Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование механизмов развития окислительного стресса при воспалении и возможностей его антиоксидантной коррекции

На правах рукописи

ЗЕНКОВ Николай Константинович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ ВОСПАЛЕНИИ И ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЕГО АНТИОКСИДАНТНОЙ КОРРЕКЦИИ

14 00 16 - патологическая физиология 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2007

003066834

Работа выполнена в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г Новосибирск)

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Меньшикова Елена Брониславовна

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

Доктор биологических наук

профессор Гичинский Михаил Абрамович

Доктор биологических наук

профессор Гуляева Людмила Фёдоровна

Ведущая организация Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (г Томск)

Защита диссертации состоится ¿АГиЬ^г007 г в ^ часов на заседании дис-

сертационного совета Д 001 048 01 в Государственном учреждении Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу ул Академика Тимакова, д 2, 630117 Тел/факс 8(383)333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Автореферат разослан"_

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ПальчиковаН А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В организмах человека и животных постоянно протекают реакции с участием высокореакционных активированных кислородных метаболитов (АКМ О 2, ОН" и др) На образование АКМ расходуется от 5 до 10% потребляемого кислорода [Esterbauer Н, 1993] Сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных процессов с участием АКМ Нельзя однозначно сказать, насколько токсичны АКМ или насколько они необходимы при развитии типовых патологических процессов Исследования, проведенные на животных-нокаутах, показывают, что ключевые элементы продукции АКМ и антиоксидантной защиты в своем большинстве не являются критическими для жизнедеятельности организма Мыши, нокаутированные по каталазе, Cu,Zn- и зксграцеллюлярной супероксиддисмутазе, глутатионпероксидазе 1, металлотионеинам 1 и 2, фактору транскрипции Nrfi рождаются и развиваются нормально, однако генетические нарушения продукции АКМ и элементов антиоксидантной защиты проявляются с возрастом, а также при различных воздействиях, таких как гипероксия, ионизирующая радиация, введение параквата или Н2О2

В настоящее время большинство исследователей считают АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференциров-ки, пролиферации и апоптоза клеток [Турпаев КТ 2002, Linnane AW et al, 2006] Так как развитие типовых патологических процессов в той или иной степени связано с изменением клеточных программ, то ясно, что течение многих заболеваний и патологических процессов определяется балансом прооксидантов и антиоксидангов Однако в большинстве случаев неизвестно, каков механизм регуляторного действия АКМ - воздействие ли это на мембраны, киназы, редокс-чувствительные факторы транскрипции или другие клеточные элементы Таким образом, участие одних и тех же молекул в повреждении клеток и тканей, в их защите от агрессии микроорганизмов, а также в процессах внутриклеточной и межорганной регуляции заставило исследователей по-новому взглянуть на биологическую роль АКМ в патофизиологических процессах [Surh У J et al, 2005] Это делает актуальным изучение молекулярно-клеточных механизмов генерации АКМ, их биологическую роль и возможности антиоксидантной терапии при типовых патологических процессах, среди которых одним из важнейших является воспаление

Цель исследования: изучить молекулярно-клеточные механизмы развития окислительного стресса при патологических процессах воспалительной природы и возможности коррекции его деструктивных эффектов антиоксидантами

Задачи исследования

1 Разработать комплекс био- и хемилюминесцентных методов оценки параметров окислительного стресса m vitro на клеточных культурах и m vivo в организмах человека и животных

2 В условиях, моделирующих состояния фагоцитирующих клеток в организме, изучить особенности их окислительного метаболизма при ишемии и реперфузии, а также трансформации в "пенистые" клетки

3 На модели трансформации перитонеальных макрофагов в "пенистые" клетки при инкубации с модифицированными липопротеинами низкой плотности изучить изменение основных механизмов генерации АКМ

4 В экспериментальных системах исследовать антиокислительные и защитные свойства новых водорастворимых фенольных антиоксидангов, синтезированных на основе бромзамещенных апкилфенолов

5 Исследовать возможность регуляции воспалительного процесса с помощью водорастворимых фенольных актиоксидантов с бифункциональным действием

3

Í

6 Исследовать изменение показателей хемипоминесцентного ответа гранулоцитов в динамике экспериментальных типовых патологических процессов у животных (зимозан-индуцированное воспаление, гипероксия, развитие перевиваемой опухоли)

7 С помощью комплекса био- и хемилюминесцетгных методов изучить проокси-дантные и антиоксидантные параметры окислительного стресса у людей с хроническими воспалительными заболеваниями разного этиопатогенеза

Научная новизна Разработаны теоретические модели активации кислорода в реакциях с металлопротеинами, а также монооксигеназных реакциях с цитохромами Р450

Впервые показано, что продукция гипогапогенитов не зависит от содержания кислорода в культурапьной среде и сохраняется даже при концентрациях 02 меньше 5 мкМ Макрофаг-активирующий фактор, полученный из митоген-стимулированных лимфоцитов, снижал продукцию супероксидного радикала, и одновременно усиливал образование других форм АКМ, вызывающих ХЛ люминола. Трансформация макрофагов в "пенистые клетей" при культивировании с модифицированными ЛНП сопровождается снижением спонтанной XJI с люцигенином, отражающей внутриклеточную продукцию О ¡ митохондриями, интенсивность зимозан-усиленной ХЛ не изменялась, что указывает на сохранение функциональной активности NADPH-оксидазы

Впервые установлено, что изменение ХЛ ответа гранулоцитов крови отражает развитие воспалительного процесса мононуклеарного типа (зимозан-индуцированное воспаление у экспериментальных животных), при экссудативном поражении легких в условиях гиперошш ХЛ ответ не изменялся Выявлено 2 альтернативных механизма изменения суммарной метаболической активности гранулоцитов периферической крови либо за счет изменения количества циркулирующих клеток, либо за счет их кондиционирования, показано, что процессы кондиционирования являются доминирующими и регулируются моно-нуклеарными фагоцитами Исследование ферментативных механизмов продукции АКМ у преждевременно стареющих крыс с повышенным радикалообразованием (линия OXYS) выявило повышенный уровень продукции О ~г и Н2О2 гранулоцитами крови и сниженный уровень синтеза OJ в митохондриях по сравнению с животными исходной линии Вистар Крысы линии OXYS обладали повышенной устойчивостью к высотной гипоксии, однако развитие локального воспаления у них было сходным с таковым у крыс линии Вистар

С помощью разработанного комплекса хемилюминесцентных методов проведен анализ радикальных окислительных процессов и ингибирующих их систем при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), показано, что степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса У больных ХНЗЛ и язвенной болезнью преобладание прооксидантного компонента определяется главным образом за счет прими-рования гранулоцитов крови и снижения антиокислительной активности сыворотки, в то время как у больных ИБС - в большей степени за счет существенного повышения процессов "ПОЛ сыворотки Использование разнонаправленных тестовых нагрузок, антиокси-дантных (внутримышечные инъекции витамина Е) и прооксидантных (аутотрансфузия УФ-облученной крови), в целом приводила к сходному результату - снижению окислительного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов крови

В разных экспериментальных системах in vitro и in vivo впервые исследованы антиоксидантные и противовоспалительные свойства новых водорастворимых фенольных соединений комбинированного действия, синтезированных на основе бромзамещенных алкилфенолов, показана высокая противовоспалительная активность и регуляторное действие частично экранированного фенола с тиосульфонатной группой в пара-положении, a также возможность угнетения воспалительного процесса посредством воздействия на экс-

прессию генов, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом

Научно-практическая значимость. Разработан комплекс методов оценки параметров окислительного стресса, включающий в себя определение а) активности метаболического "взрыва" при стимуляции гранулоцитов в образцах цельной крови, б) опсониче-ской активности сыворотки крови по динамике ХЛ ответа гранулоцитов при стимуляции зимозаном, в) концентрации образующихся в сыворотке пероксильных радикалов по интенсивности спонтанной биохемилюминесценции, г) суммарной антиокислительной активности сыворотки как величины, обратной интенсивности ее НгОг-индуцированной ХЛ Показана возможность выполнения комплекса методов в микроварианте с использованием 0,1 мл крови человека или экспериментального животного

Для новых серосодержащих антиоксидантов, синтезированных на основе алкилфе-нолов, выявлена способность стимулировать экспрессию генов, кодирующих ферменты 2 фазы детоксикации ксенобиотиков, и ингибировать развитие острого воспаления, что открывает перспективы создания нового класса противовоспалительных препаратов

Показана принципиальная возможность регистрации спонтанной биохемилюминесценции с поверхности тела человека в целях клинической диагностики

Положения, выносимые на защиту:

1 Условия, in vitro моделирующие состояния фагоцитирующих клеток в организме (содержание кислорода, действие цитокинов, захват макрофагами модифицированных ли-попротеинов), в значительной степени определяют основные механизмы генерации АКМ и хемилюминесцентный ответ клеток в присутствии разных люминофоров и стимуляторов, исследование которых позволяет более адекватно экстраполировать и прогнозировать развитие окислительного стресса m vivo

2 У животных в условиях индукции типовых патологических процессов кондиционирование (примирование и деактивация) циркулирующих в крови гранулоцитов регулируются макрофагами, в результате чего воспаление мононуклеарного типа сопровождается изменением хемилюминесцентного ответа гранулоцитов, в то время как при воспалении деструктивно-экссудативного типа такие изменения не наблюдаются

3 С помощью комплекса био- хемилюминесцентных методов показано развитие окислительного стресса при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь), что проявляется в усилении способности гранулоцитов крови к генерации АКМ, интенсификации процессов ПОЛ в сыворотке с одновременным снижением ее антиокислительной активности Степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса.

4 Синтезированные на основе бромзамещенных алкилфенолов фенольные соединения, содержащие несколько функциональных групп, проявляют в разных экспериментальных системах m vitro и m vivo уникальные антиоксидантные свойства, что делает их перспективными в плане разработки новых лекарственных препаратов

5 Синтезированные водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают выраженным противовоспалительным действием и индуцируют экспрессию гена GSTP1, что указывает на их способность активировать антиоксидант-респонсивный элемент

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Био-хемшпоминесценция" (Красноярск, 1983), школе-конференции молодых ученых "Актуальные вопросы патофизиологии" (Новосибирск, 1985), IV Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), Всесоюзном семинаре "Гомеостатика живых и технических систем" (Иркутск, 1987), Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Томск, 1989), научной конференции "Проблемы донозологической гигиенической диагностики" (Ле-

нинград, 1989), III Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990), Всесоюзной школе-семинаре "Био-термо-хемилюминесценция" (Суздаль, 1990), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы применения магнитных и электромагнитных полей в медицине" (Рига, 1991), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Патогенез хронического воспаления" (Новосибирск, 1991), научно-практической конференции "Био-хемилюминесценция Практическое применение" (Москва, 1991), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Магнитобиология и магнитотерапия в медицине (Сочи, 1991), Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992), I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), конференции "Свободно-радикальные механизмы повреждения мозга при патологических состояниях и заболеваниях" (Москва, 1993), II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения НН Аничкова (Санкт-Петербург, 1995), 6 Национальном1 Конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), научно-практической конференции "О создании единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири" (Новосибирск, 1996), Международной конференции "Свободнорадикальные процессы экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999), Научной конференции "Актуальные проблемы кардиологии" (Томск, 2000), II Всероссийском симпозиуме "Хроническое воспаление" (Новосибирск, 2000), международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), Международной конференции "Свободнорадикальные процессы и антиоксиданты в развитии и функциях нервной системы от плода к старению" (Санкт-Петербург, 2001), Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы фундаментальные и клинические аспекты", (Новосибирск, 2002), VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002), 3-й и 4-й научно-практических конференциях с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003, 2005), XV международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 130 научных работ, в том числе 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертационных работ, 6 статей в зарубежных журналах, 5 монографий

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 10 глав, включающих обзор литературы, описание материала и методов исследования, изложение собственных результатов, обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы 453 источника (109 отечественных и 344 зарубежных) Материалы диссертации изложены на 237 страницах машинописного текста Работа иллюстрирована 29 таблицами и 39 рисунками

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Антиокислительную активность фенольных антиоксвдантов оценивали in vitro по способности ингибировать ПОЛ в экспериментальных системах медь-индуцированного окисления этилолеата при 60°С в водно-эмульсионной среде (вычисляли период индукции т) [Цепалов В Ф, 1992], медь- (5 мкМ CuS04) и железо-индуцированного (25 мкМ FeS04) окисления ЛНП при 37°С в течение 30 мин (флуоресцентным методом измеряли накопление реагирующих с ТБК продуктов [Yagi К, 1976]), а также по способности угнетать ХЛ в описанных ниже модельных системах

Исследования m vitro выполнены на первичных культурах перитонеальных макро-

фагов, которые получали промыванием охлажденной средой 199 брюшной полости мышей-гибридов Fi (СВА>С57В1/6) массой 16-18 г Клетки дважды отмывали и ресуспенди-ровали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина Суспензию разливали в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм по 2 Л О6 клеток и инкубировали при 37°С в атмосфере СОг (5%) 4 часа, затем неприкре-пившиеся клетки удалялись двукратным промыванием инкубационной средой Полученные монослои макрофагов использовались в эксперименте или дальше инкубировались с добавлением в среду 50 мкг/мл ацетилированных ЛНП (получение пенистых клеток) или разных концентраций макрофаг-активирующего фактора (МАФ)

ЛНП (1,019-1,055 г/мл) выделяли из плазмы доноров с нормальными липидными показателями методом ультрацентрифугирования в плотности КВг После выделения удаление КВг проводили посредством гельфильтрации на колонке с сефадексом G-25 и определяли содержание белка по Лоури Ацетилирование ЛНП проводили с использованием уксусного ангидрида по методу [Goldstein J L et al, 1979] с последующей хроматографией на сефадексе G-25 и стерилизацией через миллипоровый (0,45 мкм) фильтр Содержание свободного холестерина и общего холестерина в пенистых клетках определяли энзимати-ческим методом с помощью стандартного набора реактивов, адаптированным для клеточных культур [Gumble W et al, 1978] Эксперименты выполнялись совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальных моделей атерогенеза НИИ терапии СО РАМН (рук проф дмн МИ Душкин)

МАФ получали в виде супернатанта стимулированных конканавалином А сплено-цитов С этой целью селезенки мышей гомогенизировали в культуральной среде с добавлением 5 Л О'7 М 2-меркаптоэтанола и 10 мМ HEPES, клеточную суспензию разбавляли до концентрации 5 х106 клеток/мл и инкубировали 48 часов в присутствии 5 мкг/мл конка-навалина А После инкубации супернатанты фильтровали через миллипоровые фильтры (размер пор 0,45 мкм) и хранили в замороженном состоянии при -20°С Работа выполнялась совместно с сотрудником НИИ иммунологии СО РАМН Г Ю Любимовым

Экспрессию гена GSTP1 в клетках гепатомы человека HepG2 определяли методом ОТ-ПЦР ПЦР проводили на амплификаторе Hybaid OMN-E в буфере (67 мМ Tris-HCI (рН 8,0), 16 мМ (NH4)2S04, 1,5 мМ MgCh, 0,001% Tween-20) с использованием полученной кДНК, смеси dNTP, специфических праймеров и Taq-ДНК-полимеразы Для амплификации продукта гена GSTPI использовали праймеры 5-ATGACTATGTGAAGGCACTGC-3' и 5'-TGTTTCCCGTTGCCATTGAT-3' (длина продукта - 280 п о ), в качестве внутреннего стандарта в реакции использовали праймеры для амплификации мРНК гена р-актина 5'-AGCCATGTACGTAGCCATCCA-3' и 5'-TCTCCGGAGTCCATCACAATG-3' (длина продукта- 81 по) Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8%-ном ПААГ при соотношении акриламид бисакриламид- 20 1 в Tns-боратиом буфере при 20°С В качестве маркера длины использовали pBR322/Bsu(HaeUT) Для определения относительного содержания мРНК интегральную оптическую плотность полос, соответствующих ген-специфическим продуктам ПЦР, нормализовали на поглощение полос р-актина Эксперименты выполнялись совместно с О Н Гусаченко и О А Шкляевой, сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Экспериментальные исследования с индукцией типовых патологических процессов выполнены на 95 взрослых крысах самцах породы Вистар массой 180-200 г (неспецифическое воспаление и гипероксическое поражение легких) и самках породы Спрег-Доули массой 160-190 г (опухолевый рост) Неспецифическое системное воспаление индуцировали внутривенным или внутрибрюшинным введением зимозана (10 и 30 мг/животное соответственно), локальное - интраплангарным введением 1 мг каррагинана, при исследо-

вании противовоспалительного действия препаратов тестируемые соединения в дозе 100 мг/кг веса тела вводили per os с помощью внутрижелудочного зонда за 1 ч до индукции воспаления каррагинаном Окислительное поражение легких вызывали помещением животных в барокамеру с атмосферой чистого кислорода (больше 95%) Развитие перевиваемой опухоли молочной железы вызывали трансплантацией крысам самкам в область живота кусочков опухоли, первоначально индуцированной 7,12-диметил-бензантраценом [Нагибнева И Н и др, 1985] (эксперименты выполнялись совместно с Т М Морозовой и 3 Б Левашовой, сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН)

В качестве обследуемых в работе выступали пациенты, проходившие курс лечения в клинике ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, и практически здоровые добровольцы (группа сравнения, 58 человек) У пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования Обследование, постановка диагноза, назначения и контроль за проведением терапевтических манипуляций выполнялись врачами клиники ГУ НЦКЭМ, взятие крови осуществлялось персоналом кли-нико-биохимической и иммунологической лаборатории ГУ НЦКЭМ Всего обследовано 202 больных ХНЗЛ (диагноз ставился на основании данных клинических, рентгенологических, бронхологических и лабораторных методов исследования), 78 больных ИБС (диагноз устанавливался на основании клинической картины, результатов биохимических исследований, велоэргометрической пробы и электрокардиографического исследования), 33 пациентов с язвенной болезнью желудка и двенадцагаперстаой кишки, а также 27 человек с хроническим гастродуодонитом в стадии ремиссии

На 22 больных ХНЗЛ исследован эффект внутримышечного введения антиокси-данта а-токоферола, препарат назначался в дозе 300 мг в сутки в течение 6 дней одновременно с проведением стандартной терапии, в группу сравнения (22 человека) отбирались больные со сходным диагнозом, но получающие только стандартную терапию Кроме того, у 15 больных ХНЗЛ было проведено исследование влияния аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) на параметры окислительного метаболизма Курс АУФОК-терапии проводился заведующим блоком интенсивной терапии клиники НЦКЭМ к м н Д И Азбелем по стандартной методике с использованием аппарата "Изольда" и состоял из 5-6 сеансов, выполняемых через день Исследование БХЛ с поверхности тела человека было проведено на 17 здоровых добровольцах мужчинах и 24 больных ХНЗЛ

Оборудование

В работе использовались ультрацентрифуга L 8-М ("Beckman", Австрия), спектрометр Specord НР-8453 ("Hewlett Packard", Германия), спектрометр Bruker DR. 500 и Фурье-спектрометр Vector 22 ("Bruker" Германия), амплификатор Hybaid OMN-E ("Hybaid", Великобритания), спектрофлуориметр Р-3000 ("Hitachi", Япония), жидкостный сцинтилля-ционный счетчик "Mark-3" ("Tracor Analytical", Япония), СОг-термостат Все измерения интенсивности ХЛ и биохемилюминесценции (БХЛ) проводились на модифицированном трехканальном хемилюминометре "Фотон" производства СОПКТБ СО ВАСХНИЛ или установке собственной конструкции, собранной по аналогичной схеме

Регистрация ХЛ

Все измерения ХЛ выполняли в условиях термостатирования при 37°С Интенсивность спонтанной БХЛ сыворотки крови измеряли по методу [Журавлев А И, 1983], определяя разницу интенсивностей свечения 1 мл сыворотки и фонового значения Интенсивность индуцированной Н2Ог БХЛ регистрировали по методу [Серкиз Я И и др, 1984] в измерительную кювету, содержащую 0,9 мл среды Хенкса (во всех ХЛ сис-

темах использовали среду Хенкса без фенолового красного) и 0,1 мл свежей сыворотки крови, вводили 0,1 мл 30%-ной Н2О2 и измеряли вспышку свечения, которая отражает антиокислительную активность сыворотки

Способность фенольных соединений ингибировать О ~ изучали по угнетению ХЛ в системе "люцигенин (10 мкМ) - ксантиноксидаза (5 х10~3 БД/мл) - ксантин (50 мкМ)" [Меныцикова Е Б и др, 1992], препарат вводили на 7 минуте с начала реакции Тушение фенольными соединениями NOVONOCT оценивали в системе "SIN-1 (20 мкМ) - люцигенин (100 мкМ)" [Van Dyke К et al, 1998] Тестируемый препарат вводили в систему одновременно с SIN-1 и люцигенином, определяли интенсивность ХЛ на пятой минуте с начала реакции Эффективность действия соединения выражали в процентах от соответствующего значения в отсутствие препарата.

Регистрацию ХЛ монослоя макрофагов проводили непосредственно со дна пластиковых чашек, с этой целью чашки с монослоем клеток дважды промывали средой Хенкса, добавляли 2 мл 100 мкМ раствора люцигенина или люминола в среде Хенкса и в течение 3 мин регистрировали спонтанную ХЛ, после чего макрофаги стимулировали добавлением 0,2 мл суспензии (20 мг/мл) зимозана, опсонизированного сывороткой мышей (индукция дыхательного взрыва через мембранные рецепторы), или ФМА (2,5 мкг/мл, индукция дыхательного взрыва через активацию протеинкиназы С) После добавления стимулятора измеряли интенсивность ХЛ макрофагов до наступления максимума свечения

ХЛ ответ гранулоцитов регистрировали в образцах цельной крови [Tono-Oka Т et al ,1983] в измерительную кювету, содержавшую 0,7 мл среды Хенкса, 0,1 мл взятой из вены крови и ОД мл 10 мкМ люминола (регистрируются генерируемые в процессе дыхательного взрыва О 2, Н2О2 и гипогалогениты) или люцигенина (регистрируется О ~2), вводили 0,1 мл суспензии неопсонизированного зимозана (2 мг/мл) и измеряли интенсивность ХЛ до достижения максимума свечения Определяли максимальную интенсивность ХЛ (I max), отражающую суммарную метаболическую активность гранулоцитов, и время наступления максимума свечения (Тшах), характеризующее опсоническую активность сыворотки Одновременно в образцах крови определяли общее количество лейкоцитов и процентное содержание гранулоцитов и высчитывали удельную интенсивность ХЛ ПЯЛ (I тах/гранулоцит) При изучении антиоксидантных свойств фенольных соединений раствор исследуемого препарата вводили в измерительную кювету перед добавлением зимозана. Эффективность действия оценивали по интенсивности хемилюминесценции в максимуме и выражали в процентах от соответствующего значения в отсутствие препарата.

Анализ данных

Концентрации 50% ингибирования (IC50) вычисляли интерполяцией из зависимостей "доза - ответ", полученных в результате тестирования не менее четырёх значимых концентраций исследуемых фенольных соединений Итоговые данные ОТ-ПЦР по уровню экспрессии гена GSTPI представлены в процентах относительно значения GSTPI/0-актин в клетках, инкубированных с трет-бутилгидрохиноном (tBHQ) Прочие данные представлены в виде М±т, где М - среднее арифметическое, т - стандартная ошибка среднего Для сравнения средних значений использовали дисперсионный анализ с последующим применением t-кригерия Стьюдента или критериев множественных сравнений Даннета и Дункана, различия между средними в группах считали значимыми при Р < 0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Активация кислорода в ферментативных реакциях

Наличие двух неспаренных электронов существенно ограничивает реакционную

способность молекулярного кислорода Однако в живых организмах в процессе эволюции выработались специализированные ферментативные системы восстановления молекулярного кислорода посредством переноса на него одного, двух или четырех электронов Все ферменты, восстанавливающие молекулярный кислород, представляют собой металло-протеины с активным центром, включающим один или несколько атомов (ионов) металла переменной валентности, который служит донором электронов для кислорода С позиций квантовой механики перенос заряда на кислород возможен только дискретными значениями, при этом волновую функцию описывающую состояние молекулы кислорода при связывании с активным центром, можно представить в виде разложения по отдельным виртуальным состояниям

Ч-Огсвяз = К0ЧО2 + Ki¥02 + К2ЧО ' + £ + 1С, ТО f + К5ЧО (1) В данном рассмотрении Ко, Kj К5 - коэффициенты, определяющие вклад каждого из состояний, а ТО2> ЧР'02 - волновые функции, описывающие состояния, которые

возникают в результате изменения спина электрона (Ч^Ог) либо добавления к молекуле кислорода соответствующего числа электронов Такая запись фактически означает, что при связывании кислорода происходит энергетическое расщепление основного состояния, в результате чего появляются восстановленные виртуальные состояния, так как процесс происходит в протежированном окружении, то свободная энергия связанного состояния снижается за счет появления восстановленных форм, энергии которых можно приблизительно аппроксимировать энергиями соответствующих состояний <'Ог>, <Н02*>, <Н2Ог>, <ОН" + Н20>, <2Н20> Преобладание того или иного состояния при связывании молекулярного кислорода прямо зависит от структуры активного центра фермента Из этого можно сделать вывод, что все металлопротеины, взаимодействующие с молекулярным кислородом, в той или иной степени способны образовывать АКМ, которые фактически являются продуктами неполного восстановления 02

Так как переходы между виртуальными состояниями <02>, <1Ог>, <0 2 >, <0 >, <Oj~>, <0 J" > сопровождаются изменением заряда, спина или того и другого, то их нельзя индуцировать с помощью электромагнитных полей, так как при электромагнитных взаимодействиях действуют законы сохранения заряда и спина Ввиду существования данных ограничивающих законов сохранения заряда и спина электромагнитные излучения не могут прямо индуцировать переходы между виртуальными состояниями кислородной молекулы, возникающими при связывании с активным центром фермента.

Антиоксидантные энзимы супероксиддисмутаза и каталаза относятся к классу ферментов, у которых с активным центром связывается не одна, а две молекулы кислорода, По крайней мере для одной формы СОД (Си^п-СОД) было показано, что фермент образует ОН-радикалы [Bast A et al, 1991], около 0,5% кислорода, образующегося при разложении перекиси водорода каталазой, находится в синглетном состоянии [Шинкаренко НВ-, 1982] При работе антиоксидантных ферментов образуются состояния, в которых с активным центром фермента оказываются связанными четыре атома кислорода или две молекулы 02 В этом случае возможны кооперативные переходы между состояниями без изменения суммарного заряда и спина Теоретически таких переходов может быть 12

1) 2<02><-*2< 102> (193 кДж/моль, 634 нм), 2) -сОгХО^^-с'ОгХО^ (96 кДж/моль, 1268 нм), 3) <02><0 2{ >ч->2<0 ¡Г> (121 кДж/моль, 1006 нм или теоретически 169 кДж/моль, 810 нм), 4) <02><0^><-х'02 ('Ag)><0^> (96 кДж/моль, 1270 нм), 5) <01' хО j х-»<02><0 J"> (109 кДж/моль, 1129 нм), 6) <02хО ^ ><-><0 ; ><0 > (205

кДж/моль, 595 нм или теоретически 167 кДж/моль, 729 нм), 7) <'02><0 ><->2<0 > (28 кДж/моль, 4419 нм), 8) <!02x0^>e<0^x0j"> (3,5 ккал/моль), 9) с'ОгХ)><-> 2<0 > (10 ккал/моль), 10) 2<0^><~><0^ ><0^> (167 кДж/моль, 729 нм), И) <0гх05">*х0^х0;!"> (17 ккал/моль), 12) <0 ><0 ><->2<0 > (96 кДж/моль, 1268 нм или теоретически 213 кДж/моль, 578 нм)

Изменение энергии при таких переходах можно грубо оценить, аппроксимировав энергию виртуальных состояний соответствующими свободными энергиями восстановленных форм кислорода, то есть приравняв энергии <Oj~> и Н2О2, <02~> и ОН* + Н20, <0 > и 2НгО Для такой оценки были использованы экспериментальные и теоретические значения энергий переходов, приведенные в работе [Singh А, 1978]

Эффективность переходов определяется плотностью соответствующих виртуальных состояний в разложении (1) Для каталазы базовыми состояниями, определяющими субстрат и продукты катализируемой реакции, являются <02>, <0 г{> и <0 >, из этого следует ожидать высокой эффективности переходов 1, 3, 6, 10, 12 Для СОД базовыми являются состояния <0г>, <0 ~г > и <0 \ >, соответственно, существенны переходы 1,2,3, 5, 10 Энергия квантов He-Ne лазера (длина волны 632,8 нм) близка изменениям энергии при переходах 1, 6, 10, 12 Поэтому следует ожидать, что при облучении СОД и каталазы светом He-Ne лазера будут индуцироваться переходы между виртуальными состояниями, при этом будет увеличиваться выход высокореакционных форм '02 и ОН*, которым соответствуют состояния <'02> и <01" > Прямое измерение этих форм АКМ - достаточно сложная задача, поэтому было применено два косвенных подхода, окисление билирубина (метод применяется для регистрации *02) и определение активности самих ферментов после облучения He-Ne лазера (ЛГ-75)

Реакционная смесь состояла из Н202 (10 мМ) и каталазы (5 мкг/мл) в фосфатном буфере (рН 7,2) Двухминутное облучение лазерным светом приводило к достоверному снижению содержания Н202 (определялась по поглощению при 240 нм) в реакционной смеси на 22 ± 7 %, что свидетельствует о повышении активности каталазы Билирубин (200 мкг/мл), введенный в реакционную смесь, окислялся в среднем на 13% сильнее в условиях облучения лазерным светом, что подтверждает усиление продукции *02

Теоретические разработки и полученные экспериментальные данные подтверждают возможность индукции лазерным светом переходов между виртуальными состояниями в молекулах антиоксидантных ферментов Представленная модель активации кислорода при взаимодействии с металлопротеинами позволяет объяснить, почему во многих ферментативных реакциях наблюдается образование разных форм АКМ, а также принцип ан-тиоксидантного действия лазерного света красного и инфракрасного диапазонов Вместе с тем данная проблема требует более точного и детального изучения спектральных характеристик индуцирующих ферменты излучений, что позволит повысить терапевтический эффект применения лазеров

Исследование антиоксидантных и противовоспалительных свойств новых фенольных соединений

Путем введения в структуру бромзамещенных алкилфенолов серосодержащих ио-ногенных фрагментов в Новосибирском НИИ химии антиоксидантов при государственном педагогическом университете были синтезированы структурно взаимосвязанные ряды гидрофильных соединений с разной степенью экранирования ОН-группы и содержащие в пара-положении апкильные заместители с группами -S03Na (С-9, С-10, С-13, С-17), или -

З-ЙОзШ (ТС-9, ТС-10, ТС-13, ТС-17) Данные соединения обладают высокой гидрофиль-ностью и бифункциональным действием, так как, помимо фенольной ОН-группы, содержат серосодержащие фрагменты, проявляющие антипероксидную активность

Исследование показало, что все соединения, имеющие гидроксильную и/или тио-сульфонатную группу, в той или иной степени проявляют ангиокислительные и антирадикальные свойства (таблицы 1 и 2) Метилирование функционально активной ОН-группы С-10 придавало соединению прооксидантные свойства, то есть его введение в экспериментальную систему либо усиливало окисление этилолеата и ЛНП, либо повышало продукцию радикалов и хемшпоминесценцию в других системах В экспериментах по окислению этилолеата и ЛНП антаокислительная активность соединений возрастала по мере увеличения степени экранирования ОН-группы, при этом тиосульфонаты (ТС-10, ТС-13 и ТС-17) обладали более выраженным эффектом, чем соответствующие сульфона

Таблица 1

Антиокислительная активность исследованных фенольных антиоксидантов (окисление этилолеата и ЛНП крови)

Соединение Окисление этилолеата (т, мин) Окисление ЛНП крови (Ю50, мкМ)

Обозначение Структура Си2+ Ре2"*"

С-10 НзО^О—(СНЛ303К;а 10 Зависимо стимули е от дозы рование

ТС-10 НзСО-О—(СН^БС^а 13 11800 >1 х106

С-9 НаН0-(СН2)з3°3Ма 38 2770 2650

ТС-9 НО~СЗ—(СВДз^С^а 53 398 381

С-13 НО—^—(СН^звОзКа 59 43 32

ТС-13 64 30 18

С-17 нф—(СН2)350зЫа 200 15 3,6

ТС-17 ноф-^зозш 258 10 1,5

Фенозан К но-(|—(СНОСОК 93 13 1,8

Примечания 1 т —период индукции окисления этилолеата 2 Здесь и далее (табл 2 и 3, рис 1) см список сокращений на с 34

Таблица 2

Антиокислительная активность исследованных фенольных антиоксидантов (дыхательный взрыв, О,, (ЖОСГ, ГС50, мкМ)

Соединение Метаболическая активность гранулоцитов О 2 (ксантин-ксантиноксидазная система) Перокси-нитрит

с люминолом | с люцигенином

С-10 Зависимое от дозы стимулирование

ТС-10 74 141 1285 16,5

С-9 214 245 2878 5,9

ТС-9 27 219 577 2,9

С-13 1170 1600 1064 10,1

ТС-13 525 1800 1214 9,7

С-17 631 724 207 24,7

ТС-17 123 68 1044 10,7

Фенозан К 800 1400 1170 21,3

ты (С-10, С-13 и С-17), что может быть связано с противоокислительным действием бивалентной серы тиосульфонатного фрагмента По антиокислительной активности соединение ТС-17 с двумя трет-бутильными заместителями в орто-положении превосходило соответствующий по строению известный антиоксидант фенозан калия

В системах с продукцией радикалов стимулированными гранулоцитами, в ксантин-ксантиноксидазной системе или при распаде 8М-1 явно выраженной зависимости между ингибирующим действием соединений и экранированием ОН-группы не наблюдалось (см табл 2) В хемилюминесцентных системах с люминолом (гранулоциты и 8Ш-1) тиосуль-фонаты превышали по своей активности соответствующие сульфонаты Это может быть связано с инактивацией тиосульфонатным фрагментом перекиси водорода и пероксинит-рита, которые, как известно, инициируют свечение люминола Результаты показывают, что антиоксидантаые свойства исследованных фенольных соединений в модельных условиях существенно зависят как от характера экранирования фенольной ОН-группы, так и от природы ионогенного фрагмента в пара-пропипыюм заместителе

Исследование противовоспалительного действия синтезированных фенольных соединений показало, что все препараты в большей или меньшей степени снижали развитие каррагинан-индуцированного отека лапы у крыс (рис 1) Наиболее выраженный эффект оказывал частично экранированный фенол с тиосульфонатной группой в пара-пропильном заместителе ТС-13 Прямой взаимосвязи между способностью соединений угнетать развитие отека и степенью экранирования ОН-группы не наблюдалось, в отличие от зависимости, обнаруженной в экспериментальных системах с окислением этилолеата и ЛНП (см табл 1) Важная роль при развитии воспалительных процессов отводится радикалам, в особенности N0", которые считаются ключевым индуцирующим элементом отека лапы крыс [8а1уегшп1 0, 1996] Однако взаимосвязь между противовоспалительным действием препаратов и их способностью ингибировать окислительный метаболизм гра-нулоцитов, продукцию АКМ ксантин-ксантиноксидазной системой или >Ю-радикалов не выявляется Поэтому мы предположили, что противовоспалительный эффект экзогенных

70 и

60 -

Контроль С-9 ТС-9 С-13 ТС-13 С-17 ТС-17 С-10 Фено-

занК

Рис 1 Влияние фенольных антиоксидантов на выраженность воспалительной реакции (* - достоверно значимое отличие от контрольной группы)

фенольных антиоксидантов может реализовываться через их действие на редокс-чувстви-тельные факторы транскрипции и, соответственно, на экспрессию генов, кодирующих белки, участвующие в воспалительном процессе, в промоторы которых входят активируемые этими транскрипционными факторами регуляторные участки, прежде всего анти-оксидант-респонсивный элемент (ARE) С целью проверки этой гипотезы на культуре клеток гепатомы человека HepG2 была исследована способность синтезированных соединений усиливать транскрипцию гена GSTP1, которая, как известно [Zhang Y, 1995], контролируется антиоксидант-респонсивным элементом

Глутатион-в-трансфераза Р1 человека (КФ 2 5 1 18) является ферментом II фазы детоксикации ксенобиотиков В промоторе кодирующего GSTP1-1 гена выявляются два сайта связывания NF-кВ, два участка связывания SP-1, один AP-1-регуляторный элемент, три последовательности ARE и ARE-подобный элемент [Zhang Y, 2002] В концентрации 20 мкМ исследованные фенольные соединения повышали экспрессию гена GSTP1 (табл 3) Наиболее эффективен был частично экранированный фенол ТС-13, активность которого при концентрациях 10-100 мкМ была в среднем в 1,5 раза выше активности "классического»' индуктора ARE tBHQ Тот факт, что данное соединение также в наибольшей степени подавляло развитие каррагинан-индуцированного отека (см рис 1), позволяет предположить, что в основе противовоспалительного действия синтезированных фенольных антиоксидантов лежит их способность индуцировать экспрессию контролируемых ARE генов, участвующих в развитии воспаления

Влияние кислорода на метаболическую активность фагоцитирующих

клеток

Ткани организма значительно отличаются по содержанию кислорода, так, если рОг в легких составляет около 160 мм ртст, то в области ишемизированного органа напря

Таблица 3

Уровень экспрессии гена ОвТР! в клетках НерС2, обработанных исследованными фенольными антиоксидантами

Соединение Концентрация (мкМ)

10 20 50 100

С-9 28,0* 106,6* 84,9* 5,2

ТС-9 4Д 124,5* 3,3 6,9

С-10 14,8* 138,8* 101,8* 13,0*

ТС-10 3,7 161,9* 97,8* 33,6*

С-13 0 128,9* 3,1 15,4*

ТС-13 12,8* 186,2* 151,7* 165,6*

С-17 2,3 151,1* 0 50,3*

ТС-17 57,4* 33,7* 88,4* 0

tBHQ 16,7* 100,0* 53,4* 192,6*

Контроль 0,006 0 0 0

Примечание результаты выражены в %, за 100% принято значение, полученное при обработке 20 мкМ tBHQ, * - достоверное отличие от контроля

женность снижается до 5 мм рт ст [Биленко М В ,1989] Образование АКМ представляет собой кислород-зависимый процесс, поэтому характер развития окислительного стресса может во многом определяться содержанием кислорода Многочисленные исследования [Маянский Д Н ,1991, Фрейдлин И С ,1984] показывают, что в среде с низкой концентрацией Ог ингибируется микробицидная функция фагоцитирующих клеток, вместе с тем даже в условиях полного отсутствия кислорода некоторая цитотоксичность сохраняется Макрофаги и гранулоциты существенно отличаются по механизмам генерации АКМ если в макрофагах главную роль играет NADPH-оксидаза, то цитотоксичность и ХЛ ответ с люминолом лейкоцитов крови определяются миелопероксидазной системой (миелоперок-сидаза-НгОг-СГ) [De Sole Р , et al ,1984] В этой связи представляет интерес сравнить зависимость от кислорода разных механизмов генерации АКМ

Интенсивности ХЛ ответа с люминолом при стимуляции зимозаном выделенных гранулоцитов крови и клеток перитонеального экссудата изменялись по-разному в зависимости от содержания Оз (рис 2) При содержании кислорода в газовой фазе меньше 8% (100 мкМ в растворе) интенсивность ХЛ ответа перитонеальных макрофагов снижается, в то время как при содержании 02 больше 8% интенсивность ХЛ не зависела от кислорода вплоть до 100% Ог Полученная зависимость хорошо согласуется с данными работы [Edwards S W et al, 1984] Сходное снижение интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов было получено при использовании люцигенина в качестве люминофора, что указывает на основную роль NADPH-оксидазы в снижении ХЛ ответа в обоих случаях Таким образом, можно заключить, что образование в тканях О^ NADPH-оксидазой фагоцитирующих клеток, особенно при ишемии, может лимитироваться наличием кислорода

В отличие от клеток перитонеального экссудата ХЛ ответ гранулоцитов не зависел от содержания кислорода в газовой смеси вплоть до полного замещения его чистым азотом (примесь 02 меньше 0,4%) Таким образом, активность наработки гипогалогенитов в миелопероксидазной системе, которая определяет интенсивность ХЛ гранулоцитов с люминолом, не зависит от кислорода Полученные результаты позволяют утверждать, что в условиях ишемии/реперфузии цитотоксическое действие гранулоцитов может реализо

Содержание кислорода в газовой смеси (%)

Рис 2 Зависимость от кислорода интенсивности XJI ответа гранулоцитов крови (Q) и клеток перитонеапьного экссудата (§) Каждое значение - среднее по 5 измерениям, * - достоверное отличие от значения, полученного при прокачивании воздуха (21% 02) и взятого за 100%

ваться не только с началом реперфузии, но и на стадии ишемии Так как продукция АКМ гранулоцитами важна для индукции клеточного апогггоза и разрешения воспаления [Kasahara Y et al ,1997] то такая зависимость от кислорода, по-видимому, позволяет избежать формирования хронических гранулем в условиях ишемии

Действие макрофаг-активирующего фактора

Существенное влияние на продукцию АКМ, XJI ответ и цитотоксичность фагоцитирующих клеток оказывают цитокины Многие провоспалительные лимфокины, в частности МАФ или интерферон-у, усиливают цитотоксичность макрофагов [Williams J G et al, 1992] Однако процесс активации макрофагов под влиянием лимфокинов представляет собой сложный комплекс цитологических и биохимических изменений, отражающих переход клетки в новое функциональное состояние, что затрудняет как методическую оценку, так и понимание механизмов действия лимфокинов

На перитонеапьных макрофагах мыши было исследовано действие МАФ на XJI ответ, индуцированный разными стимуляторами МАФ получали в виде супернатанта стимулированных конканавапином А спленоцитов Инкубация макрофагов с супернатантом лимфоцитов приводила к изменению как спонтанной ХЛ с люминолом и люцигенином, так и стимулированной ФМА или зимозаном (рис 3) Относительные изменения спонтанной и стимулированной ХЛ в разные сроки инкубации макрофагов с МАФ представлены в таблице 4 Наиболее быстро реагирует на действие МАФ спонтанная ХЛ с люминолом уже после 4 часов инкубации она возрастает в 1,5 раза По-видимому, этот параметр можно использовать для быстрого тестирования наличия МАФ в биосубстратах

Воздействие МАФ на люминол-усиленную ХЛ при стимуляции клеток ФМА или зимозаном приводило к усилению свечения, максимальные значения достигались после 20 часов инкубации (см табл 4) Противоположный по знаку эффект был получен при измерении люцигенин-усиленной ХЛ Существенно не изменяя интенсивность ХЛ в первые 12 часов инкубации, воздействие МАФ значительно снижает уровень ХЛ через 20 часов ин

Рис 3 Интенсивность люминол- (А, Б) и люцигенин-зависимого (В, Г) ХЛ ответа перитонеальных макрофагов при стимуляции ФМА (А, В) или опсонизированным зимозаном (Б, Г) после 20 ч инкубации с разными концентрациями МАФ Содержание супернатанта конканавалин А-стимулированных лимфоцитов в среде инкубации 1 - 0, 2 - 1%, 3 - 10% По осям абсцисс - время с момента добавления стимулятора (мин), по осям ординат - интенсивность ХЛ, имп/(с й О4)

Таблица 4

Изменение интенсивности ХЛ перигонеальных макрофагов в разные сроки после их инкубации с МАФ

Время инкубации, часы Люминол-усиленная ХЛ (в % от контроля)

спонтанная + ФМА + зимозан

4 151 ±19* 102 + 6 114 + 6

8 161 + 19* 181 ±21* 154+14*

12 166 + 34 182 ±23* 181 ±13**

20 234 ±47* 228 ±31** 225 ±30**

Время инкубации, часы Люцигенин-усиленная ХЛ (в % от контроля)

спонтанная + ФМА + зимозан

4 110 ±16 102 ±29 104 ±21

8 128 ±38 108 ±25 112 ± 8

12 81 ±6* 66 ±23 107 ±24

20 59 ±17 38 ±16* 59± 11*

Примечания 1 Каждое значение - среднее по пяти отдельным измерениям 2 Достоверные отличия от контроля * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01

1

2

0,1 1 10

Содержание МАФ в инкубационной среде (%)

Рис 4 Относительные изменения интенсивности люминол- (О) и люцигенин-зависимого (□) ХЛ ответа макрофагов при стимуляции зимозаном в зависимости от содержания МАФ в инкубационной среде (инкубация с МАФ в течение 20 часов, п = 6)

кубации Различие изменений люминол- и люцигенин-усиленной ХЛ макрофагов при действии МАФ было дозозависимым (рис 4) и, вероятно, определяется различиями возникновения свечения люминофоров Свечение люцигенина возникает в реакции с ОI, в то

время как ХЛ с люминолом отражает преимущественно образование гипогалогенитов, Н2О2 и пероксинитрита.

Одной из возможных причин разнонаправленных изменений концентраций OJ и других форм АКМ (и как следствие - ХЛ с люминолом и люцигенином) при действии МАФ может быть увеличение активности СОД катализирующей реакцию дисмугации О; в н20ъ в результате чего снижается концентрация, О~г , но возрастает Н2Ог Другой причиной разнонаправленного изменения ХЛ с люминолом и люцигенином при действии МАФ может являться индукция NO-сингазы В этом случае усиливается синтез NO*, который взаимодействует с О ~г с образованием пероксинитрита Так как пероксинитрит более сильный окислитель по сравнению с ОI, цитотоксичность макрофагов также возрастает

Изменение окислительного метаболизма макрофагов при трансформации в пенистые клетки

Характерным признаком начальной стадии развития атеросклероза является появление в интиме артерий перегруженных эфирами холестерином пенистых клеток преимущественно моноцитарно-макрофагального происхождения Накопление холестерина и его окисленных производных в клетках приводит к изменению их функциональных свойств, таких как фагоцитоз, хемотаксис, пролиферативная активность Захват макрофагами модифицированных ЛНП, имеющих высокое сродство к скэвинджер-рецепторам, приводит к накоплению в них эфиров холестерина и формированию пенистых клеток, во многом идентичных клеткам атеросклеротической бляшки [Brown М S , Goldstein J L, 1983]

После 24-часового культивирования с анетилированными ЛНП перитонеальные макрофаги приобретали характерные для пенистых клеток морфологические (липидные включения в цитоплазме) и биохимические (накопление холестерина и его эфиров) признаки Дальнейшая инкубация (48 ч) клеток с модифицированными ЛНП приводила к еще большему повышению содержания свободного и эстерифицированного холестерина, до 182% и 1275% по отношению к контролю, соответственно Анализ ХЛ макрофагов показал, что культивирование с ацетилированными ЛНП приводило к существенному снижению спонтанной ХЛ как с люминолом (в 14 раз после 48 часов инкубации), так и с люцигенином (в 30 раз) по сравнению с контрольными значениями, полученными для клеток, среда культивирования которых не содержача модифицированных ЛНП (табл 5) Сравнение индуцированной зимозаном ХЛ в присутствии люминола и люцигенина показало, что ацетилированные ЛНП не влияют ни на динамику ХЛ ответа, ни на его интенсивность, хотя сам процесс культивирования приводил к двукратному снижению интенсивности ХЛ как в контроле, так и в опыте (см табл 5)

Спонтанная ХЛ в нестимулированных фагоцитах является результатом наработки АКМ в митохондриях [Esterline R, Trush М А, 1989] Выявленное снижение интенсивности спонтанной ХЛ макрофагов в процессе культивирования с ацетилированными ЛНП (см табл 5) указывает на изменение энергетических механизмов клетки, вероятно, связанных с интенсивным использованием АТФ в процессе реэстерификации холестерина в пенистых клетках Результатом такого изменения может быть угнетение АТФ-зависимых функциональных процессов, таких как хемотаксис и хемокинез, что может лежать в основе накопления макрофагов и моноцитов в интиме артерий при атерогенезе Снижение спонтанной генерации АКМ клетками атеросклеротической бляшки также ведет к снижению концентрации ферментативных антиоксидантов, экспрессия которых регулируется АКМ [Hassan Н М, 1988]

Отсутствие изменений индуцированной зимозаном ХЛ макрофагов указывает на

Таблица 5

Интенсивность хемилюминесценции макрофагов при их инкубации с ацетилированными

ЛНП

Условия инкубации (п=6) Время инкубации (ч) Спонтанная ХЛ (уел ед) Индуцированная ХЛ (уследхЮ3)

с люминолом

Контроль 24 397 ±28 71,2 + 3,2

Ацетилированные ЛНП 24 186 ±20* 73,2 ± 6,0

Контроль 48 321 ±37 33,3 ± 1,7

Ацетилированные ЛНП 48 23 ±9* 34,6 ±3,5

с люцигенином

Контроль 24 1991 ±271 340,5 ± 9,7

Ацетилированные ЛНП 24 1600 ±440 328,8 ±15,6

Контроль 48 4825 ± 654 186,5 ± 8,9

Ацетилированные ЛНП 48 152 ±65* 168,2 ±5,6

Примечание * - достоверное отличие от контроля, Р < 0,001

то, что пенистые клетки, присутствующие в атеросклеротической бляшке, сохраняют способность к развитию дыхательного "взрыва", которая может реализовываться при взаимодействии с иммунными комплексами, компонентами активированного комплемента, медиаторами воспаления, эндотоксинами [Маянский А Н, Маянский Д Н , 1989] Такая активация макрофагов (пенистых клеток) на фоне ослабленной антиоксидантной защиты может вызывать окислительное поражение как самих клеток атеросклеротической бляшки, так и клеток эндотелия

Хемилюминесценция гранулоцитов крови при типовых патологических

процессах

Характер изменения интенсивности ХЛ ответа в результате кондиционирования (примирования или деактивации) клеток ПЯЛ при патологических процессах остается во многом неясным [Маянский А Н, 1990] Выявление механизмов регуляции метаболической активности ПЯЛ в условиях клинической практики затруднено высокой гетерогенностью групп больных, наложением сопутствующих заболеваний, влиянием лечебных и социальных факторов Учитывая данные сложности, было проведено изучение окислительного метаболизма гранулоцитов периферической крови, определяемой по параметрам ХЛ ответа, у животных (крысы) в динамике разных экспериментальных типовых патологаче-ских процессов

Неспецифическое воспаление, индуцированное введением зимозановых частиц

Внутривенное введение животным зимозановых частиц вызывает развитие неспецифического воспалительного процесса, площадь мононуклеарных инфильтратов на гистологических срезах печени возрастает с 7% до 34% на 7 сутки и снижается до 11% к 14 суткам Динамика изменения суммарной интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов крови

О 2 4 6 8 14

Время после введения зимозана (сутки)

Рис 5 Изменение интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов в образцах цельной крови в динамике зимозан-индуцированного воспаления Каждая величина получена по группе из 10 животных, * - достоверное отличие от контроля

хорошо отражает развитие мононукпеарных инфильтратов в печени (рис 5) Повышение интенсивности ХЛ гранулоцитов сопровождалось усилением опсонической активности сыворотки крови время наступления максимума свечения уменьшалось с 9,4 мин до 5,6 мин на 6 сутки после индукции воспаления Между суммарной интенсивностью ХЛ ответа и временем наступления максимума свечения у животных с воспалением наблюдалась обратная взаимосвязь, коэффициент корреляции г = -0,69 (Р < 0,001) Анализ изменения количества гранулоцитов и удельной интенсивности ХЛ ответа в пересчете на одну клетку показывает, что воспалительный процесс сопровождается изменением метаболической активности гранулоцитов без существенного изменения их количества (рис 6)

Окислительное поражение легких в условиях гипероксии

Помещение животных в атмосферу чистого кислорода приводит к поражению легких, которое характеризуется развитием воспалительного процесса экссудативно-деструк-тивного типа, отеком легких и гибелью животных после 60 часов экспозиции рапиевоп О й а1, 1986] Чувствительность к гипероксии у животных существенно зависит от возраста Так, если взрослые животные (крысы возрастом более 3 месяцев), как правило, погибают в атмосфере чистого кислорода, то молодые (2-3 недели) легко адаптируются и могут жить длительное время Из 20 крыс, находившихся в условиях гипероксии, между 60 и 80 часами экспозиции погибло 16 (80%), 4 животных (20%) адаптировались к гипероксии и жили в атмосфере кислорода более 10 суток

Анализ бронхоапьвеолярного смыва показал, что у животных в условиях гипероксии наблюдается интенсивная миграция полиморфноядерных лейкоцитов в легкие На 2

б-

4-

0

-щ— после введения зимозана -О- до введения зимозана

2 суп

6 сутки

"8 сутки

.14 сутки

0

1

Количество гранулоцитов (106/мл)

Рис б Изменения количества гранулоцитов крови и удельной интенсивности их ХЛ ответа при зимозан-индуцированном воспалении

сутки экспозиции в атмосфере чистого кислорода содержание гранулоцитов в лаважной жидкости возрастало в 51,2 раза по сравнению с контрольными животными, в то время как общее количество мононуклеарных клеток повышалось несущественно, значимо снижаясь в процентном соотношении (табл 6)

У животных в условиях гипероксии не наблюдалось достоверных изменений показателей ХЛ ответа и количества гранулоцитов в течение первых двух суток (рис 7), несмотря на развитие поражения легких, вследствие которого 80% крыс погибли У адаптировавшихся к гипероксии животных (4 и 6 сутки) возрастала интенсивность ХЛ и повышалось содержание гранулоцитов в крови За весь период наблюдения достоверных изменений удельной интенсивности ХЛ в пересчете на гранулоцит не наблюдалось (рис 8) У животных на 4 и 6 день нахождения в атмосфере кислорода усиление интенсивности ХЛ

Таблица 6

Содержание фагоцитирующих клеток в бронхоальвеолярной жидкости через 2 суток экспозиции крыс в условиях гипероксии

Клеточные элементы Воздух (21% Ог) Кислород (98% Ог)

Общее количество клеток 54 О3 31, ±2,7 76,4 ± 16,2

% 100 100

Гранулоциты АО5 0,3 ± 0,06 15,4 ±5,6*

% 1,0 ±0,21 18,3 ± 5,6*

Альвеолярные макрофаги Л О5 24,2 ±2,3 40,5 ± 10,2

% 78,2 ± 3,2 58,6 ± 5,9*

Примечание * - достоверное отличие от контроля ("Воздух"), Р < 0,02

—#— кислород -О- контроль

I-1-1-1-1—

0 12 4 6

Время нахождения в условиях гипероксии (сутки)

Рис 7 Изменение интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов крови животных, помещенных в атмосферу чистого кислорода

Примечания 1 Экспериментальная группа состояла из 20 животных (0, 1 и 2 сутки) и 4 выживших животаых (4, 6 сутки), контрольная - из 10 2 *-достоверное отличие от контроля

происходило за счет увеличения содержания гранулоцитов в крови По-видимому, торможение выхода гранулоцитов в легкие (в результате повышается их содержание в крови) позволяет животным адаптироваться к токсическому действию кислорода.

Анализ изменений ХЛ показателей гранулоцитов и их содержания в крови при разных патологических процессах показывает, что наблюдается два варианта изменения суммарной метаболической активности циркулирующего пула клеток В первом случае увеличивается содержание циркулирующих в крови гранулоцитов, так что интенсивность ХЛ в пересчете на одну клетку не изменяется, не изменяется и опсоническая активность сыворотки Такая регуляция наблюдается при стрессовых воздействиях и адаптации животных к атмосфере чистого кислорода Второй вариант изменения суммарной метаболической активности гранулоцитов реализуется при неспецифическом зимозановом воспалении и на начальной стадии опухолевого роста. В этом случае изменение суммарного ХЛ ответа гранулоцитов происходит в результате кондиционирования без существенного изменения содержания клеток в крови, что также сопровождается изменением опсонической активности сыворотки крови

Активность окислительных процессов у больных с хроническими

заболеваниями Хронические неспецифические заболевания легких

Результаты изучения параметров ХЛ ответа гранулоцитов крови больных ХНЗЛ представлены в таблице 7 У больных ХНЗЛ по сравнению с контролем (группа практиче ски здоровых добровольцев) существенно увеличены показатели ХЛ ответа гранулоцитов крови I шах и I тах/гранулоцит (на 89 и 61%, соответственно), также повышена опсони

3,0-

1 сутки|

6 сутки

2 сутки

Н

4 сутки л

—#— гипероксия —О— нормоксия

-г

16

-,-1-(-1-!-!-1—

0 2 4 6 8 10 12 14

Количество гранулоцитов (106/мл)

Рис 8 Изменения количества гранулоцитов крови и интенсивности их ХЛ ответа в пересчете на клетку у животных в условиях гипероксии

Таблица 7

Показатели ХЛ ответа гранулоцитов крови больных ХНЗЛ и практически здоровых добровольцев

Группы обследованных I шах (уел ед хЮ5) I тах/[ранулоцит (уел ед) Ттах (минуты)

Больные ХНЗЛ (п = 202) Необструкгивный ХБ (п = 31) Обструктивный ХБ (п = 68) Инфекционно-аллергическая БА (п = 93) Атоническая БА (п = 10) 5,10 ±0,28** 3,91 ±0,34* 5,10 ±0,41** 5,91 ±0,55** 3,27 ± 0,70 1,34 ± 0,06** 1,10 ±0,10* 1,39 ±0,11** 1,38 ±0,10** 1,28 ± 0,32 20,6 ± 0,6* 22,1 ± 1,7 20,6 ± 1,0 19,9 ± 0,8* 23,8 ± 2,4

Практически здоровые (п = 58) 2,70 ± 0,17 0,83 ± 0,06 23,1 ± 0,9

Примечание Достоверные отличия от группы практически здоровых добровольцев *-Р < 0,05, **-Р <0,001

ческая функция сыворотки (время наступления максимума свечения Т шах укорочено на 12%) Более детальный анализ с выделением различных групп пациентов показал, что наибольшее увеличение метаболической активности гранулоцитов наблюдается в группах обструктивного хронического бронхита (ХБ) и инфекционно-аллергической бронхиальной астмой (БА) В данных группах было повышено содержание в крови лейкоцитов и гранулоцитов выше контрольных цифр соответственно на 20 и 30%, в то время как у

больных ХБ эти показатели достоверно не отличаются от нормы

Как у мужчин, так и у женщин (в большей степени) в сыворотке крови повышена активность свободнорадикального окисления липидов, оцениваемая по спонтанной БХЛ (на 28 и 57%, соответственно), и одновременно снижена антиокислительная активность, на что указывает повышение на 29% индуцированной БХЛ (табл 8) По интенсивности спонтанной и индуцированной БХЛ сыворотки крови описываемые группы хронического бронхита и бронхиальной астмы достоверно не отличались между собой

Между различными показателями функционального состояния гранулоцитов крови наблюдается определенная взаимосвязь Так, обнаружена хорошая корреляция между содержанием лейкоцитов и гранулоцитов (г = 0,91, Р < 0,001), интенсивностью свечения всего пула гранулоцитов и отдельной клетки (г = 0,76, Р < 0,001), менее выраженная обратная взаимосвязь наблюдается между временем наступления максимума ХЛ ответа и его интенсивностью, как суммарной (г = -0,41, Р < 0,01), так и в пересчете на клетку (г = -0,40, Р < 0,01) Вместе с тем не выявлено корреляции (г = -0,17, Р > 0,1) между удельной интенсивностью ХЛ гранулоцитов и их количеством

Ишемическая болезнь сердца

Обследование 78 мужчин, больных ИБС, показало, что при отсутствии изменения количества клеток белой крови по сравнению с контролем интенсивность ХЛ ответа гранулоцитов повышена как в сумме (на 54%), так и в пересчете на одну клетку (на 31%) (табл 9) Опсоническая функция сыворотки крови у больных ИБС не изменяется Разделение пациентов на группы в зависимости от принадлежности к тому или иному функциональному классу позволило выявить увеличение интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов при повышении степени тяжести заболевания Так, если у больных, отнесенных к функциональному классу I, изучаемые параметры не отличались от контрольных цифр, то у больных II и III функционального класса по сравнению с практически здоровыми людьми повышены как общая, так и удельная интенсивности ХЛ (на 59% и 75%, соответствен

Таблица 8

Показатели спонтанной и индуцированной биохемшпоминесценции сыворотки крови больных ХНЗЛ и практически здоровых добровольцев

Группы обследованных Спонтанная БХЛ (уел ед ) Индуцированная БХЛ (уел ед хЮ5)

мужчины женщины

Больные ХНЗЛ Необструктивный ХБ Обструктивный ХБ Инфекционно-аллерги-ческая БА Атопическая БА 168 ± 10,4* (п = 47) 140 ± 19,7 (п = 10) 167 ± 17,9 (п= 15) 183 ± 15,5 (п= 18) 118 ± 8,6** (п = 55) 129±32,5(п = 7) 121 ± 19,4* (п= 17) 106 + 7,7** (п = 27) 1.45 ±0,11* (п = 102) 1,50 ±0,17* (п = 17) 1.46 ±0,23 (п = 32) 1.47 ±0,14* (п = 45) 1,33 ± 0,44 (п-4)

Практически здоровые 131 ± 7,7 (п= 18) 75 ± 4,8 (п = 22) 1,12 ± 0,07 (п = 40)

Примечание Достоверные отличия от группы практически здоровых добровольцев *-Р<0,05, **-Р<0,001

Таблица 9

Показатели XJI ответа гранулоцигов крови больных ИБС

Группы обследованных I гаах (уел ед хЮ5) I тах/гранулоцит (уел ед ) Т тах (минуты)

Больные ИБС (п = 78)

Функциональный класс I (п = 21) 3,40 ± 0,59 0,86 + 0,11 25,2 ±2,1

Функциональный класс И (п = 42) 4,29 ±0,29** 1,15 ±0,98* 24,8 ±1,5

Функциональный класс III (п = 15) 4,72 ±0,84** 1,29 ±0,18** 19,8 ± 2,1

ИБС без инфаркта миокарда (П = 41) 3,97 ± 0,45* 1,04 + 0,09 24,8 ± 1,4

Постинфарктные (п = 37) 4,37 ±0,81* 1,14 ±0,09* 23,0 ± 1,5

Практически здоровые (п = 22) 2,68 ± 0,39 0,79 ±0,11 23,7 ± 1,9

Примечание Достоверные отличия от группы практически здоровых добровольцев * - Р < 0,05, **-Р< 0,001

Таблица 10

Показатели биохемилюминесценции сыворотки крови больных ИБС и практически здоровых добровольцев

Группы обследованных Спонтанная БХЛ (уел ед) Индуцированная БХЛ (услед хЮ4)

Больные ИБС (п= 14) Функциональный класс I (п = 5) Функциональный класс II (п = 9) ИБС без инфаркта миокарда (п = 7) Постинфаркгные (п = 7) 226 ±34,7** 215 + 72,2 235 ±46,5* 209 ± 43,7 242 ± 53,8* 1,32 ±0,14* 1,21 ± 0,29 1,40 + 0,14 1,18 ±0,26 1,44 ±0,11*

Практически здоровые (п *= 18) 131 ±7,7 1,22 ±0,17

Примечание Достоверные отличия от группы практически здоровых добровольцев * -Р < 0,05, **-Р< 0,001

но) При этом показатели ХЛ ответа в группах с функциональным классом II и III достоверно выше, чем в группе I

У больных ИБС выявлено усиление собственной биохемилюминесценции сыворотки крови на 73% (Р < 0,01), что свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов, индуцированная биохемилюминесценция, отражающая антиокислительную активность, изменялась незначительно (снижена на 18%, Р > 0,1) (табл 10)

Анализ влияния наличия в анамнезе больных инфаркта миокарда показал, что у перенесших его пациентов практически не изменено содержание клеток белой крови, в то же время повышена как их суммарная (на 62%), так и удельная метаболическая активность (на 37%) Одновременно выявляется достоверное увеличение интенсивности спонтанной (на 85%) и индуцированной (на 29%) биохемилюминесценции сыворотки Корреляционный анализ показал, что структура взаимосвязей между различными показателями функционального состояния гранулоцигов, выявленная у больных ХНЗЛ, сохраняется и у

больных ИБС Отличительной чертой является наличие реципрокных взаимоотношений между спонтанной и индуцированной биохемилюминесценцией (г = +0,79, Р < 0,001)

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки I

Исследование метаболической активности гранулоцитов у 17 мужчин больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки показало, что при обострении заболевания значительно возрастает как их суммарная, так и удельная активность (табл 11) В то же время у больных после курса терапии, а также у людей с хроническим гастродуо-денитом интенсивность ХЛ гранулоцитов была ниже показателей контрольной группы Опсоническая активность сыворотки была повышена при обострении заболевания (Т тах уменьшалось до 12,33 ± 2,08 минуты) У больных после лечения и людей с хроническим гастродуоденитом опсоническая активность сыворотки достоверно не отличалась от нормы При обострении заболевания также были повышены спонтанная и индуцированная БХЛ сыворотки (табл 12), в стадии ремиссии показатели возвращалась к норме

Таким образом, результаты показывают значительное усиление метаболической активности гранулоцитов при обострении язвенного процесса, что указывает на возможную деструктивную роль данных клеток в ульцерогенезе Патогенетической ролью фагоцитов можно объяснить снижение метаболической активности в стадии ремиссии заболе

Таблица 11

Показатели ХЛ ответа гранулоцитов у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки

Группы обследованных 1тах I тах/гранулоцит

Язвенная болезнь: Обострение (п = 17) Ремиссия (п = 16) 5,42 ± 1,24* 1,93 ± 0,44 1,73 ±0,50* 0,52 ± 0,29

Гастродуоденит (п = 27) 1,54 ± 0,32 0,38 ±0,15*

Практически здоровые (я = 22) 2,68 ± 0,39 0,79 ±0,11

Примечание * - достоверное отличие от группы практически здоровых добровольцев, Р < 0,01

Таблица 12

Спонтанная и индуцированная биохемилюминесценция сыворотки крови у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки

Группы обследованных Спонтанная БХЛ (услед) Индуцированная БХЛ (услед хЮ4)

Язвенная болезнь. Обострение (п = 12) Ремиссия (п= 11) 172+13,2* 141 + 14,5 1,52 ± 0,17* 1,18 ± 0,23

Гастродуоденит(п =16) 129 + 9,8 1,08 ±0,14

Практически здоровые (п = 18) 131+7,7 1,22 ±0,17

Примечание * - достоверное отличие от группы практически здоровых добровольцев,? <0,01

вания Действительно, такое поведение гранулоцитов может быть своеобразной "защитной" реакцией организма, снижающей деструктивный потенциал клеток

Исследование эффектов анти- и прооксидантных терапевтических

воздействий

Одним из критериев развития окислительного стресса является выраженный эффект антиоксидантной терапии [Владимиров Ю А и др 1991] У больных XH3JI особый интерес вызывает сравнение антиоксидантной терапии с эффектом аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК-терапия), ибо эти два подхода успешно применяются в клинике, однако в отличие от антиоксидантов облучение УФ-светом (254 нм) оказывает выраженное прооксидантное действие на биологические объекты

Исследование изменений XJI показателей клеток крови и биохемилюминесценции сыворотки после 6-дневного курса внутримышечных инъекций больным ХНЗЛ масляного раствора а-токоферола (300 мг в сутки), проводимого по показаниям, не выявило достоверных изменений спонтанной и индуцированной биохемилюминесценции сыворотки крови, при этом наблюдалось достоверное (Р < 0,01)снижение как суммарной (на 48%), так и удельной (на 43%) интенсивности ХЛ гранулоцитов крови Анализ индивидуальных изменений активности гранулоцитов крови показывает, что в обследованной группе (22 человека) у части больных (5 человек) активность окислительного метаболизма гранулоцитов после курса терапии а-токоферолом не изменялась или даже возрастала У другой группы больных (17 человек) наблюдалось ярко выраженное снижение метаболической активности гранулоцитов в среднем до 45% от начального уровня

При анализе изменения метаболической активности гранулоцитов в ходе АУФОК-терапии выявилась высокая гетерогенность реагирования клеток ПЯЛ в зависимости от индивидуальных особенностей больных (рис 9) В то же время реакция гранулоцитов на первый сеанс АУФОК была однозначной и проявлялась в снижении ко второму сеансу как общей, так и удельной интенсивности ХЛ ответа на 39 и 31% соответственно, в последующем данные показатели возвращались к исходному уровню При этом на протяжении всего курса лечения величины I max, I шах/гранулоцит и Т max превышали значения аналогичных параметров для здоровых людей Сходная динамика, сдвинутая по времени на 1 сеанс, обнаружена для спонтанной и стимулированной БХЛ сыворотки крови

В зависимосто от типологии реагирования на АУФОК-терапию больные могут быть разделены на две группы, которые различались между собой по величине начального уровня интенсивности ХЛ ответа гранулоцитов и характеру изменения этого показателя Величина ХЛ гранулоцитов больных I группы (8 человек), будучи существенно выше соответствующих показателей пациентов П группы (7 человек) и практически здоровых людей на протяжении всего курса лечения, достоверно (Р < 0,01) снижалась лишь к моменту второго сеанса (на 36%), для больных второй группы обнаружено более существенное и продолжительное снижение метаболической активности гранулоцитов на момент второго и третьего сеансов она составляла 60 и 55% от первоначального значения и не отличалась от интенсивности ХЛ ответа ПЯЛ здоровых людей

Таким образом, в условиях окислительного стресса при ХНЗЛ как антиоксидант-ные, (внутримышечные инъекции токоферола) так и прооксидантные (аутотраясфузия УФ-облученной крови) воздействия приводят к сходному результату - снижению метаболической активности ПЯЛ Это можно объяснить защитным действием экзогенных антиоксидантов и индукцией синтеза эндогенных антиоксидантов при АУФОК-терапии Динамика изменения метаболической активности индивидуальная и позволяет выявить группы больных, чувствительных к терапии, направленной на коррекцию окислительного стресса.

5

Сеансы АУФОК

Рис 9 Метаболическая активность гранулоцитов больных XH3JI в динамике АУФОК-терапии

Примечание Кружками обозначены отдельные значения, столбиками - средние арифметические, пунктиром - среднее значение I max для практически здоровых людей, * - достоверное отличие от 1 сеанса

Биохемилюминесценция с поверхности тела человека

Собственная БХЛ живых тканей и биологических субстратов несет уникальную информацию о протекающих в них радикальных окислительных процессах Однако абсолютное большинство исследований проведено в системах m vitro (сыворотка, клетки, го-могенаты тканей) Нет данных о параметрах БХЛ различных участков тела как в норме, так и при патологических состояниях С помощью созданного оригинального блока регистрации слабых световых потоков было проведено исследование собственной БХЛ с поверхности тела у 10 здоровых добровольцев мужчин в возрасте от 17 до 40 лет Исследование выявило низкую интенсивность свечения (0,37 -0,68 имп/с) в области живота, груди, поясницы и голени, поверхности ладоней, стоп, лица с развитой капиллярной сетью имели более высокий уровень свечения (1,59 -2,21 имп/с) Оценка спектрального состава излучения выявила максимум в сине-зеленой области спектра (табл 13)

Таблица 13

Спектральное распределение биохемилюминесценции с ладони человека

Спектральная область Интенсивность свечения, имп/с

Суммарный сигнал Синяя область спектра (360-420 нм) Зеленая область спектра (480-560 нм) Красная область спектра (более 580 нм) 2,15 ±0,19 1,32 ±0,17 0,83 ±0,16 0,15 ±0,14

Анализ результатов с учетом квантового выхода фотоумножителя показал, что интенсивность БХЛ с поверхности тела человека находится в пределах 10-50 фото-нов/(с хм2) и имеет достаточно стабильный характер Сравнение БХЛ здоровых лиц и больных ХНЗЛ выявило достоверное повышение интенсивности свечения в области груди у последних (соответственно 0,36 ± 0,03 и 0,69 ± 0,07 имп/100 с) Это делает перспективным изучение возможностей применения биохемилюминесценции с поверхности тела в целях клинической диагностики

ВЫВОДЫ

1 При связывании молекулярного кислорода с активными центрами ферментов его состояние может быть представлено в виде суперпозиции отдельных восстановленных состояний от Ог до Н?0, при этом в ангиоксидантных ферментах электромагнитные излучения красного и инфракрасного диапазонов могут индуцировать кооперативные переходы между виртуальными состояниями связанных молекул кислорода и тем самым изменять активность ферментов

2 Способность гранулоцитов нарабатывать гипогалогениты мало зависит от кислорода в диапазоне концентраций от 5 до 1300 мкМ, в то время как активность мембран-связанной ЫАОРН-оксидазы и синтез О \ значительно снижаются при концентрациях Ог меньше 100 мкМ и полностью восстанавливаются при реперфузии кислород-содержащей средой

3 Макрофаг-активирующий фактор, выделяемый стимулированными лимфоцитами, дозозависимо снижает продукцию 0~г перитонеальными макрофагами и люцигенин-усиленную ХЛ, но повышает продукцию других форм АКМ, инициирующих ХЛ люмино-ла, что может лежать в основе повышения цитотоксичности клеток

4 Трансформация перитонеальных макрофагов в пенистые клетки в процессе культивирования с модифицированными ЛНП в течение 48 ч сопровождается снижением спонтанной продукции АКМ (О 2, Н2О2, НОС1), определяемой по люцигенин- и люминол-усиленной ХЛ (соответственно в 30 и 14 раз), что свидетельствует о нарушении процессов митохондриального дыхания, в то же время способность клеток к развитию дыхательного "взрыва" в ответ на зимозан не изменяется

5 Процессы примирования и деактивации циркулирующих в крови гранулоцитов регулируются макрофагами, в результате чего воспаление мононуклеарного типа (внутривенное введение животным зимозана) сопровождается изменением метаболической активности клеток, в то время как для воспаления экссудативно-деструктивного типа (повреждение легких в условиях гипероксии) такие изменения не характерны

6 Синтезированные на основе бромзамещенных алкилфенолов новые фенольные соединения в разных экспериментальных системах проявляют высокую антиоксидантную активность, которая зависит от степени экранирования ОН-группы и содержания тио-сульфонатной группы в ядрт-положении Противовоспалительная активность соединений коррелирует с их способностью повышать экспрессию гена СЗТР1 в клетках гепатомы человека Нерв2 и наиболее выражена у фенола, частично экранированного трет-бутильной группой

7 При хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) наблюдается развитие окислительного стресса, что проявляется в усилении способности гранулоцитов крови к генерации АКМ (О Н2Ог, НОС1), интенсификации процессов ПОЛ в сыворотке с одновременным снижением ее антиокислительной активности Обнаружено, что степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью дисбаланса окислительных процессов и систем

их детоксикации

8 При ХНЗЛ как антиоксидантные (внутримышечные инъекции а-токоферола), так и прооксидантные (аутотрансфузия УФ-облученной крови) нагрузки приводят к снижению метаболической активности гранулоцитов крови и позволяют выявить варианты реагирования ПЯЛ в зависимости от индивидуальных особенности больных и длительности курса лечения, что может служить критерием выбора адекватной терапии

9 Интенсивность собственной биохемилюминесценции с поверхности тела человека лежит в диапазоне от 10 до 50 квант/(с *м2), максимум свечения находится в синей области спектра (380-420 нм) У больных ХНЗЛ наблюдается усиление биохемилюминесценции в области груди, что делает перспективным изучение механизмов данного явления с целью разработки новых диагностических критериев

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Зенков Н К Биохемилюминесценция с поверхности тела человека / Н К Зенков, В Ю Куликов, Л В Молчанова // Бюл эксперим биологии и медицины - 1983 - № 11 - С 50-52

2 Зенков Н К Биохемшпоминесцентный анализ в биологии и медицине / Н К Зенков, В Ю Куликов // Бюл СО АМН СССР - 1984-№3-С 67-73

3 Зенков НК Хемилюминесцентный метод исследования функциональной активности фагоцитирующих клеток / Н К Зенков, В Ю Куликов // Лаб дело - 1985 - № 1 - С 43-45

4 Зенков Н К Хемилюминесценция нейтрофююв человека при стимуляции Serratia таг-cescens /Н К Зенков, О П Макарова//Бюл СО АМН СССР- 1986 -№ 6- С 31-34

5 Метаболическая активность нейтрофилов в ульцерогенезе / Е К Чечнев, Н К Зенков, А Ю Воронин, Б В Чурин // Рукопись депонир во ВНИИМТИ № Д 13553-87

6 Зенков Н К Действие антиоксидантов на хемилюминесценцию лейкоцитов крови че-ловека/НК Зенков,ВЮ Куликов //Бюл СО АМН СССР- 1987-№ 5 - С 107-108

7 Зенков Н К Влияние кислорода на хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток / Н К Зенков, В Ю Куликов, Е Б Меньщикова // Рукопись депонир в ВИНИТИ № 8585-88

8 Зенков Н К Метаболическая активность гранулоцитов периферической крови при патологических процессах / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, А Ю Воронин // Рукопись депонир в ВИНИТИ № 3709-89

9 Зенков Н К Сравнительный анализ хемилюминесценции гранулоцитов капиллярной и венозной крови / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, С М Шергин // Лаб дело - 1990 - № 12-С 33-35

10 Зенков Н К Практические замечания по регистрации хемилюминесценции фагоцитирующих клеток / Н К Зенков, Е Б Меньщикова // Бюл СО АМН СССР - 1990 - № 2 -

1 С 72-77

11 Влияние УФ-облучения на метаболическую активность гранулоцитов крови человека / Е Б Меньщикова, И Д Сафронов, Д И Азбель, Н К Зенков // Вопросы мед химии -1991 -№ 1-С 56-58

12 Зенков НК Индуцированная Н2О2 биохемилюминесценция сыворотки крови / НК Зенков, Е Б Меньщикова // Лаб дело - 1991 - № 8 - С 30

13 Меньщикова Е Б Метаболическая активность гранулоцитов при хронических неспецифических заболеваниях легких / Е Б Меньшикова, Н К Зенков // Терапевтич архив- 1991 -№ 11 -С 85-87

14 Transcapllar metabilism of lipid- and water-soluble antioxidants as marker of chronical stress in coming population of circumpolar regions / V Kulikov, I Safronov, >1 Mikichur, N Zenkov, E Menshikova, L Kim//Arctic Med Res-1991-Vol 50-P 127-130

15 Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофаг-активирующего фактора / Г Ю Любимов, Н К Зенков, Н Н Вольский, В А Козлов И Иммунология -1992 - № 1 - С 40-43

16 Меньшикова Е Б Примирование гранулоцитов крови при воспалении / Е Б Меньшикова, Н К Зенков // Патологич физиология и эксперим терапия - 1992 - № 3 - С 1416

17 Зенков НК Активированные кислородные метаболиты в биологических системах / Н К Зенков, Е Б Меньшикова // Успехи соврем биологии - 1993 - Т 113, вып 3 - С 286-296

18 Меньшикова Е Б Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е Б Меньшикова, Н К Зенков // Успехи соврем биологии - 1993 - Т 113, вып 4-С 442-455

19 Зенков Н К Окислительный стресс Диагностика, терапия, профилактика / Н К Зенков, Е Б Меньшикова, С М Шергин - Новосибирск, 1993 - 181 с

20 Изменение окислительного метаболизма макрофагов при трансформации в пенистые клетки / Н К Зенков, М И Душкин, Г Ю Любимов, Е Б Меньшикова // Вопросы мед химии - 1994 - № 1 - С 2-4

21 Зенков НК Особенности развития окислительного стресса при патологиях нервной системы / Н К Зенков, Е Б Меньшикова У/ Бюл эксперим биологии и медицины -1994 - № 2 - С 207

22 Меньшикова Е Б Биохимия окислительного стресса Оксиданты и антиоксиданты / Е Б Меньшикова, Н К Зенков, С М Шергин - Новосибирск, 1994 - 203 с

23 Ketoconazole inhibits oxidative modification of low density lipoprotein /MI Dushkm, N К Zenkov, E В Menshikova, E N Pivovarova, G Yu Lyubimov, N N Volsky // Atherosclerosis-1995-Vol 114-P 9-18

24 Влияние ингибиторов цитохрома P-450 на окислительный метаболизм липопротеинов низкой плотности макрофагами / Н К Зенков, Е Б Меньшикова,, Г Ю Любимов, Н Н Вольский//Вопросы мед химии-1996-Т 42, вып 1-С 23-30

25 Ингибирование мелатонином окисления липопротеинов низкой плотности / Н К Зенков, М И Душкин, Е Б Меньшикова, Ю И Рагино, Е Н Пивоварова // Бюл эксперим биологии и медицины -1996 - № 10 - С 399-402

26 Зенков Н К Окислительная модификация липопротеинов низкой плотности / Н К Зенков, Е Б Меньшикова//Успехи соврем биологии-1996-Т 116, вып 6-С 729-748

27 Menshikova Е В Ketoconazole effects on low density lipoprotein oxidative modification / EB Menshikova, N К Zenkov, MI Dushkm//Jap J Clm Pathol - 1996 - Vol 44 -P 201

28 Меньшикова E Б Окислительный стресс при воспалении / Е Б Меньшикова, Н К Зенков//Успехи соврем биологии-1997-Т 117,вып 2-С 155-171

29 Меньшикова Е Б Окислительный стресс при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда / Б Б Меньшикова, Н К Зенков, А Ф Сафина // Успехи соврем биологии-1997-Т 117, вып 3-С 362-373

30 Zenkov N К Macrophage chemilummescence upon transformation into foam cells / N К Zenkov, EB Menshikova // Proc 10th Int Symp on Biolummescense and Chemilummescence, Bologna, September4-8,1998 - Bofogna, 1998 - P 147

31 Меньшикова ЕБ Генерация кислородных радикалов в крови больных хроническими

неспецифическими заболеваниями легких / Е Б Меньщикова, Н К Зенков // Цитология-1999-Т 41,№9-С 773-774

32 Зенков Н К Ангаоксидантный тест для индивидуального подбора терапии / Н К Зенков, Е Б Меньщикова // Цитология - 1999 - Т 41, № 9 - С 816

33 Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, НН Вольский, В А Козлов//Успехи соврем биологии- 1999-Т 119, вып 5-С 439-449

34 Меньщикова Е Б Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях/ Е Б Меньщикова, Н К Зенков, В П Реутов // Биохимия-2000-Т 65,вып 4-С 485-503

35 Зенков Н К NO-синтазы в норме и при патологии различного генеза / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, В П Реутов // Вестник РАМН - 2000 - № 4 - С 30-34

36 Влияние антиоксиданта "тиофан" на параметры окислительного стресса при ишемиче-ской болезни сердца / И А Бахтина, Е В Антипьева, А Е Просенко, Г П Стрельцова, М И Душкин, Н К Зенков, Е Б Меньщикова, Ю И Рагино // Бюл СО РАМН - 2000 -№ 3-4 - С 24-29

37 Регистрация генерации активированных кислородных метаболитов ферментативными системами преждевременно стареющих крыс линии OXYS методами хемилюминес-центного анализа / Е Б Меньшикова, И Г Шабалина, Н К Зенков, Колосова Н Г, Л Е Панин//Бюл СО РАМН-2000-№3-4-С 43-49

38 Синтез и исследование антиоксидантных свойств новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений / А Е Просенко, С Ю Клепикова, Н В Кандалинцева, О И Дюбченко, М И Душкин, Н К Зенков, Е Б Меньщикова // Бюл СО РАМН -2001 1-С 133-138

39 Синтез и ангиокислительная активность новых водорастворимых солей 3-(4-оксифе-нил)пропилизотиурония и -аммония / Н В Кандалинцева, О И Дюбченко, А Е Просенко, МИ Душкин, Н К Зенков, Е Б Меньшикова//Хим-фарм журн- 2001 - № 3-С 22-25

40 Зенков Н К Хемшпоминесцентное исследование генерации активированных форм кислорода гомогенатами мозга преждевременно стареющих крыс OXYS / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, Н Г Колосова // Успехи геронтологии - 2001 - вып 6 - С 73

41 Зенков Н К Окислительный стресс Биохимический и патофизиологический аспекты / НК Зенков, ВЗ Ланкин, ЕБ Меньщикова- М МАИК "Наука/Интерпериодика", 2001-343 с

42 Генерация активированных кислородных метаболитов митохондриями преждевременно стареющих крыс OXYS / Е Б Меньщикова, И Г Шабалина, Н К Зенков, Н Г Колосова //Бюл эксперим биологии и медицины-2002-№2- С 207-210

43 Фенольные биоантиоксиданты / Н К Зенков, Н В Кандалинцева, В 3 Ланкин, Е Б Меньшикова, А Е Просенко - Новосибирск, 2003 - 328 с

44 Anti-inflammatory effect of new water soluble phenolic antioxidants / E В Menshikova, N V Kandalmtseva, N К Zenkov, ОI Dyubchenko, A E Prosenko // Int Conf "Reactive oxygen and nitrogen species antioxidants and human health" (Work Collection) - Smolensk, 2003-P 19

45 Структурные изменения и особенности окислительного фосфорилирования в митохондриях печени крыс линии OXYS / Л Е Панин, Н И Шалбуева, В Ф Максимов, Л М Поляков, Н К Зенков, Н Г Колосова II Биол мембраны - 2004 - Т 21, № 1-С 32-37

46 Зенков Н К АКМ - главное оружие фагоцитов в борьбе с микроорганизмами / Н К Зенков, Е Б Меньщикова // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и

здоровье человека - Смоленск, 2005 - С 32-35

47 Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях / В В Ляхо-вич, В А Вавилин, Н К Зенков, Е Б Меньшикова // Бюл СО РАМН - 2005 - Вып 4 -С 9-13

48 Меньщикова Е Б Свойства и функции НАДФН-оксидаз клеток млекопитающих / Е Б Меньшикова, Н К Зенков // Успехи соврем биологии - 2006 - Т 126, вып 1 - С 97112

49 Окислительный стресс Прооксиданты и антиоксиданты / Е Б Меньщикова, В 3 Лан-кин, Н К Зенков, И А Бондарь, Н Ф Круговых, В А Труфакин - М "Слово", 2006 -556 с

50 Активная защита при окислительном стрессе Антиоксидант-респонсивный элемент / В В Ляхович, В А Вавилин, Н К Зенков, Е Б Меньщикова//Биохимия - 2006 - Т 71, вып 9 —С 1183-1197

51 Антиоксидантные и противовоспалительные свойства новых водорастворимых серосодержащих фенольных соединений / Н К Зенков, Е Б Меньшикова, Н В Кандалин-цева, А С Олейник, А Е Просенко, О Н Гусаченко, О А Шкляева, В А Вавилин, В В Ляхович//Биохимия-2007-Т 72, вып 6-С 790-798

52 Зенков Н К Механизмы активации макрофагов / Н К Зенков, Е Б Меньщикова, В А Шкурупий//Успехи соврем биологии - 2007 - Т 127, вып 3-С 243-256

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ активированные кислородные метаболиты

АУФОК - аутотрансфузия УФ-облученной крови

БА бронхиальная астма

БХЛ биохемилюминесценция

ИБС ишемическая болезнь легких

ЛНП липопротеины низкой плотности

МАФ - макрофаг-активирующий фактор

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

ПОЛ перекисное окисление липидов

ПЯЛ полиморфноядерные лейкоциты

С-9 3-(4'-гидроксифенил)пропилсульфонат натрия

С-10 3-(4'-метоксифенил)пропилсульфонат натрия

С-13 (3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропш1сульфонат натрия

С-17 3-(3'!5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилсульфонат натрия

ТБК 2-тиобарбитуровая кислота

ТС-9 3-(4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия

ТС-10 - 3-(4'-метоксифенил)пропилтиосульфонат натрия

ТС-13 - 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия

ТС-17 - 3-(3',5'-ди-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия

ФМА форболмиристатацетат

ХБ хронический бронхит

ХЛ хемилюминесценция

ХНЗЛ - хронические неспецифические заболевания легких

АЯЕ антиоксидант-респонсивный элемент

ввт глутатион-8-трансфераза

I тах - максимальная интенсивность дыхательного взрыва (ХЛ ответа)

I тах/гранулоцит- удельная интенсивность ХЛ ответа гранулоцитов крови 8Ш-1 - морфолиносиднонимин Т тах - время наступления максимума ХЛ ответа 1ВН<3 - трет-бутилгидрохинон

ЗЕНКОВ Николая Константинович

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ ВОСПАЛЕНИИ И ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЕГО АНТИОКСИДАНТНОЙ КОРРЕКЦИИ

Автореф дисс на соискание ученой степени доктора биологических наук Подписано в печать 12 09 2007 Заказ № 78 Формат 60x90/16 Уел печ л 2 Тираж 100 экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

В организмах человека и животных постоянно протекают реакции с участием высокореакционных активированных кислородных метаболитов (АКМ: О^, ОН* и др.). На образование АКМ расходуется от 5 до 10% потребляемого кислорода [200]. Сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных процессов с участием АКМ. Нельзя однозначно сказать, насколько токсичны АКМ или насколько они необходимы при развитии типовых патологических процессов. Исследования, проведенные на животных-нокаутах, показывают, что ключевые элементы продукции АКМ и антиоксидантной защиты в своем большинстве не являются критическими для жизнедеятельности организма. Мыши, нокаутированные по каталазе, Схх,Ъп- и экстрацеллюлярной супероксиддисмутазе, глутатионпероксидазе 1, металлотионеинам 1 и 2, фактору транскрипции рождаются и развиваются нормально, однако генетические нарушения продукции АКМ и элементов антиоксидантной защиты проявляются с возрастом, а также при различных воздействиях, таких как гипероксия, ионизирующая радиация, введение параквата или Н202.

В настоящее время большинство исследователей считают АКМ важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом изменения программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток [93, 287]. Так как развитие типовых патологических процессов в той или иной степени связано с изменением клеточных программ, то ясно, что течение многих заболеваний и патологических процессов определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Однако в большинстве случаев неизвестно, каков механизм регуляторного действия АКМ - воздействие ли это на мембраны, киназы, редокс-чувствительные факторы транскрипции или другие клеточные элементы. Таким образом, участие одних и тех же молекул в повреждении клеток и тканей, в их защите от агрессии микроорганизмов, а также в процессах внутриклеточной и межорганной регуляции заставило исследователей по-новому взглянуть на биологическую роль АКМ в патофизиологических процессах [401]. Это делает актуальным изучение молекулярно-клеточных механизмов генерации АКМ, их биологическую роль и возможности антиоксидантной терапии при типовых патологических процессах, среди которых одним из важнейших является воспаление.

Цель исследования: изучить молекулярно-клеточные механизмы развития окислительного стресса при патологических процессах воспалительной природы и возможности коррекции его деструктивных эффектов антиоксид антами.

Задачи исследования:

1. Разработать комплекс био- и хемилюминесцентных методов оценки параметров окислительного стресса in vitro на клеточных культурах и in vivo в организмах человека и животных.

2. В условиях, моделирующих состояния фагоцитирующих клеток в организме, изучить особенности их окислительного метаболизма при ишемии и реперфузии, а также трансформации в "пенистые" клетки.

3. На модели трансформации перитонеальных макрофагов в "пенистые" клетки при инкубации с модифицированными липопротеинами низкой плотности изучить изменение основных механизмов генерации АКМ.

4. В экспериментальных системах исследовать антиокислительные и защитные свойства новых водорастворимых фенольных антиоксидантов, синтезированных на основе бромзамещенных алкилфенолов.

5. Исследовать возможность регуляции воспалительного процесса с помощью водорастворимых фенольных антиоксидантов с бифункциональным действием.

6. Исследовать изменение показателей хемилюминесцентного ответа гранулоцитов в динамике экспериментальных типовых патологических процессов у животных (зимозан-индуцированное воспаление, гипероксия, развитие перевиваемой опухоли).

7. С помощью комплекса био- и хемилюминесцентных методов изучить прооксидантные и антиоксидантные параметры окислительного стресса у людей с хроническими воспалительными заболеваниями разного этиопатогенеза.

Научная новизна. Разработаны теоретические модели активации кислорода в реакциях с металлопротеинами, а также монооксигеназных реакциях с цитохромами Р450.

Впервые показано, что продукция гипогалогенитов не зависит от содержания кислорода в культуральной среде и сохраняется далее при концентрациях 02 меньше 5 мкМ. Макрофаг-активирующий фактор, полученный из митоген-стимулированных лимфоцитов, снижал продукцию супероксидного радикала, и одновременно усиливал образование других форм АКМ, вызывающих ХЛ люминола. Трансформация макрофагов в "пенистые клетки" при культивировании с модифицированными ЛНП сопровождается снижением спонтанной ХЛ с люцигенином, отражающей внутриклеточную продукцию О ~2 митохондриями; интенсивность зимозан-усиленной ХЛ не изменялась, что указывает на сохранение функциональной активности ЫАГЗРН-оксидазы.

Впервые установлено, что изменение ХЛ ответа гранулоцитов крови отражает развитие воспалительного процесса мононуклеарного типа (зимозан-индуцированное воспаление у экспериментальных животных); при экссудативном поражении легких в условиях гипероксии ХЛ ответ не изменялся. Выявлено 2 альтернативных механизма изменения суммарной метаболической активности гранулоцитов периферической крови: либо за счет изменения количества циркулирующих клеток, либо за счет их кондиционирования; показано, что процессы кондиционирования являются доминирующими и регулируются мононуклеарными фагоцитами. Исследование ферментативных механизмов продукции АКМ у преждевременно стареющих крыс с повышенным радикалообразованием (линия ОХУ8) выявило повышенный уровень продукции О^ и Н202 гранулоцитами крови и сниженный уровень синтеза С^ в митохондриях по сравнению с животными исходной линии Вистар. Крысы линии ОХУ8 обладали повышенной устойчивостью к высотной гипоксии, однако развитие локального воспаления у них было сходным с таковым у крыс линии Вистар.

С помощью разработанного комплекса хемилюминесцентных методов проведен анализ радикальных окислительных процессов и ингибирующих их систем при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (XH3J1, ИБС, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), показано, что степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса. У больных XH3JI и язвенной болезнью преобладание прооксидантного компонента определяется главным образом за счет примирования гранулоцитов крови и снижения антиокислительной активности сыворотки, в то время как у больных ИБС - в большей степени за счет существенного повышения процессов ПОЛ сыворотки. Использование разнонаправленных тестовых нагрузок, антиоксидантных (внутримышечные инъекции витамина Е) и прооксидантных (аутотрансфузия УФ-облученной крови), в целом приводила к сходному результату - снижению окислительного потенциала полиморфноядерных лейкоцитов крови.

В разных экспериментальных системах in vitro и in vivo впервые исследованы антиоксидантные и противовоспалительные свойства новых водорастворимых фенольных соединений комбинированного действия, синтезированных на основе бромзамещенных алкилфенолов, показана высокая противовоспалительная активность и регуляторное действие частично экранированного фенола с тиосульфонатной группой в пара-положении, a также возможность угнетения воспалительного процесса посредством воздействия на экспрессию генов, контролируемых антиоксидант-респонсивным элементом.

Научно-практическая значимость. Разработан комплекс методов оценки параметров окислительного стресса, включающий в себя определение: а) активности метаболического "взрыва" при стимуляции гранулоцитов в образцах цельной крови, б) опсонической активности сыворотки крови rio динамике ХЛ ответа гранулоцитов при стимуляции зимозаном, в) концентрации образующихся в сыворотке пероксильных радикалов по интенсивности спонтанной биохемилюминесценции, г) суммарной антиокислительной активности сыворотки как величины, обратной интенсивности ее Н202-индуцированной ХЛ. Показана возможность выполнения комплекса методов в микроварианте с использованием 0,1 мл крови человека или экспериментального животного.

Для новых серосодержащих антиоксидантов, синтезированных на основе алкилфенолов, выявлена способность стимулировать экспрессию генов, кодирующих ферменты 2 фазы детоксикации ксенобиотиков, и ингибировать развитие острого воспаления, что открывает перспективы создания нового класса противовоспалительных препаратов.

Показана принципиальная возможность регистрации спонтанной биохемилюминесценции с поверхности тела человека в целях клинической диагностики.

Положения, выносимые на защиту:

1. Условия, in vitro моделирующие состояния фагоцитирующих клеток в организме (содержание кислорода, действие цитокинов, захват макрофагами модифицированных липопротеинов), в значительной степени определяют основные механизмы генерации АКМ и хемилюминесцентный ответ клеток в присутствии разных люминофоров и стимуляторов, исследование которых позволяет более адекватно экстраполировать и прогнозировать развитие окислительного стресса in vivo.

2. У животных в условиях индукции типовых патологических процессов кондиционирование (примирование и деактивация) циркулирующих в крови гранулоцитов регулируются макрофагами, в результате чего воспаление мононуклеарного типа сопровождается изменением хемилюминесцентного ответа гранулоцитов, в то время как при воспалении деструктивно-экссудативного типа такие изменения не наблюдаются.

3. С помощью комплекса био- хемилюминесцентных методов показано развитие окислительного стресса при хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь), что проявляется в усилении способности гранулоцитов крови к генерации АКМ, интенсификации процессов ПОЛ в сыворотке с одновременным снижением ее антиокислительной активности. Степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью окислительного стресса.

4. Синтезированные на основе бромзамещенных алкилфенолов фенольные соединения, содержащие несколько функциональных групп, проявляют в разных экспериментальных системах in vitro и in vivo уникальные антиоксидантные свойства, что делает их перспективными в плане разработки новых лекарственных препаратов.

5. Синтезированные водорастворимые фенольные антиоксиданты обладают выраженным противовоспалительным действием и индуцируют экспрессию гена GSTP1, что указывает на их способность активировать антиоксидант-респонсивный элемент.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Био-хемилюминесценция" (Красноярск, 1983); школе-конференции молодых ученых "Актуальные вопросы патофизиологии" (Новосибирск, 1985); IV Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987); Всесоюзном семинаре "Гомеостатика живых и технических систем" (Иркутск, 1987); Всесоюзной конференции "Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока" (Томск, 1989); научной конференции "Проблемы донозологической гигиенической диагностики" (Ленинград, 1989); III Всесоюзном совещании по хемилюминесценции (Рига, 1990); Всесоюзной школе-семинаре "Био-термо-хемилюминесценция" (Суздаль,

1990); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы применения магнитных и электромагнитных полей в медицине" (Рига, 1991); Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Патогенез хронического воспаления" (Новосибирск,

1991); научно-практической конференции "Биохемилюминесценция. Практическое применение" (Москва, 1991); Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Магнитобиология и магнитотерапия в медицине (Сочи, 1991); Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата, 1992); I съезде иммунологов России (Новосибирск,

1992); конференции "Свободнорадикальные механизмы повреждения мозга при патологических состояниях и заболеваниях" (Москва, 1993); II съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995); симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения H.H. Аничкова (Санкт-Петербург, 1995); 6 Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск,

1996); научно-практической конференции "О создании единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири" (Новосибирск, 1996); Международной конференции "Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты" (Санкт-Петербург, 1999); Научной конференции "Актуальные проблемы кардиологии" (Томск, 2000); II Всероссийском симпозиуме "Хроническое воспаление" (Новосибирск, 2000); международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000); Международной конференции "Свободнорадикальные процессы и антиоксиданты в развитии и функциях нервной системы: от плода к старению" (Санкт-Петербург, 2001); Всероссийской конференции "Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты", (Новосибирск, 2002); VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002). 3-й и 4-й научно-практических конференциях с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003, 2005); XV международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Ялта-Гурзуф, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 130 научных работ, в том числе 29 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертационных работ, 6 статей в зарубежных журналах, 5 монографий.

выводы

1. При связывании молекулярного кислорода с активными центрами ферментов его состояние может быть представлено в виде суперпозиции отдельных восстановленных состояний от 02 до Н20, при этом в антиоксидантных ферментах электромагнитные излучения красного и инфракрасного диапазонов могут индуцировать кооперативные переходы между виртуальными состояниями связанных молекул кислорода и тем самым изменять активность ферментов.

2. Способность гранулоцитов нарабатывать гипогалогениты мало зависит от кислорода в диапазоне концентраций от 5 до 1300 мкМ, в то время как активность мембрансвязанной КАОРН-оксидазы и синтез О ~ значительно снижаются при концентрациях 02 меньше 100 мкМ и полностью восстанавливаются при реперфузии кислород-содержащей средой.

3. Макрофаг-активируюгций фактор, выделяемый стимулированными лимфоцитами, дозозависимо снижает продукцию 02 перитонеальными макрофагами и люцигенин-усиленную ХЛ, но повышает продукцию других форм АКМ, инициирующих ХЛ люминола, что может лежать в основе повышения цитотоксичности клеток.

4. Трансформация перитонеальных макрофагов в пенистые клетки в процессе культивирования с модифицированными ЛНП в течение 48 ч сопровождается снижением спонтанной продукции АКМ (02, Н202, НОС1), определяемой по люцигенин- и люминол-усиленной ХЛ (соответственно в 30 и 14 раз), что свидетельствует о нарушении процессов митохондриального дыхания, в то же время способность клеток к развитию дыхательного "взрыва" в ответ на зимозан не изменяется.

5. Процессы премирования и деактивации циркулирующих в крови гранулоцитов регулируются макрофагами, в результате чего воспаление мононуклеарного типа (внутривенное введение животным зимозана) сопровождается изменением метаболической активности клеток, в то время как для воспаления экссудативно-деструктивного типа (повреждение легких в условиях гииероксии) такие изменения не характерны.

6. Синтезированные на основе бромзамещенных алкилфенолов новые фенольные соединения в разных экспериментальных системах проявляют высокую антиоксидантную активность, которая зависит от степени экранирования ОН-группы и содержания тиосульфонатной группы в пара-положении. Противовоспалительная активность соединений коррелирует с их способностью повышать экспрессию гена СБТП в клетках гепатомы человека Нерв2 и наиболее выражена у фенола, частично экранированного трет-бутильной группой.

7. При хронических заболеваниях воспалительной этиологии (ХНЗЛ, ИБС, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) наблюдается развитие окислительного стресса, что проявляется в усилении способности гранулоцитов крови к генерации АКМ (0^, Н202, Н0С1), интенсификации процессов ПОЛ в сыворотке с одновременным снижением ее антиокислительной активности. Обнаружено, что степень тяжести патологического процесса сопряжена с выраженностью дисбаланса окислительных процессов и систем их детоксикации.

8. При ХНЗЛ как антиоксидантные (внутримышечные инъекции а-токоферола), так и прооксидантные (аутотрансфузия УФ-облученной крови) нагрузки приводят к снижению метаболической активности гранулоцитов крови и позволяют выявить варианты реагирования ПЯЛ в зависимости от индивидуальных особенности больных и длительности курса лечения, что может служить критерием выбора адекватной терапии.

9. Интенсивность собственной биохемилюминесценции с поверхности тела человека лежит в диапазоне от 10 до 50 квант/(схсм2), максимум свечения находится в синей области спектра (380-420 нм). У больных ХНЗЛ наблюдается усиление биохемилюминесценции в области груди, что делает перспективным изучение механизмов данного явления с целью разработки новых диагностических критериев.