови ФМБА России, д.б.н. A.A. Еловым).

Для определения полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-1 был применен метод пиросеквенирования, разработанный совместно с лабораторией постгеномных технологий НИИ МТ РАМН (зав. лабораторией постгеномных технологий, академик РАМН В.В. Покровский). Ген ММП-1 расположен в 11-й паре хромосом. Был определен характер полиморфизма инсерций/делеций гуанина (1607delG) в промоторном участке гена ММР-1 (с использованием базы данных NCBI). Наличие инсерции/делеции влияет на уровень транскрипции гена, обуславливая повышенный синтез профермента и как следствие - повышение активности матриксной

металлопротеиназы-1, избыток которой способствует деструкции компонентов соединительной ткани. При этом гомозиготный вариант с делецией гуанина 2G имеет более высокую транскрипционную активность, чем промотор с гетерозиготным аллельным вариантом гена, имеющий инсерцию гуанина 1G в промоторной области. При этом отсутствие инсерций/делеций гуанина определяет нормальный уровень синтеза и активности фермента.

Используемый в основе метода принцип пиросеквенирующего синтеза обеспечивает надежность и точность полученных результатов, высокую пропускную способность, максимальную автоматизированность процесса, быстроту проведения анализа [Chen D.C. et al., 2003; Royo J.L. et al., 2009]. Пиросеквенирование является новым поколением методик секвенирования, нашедшее свое применение, как в фундаментальных исследованиях, так и в диагностических целях [Voelkerding K.V. et al, 2009]. Разработана тест-система на выявление полиморфных гиперсекреторных вариантов гена ММП-1, которая позволит определять индивидуальный риск развития заболеваний бронхолегочной системы при воздействии производственных факторов. (Заявка на патент № 2010134590 от 19.08.2010)

Для пиросеквенирования используются приборы и станция для пробоподготовки фирмы «Qiagen», Германия. Для пиросеквинирования использовались пиросеквенаторы «PyroMarfc Q96 MD» и «PyroMark Q24».

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерной программы "Биостат". Был применен анализ качественных и количественных признаков с применением параметрических (однофакторный дисперсионный анализ, критерий Стьюдента) и непараметрических (анализ множественных попарных сравнений с применением критерия точного критерия Фишера) критериев статистической обработки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Характеристика обследованного контингента больных и условий их труда.

Условия труда оценивались с учетом научных разработок сотрудников

гигиенических подразделений института, а также по данным характеристик условий труда, представленных территориальными ЦСЭН с мест работы заболевших.

Основная масса обследованных больных (63% мужчины и 37% женщин) представлена лицами средних и старших возрастных групп Средний возраст лиц

группы больных пневмокониозами составил 55,0 ± 2,58 лет, в группе больных хроническим профессиональным бронхитом - 59,0 ± 1,83, в группе лиц с диагнозом профессиональной бронхиальной астмы - 54,4 ± 1,59 лет. Средний возраст обследуемых лиц работающих на асбестцементном комбинате составил 29,1 + 4,3 года.

Большая часть больных были заняты в строительстве, производстве строительных материалов - 59,2% человек. Эти рабочие имели контакт с промышленными аэрозолями сложного состава, включающего в себя вещества слабофиброгенного, раздражающего и сенсибилизирующего действия. Наряду с этим их труд был связан с воздействием неблагоприятных микроклиматических условий.

Профессии 13,8% лиц были связаны с обработкой металла. 8,5% обследованных были медицинскими работниками и работниками фармацевтической промышленности и имели контакт с медикаментами, формальдегидом, хлорамином. 3% лиц работали в приборостроительной промышленности и имели контакт с кислотами, соединениями хлора, растворителями, смолами. 3,8% человек работали в сельскохозяйственной промышленности и контактировали с удобрениями, ядохимикатами и животными. 8,5% лиц работали в швейном производстве и имели контакт с текстильными аллергенами, клеями, кожей, мехом животных. 3,8% лиц работали в пищевом производстве, контактируя с мучной пылью.

Развитие профессионального заболевания бронхолегочной системы от воздействия слабофиброгенной пыли в большинстве случаев наблюдалось у лиц со стажем работы во вредных условиях от 10 и более лет (55,7%).

Все обследованные лица в зависимости от формы профессионального заболевания бронхолегочной системы были разделены на 4 группы.

Первую группу составили 25 лиц с диагнозом пневмокониозы, среди них было выделено 11 человек с диагнозом гиперчувствительный пневмонит и 14 человек с диагнозом - силикоз. У 4 больных силикозом заболевание было осложнено туберкулезом, преимущественно очаговой локализации в стадии уплотнения. У 3 обследованных пневмокониотический процесс сочетался с клиническими проявлениями бронхита.

При неосложненном силикозе и силикозе, осложненном хроническим бронхитом, рентгенологические изменения кониотического фиброза характеризовались преимущественно мелкоузелковым и узелковыми проявлениями типа р,я,г.

Присоединение туберкулеза способствовало прогрессированию пневмофиброза до образования узловых форм (А,В,С)

Среди 11 больных гиперчувствительным пневмонитом у 45% лиц заболевание характеризовалось средне-тяжелым течением, у остальных - отличалось тяжелым течением с быстрым развитием выраженной дыхательной недостаточности. У одного больного наблюдалась сочетанная кожная патология (экзема).

У 72% больных группы пневмокониозами выявлена эмфизема легких, у 1-го пациента - бронхоэктазии. У 52% человек отмечались признаки дыхательной недостаточности 1-2 и 2 степени выраженности. У 10% лиц диагностировалось хроническое легочное сердце в стадии субкомпенсации.

Вторую группу составили 30 больных с профессиональным бронхитом. Из них 17 человек страдали хроническим обструктивным бронхитом, а 13 - необструктивным. Рентгенологически у 87% лиц этой группы наблюдалась эмфизема легких. Дыхательная недостаточность в этой группе была наиболее выражена. Так у более чем половины больных диагностировалась дыхательная недостаточность 2, 3 степени. У 10% лиц диагностировалось легочное сердце в стадии субкомпенсации.

Третью группу составили 45 пациентов с профессиональной бронхиальной астмой, из них у 44% больных была диагностирована средняя тяжесть заболевания, у 11% -тяжелое течение. Аллергическую форму имели 22% человек, аллергическую и неаллергическую - 33% (с сенсибилизацией к органическим веществам, хрому, никелю и формальдегиду). У 87% больных данной группы была выявлена эмфизема легких. По результатам рентгенографии у 27% лиц были обнаружены признаки пневмосклероза. У 16% больных была выявлена дыхательная недостаточность 1-2,2 степени, у 36% - 2-3,3 - степени. У 13% лиц больных диагностировалось хроническое легочное сердце в стадии субкомпенсации.

Четвертая группа была представлена 30 пациентами, работниками асбестцементного комбината (АЦК), не имеющими профессиональных заболеваний бронхолегочной системы. Указанная группа была разбита на 2 подгруппы по наличию или отсутствию бронхолегочной патологии непрофессионального генеза. Все рабочие по результатам проведенных периодических медицинских осмотров были признаны годными к работе. Группу работников АЦК не имеющих бронхолегочной патологии вошли 17 человек.

У 13 человек были выявлены заболевания бронхолегочной системы в виде хронического обструктивного бронхита у 38% лиц и хронического необструктивного бронхита у 24% лиц, с развитием эмфиземы легких и пнемосклероза по данным рентгенологического обследования.

Биохимические и молекулярно-генетнческие исследования. Анализ изученных биохимических показателей системы «протеолиз-антипротеолиз» выявил наиболее выраженные изменения в группах больных профессиональным бронхитом и пневмокониозом (силикоз и гиперчувствительный пневмонит): достоверно высокие уровни нейтрофильной эластазы и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1, а1-ингибитора протеиназ и низкий уровень профермента про-ММП-1, являющегося предшественником матриксиой металлопротеиназы-1. В группе больных профессиональным хроническим бронхитом, силикозом и гиперчувствительным пневмонитом уровни нейтрофильной эластазы составили соответственно 3,18 нг/мл, 3,23 нг/мл и 3,51 нг/мл (в контрольной группе - 1,99 нг/мл) (таб.1, таб.2). Обращает на себя внимание достоверное понижение уровня про-ММП-1 в группах больных профессиональным бронхитом и гиперчувствительным пневмонитом - 1,53 и 0,23 соответственно (контроль 3,45 нг/мл).

Основным ферментом, повреждающим эластические структуры бронхолегочной системы, является нейтрофильная эластаза, которая способна вызывать деградацию не только эластина, но и нативного коллагена, протеогликанов дыхательных путей, что делает ее участником процесса склерозирования. Весьма важным представляется значение нейтрофильной эластазы, как регулятора воспаления, при чем в разных ситуациях она может выступать как провоспалительный, так и противовоспалительный агент. Известна стимулирующая активность нейтрофильной эластазы на продукцию бронхиального секрета и способность подавлять цилиарную активность эпителия, усугубляя тем самым течение заболевания, что объясняет высокие значения этого показателя у больных силикозом, профессиональным бронхитом, гиперчувствительнм пневмонитом.

Нейтрофильная эластаза является мощным активатором матриксных металлопротеиназ, воздействие которых способствует развитию склеротических процессов и фиброзу легочной ткани.

Таким образом, высокий уровень нейтрофильной эластазы и пониженный уровень про-ММП-1 и у больных профессиональным бронхитом, силикозом и гиперчувствительным пневмонитом свидетельствует о высокой активности ограниченного протеолиза - активации профермента про-ММП-1 нейтрофильной эластазой, запускающих протеолитические процессы с последующей деструкцией компонентов соединительной ткани и развитием фиброза.

Таблица 1.

Изученные показатели протеазно-ингибиторной системы у обследованных лиц.

Группа Я Про-ММР-1 яг/мл У1МР-8 «•/мл ММР-2 нг/мл 1ейтрофильная »ластаза г1г/мл

Силикоз 14 г, 47±0,26 41,43±9,73 166,00±12,08 3,23±0,48**

Гиперчувствительный пневмонит 11 ),23±0,06** 47,53±9,74 213,33±19,20 3,51±0,62**

Проф. хронический бронхит 30 1,53±0,07** 128,77±4,84 180,00±12,08 3,18±0,48**

Проф. Бронхиальная астма 35 ),92±0,23** 141,06±5,90 212,00±37,00 2,45±0,19

Работники АЦК 17 1,70±0,80 || 18,20±7,80 171,70±12,70 2,06±0,34

Работники АЦК, с сопутствующей бронхолегочной патологией 13 3,20±0,36 121,00±4,30 190,00±23,00 1,70±0,30

Контроль 40 |3,45±0,60 |42,00±5,60 193,00±7,60 1,99±0,17

Примечание. Достоверность различий с контрольной группой.

** р <0,001;* р<0,05 Таблица 2

Группа Т1МР-1 нг/мл «1 ип нг/мл

Силикоз 250,00±9,35** 1.94±0,09*

Гиперчувствительный пневмонит 238,00±8,50** 1,89±0,06

Проф. Хронический бронхит 225,00±7,70** 2.04±0.08**

Проф. Бронхиальная астма 230,00±9,03** 1,88±0,07

Работники АЦК, без сопутствующей бронхолегочной патологии 163,20±13,90* 1,76± 0,08

Работники АЦК, с сопутствующей бронхолегочной патологией 150,30±13,60* 1.71 ±0,05

Контроль 123,00±6,08 1.75±0,03

Примечание. Достоверность различий с контрольной группой. ** р <0,001;* р <0,05

При анализе средних уровней матриксных металлопротеиназ 2 и 8 в обследованных группах не было выявлено статистически значимых отличий от контрольных значений (таб.1, рис.1). При индивидуальном анализе уровня матриксной металлопротеиназы-8 было показано увеличение этого показателя в 1,5 раза и более в сравнении с референтными значениями у 11% лиц группы с профессиональным хроническим бронхитом и у 66% больных пневмокониозами. По данным литературы матриксная металлопротеиназа-8 является одной из наиболее активных коллагеназ, способных инициировать разложение коллагена I типа, что может свидетельствовать о развитии фиброзных поражений легких под действием неблагоприятных производственных факторов.

Обращает на себя внимание достоверное понижение уровня про-ММП-1 - 0,92 нг/мл (контроль 3,45 нг/мл) и повышение уровня тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 230 нг/мл (контроль 123 нг/мл) в группе больных профессиональной бронхиальной астмой на фоне нормальных уровней нейтрофильной эластазы, а1-ингибитора протеиназ, матриксных металлопротеиназ-2,8 (таб.1, таб.2, рис.1).

Современное определение бронхиальной астмы трактует астму как хронический воспалительный процесс нижних дыхательных путей. При наличии острого или хронического воспалительного процесса развивается комплекс защитных биохимических реакций, в которых участвуют многочисленные ферментные белки, выполняющие различные функции - транспортные, антиоксидантные, ингибиторные.

Повышение уровня тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 у больных бронхиальной астмой является показателем воспалительных процессов. Однако, снижение про-ММП-1 и наличие значительного процента лиц (18%) с гиперсекреторными мутациями гена матриксной металлопротеиназы-1(инсерции и делеции) (рис.4) является показателем неблагоприятного прогноза заболевания.

Особого внимания заслуживают исследования в системе «протеолиз-антипротеолиз» у работающих на асбестцементном комбинате. У лиц данной группы были выявлены достоверно высокие уровни тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ при нормальных уровнях протеолитических ферментов. При индивидуальном анализе было выявлено, что 35% лиц данной группы имели уровни нейтрофильной эластазы выше референтных значений и 40% лиц - имели снижение

уровня про-ММП-1. Полученные данные свидетельствуют о прогностической значимости изученных показателей для оценки индивидуального риска развития заболеваний бронхолегочной системы при воздействии вредных производственных факторов (таб.1, таб.2, рис.1).

Рис.1 Уровень ММР 2,8 и Т1МР-1 в обследованных группах

Активность матриксных металлопротеиназ в тканях зависит от уровня экспрессии их генов и от наличия активаторов, переводящих неактивный про-фермент в активную форму, и их ингибиторов. Баланс в системе «протеазы - ингибиторы» генетически детерминирован, к нарушению равновесия может приводить наследственно обусловленный недостаток синтеза ингибиторов протеиназ или избыточный синтез протеолитических ферментов, обладающих деструктивным действием.

За развитие недостаточности а1-ИП отвечает ген, расположенный в 14-й паре хромосом. Выделяют 3 полиморфных варианта гена: М, Ъ и Б. Нормальной секрецией отличается гомозиготный Р!ММ вариант. Гетеро- или гомозиготные по Ъ и Б (Р1Мг, РМБ, Р^Б) варианты являются гипосекреторными и определяют высокий риск развития фиброзных изменений в легких и предрасположенность к развитию бронхолегочной патологии.

Результаты проведенного генотипирования а1 ИП методом аллельспецифичной ПЦР представлены на рис.2. Мутации гена а1 ИП были выявлены у 7 человек, с диагнозами: профессиональная бронхиальная астма, гиперчувствительный пневмонит, профессиональный бронхит. У 2-х больных были выявлены полиморфные Р^МБ

генотипы, у 5-ти лиц были выявлены Р1МЪ генотипы. Полученные результаты подтверждают проведенные ранее исследования по выявлению гипосекреторных вариантов генов а 1-ингибитора протеиназ и их роль в патогенезе профессиональной бронхолегочной патологии

□ мутации- Р1М2,Р1М5

□ норма - Р/ММ

Рис.2 Частота встречаемости гипосекреторных аллелей гена а1ИП у обследованных лиц

За избыточный синтез ММП-1 отвечает ген, расположенный в 11-й паре хромосом. При определении генотипов ММП-1 были обнаружены гетерозиготный генотип с инсерциями гуанина 01 у 47% обследованных лиц, и гомозиготный генотип с делециями гуанина й2 у - 15% (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о наследственно детерминированном повышении секреции протеолитического фермента матриксной металлопротеиназы-1, обладающей деструктивным действием.

□ гетерозиготный 01 генотип (инсерция) ■ гомозиготный Э2 генотип (делеция) а отсутствие инсерций/делеций - норма

15%

Рис.3 Частота встречаемости гиперсекреторных аллелей гена ММП-1 у обследованных лиц

Результаты изучения распределения мутаций (инсерций 01 и делеций й2) по различным нозологическим формам представлены на рис.5. Наибольшее количество гетеро- и гомозиготных вариантов гена ММП-1 встречалось в группах профессионального хронического бронхита и силикоза соответственно.

Рис.4 Встречаемость нормального, гомо и гетерозиготного вариантов гена ММП-1 в зависимости от нозологической формы патологии.

При сопоставлении тяжести клинического течения заболевания и наличия мутаций была выявлена достоверная связь между этими показателями. Так при наличии гетеро- и гомозиготных вариантов частота развития эмфиземы легких и пневмосклероза существенно превышает наличие этих клинических признаков у лиц при отсутствии мутаций (таб.3).

Таблица 3

Зависимость тяжести течения заболевания от наличия гиперсекреторных мутаций гена ММП-1

Мутации ММП-1 Дыхательная Эмфизема Пневмо- 1

недостаточность (степень) легких склероз

1,1-2 2, 2-3 3

отсутствие инсерций/делеций - 22% 38% 5% 28% 16%

норма

гетерозиготный 01 генотип (инсерция) 17% 51% 25% 71%** 58%**

гомозиготный 02 генотип (делеция) 11% 53% 26% 84%** 42%*

Примечание. Достоверность различий с группой лиц с отсутствием делеций/инсерций. **р<0,001; * р<0,05

Так, эмфизема у носителей гетерозиготного генотипа гена матриксной металлопротеиназы-1 встречалась у 71% лиц(%2 - 17,23 при р <0,0001), у носителей гомозиготного генотипа гена матриксной металлопротеиназы-1 02 - у 84% лиц (х2 -14,77 при р <0,0001), при отсутствии инсерций/делеций эмфизема встречалась в 28% случаев. Признаки пневмосклероза у носителей гетерозиготного генотипа гена

матриксной металлопротеиназы-1 01 встречались у 58% лиц (х2-12,8 при р <0,0001), у лиц имеющих гомозиготный вариант генотипа гена матриксной металлопротеиназы-1 02 частота встречаемости составила 42% (х2 - 4,6 при р <0,032), тогда как при отсутствии инсерций/делеций признаки пневмосклероза наблюдались у 16% лиц.

Также представляло интерес проанализировать сочетание полиморфных аллельных вариантов генов матриксной металлопротеиназы-1 и а1- ингибитора протеиназ, один из которых связан с гиперсекрецией матриксной металлопротеиназы-1, обладающей деструктивным действием, а другой с гипосекрецией а1- ингибитора протеиназ и снижением ингибиторного потенциала у отдельных лиц. У 5 человек было выявлено сочетание 2 мутаций. Анализ зависимости тяжести клинического течения от наличия сочетания неблагоприятных аллельных вариантов гена матриксной металлопротеиназы1 и а1- ингибитора протеиназ представлен в таблице 4. Проведенный анализ выявил, что наличие совпадения гипо- и гиперсекреторных аллелей генов матриксной металлопротеиназы-1 и а1- ингибитора протеиназ характеризуется более тяжелым течением (дыхательная недостаточность - 2, 2-3 степени, наличие эмфиземы легких и сочетанной бронхолегочной и кожной патологии.

Таблица 4

Сочетание полиморфных гипо- и гиперсекреторных аллелей генов а1-ИП и

ММП-1 у больных профессиональной бронхолегочной патологией.

1 л о Я и я ч Дыхательная Курение Эмфизема легких Лневмосклер оз Сочетаниая патология генотип ммп-1 Генотип а1-ип

Профессиональная зронхиальная астма, -•р.тяж.теч. 2 + гетерозиготный в1 генотип(инсерция) р ¡мг

1рофессиональная бронхиальная астма, :р.тяж.теч., гормон )ависимая 2 + + аллергич. эиносинусопата а гетерозиготный генотип(инсерция)

"иперчув ств игельн ы й шевмонит 2-3 + + + экзема гетерозиготный 01 геиотип(инсерция) Р1мг

Профессиональная Зронхиальная астма, щиерг. 2 дерматит вер.конеч гетерозиготный 01 генотип(инсерция)

Профессиональный фонический бронхит 2 + + + экзема гомозиготный в2 генотип (делеция) PiMS

Таким образом, проведенные исследования по изучению состояния системы «протеолиз-аотипротеолиз» на уровне матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов расширяют представления о роли ограниченного и неограниченного протеолиза и свидетельствуют о патогенетической значимости данной системы в развитии профессиональной бронхолегочной патологии. Проведенные исследования биохимических и молекулярно-генетических показателей системы «протеолиз-антипротеолиз» выявили изменения соотношения между содержанием протеолитических ферментов и их ингибиторов во всех изученных группах с различной степенью выраженности, что свидетельствует об особенностях патогенетических механизмов развития представленных нозологических форм бронхолегочной патологии.

Анализ полученных результатов позволил выявить комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей протеиназно-ингибиторной системы для оценки индивидуального риска развития и прогноза профессиональных заболеваний бронхолегочной системы.

ВЫВОДЫ

1. У больных профессиональными заболеваниями легких выявлено нарушение баланса матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, в основе которого лежит изменение их соотношения. Наиболее выраженные изменения системы (повышение уровней нейтрофильной эластазы, тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 и а 1-ингибитора протеиназ, снижение уровня про-ММП-1) выявлены у больных пневмокониозами и профессиональным бронхитом. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании деструктивных процессов при данных нозологических формах.

2. У больных бронхиальной астмой выявлено достоверное снижение про-ММП-1, повышение тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ-1 при нормальных уровнях матриксных металлопротеиназ 2,8 и нейтрофильной эластазы, что свидетельствует о преобладании воспалительных процессов. Высокая встречаемость среди больных данной группы (18%) лиц с гиперсекреторными мутациями (инсерции и делеции) гена матриксной металлопротеиназы-1 является показателем неблагоприятного прогноза течения заболевания.

3. Для оценки индивидуального риска развития заболевания бронхолегочной системы и прогноза клинического течения на основании данных о нуклеотидной

последовательности гена ММП-1 был установлен характер мутаций (инсерции 01/делеции 02) промоторной области гена, подобраны праймеры для выявления гиперсекреторных аллелей гена ММП-1 и разработана тест-система.

4. У больных с различными формами профессиональной бронхолегочной патологии (профессиональный хронический бронхит, пневмокониоз, профессиональная бронхиальная астма) установлено наличие гиперсекреторных мутаций гена ММП-1 что свидетельствует об участии генетически детерминированной системы «протеолиз-антипротеолиз» в патогенезе указанной бронхолегочной патологии от воздействия промышленных аэрозолей сложного состава. Наибольшее количество гиперсекрегорных мутаций инсерции и делеции) гена матриксной металлопротеиназы-1 - 20% обнаружено у больных профессиональным хроническим бронхитом, в группе больных силикозом - 9%.

5. Сочетание полиморфных вариантов генов ММП-1 и а1-ингибитора протеиназ у отдельных лиц характеризуется наличием клинических осложнений в виде дыхательной недостаточности 2, 2-3 типа, наличия эмфиземы легких и пневмосклероза, сочетаннием бронхолегочной и кожной патологии.

6. У работников асбестцементного комбината в системе «протеолиз- антипротеолиз» были выявлены достоверно высокие уровни тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ при нормальных уровнях протеолитических ферментов, т.е. дисбаланс системы. Установленные нарушения (ТИМП-1) позволяют рассматривать эти показатели, как информативные критерии индивидуального риска развития бронхолегочной патологии при воздействии производственных факторов.

7. На основании проведенных исследований разработан комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей протеиназно-ингибиторной системы, включающий определение (инсерции/делеции гуанина гена ММП-1), про-ММП-1, НЭ, а1-ИП (определение гипосекреторных 8 и Ъ вариантов), ТИМП-1 для оценки индивидуального риска развития и прогноза заболевания.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фомина B.C., Кузьмина Л.П. Изучение генетического полиморфизма al-ингибитора протеиназ (ИП) и генов детоксикации у больных профессиональной бронхолегочной патологией тезисы на XVII Национальный конгресс по болезням органов дыхания Казань-2007г.

2. Фомина B.C., Кузьмина Л.П. Роль системы матрикс-разрушающих металлопротеиназ и их ингибиторов в патогенезе профессиональных заболеваний бронхолегочной системы - Материалы VI Всероссийского конгресса «Профессия и Здоровье». С. 648-649, Москва, 2007.

3. Л.П. Кузьмина, Н.И. Измерова, Л.М. Безрукавникова, H.A. Лазарашвили, , Г.В. Пай, B.C. Фомина, Е.В. Софронова. Определение полиморфизма генетико-биохимических систем для оценки индивидуальной чувствительности организма к воздействию неблагоприятных факторов производственной среды Методическое пособие. (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва 2005г.)

4. Л.П.Кузьмина, Л.М. Безрукавникова, М.М. Коляскина, В.С.Фомина, H.A. Лазарашвили, Е.Ф.Софронова Современные диагностические подходы при изучении действия на организм наночастиц Нанотехнологии и наноматериалы в медицине труда и промышленной экологии. Проблемы и пути обеспечения безопасности. Сборник докладов пленума Научного Совета по медико-экологическим проблемам здоровья работающих./ под ред. Акад. РАМН Н.Ф. Измерова. М. 2009-96с. Стр.40-47.

5. Кузьмина Л.П., Фомина B.C. Изучение роли системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов при профессиональной бронхолегочной патологии Материалы VIII Всероссийского Конгресса «Профессия и Здоровье» М.-2009,

6. Л.П. Кузьмина, Н.И. Измерова, H.A. Лазарашвили, Л.М. Безрукавникова, , М.М. Коляскина, В.С Фомина, Е.В. Софронова. Проблема индивидуальной чувствительности в медицине труда, Методическое пособие. (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва, 2009 г.)

7, B.C. Фомина, Л.П. Кузьмина Роль системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в патогенезе профессиональных заболеваний легких. Медицина труда и промышленная экология, №7, М 2010, с 29-33

Бумага "вуйоСору". Формат 60x90 1/32. Тираж 100 экз. Подписано в печать 23.08.2010 г. Отпечатано в типографии ООО КМП «Фирма ЭРА» 105484, Москва, Сиреневый б-р, д. 72 Тел.(495)464-1774

Комплексное и комбинированное воздействие вредных факторов производственной среды, приводит к возникновению и развитию бронхолегочной патологии различного генеза. Болезни органов дыхания от воздействия промышленных аэрозолей занимают ведущее место в структуре профессиональной заболеваемости трудоспособного населения в России. Они характеризуются высокой распространённостью и неуклонным ростом. [Измеров Н.Ф., 2009; Монаенкова A.M., 2002; Милишникова В.В., 2004 и др.] В настоящее время не теряют своей актуальности исследования по изучению механизмов повреждения легочной ткани, изысканию возможностей для ранней диагностики и представлению новых подходов к лечению данной патологии.

В патогенезе бронхолегочной патологии выделяют три ведущих составляющих: хроническое воспаление, дисбаланс в системе «протеолиз -антипротеолиз» и оксидативный стресс. При анализе данных последних лет обращает на себя внимание важность оценки баланса в системе протеолиз-антипротеолиз при заболеваниях воспалительной природы. Проведены многочисленные исследования системы «протеолиз-антипротеолиз» с определением содержания сериновых и цистеиновых протеиназ и их ингибиторов у больных профессиональной патологией бронхолегочной системы. [Л.П. Кузьмина 2003, 2005, 2008, О.В.Чиненная, 2003, О.И. Румянцева, 2005] Данные исследования свидетельствуют о том, что характер развития патологии, клинические проявления и течение заболеваний бронхолегочной системы у работающих определяются не только составом промышленных аэрозолей и длительностью воздействия вредных производственных факторов, но и индивидуальными особенностями организма.

В литературе освещены вопросы участия системы матриксных металлопротеиназ в развитии доброкачественных, злокачественных и хронических заболеваниях легких, таких как ХОБЛ, астма, туберкулез, рак легкого. [М.В. Веселовская 2007; Doornaet et al.2003; Amara et al. 2007; Bechtold et al. 1985; Hirano et al. 2003]. Однако, роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе профессиональной бронхолегочной патологии остается не изученной. Данные по частоте встречаемости полиморфных вариантов гена матриксной металлопротеиназы-1(ММП-1), являются неоднозначными и противоречивыми.

Система «протеолиз-антипротеолиз» регулируется несколькими генами, их соотношение может предопределять наследственную предрасположенность к тем или иным заболеваниям. Так, в случае наследственных нарушений правильности синтеза одного из звеньев системы возникает дисбаланс ферментов и их ингибиторов.

Протеолитические ферменты вызывают деградацию всех компонентов внеклеточного матрикса паренхимы легких, включая эластин, коллаген, фибронектин, ламинин, протеогликаны. При этом происходит разрушение эластического каркаса тканей и нарушение нормальной архитектоники легких. Тонкие эластические волокна межальвеолярных перегородок разрушаются быстрее, чем их пучки в стенках - формируется эмфизема легких. Возникает обструктивный синдром, в основе которого лежит нарушение равновесия эластического натяжения между легочной паренхимой и бронхами.

Все вышеизложенное определяет актуальность изучения системы протеолиз-антипротеолиз на уровне системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, сериновых протеиназ - нейтрофильной эластазы (НЭ) и al-ингибитора протеиназ (al ИП) с использованием молекулярно-генетических и биохимических методов исследования у больных профессиональными заболеваниями органов дыхания для выявления маркеров индивидуальной предрасположенности к развитию профессиональных заболеваний бронхолегочной системы и оценки выраженности воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани

Диссертационная работа выполнена в рамках госбюджетных тем ГУ НИИ медицины труда РАМН: № 0602 «Разработка дифференцированных систем комплексной профилактики профессиональной и производственно-обусловленной патологии и реабилитации работников современных производств с учетом ведущих факторов риска нарушения здоровья» и № 0904 «Производственные факторы, как триггеры в развитии наиболее распространенных форм общесоматической патологии и роль медицины труда в системе их профилактики»

Цель работы - изучение роли системы матриксразрушающих металлопротеиназ и их ингибиторов в патогенезе профессиональных заболеваний бронхолегочной системы для расширения представления о патогенетических механизмах формирования профессиональных заболеваниях легких с целью разработки биохимических критериев оценки риска развития бронхолегочной патологии и для оценки выраженности воспалительных и деструктивных процессов.

Для ее достижения предстояло решить следующие задачи:

1. Определить количественное содержание матрикс-разрушающих металлопротеиназ (про-ММР-1, ММР-2, ММР-8) и сериновых протеиназ (НЭ) у больных различными формами профессиональной бронхолегочной патологии и оценить выраженность изменений в зависимости от нозологической формы и тяжести клинического течения.

2. Разработать тест-систему для определения гомо- и гетерозиготных вариантов (инсерций G1 и делеций G2) гена матриксной металлопротеиназы -1. Провести генотипирование ММП-1 у обследованных лиц, с целью установления генетически обусловленной гиперсекреции фермента.

3. Проанализировать состояние антипротеазной системы: определить количественное содержание тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 (ТИМП-1) и al- ингибитора протеиназ (al-ИП) биохимическими методами и провести генотипирование al- ингибитора протеиназ методами ДНК-диагностики с целью оценки их диагностической значимости и выявления возможной взаимосвязи между указанными ингибиторами.

4. Изучить зависимость клинических осложнений различных нозологических форм профессиональной бронхолегочной патологии от наличия полиморфных гипер- и гипосекреторных вариантов генов матриксной металлопротеиназы-1 и al- ингибитора протеиназ.

5. Научно обосновать выбор наиболее информативных критериев оценки индивидуальной предрасположенности к развитию профессиональных заболеваний бронхолегочной системы и оценки выраженности воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани.

Научная новизна и теоретическая значимость работы состоит в изучении системы протеолиз-антипротеолиз на уровне системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов с использованием молекулярно-генетических и биохимических методов. В результате проведенных исследований получены новые данные, расширяющие представления о патогенетических механизмах развития профессиональной бронхолегочной патологии. Впервые показано, что наиболее выраженные изменения в системе матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов были выявлены в группах больных профессиональным бронхитом и пневмокониозами (силикоз и гиперчувствительный пневмонит).

Впервые разработана тест-система для определения генетического полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-1, на основании знания о характере полиморфизмов инсерций/делеций гуанина (1607delG) в промоторном участке гена.

Разработан новый способ детекции для выявления дефицитных SZ аллелей гена al- ингибитора протеиназ (FLASH-детекция), который позволяет сократить время проведения и стоимость анализа, а также делает более безопасным проведение анализа для персонала.

Изучена зависимость особенностей клинического течения профессиональных заболеваний органов дыхания (выраженность дыхательной недостаточности, наличие пневмосклероза и эмфиземы легких, наличие сочетанной патологии) от наличия полиморфных вариантов генов металлопротеиназы-1 (гетерозиготный вариант Gl-инсерция гуанина, гомозиготный вариант С2-делеция гуанина и al- ингибитора протеиназ (PiMM, PiMZ, PiMS).

Проведена оценка диагностической информативности биохимических и молекулярно-генетических методов исследования. Показано, что биохимические методы позволяют изучать механизмы формирования воспалительно-деструктивных изменений в легочной ткани, оценить степень выраженности этих изменений.

Применение генетических методов анализа (пиросиквенирование и аллельспецифичная ПНР-реакция) для выявления полиморфных вариантов генов металлопротеиназы-1 и a 1-ингибитора протеиназ дает возможность проводить скрининговые исследования для оценки риска развития профессиональных заболеваний бронхолегочной системы.

Практическая значимость работы. Разработана тест-система для определения инсерций G/- (G1) и делеций -/- (G2) гена матриксной металлопротеиназы-1. Разработан комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей протеиназно-ингибиторной системы, включающий определение (инсерции/делеции гуанина гена металлопротеиназы-1), профермента матриксной металлопротеиназы-1, нейтрофильной эластазы, al-ингибитора протеиназ (определение гипосекреторных S и Z вариантов), тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 для оценки риска развития и прогноза заболевания.

Основными формами внедрения являются:

1. Заявка на патент «Способ прогнозирования риска развития профессиональной бронхолегочной патологии» (№ 2010134590 от 19.08.2010г.)

2. Материалы диссертационной работы были использованы при составлении методического пособия для врачей «Определение полиморфизма генетико-биохимических систем для оценки индивидуальной чувствительности организма к воздействию неблагоприятных факторов производственной среды» Методическое пособие (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва 2005г.).

3. Материалы диссертационной работы были использованы при составлении методического пособия для врачей «Проблема индивидуальной чувствительности в медицине труда», Методическое пособие (Утверждено научным советом «Медико-экологические проблемы здоровья работающих», Москва, 2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии важную роль играет нарушение баланса матриксных металлопротеиназ и ингибиторов, в основе которого лежит изменение их соотношения, а также наличие полиморфных гипо- или гиперсекреторных мутаций генов ферментов и ингибиторов.

2. Сочетание неблагоприятных гетеро и гомозиготных аллелей генов металлопротеиназы -1 и al- ингибитора протеиназ характеризуется тяжелым течением и наличием сочетанной бронхолегочной и кожной патологией.

3. Для оценки риска развития, тяжести клинического течения и прогноза профессиональной бронхолегочной патологии целесообразно определение биохимических и молекулярно-генетических показателей системы «протеолиз-антипротеолиз» на уровне ферментов металлопротеиназы -1, нейтрофильной эластазы и ингибиторов - al-ингибитора протеиназ, тканевого ингибитора металлопротеиназ-1.

выводы

1. У больных профессиональными заболеваниями легких выявлено нарушение баланса матриксных металлопротеиназ и ингибиторов, в основе которого лежит изменение их соотношения. Наиболее выраженные изменения системы (повышение уровней нейтрофильной эластазы, тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 и а 1-ингибитора протеиназ, снижение уровня про-ММП-1) выявлены у больных пневмокониозами и профессиональным бронхитом. Полученные результаты свидетельствуют о преобладании деструктивных процессов при данных нозологиях.

2. У больных бронхиальной астмой выявлено достоверное снижение про-ММП-1, повышение ТИМП-1 при нормальных уровнях матриксных металлопротеиназ 2,8 и нейтрофильной эластазы, что свидетельствует о преобладании воспалительных процессов. Высокая встречаемость среди больных данной группы (18%) лиц с гиперсекреторными мутациями (инсерции и делеции) гена матриксной металлопротеиназы-1 является показателем неблагоприятного прогноза заболевания.

3. Для оценки индивидуального риска развития заболевания бронхолегочной системы и прогноза клинического течения на основании данных о нуклеотидной последовательности гена ММП-1 был установлен характер мутаций (инсерции G1/делеции G2) промоторной области гена, подобраны праймеры для выявления гиперсекреторных аллелей гена ММП-1 и разработана тест-система.

4. У больных с различными формами профессиональной бронхолегочной патологией (профессиональный хронический бронхит, пневмокониозы, профессиональная бронхиальная астма) выявлено наличие гиперсекреторных мутаций гена ММП-1: гетерозиготный (инсерция) G1 генотип - 39%, гомозиготный (делеция) G2 генотип— 13% и наличие мутаций гена al ИП — 6%, что свидетельствует об участии генетически детерминированной системы «протеолиз-антипротеолиз» в патогенетических механизмах развития бронхолегочной патологии от воздействия промышленных аэрозолей сложного состава. Наибольшее количество гиперсекреторных мутаций инсерции и делеции) гена матриксной металлопротеиназы-1 - 20% обнаружено у больных профессиональным хроническим бронхитом, в группе больных силикозом - 9%.

5. Сочетание полиморфных вариантов генов ММП-1 и al-ИП у отдельных •лиц характеризуется наличием клинических осложнений в виде дыхательной недостаточности 2, 2-3 типа, наличия эмфиземы легких и пневмосклероза, сочетанием бронхолегочной и кожной патологии.

6. У работников асбестцементного комбината в системе «протеолиз -антипротеолиз» были выявлены достоверно высокие уровни тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ при нормальных уровнях протеолитических ферментов, т.е. признаки нарушения биологического баланса в системе. Указанные показатели (повышение уровня ТИМП-1 и наличие лиц с гиперсекреторными мутациями гена матрикснойметаллопротеиназы-1 (9% лиц)) позволяют рассматривать эти показатели, как информативные критерии индивидуального риска развития бронхолегочной патологии при воздействии производственных факторов.

6. На основании проведенных исследований разработан комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей протеиназно-ингибиторной системы, включающий определение (инсерции/делеции гуанина гена ММП-1), про-ММП-1, НЭ, al-ИП (определение гипосекреторных S и Z вариантов), ТИМП-1 для оценки индивидуального риска развития и прогноза заболевания.

112