РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

Жаворонок, Татьяна Васильевна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Жаворонок, Татьяна Васильевна Томск 2012 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.03

Автореферат диссертации по медицине на тему РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

На правах рукописи

Жаворонок Татьяна Васильевна

РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

14.03.03 - патологическая физиология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 0 идл 2012

Томск-2012

005017280

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

Рязанцева Наталья

Владимировна

Степовая Елена Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, профессор Хлусов Игорь Альбертович кафедры морфологии и общей патологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор, член- УдУт Владимир Васильевич

корреспондент РАМН, заведующий лабораторией

физиологии, молекулярной и клинической

фармакологии, заместитель директора по научной и

лечебной работе ФГБУ НИИ фармакологии СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор, заведующий Поляков Лев Михайлович лабораторией медицинской биотехнологии, заместитель директора по научной работе ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН

Ведущая организация: ФГБУ НИИ медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН (г. Красноярск)

Защита состоится « 25 » мая 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (634050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан «г.

Ученый секретарь диссертационного совета Петрова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из наиболее актуальных вопросов медицины остается проблема идентификации молекулярных и клеточных механизмов воспаления, лежащего в основе большинства заболеваний. Течение и исходы острого воспаления (ОВ) во многом зависят от функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов (Меньшикова Е£. и ооавт„ 2006; Маянский АЛ., 2007; Rutkowski R. et al, 2007]. .

Нейтрофил является ключевой клеткой в развитии ОВ. С одной стороны, он относится к клеткам-эффекторам очага воспаления, где запускает целый каскад молекулярных механизмов, от которых зависит, перейдет ли процесс в хроническую фазу или наступит разрешение воспаления. С другой стороны, нейтрофил выступает продуцентом веществ, принимающих участие в развитии и поддержании воспаления, к числу которых относятся: активные формы кислорода (АФК), ферменты азурофильных и специфических гранул, провоспалительные цитокины (фактор некроза опухоли a (TNFa), интерферон у, интерлейкины (IL) -1, -8 и др.), лейкотриены, простагландины, факторы сосудистой проницаемости и иные биологически активные вещества. [Yamamoto К, et al., 2003; Коваленко ЕЛ. и соавг, 2007; Grimstad О. et al., 2011].

При остром воспалении гиперпродукция АФК нейтрофилами носит адаптивный характер, но она же предполагает возможность нарушения редокс-зависимых путей регуляции клетки [Маянский НА, 2004; Лущак В Я., 2007; Rutkowski R et al, 2007; Зеиков HJC и соавг, 2009]. Накопление АФК в нейтрофильных гранулоцитах может приводить к окислительной модификации макромолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот), нарушению функций и повреждению клеток, активации программированной гибели вследствие развития окислительного стресса (ОС) [Владимиров Ю.А., 2000; Peake J., Suzuki К., 2004; Nathan С, 2006; Бурлакова ЕБ, 2006; Дубинина EJB, 2006; Чеснокова Н.П, 2007; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2008; Catala А., 2009].

Ведущую роль в защите от повреждающего действия АФК и поддержании, редокс-статуса нейтрофилов, от которого зависит эффективность их функционирования, играет тиолдисульфидная система (ТДС) [Stadtman E.R., Levine R.L., 2000; Chappie I.L., 2002; Калинина Е.В. и соавт., 2008]. Эффекты этой системы основаны на восстановительном потенциале глутатиона (GSH) [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009]. GSH выступает акцептором АФК, кофактором ряда ферментов антиоксидантной и детоксикационной систем [Zhu Y et al, 2007; Калинина Е.В. и соавт., 2008], участвует в экспрессии редокс-чувствительных генов, регуляции внутриклеточной сигнализации [Pietarinen-Runtti Р, et al., 2000; Октябрьский О.Н, Смирнова Г.В., 2007; Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2009]. Глутатион и сопряженные с ним ферментативные редокс-белки ТДС (перокси-, глута-, тиоредоксины и др.) обеспечивают процесс S-тиоляции/

детиоляции активных центров протеинов, защищая их от необратимой окислительной модификации и инактивации [Дас Д.К., Модик Н., 2004; Nakamura Н, 2004; Trudel S. et al., 2009; Liu G. et al., 2010], что способствует поддержанию функциональной активности клеток. Изучение механизмов оптимизации редокс-состояния ТДС в нейтрофилах актуально в плане поиска путей возрастания эффективности функционирования этих клеток при ОВ.

Механизмом контроля гомеостаза в организме является апоптоз [Kerr J.F.R., 1972; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Активация программированной гибели клетки напрямую связана с развитием ОС. АФК участвуют в реализации танатогенной программы посредством изменения редокс-регуляции клетки, экспрессии генов [Белушкина НЛ. с соавт., 1998; Дубинина ЕЕ., 2006], открытия пор в мембране митохондрий с высвобождением Са2+ и проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) [Y1 J. et al, 2002; Лущак В.И., 2007]. Несмотря на очевидность взаимных связей между ОС и апоптозом, роль АФК в ограничении срока жизнедеятельности нейтрофилов посредством реализации программированной гибели не вполне ясна. Среди АФК уникальной химической природой и множеством внутриклеточных мишеней обладает NO, что обеспечивает ему как проапоптотические (Hortelano S. et al, 1997; Bmene В, 1999; Лущак ВЛ, 2006; Кулинский ВЛ, 2007], так и антиапоптотические эффекты [De Nadai С. et al, 2000, Choi B.M. et al, 2002]. Остается открытой проблема выяснения молекулярных механизмов влияния молекул NO на программированную гибель нейтрофилов в условиях окислительного стресса, развивающегося при ОВ.

Таким образом, идентификация редокс-зависимых механизмов нарушения функций нейтрофилов при ОВ и ОС в настоящее время лежит в плоскости понимания ряда молекулярных процессов: определения роли тиолдисульфидной системы в регуляции функционального статуса клетки, оценки выраженности окислительной модификации макромолекул регуляторкых систем клетки, а также изучения молекулярных механизмов сопряжения ОС и апоптоза. Сосредоточение фундаментальных исследований на этом направлении необходимо для разработки технологических основ селективного управления острым воспалительным процессом.

Цель исследования: установить общие закономерности и особенности нарушений редокс-зависимых механизмов регуляции функциональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе.

Задачи исследования: 1. Оценить функциональные свойства (активность миелопероксидазы, продукция активных форм кислорода и цитокинов — фактора некроза опухоли а и интерлейкина-8) и апоптоз нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro.

2. Оценить состояние компонентов системы про- и антиоксидантов в мембране эритроцитов и плазме крови у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит); выявить клинико-патогенетические закономерности в зависимости от особенностей клинического течения процесса воспаления.

3. Дать комплексную характеристику тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro, оценить ее функциональный резерв в условиях действия блокатора (N-этил-малеимид) или протектора (1,4-дитиоэритритол) SH-rpynn, ингибитора катал азы (З-амино-1,2,4-триазол) или синтеза глутатиона (бутионин-сульфоксимин).

4. Выявить общие закономерности и особенности влияния тиолдисульфидной системы на окислительную модификацию белков и функциональные свойства нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора каталазы или синтеза глутатиона.

5. Установить роль оксида азота в механизмах дизрегуляции апоптоза нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro в условиях индукции (L-аргинин) и ингибирования (№-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир) NO-синтаз.

6. Идентифицировать молекулярные мишени влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов, оценив содержание белков-регуляторов с про- (Вах) и антиапоптотической (Bcl-2) активностью и концентрацию внутриклеточных сигнальных молекул (CaJ+, цАМФ и цГМФ) при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro на фоне индукции и ингибирования NO-синтаз.

Научная новизна. Получены новые знания фундаментального характера о молекулярных механизмах изменения редокс-регуляции эффекторного потенциала и апоптоза нейтрофильных лейкоцитов крови при остром воспалении. Выявлено, что молекулярные механизмы изменений функциональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и моделировании окислительного стресса с помощью 200 мкМ Н202 являются однотипными и сопряжены с повышением карбонилирования и глутатионилирования белков в клетке.

производных белков нейтрофилов, а дефицит восстановленного глутатиона при ингибировании синтеза de novo 1 мМ бутионинсульфоксимином (BSO) приводит к накоплению карбонильных производных белков и перераспределению клеточного пула глутатиона с целью сохранения его белковосвязанной формы. Ингибирование синтеза глутатиона с помощью BSO снижает кислород-зависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (продукция 'ОН и активность миелопероксидазы), необходимые для обеспечения микробицидной функции, и не влияет на продукцию IL-8 и TNF-D. Ингибирование каталазы с помощью 2 мМ 3-амино-1,2,4-триазола (AT) при остром воспалении компенсируется участием тиоддисульфидной системы в поддержании редокс-статуса и функциональной активности нейтрофилов, которые снижают только продукцию "ОН.

Показано, что при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro, моделируемом с помощью 5 мМ Н202, оксид азота ограничивает реализацию программированной гибели нейтрофилов в условиях индукции синтеза NO 500 мкМ L-аргинином. Продемонстрировано, что молекулярные механизмы антиапоптотического влияния N0 на программированную гибель нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro не связаны с изменением баланса про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков, а опосредованы участием цГМФ, цАМФ и ионов кальция.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в результате проведенного исследования фактические данные расширяют существующие фундаментальные представления о процессах дизрегуляции редокс-статуса и функциональной активности нейтрофилов крови при остром воспалении. Выявлен редокс-зависимый характер нарушений функций нейтрофильных гранулоцитов, сопряженный с состоянием тиоддисульфидной системы, и определена роль восстановленного и белковосвязанного глутатиона в регуляции процессов окислительной модификации белков и поддержании функционального статуса нейтрофилов у пациентов с острым воспалением и при моделировании окислительного стресса in vitro. Данные о роли глутатиона в поддержании функциональной активности нейтрофилов и регуляции процессов окислительной модификации белков позволяют разработать подходы для эффективного патогенетически обоснованного использования антиоксидантов в комплексной терапии острых воспалительных заболеваний.

Идентифицированы молекулярные мишени оксида азота, опосредующие механизмы его влияния на индукцию апоптоза нейтрофилов при остром воспалении и моделировании окислительного стресса. Основные положения исследования могут служить базой для идентификации молекулярных мишеней, подверженных воздействию активных форм кислорода при острых воспалительных заболеваниях. Установленные закономерности могут быть положены в основу разработки селективных молекулярных технологий

управления развитием процесса острого воспаления посредством влияния на функциональный статус и продолжительность жизни нейтрофилов.

Положения, выносимые на защиту:

1. При окислительном стрессе, индуцированном в условиях острого воспаления и in vitro с использованием 200 мкМ Н202, имеют место однотипные редокс-зависимые механизмы изменений функциональных свойств нейтрофилов крови (увеличение активности миелопероксидазы, продукции радикала 'ОН и провоспалительных цитокинов - шперлейкина-8 и фактора некроза опухоли а).

2. Нарушения состояния тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro (200 мкМ Н202) характеризуются снижением содержания восстановленного глутатиона, SH-групп белков и активности глутатионпероксвдазы при повышении концентрации окисленного и белковосвязанного глутатиона.

3. Механизмы нарушения функциональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro (200 мкМ Н2О2) обусловлены изменением процессов окислительной модификации белков (карбонилирования и глутатионилирования белковых молекул) и концентрации восстановленного глутатиона в клетке.

4. Молекулы оксида азота ограничивают реализацию апоптотической гибели нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении и экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 5мМ Н2О2, что сопряжено с изменением внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров (цГМФ, цАМФ и Са*) и не зависит от содержания про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков.

Апробация и внедрение результатов работы. Результаты исследований представлены и обсуждались на I и II съездах физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005; Кишинев, 2008), V и VI Сибирских физиологических съездах (Томск, 2005; Барнаул, 2008), региональной научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации» (Томск, 2006), научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований» (Ростов-на-Дону, 2006), XVI, XVII и XVIII Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (С-Петербург, 2006; Казань, 2007; Екатеринбург, 2008), XX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007), всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2007), III общероссийской научной конференции с международным участием «Перспективы развития вузовской науки» (Дагомыс, Сочи, 2007), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2007), 14 научно-практической конференции с международным

участием «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень, 2007), II и III национальных конгрессах терапевтов (Москва, 2007 и 2008), XVI, XVH, XVIII и XIX конгрессах Европейского респираторного общества (Мюнхен, 2006; Стокгольм, 2007; Берлин, 2008; Вена, 2009), VIII международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).

Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ (проект НШ-4153.2006.7), РФФИ (проекты № 07-04-12150 и № 09-04-99026); реализованы в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 гг.» (№ 02.442.11.7276 от 20.02.2006 и № 02.445.11.7419 от 09.06.2006) и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 гг.» (№ 02.512.12.0013 от 01.08.2008 и № 02.512.11.2285 от 10.03.2009).

Основные результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры патофизиологии в разделах «Патофизиология воспаления» и «Патофизиология клетки», кафедры биохимии и молекулярной биологии в разделе «Патохимия клетки», кафедры пропедевтики внутренних болезней в разделе «Семиология воспалительных заболеваний системы органов дыхания и кровообращения» и в лечебно-диагностический процесс клиники пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России и отделения терапии МБЛПМУ «Городская больница скорой медицинской помощи» г. Томска.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 46 работ, из них 15 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 327 страницах и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов, списка литературы (544 источника: 168 отечественных и 376 иностранных). Работа иллюстрирована 29 таблицами и 15 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 125 человек: 90 пациентов (45 мужчин и 45 женщин, возраст от 18 до 50 л., в среднем 32±3 л.) с острыми воспалительными заболеваниями (ОВЗ) (внебольничная пневмония (ВП) - 50 человек, острый аппендицит (ОА) - 40) и 35 здоровых доноров (18 мужчин и 17 женщин, возраст от 18 до 45 л., в среднем 29±6 л.). Пациенты были обследованы в порядке скорой медицинской помощи при госпитализации в терапевтическое и хирургическое отделения МБЛПМУ Городская больница №1 г. Томска (главный врач - О.Н. Попадейкин), клиники ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (главный врач - засл. врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелев). Диагноз устанавливали по данным анамнеза, физикального, клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования. При ВП тип инфильтрата (интерстициальный у 20 и альвеолярный у 30 пациентов) и объем

его распространения (моносегментарный у 20 и полисегментарный у 30 человек) в паренхиме легких, верифицировали с помощью компьютерной томографии с шагом 1,5 мм; при OA выраженность воспаления (флегмонозное у 26 и гангренозное у 14 человек) определяли в ходе резекции аппендикса. Критериями исключения для больных ОВЗ и здоровых лиц являлись: возраст моложе 18 и старше 50 лет, наличие в анамнезе хронических инфекционных, вирусных, аутоиммунных заболеваний, сахарного диабета, злокачественных опухолей, психических расстройств, алкогольной и наркотической зависимости, отсутствие информированного согласия. Набор клинического материала проводили при участии Т.С. Агеевой - д-ра мед. наук, проф. кафедры пропедевтики внутренних болезней и Е.Г. Соколовича - д-ра мед. наук, проф. кафедры госпитальной хирургии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также A.B. Дубоделовой - канд. мед. наук, зав. отделением терапии и ВЛ.Митасова - канд. мед. наук, зав. отделением хирургии МБЛМПУ Городская больница №1, за что автор выражает искреннюю благодарность.

Лабораторные исследования проводили на базе НОЦ молекулярной медицины (руководитель - канд. мед. наук O.E. Савельева), межкафедральной лаборатории оптической спектроскопии (зав. лабораторией - Е.В. Шахристова) ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (ректор - академик РАМН В.В. Новицкий); лаборатории радионуклидных методов исследования (зав. лабораторией - доктор мед. наук Н.Г. Кривоногое) УРАМН НИИ кардиологии СО РАМН (директор - академик РАМН P.C. Карпов) (г. Томск). Автор выражает благодарность В.В. Иванову - канд. биол. наук, доц. кафедры биохимии и молекулярной биологии, O.E. Савельевой - канд. мед. наук, руководителю НОЦ молекулярной медицины за интерес к работе, ценные теоретические и методические советы, помощь в организации исследований.

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак с использованием вакуумных систем объемом 9,0 мл («Greiner-bio-опе», Австрия) с гепарином лития. Из нее получали плазму, выделяли нейтрофилы путем центрифугирования на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/см3) и Ficoll-урографин (р=1,095 г/см3) («GE Healthcare», Швеция), отмывали эритроциты изотоническим фосфатно-соляным буфером и далее получали мембраны эритроцитов с помощью гипоосмотического метода (Dodge J. et al., 1963) в модификации (Петрова М.П. и соавт., 1978).

В соответствии с целью и поставленными задачами был предложен дизайн исследования, предполагающий разделение работы на последовательные этапы: клинико-биохимический и экспериментальный. На первом этапе оценивали, с одной стороны, - развитие ОС при ОВЗ (ВП и OA), для чего в плазме крови определяли показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ), ОМБ и антиоксидантной системы, в мембране эритроцитов - показатели ПОЛ и активность №7К+-АТФазы (табл. 1), с другой стороны, - состояние

нейтрофилов. включая оценку функционального статуса (продукция АФК, цитокинов, активность миелопероксидазы (МПО)), параметров ТДС, степени ОМБ и индукции апоптоза.

р Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с задачей изучения процессов окислительной модификации белковых и липидных молекул плазмы крови и мембран

Группы обследованных лиц Плазма крови Мембраны эритроцитов

ТБК-реактивные продукты Карбонильные производные белков Битирозин Окисленный триптофан в: s S а I о, ft Каталаза ТБК-реакгивные продукты Диеновые конъюгаты я Я 1 £ ез

Здо! х>вы.е доноры 27 15 10 10 27 25 10 10 10

Пациенты с острым воспалением Внебольничная пневмония 48 28 14 14 35 48 23 23 23

Острый аппендицит 24 25 15 15 24 24 24 24 24

На втором этапе сначала проводили сравнительные исследования in vitro с цегхьга оценки участия компонентов ТДС и ОМБ в поддержании функционального состояния нейтрофилов при ОС, для чего клетки, взятые у пациентов с ВП, культивировали с блокатором SH-rpynn N-этилмалеимидом в конечной концентрации 5мМ [Sahaf В. et а!., 2003], протектором SH-rpynn 1,4-дитиоэритритолом в конечной концентрации 5мМ [Brumell J., 1995], ингибитором синтеза глутатиона бутионинсульфоксимином в конечной концентрации 1мМ [Laragione Т. et al., 2003] или ингибитором каталазы 3-амино-1,2,4-триазолом в конечной концентрации 2мМ [Spolarics Z. et al., 1997] (все модуляторы «Sigma», США) в течение 18 ч в полной питательной среде при 37° С и 5 % С02; клетки, полученные у здоровых доноров, - в аналогичных условиях с добавлением 200 мкМ Н202 (табл. 2).

Затем выявляли оптимальную концентрацию Н202 (с использованием 1, 5, 10 и 50 мМ Н202), способную вызывать на фоне развития ОС in vitro запуск апоптоза максимального числа нейтрофилов без индукции некроза, имитируя патологический процесс, формирующийся в отношении нейтрофилов при ОВЗ. Для проверки гипотезы об участии оксида азота в регуляции апоптоза нейтрофилов в условиях ОС и верификации молекулярных мишеней, ответственных за NO-зависимую модуляцию программированной гибели, клетки крови, полученные у пациентов с ОВЗ, инкубировали в присутствии ингибитора NO-синтаз L-NAME («Fluka», США) в конечной концентрации 500

мкМ [Beltran В. et al., 2002] или субстрата NO-синтазной реакции L-аргинина («МР», США) в концентрации 500 мкМ [Niu X.-F. et al, 1996] в течение18 ч в полной питательной среде при 37° С и 5 % С02, клетки здоровых доноров - в аналогичных условиях с добавлением 5 мМ Н202 (табл. 3).

Таблица 2

Распределение здоровых доноров и пациентов с внебольничной пневмонией в соответствии с задачей изучения функциональной активности, состояния тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Группы обследованных лиц 00 а 1 S Фактор некроза опухоли а Гидроксильный радикал Миелопероксидаза Глутатионпероксидаза Тиоредоксинредукгаза Восстановленный глутатион Окисленный глутатион SH-группы белков Белковосвязанный глутатион Карбонильные пооизволные белков

Интакгные нейтрофилы (контроль) 8 8 22 22 13 18 12 12 12 12 14

•А О. о Нейтрофилы, инкубированные с 200 мкМ Н202 8 8 13 13 13 13 10 10 10 10 12

а § о Нейтрофилы, инкубированные с 200 мкМ Н2О2 и NEM 5 5 8 8 8 8 5 5 5 5 6

3 ва о о. Нейтрофилы, инкубированные с 200 мкМ Н2О2 и Ш"Е 5 5 8 8 8 8 5 5 S 5 6

§ со Нейтрофилы, инкубированные с 200 мкМ Н202 и ВБО 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6

Нейтрофилы, инкубированные с 200 мкМ Н2О2 и АТ 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6

Интакгные нейтрофилы 16 16 39 39 23 23 23 23 23 23 16

Ч % о я \о я и о Нейтрофилы, инкубированные с КЕМ 8 8 11 11 11 11 11 11 11 11 5

а со о и а В Нейтрофилы, инкубированные сОТЕ 8 8 11 11 И 11 8 8 8 8 5

Е « I щ Нейтрофилы, инкубированные с ВБО 7 7 7 7 8 8 8 8 8 8 5

a s с == Нейтрофилы, инкубированные сАТ 7 7 8 8 8 8 8 8 8 8 5

В супернатантах интактных, Н202-стимулированных и инкубированных с модуляторами культур нейтрофилов определяли содержание цитокинов TNFa и IL-8, используя метод твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с протоколами производителя тест-систем («Вектор-бест», Россия) и метаболитов NO с помощью цветной реакции с реактивом Грисса [Green L.C. et al., 1982]. Число аннексин-положительных клеток в культуре и содержание АФК и Са2+ в нейтрофилах определяли методом проточной

лазерной цитометрии, используя цитометр Epics XL («Beckman Coulter», Франция): концентрацию АФК в клетках - с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией дихлорфлуоресцеина диацетата («Sigma», США) [Bass D.A. et al., 1983], содержание Са2+ в цитоплазме - оценивая интенсивность флуоресценции липофильного зонда Fluo 3 AM («MP Biomedicals», США), связывающего Са2+ [Merritt J.E. et al.,1990]; реализацию апоптоза - с помощью набора «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция), содержащего обладающий сродством к фосфатцдилсерину мембран аннексии V, меченый флуоресцеин изотиоцианатом [Van Engeland М. et al, 1998]. Концентрацию белков-регуляторов апоптоза Вс1-2 и Вах в нейтрофилах оценивали методом вестерн-блоттинга, для чего получали клеточные экстракты путем лизиса клеток и, разделив белки по молекулярной массе под действием электрического поля (напряжение 120 В, 60 мин), переносили их на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) электрофоретически (сила тока 60 мА, 90 мин), блоты инкубировали с первичными антителами к белкам-регуляторам («Biosource», США), в качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Таблица 3

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с задачей исследования влияния NO на реализацию программированной гибели и системы внутриклеточной регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе и остром воспалении

О 4> § о

Группы обследованных лиц 1 1 2 Активные формы кислорода Апоптотиче клетки i цГМФ •Л а 2 а о S Белок Вах Белок Вс1-2

Интактные нейтрофилы (контроль) 22 32 32 7 7 22 3 3

А От 0 1 Нейтрофилы, инкубированные с 5 мМ Н202 22 32 32 7 7 22 3 3

о 2 ш а § Нейтрофилы, инкубированные с 5 мМ Н2О2 и L-аргинином 22 22 22 6 8 22 3 3

го Нейтрофилы, инкубированные с 5мМ Н202 и L-NAME 22 22 22 7 9 22 3 3

Интактные нейтрофилы 54 54 54 14 14 54 3 3

_ qj ess в й 5 Нейтрофилы, инкубированные с L-аргинином 54 54 54 15 16 54 3 3

log с § Нейтрофилы, инкубированные с L-NAME 54 54 54 17 14 54 3 3

В нейтрофилах определяли: продукцию "ОН, учитывая его способность разрушать модельный субстрат 2-дезокси-О-рибозу [Thorn S.R., Elbuken М.Е., 1991]; активность ферментов: МПО - методом, основанным на реакции окисления о-фенилендиамина пероксидом водорода [Арутюнян A.B. и соавт., 2000], глутатионпероксидазы (ГПО) - методом, основанным на реакции взаимодействия GSH с гидроперекисью т-бутила [Карпищенко А.И, 1999], тиоредоксинредуктазы - методом, основанным на НАДФН-зависимом восстановлении 5,5С1-дитио-бис(2-нитробензойной) кислоты [Ташига Т., Stadtman E.R, 1996]; а также содержание компонентов ТДС: GSH и окисленного глутатиона (GSSG) - кинетическим методом, предложенным М.Е. Anderson (1985) в модификации [S. Kojima et al., 2004], тиоловых групп белков (Б-SH) и белковосвязанного глутатиона (Б-SSG) - методом, основанным на способности тиолов реагировать с 5,5С-дитио-бис(2)-нитробензойной кислотой с образованием окрашенного соединения и участии боргидрата в высвобождении из связи с белками глутатиона, концентрацию которого измеряли спектрофотометрически [Burchili B.R. et al., 1978]; карбонильных производных белков (КПБ) - методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора «Protein Carbonyl ELISA Kit» («Alexis Corporation», Швейцария); общего белка - методом М.М. Bredford (1976); циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) - методом радиоиммунного анализа, используя наборы «RIA АМРс/сАМР» и «RIA cGMP» («Immunotech», Франция).

В плазме крови оценивали содержание продуктов окислительной модификации макромолекул: КПБ - методом, основанным на взаимодействии окисленных остатков аминокислот с 2,4-динитрофенилгидразином [Арутюнян A.B. и соавт, 2000], битирозина и окисленного триптофана -флюориметрическим методом K.J. Davies (1987) в модификации [Бекман Э.М. и соавт, 2006], продуктов ПОЛ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП) - по их способности к образованию окрашенного тримегинового комплекса [Владимиров Ю.А, Арчаков А.И., 1972]; кроме того, оценивали компоненты антиоксидантной системы: активность каталазы - методом, основанным на способности пероксида водорода к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония [Королюк М.А и соавт, 1988], содержание церулоплазмина - методом, учитывающим его способность окислять диамины с последующей реакцией с п-фенилендиамином [Камышников B.C., 2000].

В мембране эритроцитов (модель клеточной мембраны) определяли концентрацию ТБК-РП [Владимиров Ю.А, Арчаков А.И, 1972], диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, основываясь на их способности поглощать свет при длине волны 233 нм [Косухин А.Б., Ахметова Б.С, 1987], и активность Ыа7К+-АТФазы методом A.M. Казеннова и соавт. (1984) в модификации [Мацкевич Ю.А. и соавт., 1994], оценивая нарастание уровня неорганического фосфора при гидролизе АТФ («MP Biomedicals», США).

При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999]. Для каждой выборки вычисляли медиану, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения показателей проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова, различия между зависимыми выборками оценивали непараметрическим критерием Вилкоксона, между независимыми выборками -ранговым критерием Манна-Уитни. Наличие связи между изученными показателями определяли с помощью корреляционного анализа Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности реализации окислительного стресса при острых воспалительных заболеваниях

Современные представления о развитии и исходах острого воспаления основываются на признании значимой роли функционального состояния активированных нейтрофилов в инициации ОС [Маянский Д.Н., 1997; Болдырев АЛ, 1998; Rahman I., 2005; Кленова Н.А., 2006; Кулинский В.И., 2007]. Гиперпродукция АФК необходима нейтрофилам для обеспечения микробицидных эффектов, но она же инцуцируег процессы окислительной модификации макромолекул в клетках очага воспаления, самих нейтрофильных гранулоцитах и может быть причиной индукции апоптоза. Постоянный контакт с АФК потенцирует дисбаланс редокс-состояния нейтрофилов, приводя к угнетению их функций, дезадаптации и быстрой элиминации, что негативно сказывается на разрешении процесса ОВ. В такой ситуации необходимо создание селективных технологий управления воспалительным процессом на основе комплексного подхода к изучению компонентов антиоксидантной системы, определяющих молекулярные механизмы поддержания редокс-статуса и функциональной активности нейтрофилов, а также к пониманию редокс-зависимых механизмов регуляции продолжительности жизни этих клеток.

Наше исследование было нацелено на оценку редокс-состояния и функциональных свойств нейтрофилов, механизмов участия ТДС в поддержании эффективности жизнедеятельности данных клеток и роли NO (как одной из ведущих форм АФК) в реализации апоптоза нейтрофилов при окислительном дисбалансе, формирующемся на фоне ОВЗ. Для решения этой проблемы были проведены клинико-лабораторные исследования (изучение нейтрофилов, полученных у пациентов с ОВЗ) и выполнен экспериментальный блок (проведение ингибиторного анализа в условиях сравнительного изучения клеток, полученных у пациентов с ОВЗ, и нейтрофилов, взятых у здоровых доноров и оцениваемых на фоне ОС in vitro). Продукцию АФК, состояние процессов ПОЛ, ОМБ и антиоксидантной системы при ОВ в клинике внутренних болезней мы оценивали, главным образом, на примере ВП,

поскольку окислительные процессы в легких не лимитированы содержанием кислорода, а также при воспалительном процессе, формирующемся на фоне ОА.

В первую очередь, была проведена оценка функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов как эффекторных клеток ОВ. У больных ВП и ОА, выявлено увеличение уровня АФК в нейтрофилах - в 2,7 и 2,8 раза, соответственно, по сравнению с таковым в кошроле [0,240 (0,214-0,259) усл.ед., р<0,05], а также содержания метаболитов N0 в среде инкубации нейтрофилов - в 1,5 и 1,4 раза относительно такового у здоровых доноров [0,108(0,106-0,110) мкМ] (р<0,05). Кроме того, при ВП с преимущественно интерстициальным и альвеолярным типами инфильтрации ткани легких у пациентов были увеличены уровень продукции "ОН в нейтрофилах (2,0 и 1,8 раза, соответственно) и активность МПО, образующей бактерицидные гипогалоиды (в обоих случаях в 1,2 раза) по сравнению с контролем (р<0,05). Помимо включения кислород-зависимых механизмов защиты, нейтрофилы регулируют течение ОВ посредством синтеза и секреции цитокинов [Маянский А.Н., 1989; Симбирцев А.С., 2004; Нестерова ИВ. и соавт„ 2006]. При ВП содержание провоспалительных цитокинов 1Ь-8 и ТОР-а в среде инкубации нейтрофилов возрастало в случае альвеолярной инфильтрации легочной паренхимы в 1,2 и 1,4 раза, соответственно, в случае интерсгациальной - в 1,2 и 13 раза, соответственно, по сравнению со значениями аналогичных показателей в контроле (р<0,05). Достоверных различий в значениях показателей, характеризующих функциональный статус нейтрофилов крови, выявлено не было как между подгруппами больных ВП (р>0,05), так и пациентами групп ВП и ОА (р>0,05).

Активация нейтрофилов при ОВ становится потенцирующим моментом в развитии ОС, который всегда сопровождается выраженными изменениями в системе про-/антиоксиданты крови и повреждением клеточных мембран. Оценка содержания ТБК-РП, характеризующих интенсивность ПОЛ, в плазме крови и мембране эритроцитов у лиц с ОВЗ показала повышение обеих величин этого параметра относительно таковых у здоровых доноров [0,21 (0,18-0,26) мкмоль/л и 4,47(2,75-5,67) нмоль/мг, соответственно] (р<0,05). Активация процессов ПОЛ снижает устойчивость мембран к прооксидантным влияниям и способствует нарушению функций мембран и клетки в целом. В частности, в мембране эритроцитов во всех подгруппах пациентов с ОВЗ нами выявлено угнетение активности Ыа7К+-А'ГФазы в 4,1-5,5 раза по сравнению со значениями показателя у здоровых лиц [0,077(0,061-0,108) мкМ/(ч мг)] (р<0,05).

Избыток АФК в нейтрофильных лейкоцитах вместе с ростом концентрации продуктов ПОЛ в крови у пациентов с ВП способствовал индукции процессов окислительной модификации белков и накоплению в плазме крови продуктов ОМБ - окисленного триптофана, битирозиновых сшивок и КПБ (рис. 1). Прирост значений концентрации КПБ в плазме крови у пациентов с ВП относительно таковой у здоровых лиц в контроле (р<0,05) был отмечен при

спонтанном и металл-катализируемом окислении, что свидетельствует о выраженной деструкции и высокой окисляемости белков плазмы (рис. 1). Металл-катализируемое окисление провоцировали компоненты системы Фентона, что связано, главным образом, с генерацией "ОН, а также некоторого количества феррил- и перферрил-ионов (Бе02+ и РеОН3+). При ВП нами отмечена тесная взаимосвязь между уровнем генерации "ОН нейтрофилами и концентрацией продуктов металл-катализируемого окисления в плазме крови (г=0,90, р<0,05 - при >.=274 нм; г=0,82, р<0,05 - при Х=373 нм). Повышение карбонилирования белков выявлено не только в плазме крови, но и в самих нейтрофилах (рис. 1 и 2), причем, при ВП показана высокая степень корреляции уровня КПБ в клетках и в плазме крови (г=0,83, р<0,05 - спонтанное окисление,

>„=274 нм; г=0,86, р<0,05 - металл-катализируемое окисление, Х=363 нм). %

1200 -1000800600400200 -0-

Рис. 1. Особенности окислительной модификации белков плазмы крови у пациентов с внебольничной пневмонией

Примечание: 1 — карбонильные производные белков (КПБ), спонтанное окисление (^=274 км), 2 - КПБ, спонтанное окисление (Х=363 нм), 3 - КПБ, металл-катализируемое окисление (>.=274 нм), 4 - КПБ, металл-катализируемое окисление (Х=363 нм), 5-битирозин, 6-окисленный триптофан

Вывод о значительной степени повреждения белков при ВП подтверждает зарегистрированный нами в плазме крови высокий уровень стабильных нерепарируемых модификаций триптофана и тирозина (рис. 1). Образование битирозиновых сшивок считается, в первую очередь, следствием действия синтазы оксида азота и МПО [Рябов Г.А, Азизов Ю.М, 2002], активность которых в нейтрофилах при ВП была увеличена (г=0,82, р<0,05, - корреляция между активностью МПО и содержанием битирозина в плазме крови), а окисление триптофана зависит от действия "ОН [АцШпа .1.А. е1 а1, 2000; Дубинина Е.Е, 2006] (г=0,94, р<0,05, - корреляция между продукцией "ОН нейтрофилами и уровнем окисленного триптофана в плазме крови).

О Здоровые доноры ■ Пациенты с вкебольничной пневмонией ♦ - р<0,05 значимость различий по сравнению со значениями в плазме крови у здоровых доноров

Значимых различий по изученным показателям ПОЛ и ОМБ между подгруппами пациентов с ВП обнаружено не было (р>0,05). Вместе с повышением содержания продуктов ПОЛ и ОМБ в плазме крови у пациентов с ВП и ОА отмечалось снижение антиоксидантной активности каталазы по сравнению с таковой в контроле [26,17 (24,54-27,78) мкат/л] (р<0,05), что можегг быть связано с повреждением фермента продуктами ПОЛ и АФК и провоцирует их дополнительный прирост. Угнетение активности каталазы у всех пациентов с ВП могло быть частично компенсировано одинаково выраженным ростом концентрации белка-антиоксиданта острой фазы церулоплазмина относительно контроля [62,30 (54,41-69,11) мг/л] (р<0,05).

Следовательно, полученные нами данные свидетельствуют о развитии в острый период ОВЗ состояния ОС, который затрагивает весь организм в целом. При этом окислительный сппус самих нейтрофильных лейкоцитов в значительной мере зависит от продукции АФК, избыток которых инициирует окислительное повреждение макромолекул и нарушает функциональную активность клеток. Гиперпродукция АФК используется для защиты от флогогенов, но она же выступает функциональной особенностью нейтрофилов, направленной на удаление этих потенциально опасных клеток, ставших неполноценными. При ВП и ОА нами показано равнозначное (р>0,05) увеличение количества аннексин-положительных нейтрофилов относительно значений показателя у здоровых лиц [49,25(45,03-58,13)%] (р<0,05), что сопровождалось одинаковым в обоих случаях (р>0,05) ростом содержания проапоптотического белка Вах в клетках по сравнению с таковым в контроле (р<0,05).

Необходимо еще раз подчеркнуть четко прослеживаемую, согласно нашим данным, закономерность: отсутствие значимых различий между пациентами с ОВ средней степени тяжести разной локализации (ВП и ОА), как и между подгруппами пациентов с ВП, по всем изученным показателям в нейтрофилах (внутриклеточный уровень АФК, активность МПО, продукция цитокинов и инициация апоптоза) и выраженности проявлений ОС в организме, регистрируемого по параметрам ПОЛ и антиоксидантной защиты. Это позволило нам в ходе дальнейших исследований объединить всех больных ВП и ОА в одну клиническую группу и оценивать изменения при ОВЗ как проявления типового патологического процесса - ОВ.

В целом, от адекватности продукции АФК в острую фазу воспаления и состояния антиоксидантной защиты клетки зависит не только эффективность и продолжительность функционирования, но и сама жизнь нейтрофилов. В этом плане остаются недостаточно изученными, с одной стороны, механизмы поддержания антиоксидантных свойств тиолдисульфидной системы, обеспечивающей результативность функционирования нейтрофилов при ОВ, с другой, - механизмы участия отдельных АФК в процессах элиминации данных клеток, что необходимо для успешного разрешения воспалительного процесса.

2. Сравнительная оценка функциональных свойств, редокс-состояния тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков

нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro

На следующем этапе работы необходимо было соотнести функциональный статус нейтрофилов при ОВ с таковым в условиях моделирования ОС in vitro и, одновременно, оценить зависимость функциональной активности клеток от редокс-состояния ТДС и окислительной модификации белков. Для моделирования ОС in vitro в культурах нейтрофилов, полученных у здоровых доноров, был выбран электростатически нейтральный пероксид водорода, способный быстро диффундировать через мембраны клеток [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Оптимальными для моделирования ОС считаются концентрации Н202 от 100 до 500 мкМ [Pietarinen-Runtti Р. et al., 2000; Коваленко Е.И. и соавт., 2007], а более высокие (1 мМ и выше - в зависимости от типа клетки) могут активировать запуск апоптоза [Cumming R.C. et al., 2004]. Поэтому для индукции ОС in vitro при изучении влияния редокс-состояния ТДС на функции нейтрофилов мы использовали концентрацию Н202 200 мкМ, которая активирует ОМБ, но не апоптоз [Gruñe Т. et al., 1995].

Сравнительный анализ функциональной активности нейтрофилов при ВП и моделировании ОС in vitro показал равнозначное в обоих случаях (р>0,05) повышение активности МПО, продукции клетками "ОН и цитокинов (рис. 2). Скорее всего, при ОС in vitro, индуцированном 200 мкМ Н202, и в условиях ОВ имеют место однотипные редокс-зависимые механизмы изменений функциональных свойств нейтрофилов. В частности, регуляцию синтеза провоспалительных цитокинов опосредуют факторы транскрипции семейства NF-kB, которые подвержены влиянию АФК и зависят от редокс-состояния клетки [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Способность факторов транскрипции связываться с ДНК могут регулировать оксиданты, модулируя редокс-статус их цистеиновых остатков [Pool L.B. et al., 2004].

Ведущую роль в поддержании редокс-статуса нейтрофилов, который определяет эффективность их функционирования и лежит в основе защиты от повреждающего действия АФК, играет тиолдисульфидная система [Stadtman ЕЛ., Levine RJL, 2000; Калинина ЕВ. и соавт., 2008]. Наши данные показывают, что ключевым фактором, определяющим нарушения редокс-состояния ТДС нейтрофилов крови при ОВ и ОС in vitro (200 мкМ Н202), является снижение концентрации GSH, сопряженное с уменьшением свободных SH-групп белков и активности ГПО при повышении содержания GSSG и Б-SSG. GSH ингибирует АФК, обеспечивает восстановление гидроперекисей фосфолипидов мембран глутатион-8-трансферазами и ГПО [Hayes JD. et al, 2005; Зенков HJC. и соавт, 2009; Liu G. et al., 2010]. Концентрация GSH в клетках при моделировании ОС была в 2,7 раза, при ВП - в 3,0 раза ниже контроля (р<0,05), а содержание GSSG выше такового в контроле в 2,0 и 1,7 раза, соответственно (р<0,05) (рис. 2).

Редокс-состояние ТДС и клетки в целом обусловлено соотношением GSH/GSSG - одним из общепризнанных критериев оценки выраженности ОС [Октабрьский ОН., Смирнова ГВ„ 2007; Reed М.С. et al, 2008]. Расчет величины соотношения GSH/GSSG в нейтрофилах показал ее снижение при ОС in vitro в

6,2 раза, при ВП - в 6,5 раза по сравнению с таковым в контроле (р<0,05). %

300

200

100

МПО

GSH GSSG GSH/GSSG КПБ

IL-8 TNF-a

□ Нешрофилы здоровых доноров (контроль)

□ Н«профили здоровых доноров. ннкубированныс с 200 мкМ Н3О2

Я Нешрофилы паидентов с внебольничной пневмонией

♦ -р<0,05 значимость разшгшй по сравнению со значениями в

ингактных нейтрофилах крови здоровых доноров

Рис. 2. Параметры функционального состояния, тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков нейтрофильных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro и при внебольничной пневмонии

Основной мишенью АФК в цитозоле клетки являются белки. При ВП и ОС in vitro снижение антиоксидантного потенциала глугатиона в нейтрофилах сопровождалось активацией ОМБ - как обратимых ее процессов (снижение содержания Б-SH и увеличение концентрации Б-SSG), так и необратимых (повышение уровня КПБ) (рис. 2). Содержание КПБ в нейтрофилах при моделировании ОС и у больных ВП превышало значения показателя в контрольной группе в 2,5 и 2,3 раза, соответственно (р<0,05). Достоверных различий по этому показателю при ОС in vitro и ВП не выявлено (р>0,05). Окислительная модификация Б-SH до Б-SSG вследствие экранирования редокс-чувствительных SH-групп белков глутатионом является неспецифической реакцией и представляет собой часть системы редокс-регуляции в клетке [Дубинина ЕЕ., 2006; Зенков Н.К. и соавт, 2009], тогда как накопление не репарируемых КПБ может привести к апоптозу или некрозу [Chen Q.etal, 2003].

Необходимо отметить, что сравнительный анализ данных, характеризующих состояние ТДС (содержание GSH и GSSG, соотношение GSH/GSSG), окислительной модификации белков (содержание Б-SH, Б-SSG и КПБ) и функциональные свойства (активность МПО, продукция НО', TNF-a и IL-8) нейтрофилов крови, показал, что все величины исследованных параметров у больных ВП статистически значимо не различались с таковыми при ОС,

индуцированном in vitro. Полученный факт свидетельствует о том, что использованная нами концентрация Н202 была адекватной для моделирования ОС, сопоставимого с окислительным стрессом, развивающимся при ОВ.

3. Оценка молекулярных механизмов участия тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков в поддержании функционального статуса

нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitra

Для исследования молекулярных механизмов влияния ТДС и ОМБ и на функционирование нейтрофилов крови в условиях ОС in vitro и при ОВ в среду инкубации клеток добавляли блокатор или протектор свободных SH-групп, или ингибитор синтеза глутатиона de novo, а также селективный ингибитор каталазы, учитывая участие ТДС и каталазы в антиоксидантной защите клетки.

Присутствие блокатора SH-групп NEM или ингибитора синтеза глутатиона BSO в среде инкубации нейтрофилов, находящихся в условиях ОС in vitro или взятых у больных ВП, приводило одновременно с падением концентрации GSH к снижению (р<0,05) активности МПО и продукции "ОН (табл. 4) и накоплению (р<0,05) КПБ в клетках (табл. 5). Недостаток GSH мог привести к индукции окислительной модификации аминокислот и сайт-специфическому повреждению активного центра в молекулах МПО и НАДФН-оксидазы с потерей способности к функционированию. Высказанное предположение косвенно подтверждается наличием выявленной нами положительной корреляционной связи между содержанием GSH в клетках и активностью МПО (г=0,70, р<0,05 - при ОС in vitro в присутствии NEM; г=0,61, р<0,05 - при инкубации с BSO нейтрофилов, взятых у больных ВП).

При добавлении ингибитора каталазы AT в среду инкубации нейтрофилов активность МПО и продукция 'ОН в клетках также снижались (р<0,05) как в условиях ОС in vitro, так и при ОВ (табл. 4), что может быть опосредовано разными механизмами. В частности, на активность МПО могут влиять изменения содержания субстратов и величины рН среды, причем высокие концентрации Н202 прямо повреждают молекулы фермента [Коваленко Е.И. и соавт., 2007], а в отсутствие каталазы был отмечен компенсаторный перерасход GSH (табл. 5). При блокаде каталазы в клетке падает активность ряда чувствительных к окислению ферментов, в том числе супероксиддисмутазы [Байляк М.М. и соавт., 2008], которая синтезирует пероксид водорода, преобразуемый посредством реакции Фентона в "ОН. Добавление нами протектора SH-групп DTE в среду культивирования нейтрофилов также приводило к снижению продукции 'ОН, повышенной при моделировании ОС in vitro и у больных ВП. Восстановленный глутатион и SH-содержащие белки эффективно ингибируют АФК и стабилизируют мембраны клеток [Sies H. et al., 1997; Hayes JD. et al, 2005; Зенков HJC. и соавт, 2009; Liu G. et al., 2010]. Одним из механизмов проявления антиоксидантных эффектов GSH в клетке является активное связывание Fe2+ и Си+ и ограничение реакций Фентона [Zhu Y., 2007].

Таблица 4

Влияние протектора SH-групп 1,4-дитиоэритритола (DTE), блокатораБН-групп N-этшмалешшда (NEM), ингибитора синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимина (BSO) и ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола (AT) ш функциональное состояние нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении (Me(QrQi), р)__

Группы обследованных 'ОН, нмоль/мг Миело-пероксидаза, усл.ед./мг IL-8, пг/мл TNF-D, пг/мл

Интактные нейтрофилы (контроль) 25 32 (19,87-27,60) 715,80 (669,80-741,10) 281,10 (273,71-304,10) 124,52 (89,02-156,00)

Нейтрофилы, инкубированные сН202 45,38 (38,21-70,31) * 846,70 (806,50-986,60) * 334,10 (311,82-352,00)* 170,40 (119,91-188,60) *

ja о о ж § Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и NEM 24,87 (10,36-46,86) * 636,35 (578,60-673,60) * * 92,95 (77,63-116,01)** 56,45 (36,20-68,11)**

и 3 а о о о Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и DTE 23,46 (17,6-32,28)" 697,05 (616,80-772,95) * 309,20 (279,11-326,20)* 105,90 (68,05-126,30)* *

го Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и BSO 13,31 (12,52-25,34) * 622,75 (544,00-655,35) * * 308,80 (303,62-329,62) * 174,91 (152,40-234,31) *

Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и AT 25,97 (18,16-26,94) * 689,10 (676,21-743,30)* 383,60 (331,42-403Д1) * 145,40 (132,72-185,11)*

S и К Интактные нейтрофилы 46,79 (40,64-52,74) * 832,00 (747,80-924,01) * 325,91 (312,91-335,40) * 168,31 (153Д7-171,47) *

Я и S п о Нейтрофилы, инкубированные cNEM 31,10 (22,44-33,95)л 694,33 (609,40-831,50) л 255,97 (241,40-280ДО)* л 103,67 (81,61-131,33) Л

а S а g Нейтрофилы, инкубированные с DTE 37,63 (33,72-40,02) *л 769,50 (645,12-913,49) 305,51 (270,73-371,30) 145,65 (125,23-164,75)* л

о и Нейтрофилы, инкубированные cBSO 32,56 (24,38-36,64)л 615,59 (571,89-686,89)* л 320,50 (290,32-340,12) 153,90 (135,90-164,60) *

<и Я 5 С Нейтрофилы, инкубированные с AT 27,44 (18,28-35,05) л 746,70 (562,9-822,8) 305,51 (270,73-371,30) * 144,60 (125,10-176,90)* ____ *

__^ __——--—-——---- #

Примечание: * - значимость различий по сравнению с контролем, р<0,05; -по сравнению с нейтрофилами у здоровых доноров, при инкубации клеток с Нг02, р<0 05- л - по сравнению с интакгаыми нейтрофилами у больных внебольничнои

пневмонией, р<0,05

Поддержание восстановительной способности GSH с помощью DTE нормализовало показатель активности МПО, повышенный при индукции ОС in vitro и в условиях ВП, до величин в интактных нейтрофилах у здоровых

доноров. Модификация эффективности действия МПО под влиянием DTE указывает на протекторный эффект восстановленных SH-групп в отношении поддержания функций фермента, что подтверждает коэффициент корреляции между содержанием SH-групп и активностью МПО в нейтрофилах, полученных у больных ВП и инкубированных с DTE (г=0,90, р<0,05).

Результативность взаимодействия нейтрофилов с микроорганизмами определяется интенсивностью проявления той или иной эффекторной функции, одной из которых является продукция цитокинов [Maianski, NA. et al.; 2003; Малышев И.Ю. и соавт., 2004]. АФК в условиях дизрегуляции окислительных процессов при OB осуществляют индукцию синтеза и секреции провоспалительных цитокинов. Действие АФК реализуется посредством активации факторов транскрипции, в том числе NF-kB, который контролирует синтез ряда цитокинов, молекул адгезии и белков острой фазы, опосредуя регуляцию иммунного ответа, воспалительной реакции и участие в контроле клеточного деления и апоптоза фагоцитирующих клеток (Haddad J., 2002; Kucharczak J. et al., 2003; Bonizzi G., Karin M., 2004]. По данным литературы, при ОС на фоне активации ПОЛ, низкого уровня GSH н высокого содержания GSSG в клетке отмечается фосфорилирование и деградация IkB и активация NF-kB, что, повышает скорость транскрипции генов провоспалительных цитокинов [Дубинина Е.Е., 2006; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006].

Изменения продукции TNF-a в условиях ОС наводят на мысль о вовлечении редокс-сигнальных систем в регуляцию синтеза этого цитокина (табл. 4). Нами отмечено наличие отрицательной корреляционной связи между секрецией TNF-a и содержанием белково-связанного глутатиона в нейтрофилах у пациентов с ВП при культивировании клеток в присутствии блокатора SH-групп (г=-0,82, р<0,05), между продукцией TNF-a и содержанием GSH в условиях модели ОС (г=-0,58, р<0,05). Наряду с этим в супернатантах культур нейтрофилов, инкубированных с протектором SH-групп DTE, зарегистрировано снижение концентрации TNF-a при ОС in vitro и у пациентов с ВП. Известно, что молекулы, обладающие антиоксидантными свойствами, в том числе DTE, препятствуют активации NF-kB путем снижения эффективности процесса фосфорилирования IkB, возможно, за счет ингибирования соответствующих киназ [Дубинина Е. Е., 2006], что объясняет пониженную продукцию TNF-a.

С другой стороны, дефицит GSH в случае применения нами блокатора NEM также приводил к снижению продукции IL-8 и TNF-a (табл.4). Активация факторов транскрипции и их связывание с регуляторными сайтами ДНК контролируется редокс-статусом, особенно балансом ТДС, показателем которого служит соотношение восстановленных и окисленных SH-групп [Меньшикова Е. Б. и соавт., 2006]. Для связывания NF-kB с ДНК необходимо отсутствие в ядре прооксидантной ситуации. В экспериментах in vitro было показано, что окисление остатка цистеина в ДНК-связывающем домене NF-kB до сульфеновой

кислоты сопровождается образованием Б-SSG. Итогом связывания глутатиона с белком становится ингибирование ДНК-связывающей активности [Октябрьский О Л, Смирнова ГБ, 2007], что могло происходить и в случае применения NEM.

Таблица 5

Влияние протектора SH-групп дитиоэритритола (DTE), блокатора SH-групп N-этилмалеимида (NEM), ингибитора синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимина (BSO) и ингибитора каталазы аминотриазола (AT) на показатели тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков нейтрофшов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

(Me(QrQ3).p)

Группы обследованных GSH, нмоль/мг белка GSSG, нмоль/мг белка Белок-SSG, нмоль/мг белка КПБ, пг/мг белка

Интактные нейтрофилы (контроль) 4,84 (4,64-5,39) 0,27 (0,25-0,31) 0,05 (0,03-0,08) 2,85 (2,01-3,29)

л Нейтрофилы, инкубированные сН202 1,97 (1,45-2,40) * 0,55 (0,51-0,59) * 0,32 (0,11-0,62) * 7,13 (6,82-8,30) *

о. о а о ч о Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и NEM 1,04 (1,02-1,12)** 0,57 (0,52-0,64) * 0,37 (0,35-0,38) * 8,03 (7,60-8,78) *

а m о п. о ч Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и DTE 3,18 (3,06-3,40) * * 0,41 (0,38-0,43) *' 0,16 (0,12-0,17) * * 2,87 (2,49-3,18) *

Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и BSO 1,15 (1,01-1,16)** 0,37 (0,35-0,47) * * 0,38 (0,37-0,39) * 9,18 (8,12-10,18)**

Нейтрофилы, инкубированные с Н202 и AT 1,23 (1,08-1,63) * * 0,59 (0,56-0,72) * 0,30 (0,28-0,35) * 8,30 (5,08-11,30)*

S 0) X я Интактные нейтрофилы 1,62 (1,23-1,92)* 0,47 (0,37-0,66) * 0,58 (0,47-0,70) * * 6,68 (5,73-7,94)*

о 5 С и о Нейтрофилы, инкубированные cNEM 1,11 (0,92-1,47) * л 0,55 (0,52-0,72) * Л 0,77 (0,59-0,87) * л 8,28 (6,72-9,14) * Л

Ж о. н о Нейтрофилы, инкубированные с DTE 1,80 (1,44-1,96)* 0,49 (0,40-0,62) * 0,55 (0,25-0,66) * 4,49 (3,77-5,09) * л

о 2 = Нейтрофилы, инкубированные с BSO 0,85 (0,81-0,96) * л 0,66 (0,57-0,76) *л 0,65 (0,61-0,70) * 8,49 (7,78-9,02) * л

1 Е Нейтрофилы, инкубированные с AT 1,33 (1,09-1,71) * л 0,58 (0,51-0,69) * 0,63 (0,61-0,81)* 8,22 (7,67-8,73) * л

Примечание: * - значимость различий по сравнению с контролем, р<0,05; * - по сравнению с нейтрофилами у здоровых доноров, при инкубации клеток с Н202, р<0,05; л - по сравнению с интактными нейтрофилами у больных внебольничной пневмонией, р<0,05; КПБ - карбонильные производные белков.

Антиоксидантная защита нейтрофилов, основным компонентом которой выступает ТДС, ограничивает окислительный потенциал АФК. Эффекты ферментов и неферментативных антиоксидантов ТДС тесно связаны и сбалансированы между собой, что способствует поддержанию и четкой регуляции редокс-состояния меток [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Kiley P.J., 2004]. Снижение концентрации GSH в нейтрофилах при ОС in vitro и остром воспалении (табл. 5) во многом обусловлено расходом тиола для обратимого связывания с SH-группами белков, которые в прооксидантной ситуации подвергаются окислению АФК в первую очередь. В нашем исследовании величина соотношения GSH/GSSG в нейтрофилах была снижена как у больных ВП, так и при ОС in vitro. Это указывает на снижение восстановительного потенциала редокс-сисгемы глутатиона и, соответственно, ее протекторной роли в отношении обратимой модификации белковых молекул.

Снижение концентрации GSH, несущего около 90 % свободных SH-rpynn клетки, приводит к повышению доступности мембран для токсического действия продуктов ПОЛ [Day R.M., 2005; Reed М.С., 2008]. Нами отмечен рост содержания метабсиштов ПОЛ в мембране эритроцитов и плазме крови при ВП (г=-0,59, р<0,05 - коэффициент корреляции между содержанием GSH в нейтрофилах и концентрацией ТБК-РП в плазме крови у больных ВП). Снижение содержания GSH в нейтрофилах у больных ВП объясняется не только расходом его ЗН-групп для защиты от 'ОН и других АФК, но и интенсивным использованием для ГПО [Fuchs Т.А., 2007, Меньшикова Е.Б. и соавт., 2008]. Однако сами АФК, в частности "ОН, могут ингибировать ГПО [Pigeolet Е., Remacle J., 1991]. Активность ГПО в нейтрофилах при ВП, была снижена в 1,6 раза, при экспериментальном ОС - в 2,2 раза по сравнению с таковой в клетках у здоровых доноров [160,6 (132,60-174,20) нмоль/(мин мг белка)] (р<0,05).

При инкубации нейтрофилов с NEM или В SO отмечен дефицит GSH, являющегося субстратом ГПО, что вызывало снижение активности данного фермента в практически в 2,0 раза в обоих случаях при ОС in vitro (р<0,05) и в 1,7 и 2,5 раза, соответственно, в условиях ВП (р<0,05). Кроме того, выключение эффектов каталазы ингибитором AT приводило к компенсаторному росту активности ГПО в клетках с индуцированным ОС в 1,7 раза (р<0,05). Однако при ВП под действием AT активность ГПО снижалась в 1,7 раза (р<0,05), как и содержание GSH - в 1,2 раза (р<0,05) на фоне стабильности иных показателей нейтрофилов. Действие DTE на нейтрофилы не изменяло активность ГПО в условиях модели ОС и повышало в 1,2 раза у пациентов с ВП (р<0,05). Вероятно, при ВП восстановительный потенциал DTE расходовался клетками для поддержания редокс-состояния ТДС, а неиспользованные молекулы GSH могли направляться на обратимое экранирование функционально активных SH-групп белков (образование Б-SSG) и поддержание активности ГПО: при OB оба показателя были выше таковых при ОС in vitro в 1,6 и 1,4 раза, соответственно (р<0,05).

Снижение восстановительного потенциала ТДС при ОС может усугублять процессы окислительной деградации липидных и белковых молекул клеток. Оценка параметров ОМБ белков в нейтрофилах крови у пациентов с ВП и при моделировании ОС на клетках у здоровых доноров, показала увеличение содержания карбонильных производных белков (табл. 5). Большое количество карбонильных соединений, связанных с деградацией белков, образуется в результате металл-катализируемого окисления и при воздействии гипохлорита, что характерно для острых воспалительных заболеваний [Дубинина Е.Е., 2006]. Подтверждением данного положения служит наличие корреляционной связи между активностью МПО и содержанием КПБ в нейтрофилах (г=0,74, р<0,05 -при экспериментальном ОС, г=0,76, р<0,05 - при внебольничной пневмонии).

Усиление окисления белков на фоне низкого содержания восстановленных эквивалентов в нейтрофилах, культивированных с BSO или AT при ВП и ОС in vitro, а также при инкубации с NEM нейтрофилов, полученных у пациентов с ВП, вероятно, связано с дисбалансом системы про-/антиоксиданты в эффекторных клетках ОВ. Это подтверждается наличием отрицательной корреляционной связи между содержанием GSH и КПБ в нейтрофилах у больных ВП (г=-0,72, р<0,05), а также между величиной соотношения GSH/GSSG и уровнем КПБ (г=-0,88, р<0,05) в условиях модели ОС in vitro. Ингибирование синтеза GSH в нейтрофилах нарушает образование дисульфидов Б-SSG, которые сохраняют SH-группы белков от необратимого окисления. В наших исследованиях содержание КПБ было максимально повышено в нейтрофилах, инкубированных с BSO, когда в условиях отсутствия синтеза GSH de novo не отмечалось дополнительного образования Б-SSG.

Таким образом, у пациентов с ВП и при моделировании ОС in vitro существенная роль в антиоксидантной защите принадлежит ТДС, редокс-потенциал которой основан на GSH и является базовым фактором защиты SH-групп белков от необратимого окислительного повреждения. Окислительные модификации, как модулирующие активность протеинов, в частности глутатионилирование, так и необратимое карбонилирование белков, могут участвовать в механизмах изменений и нарушений функциональных свойств нейтрофилов крови (активность МПО, продукция 'ОН, TNF-a и IL-8). Низкое содержание GSH и снижение скорости его регенерации из GSSG в нейтрофилах повышают степень риска необратимого окислительного повреждения белков, следствием чего является нарушение их функциональной активности [Berlett B.S, Stadtman E.R., 1997; Ramirez D.C. et al., 2005]. В частности, ингибирование каталазы или синтеза глутатиона в нейтрофилах крови сопровождается снижением активности МПО и способности продуцировать 'ОН, которые так необходимы для обеспечения микробицидной функции. Кроме того, ОМБ меняет антигенные свойства белков, а активация ПОЛ способствует синтезу хемоаттрактантов, увеличивающих миграцию фагоцитов в очаг ОВ.

Воспаление представляет собой сложный многокомпонентный процесс и можно полагать, что в активацию продукции TNF-a и IL-8 нейтрофилами при внебольничной пневмонии и экспериментальном ОС могут быть вовлечены и многие факторы (цАМФ, цГМФ, ионы Са, активные метаболиты арахидоновой кислоты и др.), выступающие универсальными регуляторами клеточного метаболизма [Rossi A.G. et al, 1998; Дубинина ЕЕ, 2008]. В частности, истощение внутриклеточного пула свободных и протеинсвязанных тиолов приводит к нарушению гомеостаза кальция и увеличению его концентрации в цитозоле, в результате чего активируются Са2+-зависимые гидролитические ферменты (прогеазы, фосфолипазы, эндонуклеазы), и, как следствие, необратимо повреждаются клеточные структуры [Yermolaieva О, 2000].

В данной ситуации при защите нейтрофилов от ОС, развивающегося в эксперименте и при ОВ, молекулы GSH, вероятно, перераспределяются в клетке с целью оказания протекторного влияния на функционально значимые белки, в том числе путем обратимого глутатионилирования свободных тиоловых групп. Вероятно, подобная оптимизация ТДС в пользу одних протекторных механизмов осуществляется за счет ограничения других и направлена на сохранение эффективности функционирования нейтрофилов в условиях окислительного дисбаланса (рис. 3). Процессы адаптации нейтрофилов к экстремальным условиям ОВ, скорее всего, связаны с повышением Н202-деградирующей активности и оптимальным распределением таковой среди антиперекисных ферментов, что осуществляется посредством активации фактора транскрипции NF-кВ и роста экспрессии генов ферментов антиоксидантной защиты, ограничивающих реакции ОМБ и ПОЛ.

Избыток АФК способствует повреждению ДНК и нарушению считывания информации, а модифицированная м-РНК опосредует синтез белков с измененными физико-химическими свойствами, в итоге меняется метаболизм и структурно-функциональный статус клетки. Выраженные нарушения каталитических способностей и процессов репарации белков могут приводить к активации апоптоза клетки, а дальнейший рост деструкции протеинов — к некротическому лизису [Зенков HJC. и соавт, 2001; Circu CJL, Stringer S. et al, 2009]. При этом окислительное повреждение и фрагментация ДНК сами являются танатогенными стимулами, а сегментированность ядра нейтрофильных лейкоцитов указывает на их предрасположенность к активации апоптоза.

В целом, в очаге ОВ нейтрофилы оказываются «заложниками» своей способности к гиперпродукции АФК, которые вызывают формирование выраженного ОС. Избыток АФК в нейтрофилах потенцирует необратимое повреждение макромолекул, рост проницаемости мембран, выход в цитозоль Са и проапоптотичгских факторов, приводящих к быстрой элиминации клеток, ставших функционально неполноценными. При этом нет однозначного ответа на вопрос - ОС является следствием или индуктором морфо-функциональных изменений,

сопровождающих развитие апоптоза [Болдырев АА, 1999; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Очевидно, что различные АФК прямо или опосредованно участвуют в механизмах развития апоптоза. В частности накопление Н202 активирует запуск апоптоза клеток in vitro - нейтрофилов, лимфоцитов, эндотелиоцитов и др. [Simon H.U. et al., 2000; Cumming R.C. et al., 2004].

Рис. 3. Сценарии развития окислительного стресса в нейтрофилах и функциональная активность клеток при остром воспалении (по данным А. IV. агоШ, 1998, Е.Е. Дубининой, 2006, А. Catala, 2009, и собственным

результатам)

4. Особенности апоптоза и продукции активных форм кислорода нейтрофилами крови, влияние оксида азота на программированную гибель нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Известно, что концентрации пероксида водорода от 1 мМ и выше могут активировать запуск апоптоза в культуре клеток (в зависимости от типа клеток) [Cumming R. С. et al, 2004], но в научной литературе фактически отсутствуют данные, показывающие изменения в метаболизме нейтрофилов в зависимости от концентрации Н202 in vitro. Наряду с этим для индикации фенотипических проявлений апоптоза и некроза клеток используются разнообразные способы, что в нашем случае определило необходимость экспериментального подбора оптимальной концентрации Н202, способной эффективно индуцировать как ОС, так и программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов.

Для моделирования ОС in vitro нейтрофилы, полученные из крови здоровых доноров, инкубировали с Н202 в конечной концентрации 1, 5, 10 и 50 мМ. С помощью данных экспериментов мы выявляли конечную концентрацию Н202, которая одновременно с нарастанием внутриклеточного содержания АФК вызывала в культуре клеток индукцию апоптоза наибольшего числа нейтрофилов без увеличения количества некротически измененных (рис. 4). Нашим требованиям в полной мере удовлетворяли лишь те результаты, что были получены при использовании 5 мМ концентрации Н202.

————[__.————|-1-1

ОмМ 1мМ 5мМ ЮмМ 50мМ

(контроль)

□ Апоптоз,% □ Некроз,% В АФК, у. е.. * — р<0,05 значимость различий по сравнению с аналогичным показателем в контроле (ингактные культуры нейтрофилов крови здоровых доноров)

Рис. 4. Внутриклеточное содержание активных форм кислорода (АФК), число клеток в состоянии апоптоза и некроза в культурах нейтрофилов крови у здоровых доноров при добавлении в среду инкубации разных концентраций НгОг

Выбранную модель ОС (5 мМ Н202) мы сравнивали по ключевым показателям (продукция АФК и реализация апоптоза) с окислительным стрессом, возникающим при ОВЗ (рис.5). В эксперименте и при оценке клинического материала обнаружено статистически равнозначное увеличение содержания АФК в нейтрофилах [0,678(0,596-0,705) усл.ед. - при ОС in vitro, 0,653(0,574-0,728) усл.ед. - при ВП, 0,673(0,561-0,690) усл.ед - при OA] а также количества апоптотических клеток [61,10(57,80-67,50), 62,37(54,25-69,20) и 57,40(51,37-62,37)%, соответственно] относительно таковых в контроле (р<0,05). Это указывает на близкие механизмы активации апоптоза клеток, полученных у здоровых доноров и инкубируемых с 5 мМ Н202, и нейтрофилов, взятых у пациентов с ОВЗ. Влияние АФК на развитие апоптоза подтверждалось наличием тесной корреляционной связи между увеличением внутриклеточного уровня АФК и количества апоптотических клеток в культурах нейтрофилов с ОС in vitro (r=0,89, р<0,05), а также в культурах клеток, полученных у больных ОВЗ (г=0,71, р<0,05). В целом, приведенные факты показывают адекватность подобранной концентрации Н202 и используемой нами модели ОС для имитации редокс-состояния нейтрофилов в условиях ОВ, когда происходит индукция программы апоптоза без активации некротических изменений клетки.

Вместе с тем, в среде инкубации нейтрофилов нами отмечен прирост содержания метаболитов NO в сравнении с контролем [0,108(0,106-0,110) мкМ]

■ • « / *-> ч-

5 ыМ Н^О; ОВЗ 5 ыМ Н;0; ОВЗ

1 — нейтрофилы здоровых доноров (контроль)

2 - неПтрофилы здоровых доноров. (5 мМ H2OJ

3 - нейтрофилы здоровых доноров, (5 ыМ Н202 и L-аргинин)

4 - нейтрофилы здоровых доноров, (5 мМ HjOjtiL-NAME)

5 -нейтрофилы больных острыми воспалительными заболеваниями (ОВЗ)

6 - нейтрофилы больных ОВЗ. (L-аргинин)

7 — нейтрофилы больных ОВЗ. (L-NAME)

Рис 5. Апоптоз (А) и внутриклеточное содержание активных форм кислорода (Б) в нейтрофилах при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro в условиях индукции и ингибирования синтеза NO

(р<0,05) в условиях ОС in vitro - до 0,121 (0,120-0,132) мкМ и, в относительно большей степени (р<0,05), при ОВЗ - до 0,157 (0,153-0,161) мкМ (рис. 6). Полученные данные указывают на увеличение продукции оксида азота нейтрофилами при ОС и дополнительную стимуляцию синтеза NO при ОВ. По данным литературы, во время развития ОВ под действием провоспалительных цитокинов резко повышается экспрессия индуцибельной NO-синтазы и реализация эффектов оксида азота в клетках [Меньшикова ЕБ. и соавт., 2000; Choi В.-М. et al, 2002; Сомова JLM, Плехова Н.Г., 2006], результатом чего мог стать рост уровня конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов. Это может быть закономерным следствием универсальной роли молекул NO в развитии ОВ: регуляция тонуса сосудов, фагоцитарной активное™ и биоэнергетики клеток, экспрессии ферментов и факторов транскрипции, ответственных за апоптоз и пролиферацию [МаедаХ., АкаикеТ., 1998; GongL. et al, 2004; TutqaN. et al., 2004].

Выяснение роли NO в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при ОС in vitro (5 мМ Н202) и ОВ проводили с помощью добавления в среду инкубации клеток индуктора или ингибитора NO-синтаз. В присутствии L-аргинина отмечался прирост концентрации конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов как в условиях модели ОС, так и при ОВЗ. Добавление ингибитора L-NAME приводило к снижению этого показателя до значений контроля в случае модели ОС, а при ОВЗ данный эффект отсутствовал -продукция метаболитов NO нейтрофилами оставалась на уровне, характерном для клеток пациентов с острым воспалением и превышающем таковой при ОС in vitro. Данный факт свидетельствует не только об активации NO-синтазы в условиях воспалительного процесса, но и о запуске неферментативных механизмов наработки NO, не чувствительных к воздействию L-NAME [Реутов В.П. и соавт., 1998; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2000; Beltran В. et al. 2000 и 2002].

L-аргинин не влиял на содержание АФК в цитозоле нейтрофилов ни при ОС in vitro, шГу пациентов с ОВЗ, и, вместе с тем, эффективно снижал (до значений контроля) процент апоптотических клеток в культурах с моделированием ОС, не оказывая значимого влияния на апоптоз нейтрофилов крови у пациентов с ОВЗ. Предположение о возможном стабилизирующем влиянии NO на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждается наличием обратной корреляционной зависимости между концентрацией метаболитов NO в среде инкубации и числом апоптотических клеток как в случае ОС, индуцированного 5 мМ Н202 (г =-0,83, р<0,05), так и при ОВЗ (г =-0,59, р<0,05).

Рост концентрации АФК в цитозоле нейтрофилов был зарегистрирован при действии L-NAME в условиях модели ОС, отсутствуя при ОВЗ, тогда как число апоптотических нейтрофилов, наоборот, увеличивалось при ОВ и не изменялось при ОС in vitro. Действие L-NAME отменяло эффекты NO в плане ограничения реализации апоптоза, а рост содержания АФК на фоне ОС in vitro указывал на отсутствие сдерживающего влияния NO на генерацию АФК в клетке.

5 ыМ Hj02

нМ'10екл в

нМЛОкл 160

- — Г~1Г

■ "Я

3 4. .5 б 7.

5КМНЛ

овз

5и\1НА

ОВЗ

1 — неПтрофилы здоровых доноров (контроль)

2 — нпорофилы здоровых доноров, (5 мМ HjOj)

3 — нейтрофилы здоровых доноров, (5 ыМ Н;02 к L-аргинин)

4 - нейгрофилы здоровых доноров, (5 ыМ Н202 и L -NAME)

5 — нейпкмЬипы больных острыми воспалительными заболевания ми (ОВЗ)

6 - нсйгоофилы больных ОВЗ. (L-аргинин)

7-нешрофилы больных ОВЗ.(L-NAME)

Рис 6. Содержание метаболитов NO в среде инкубации (А), ионов кальция

(Б) и циклических нуклеотидов (иАМФ (В) и цГМФ (Г)) в нейтрофилах крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro в условиях индукции и ингибирования синтеза NO

Таким образом, в наших исследованиях установлено, что индукция синтеза N0 сопровождается угнетением апоптоза нейтрофилов крови в условиях ОС in vitro, а ингибирование NO-синтаз способствует программированной гибели этих клеток при ОС, как формирующемся при ОВЗ, так и создаваемом с помощью 5мМ Н202. Следовательно, на основании полученных результатов можно предполагать наличие в арсенале оксида азота способности ограничивать механизмы реализации апоптоза нейтрофилов в условиях ОС, но

трудно сделать вывод о том, является ли N0 протекторным агентом непосредственно или стимулирует механизмы защиты клетки от повреждения (рис. 7). Обнаружение молекулярных механизмов реализации программированной гибели в ответ на повышение или снижение концентрации N0 в клетке при ОС позволит не только выявить молекулярные мишени влияния NO на апоптоз нейтрофилов периферической крови, но и предположить схожие механизмы участия оксида азота в развитии гибели нейтрофилов в очаге воспаления.

5. Молекулярные механизмы управления апоптозом нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro

Оксид азота известен как важный компонент окислительного стресса и, одновременно;: он выступает важнейшим медиатором, способным напрямую влиять на внутриклеточные метаболические процессы без участия каких-либо мессенджеров [Ванин А.Ф, 2000, Зенков Н.К. и соавт., 2001; Tuteja N. et al., 2004], а также посредством подключения таковых [De Nadai С. et al., 2000; Choi B.-M. et al., 2002]. Для идентификации молекулярных мишеней регуляторного воздействия NO на апоптоз нейтрофилов в первую очередь необходимо было оценить причинно-следственные связи каскадных реакций передачи внутриклеточных сигналов, поэтому наши исследования были направлены на оценку изменения концентрации внутриклеточных мессенджеров (цГМФ, цАМФ и Са2+) в нейтрофильных гранулоцитах при развитии ОС.

Концентрация цАМФ и цГМФ в нейтрофилах при инкубации с 5 мМ Н202 изменялась разнонаправленно: содержание цАМФ возрастало в 1,2 раза, а цГМФ снижалось в 3,0 раза относительно соответствующих показателей в клетках у здоровых доноров [114,13(101,96-120,55) и 12,25(10,48-17,04) нМ/106 кл] (р<0,05), что приводило к увеличению соотношения цАМФ/цГМФ в 3,4 раза по сравнению с таковым в контроле (р<0,05).

При ОВ концентрация цАМФ в нейтрофилах была ниже величины аналогичного параметра в интактной культуре клеток у здоровых доноров - в 1,3 раза (р<0,05), в клетках с моделированием ОС in vitro - в 1,5 раза (р<0,05). Содержание цГМФ также было ниже соответствующего параметра в контроле (р<0,05), но достигало уровня, близкого к таковому при ОС in vitro (рис. 6). Выраженное снижение концентрации цГМФ в нейтрофилах, полученных у лиц с ОВЗ, обеспечило рост соотношения цАМФ/цГМФ в клетке в 2,0 раза. Рост соотношения цАМФ/цГМФ на фоне активации программированной гибели нейтрофилов в условиях ОВ, скорее всего, носит защитно-приспособительный характер. Данные о влиянии цАМФ на апоптоз нейтрофилов малочисленны и указывают, что регуляция программы клеточной гибели системой циклических нуклеотидов носит тканеспецифический характер [Chang H.S. et al., 2000; Kato Т. et al., 2006]. Биологическая роль повышения концентрации цАМФ в нейтрофилах при ОВЗ может быть связана со способностью данного

Пероксид водорода

i i Апоптоз нейтрофилов

Рис. 7. Влияние оксида азота на реализацию программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса (по данным В.П. Реутова и соавт., 1998, НА. Маянского, 2004, К Basso et aL, 2005, и результатам собственных

исследований)

циклического нуклеотида участвовать в подавлении фагоцитоза нейтрофилов макрофагами в очаге воспаления [Rossi A.G. et al., 1998].

Воздействие индуктора NO-синтаз L-аргинина на нейтрофилы, полученные у больных ОВЗ, не изменяло концентрацию цАМФ относительно собственного базального уровня (р>0,05), но сопровождалось ростом содержания цГМФ в клетках в 2,3 раза (р<0,05), приводящим к снижению отношения цАМФ/цГМФ. Повышение содержания цГМФ, на наш взгляд, может быть напрямую связано со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы оксидом азота [Hanafy К.А., 2001; Bian К., 2006]. Использование индукции N0 с помощью 500 мкМ L-аргинина в условиях ОС in vitro способствовало снижению внутриклеточного

содержания цАМФ (р<0,05) и увеличению концентрации цГМФ в нейтрофилах до значений контроля (р>0,05). Рост содержания цГМФ в 3,0 раза относительно базового уровня в нейтрофильных гранулоцитах обеспечил снижение соотношения цАМФ/цГМФ до контрольных величин.

Приведенная выше краткая интерпретация результатов собственных исследований и анализ данных других авторов [DeNadai С. et al, 2000; Choi В.-М. et al, 2002; Maianski NA et al, 2004], позволили предположить, что оксид азота посредством увеличения концентрации цГМФ снижает соотношение циклических нуклеотидов в клетке до значений, близких к контрольным, стабилизируя, тем самым, метаболизм нейтрофилов и продлевая жизнь клетки. Способность L-аргинина подавлять развитие апоптоза в случае экспериментального ОС связана, по всей вероятности, с цитопротекторными эффектами NO, который посредством цГМФ активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу G, что приводит к снижению цитоплазматической концентрации ионов кальция, играющих ключевую роль в реализации апоптоза.

Добавление в среду инкубации нейтрофилов ингибитора L-NAME приводило в условиях ОС in vitro к достоверному (р<0,05) снижению внутриклеточной концентрации цАМФ в 1,5 раза, цГМФ — в 3,0 раза (рис. 6). Воздействие ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты при ОВЗ сопровождалось снижением содержания цАМФ в 1,4 раза, цГМФ — в 1,6 раза относительно базового уровня (р<0,05). В обоих случаях этому сопутствовало увеличение соотношения концентраций данных нуклеотидов.

Рост соотношения цАМФ/цГМФ в нейтрофилах, культивированных с 5 мМ Н202 и L-NAME, может быть связан с токсическим влиянием пероксида водорода на аденилатциклазу и гуанилатциклазу, которое усиливается при отсутствии стабилизирующего влияния NO на дыхательную цепь митохондрий [Beltran В. et al. 2000,2002]. Напомним, что введение в культуральную среду L-NAME приводило к росту концентрации внутриклеточных АФК и усугубляло развитие ОС. Изменение соотношения цАМФ/цГМФ при культивировании нейтрофилов, полученных у больных ОВЗ, с селективным ингибитором NO-синтазы происходило на фоне увеличения количества апоптотических клеток. Скорее всего, рост соотношения цАМФ/цГМФ в клетке при развитии апоптоза носит транзиторный характер, связанный с нормализацией метаболизма клеток и предотвращением гибели нейтрофилов. В свою очередь, одним из эффектов цАМФ является рост концентрации ионов кальция в цитоплазме, что указывает на функциональную взаимосвязь вторичных мессенджеров — цАМФ и Са2+.

В наших исследованиях рост концентрации Са2+ в цитоплазме клеток в 2,0 раза, по сравнению с соответствующим параметром в контроле [0,220(0,114— 0,234) усл.ед.] (р<0,05), отмечен только при моделировании ОС 5 мМ Н202, а при ОВ данный показатель значимо не изменялся (рис. 5). При этом в

нейтрофилах, полученных у пациентов с ОВ, концентрация внутриклеточного кальция была в 1,9 раза ниже таковой при индукции ОС (р<0,05).

Существуют данные, указывающие на взаимосвязь изменений концентрации свободного кальция в клетке с системами образования и утилизации АФК [Yermolaieva О. et al., 2000, 2003]. Повышение уровня внутриклеточного кальция в нейтрофилах при воздействии 5 мМ Н202 может быть следствием стимулирующего влияния АФК на высвобождение ионов Са2+ из внутриклеточных депо. Вместе с тем ионы Са инициируют перестройку липидного матрикса мембраны митохондрии, приводящую к дезорганизации компонентов дыхательной цепи и повышению продукции АФК в клетке. Следует отметить, что генерация Н202 усиливается при повышении концентрации цитозольного кальция, а также по мере увеличения концентрации свободных ионов кальция вне клетки.

Культивирование нейтрофилов с индуктором NO-синтаз L-аргинином полностью до значений контроля (р>0,05) нивелировало в клетках повышение концентрации Са2+, формирующееся в условиях ОС in vitro. Учитывая ЭПР, митохондрии - основное депо Са2+ среди клеточных компартментов, поэтому по изменению содержания этого иона в цитоплазме можно косвенно судить о митохондриальной дисфункции. Возможно, снижение концентрации Са2+ в нейтрофилах под действием NO при ОС in vitro происходило за счет стабилизирующего влияния NO на проницаемость мембраны митохондрий [Реутов В.П. и соавт., 1998; Brune В., 1999; Beltran В. et al., 2000, 2002]. Вместе с тем в нейтрофилах, полученных у больных ОВЗ, внутриклеточный уровень Са2+, изначально не отличавшийся от контрольного, под влиянием L-аргинина увеличивался в 1,6 раза (р<0,05), оставаясь все же ниже такового при культивировании с селективным ингибитором NO-синтазы (р<0,05) и на фоне ОС in vitro (р<0,05). Кроме того, в наших исследованиях воздействие ингибитора NO-синтазы L-NAME на нейтрофилы, взятые у пациентов с ОВЗ, вызывало вместе с повышением уровня внутриклеточного кальция рост числа аннексин-положительных клеток. В нашем случае предположение о подавлении развития апоптотической программы нейтрофилов оксидом азота за счет снижения выхода Са2+ из митохондрий подтверждено обратной корреляционной связью между концентрацией метаболитов NO и уровнем внутриклеточного кальция при ОС in vitro (r=-0,79, р<0,05) и на фоне ОВЗ (г =-0,57, р<0,05).

Активные формы кислорода и кальций могут действовать совместно, индуцируя повышение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны (образование гигантских пор пермеабилизационного перехода). Имеются сведения о способности оксида азота предотвращать открытие гигантских пор митохондрии, блокируя тем самым выход ионов Са, цитохрома с в цитоплазму и предотвращая запуск каспазного каскада [Brookes P.S. et al., 2000]. Одним из важных регуляторов проницаемости наружной мембраны

митохондрий и развития программированной гибели клеток является семейство белков Bcl-2. Проницаемость пор зависит от соотношения про- (Вах) и антиапоптотического (Вс1-2) белков этого семейства [Ravagnan L. et al., 1999; Smaili S.S. et al., 2000; Sun J. et. al., 2010]. Логично предположить, что мишенью NO при реализации регуляторных эффектов могут быть белковые молекулы, как потенцирующие открытие пор, так и участвующие в поддержании целостности мембраны митохондрий с целью обеспечения жизнеспособности нешрофйлов в условиях ОВ. Далее гипотезу оценивали на модели ОС in vitro, поскольку в этом случае был более выражен антиапоптотический эффект NO в отношении нейтрофилов, показанный выше при индукции NO-синтаз .

При оценке содержания проапоптотического белка Вах в нейтрофилах нами было обнаружено его увеличение как при ОС in vitro, так и у больных ОВЗ по сравнению с таковым в контроле (р<0,05). Воздействие L-аргинина и IGNAME на нейтрофилы, культивированные в присутствии 5 мМ Н2Ог, в обоих случаях не изменяло содержания белка Вах по сравнению с аналогичным показателем, регистрируемым в отсутствие индуктора и ингибитора. Исследование содержания антиапоптотического протеина Вс1-2 в нейтрофилах не выявило данного белка ни при моделировании ОС in vitro, ни при остром воспалении. Это согласуется с данными литературы [Edward S.W. et al., 2003] и указывает на необратимость запуска танатогенной программы нейтрофилов. Соответственно, наличие L-аргинина или L-NAME не могло повлиять на данный показатель в условиях экспериментального окислительного стресса.

Полученные нами результаты свидетельствуют не только об отсутствии влияния NO на регуляторные транскрипционные механизмы синтеза белков Вах и Вс1-2 при используемых нами условиях ОС, но и об отсутствии у NO способности изменять функциональные свойства Вах путем нитрозилирования, показанного для ряда других белков митохондриальных мембран [Alonso D. et al., 2002; Daniel P.T. et al., 2003]. Резюмируя, можно заключить, что молекулы NO ограничивают реализацию апоптоза нейтрофилов при остром воспалении и индукции ОС in vitro 5мМН202, изменяя внутриклеточную концентрацию вторичных мессенджеров (цГМФ, цАМФ и Са2+), вне зависимости от наличия и концентрации про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков.

В целом, полученные в ходе исследования результаты представляют собой теоретическую основу для последующей разработки методов профилактики, диагностики и коррекции острых воспалительных процессов, связанных с развитием окислительного стресса. Разработка методологии редоке-регуляции на уровне системы тиоддисульфидных антиоксидантов может стать основой для создания селективных технологий управления нейтрофилами при остром воспалении, нацеленных на оптимизацию функционирования эффекторных клеток и ограничение аутотоксических эффектов, приводящих к чрезмерно быстрой апоптотической элиминации. Изучение взаимосвязи внутриклеточных

сигнальных путей, участвующих в реализации программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса, показало важную роль оксида азота в системе вторичных мессенджеров, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность и функционирование клетки. Дальнейшая идентификация молекулярных мишеней действия оксида азота позволит уточнить механизмы регуляции клеточных функций, что в конечном итоге будет способствовать разработке подходов управления апоптозом клетки при широком спектре патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса;

Выводы

1. В условиях развития окислительного стресса, возникающего при острых воспалительных заболеваниях (внебольничной пневмонии, остром аппендиците) и индукции in vitro 200 мкМ пероксидом водорода, нарушения функционального статуса нейтрофильных лейкоцитов крови характеризуются увеличением активности миелопероксидазы, продукции гидроксильного радикала и провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNF-a).

2. При окислительном стрессе, развивающемся при острых воспалительных заболеваниях, в мембране эритроцитов возрастает содержание метаболитов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой) и снижается активность Ыа+/К+-АТФазы, что сопровождается нарушением редокс-баланса в плазме крови: повышением концентрации ТБК-реагирующих продуктов и церулоплазмина на фоне угнетения активности каталазы. Проявления окислительного стресса при различиях в клинической картине острых очаговых воспалительных заболеваний (моно- и полисегментарная внебольничная пневмония с альвеолярным и интерстициальным типом инфильтрата; острый флегмонозный и гангренозный аппендицит) носят однотипный характер.

3. Нарушения функциональных свойств нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro сопряжены с изменением состояния редокс-зависимых механизмов регуляции, опосредуемых участием тиолдисульфидной системы и окислительной модификацией белков, а также влиянием внутриклеточных сигнальных систем (циклических нуклеотидов и ионов кальция) на реализацию апоптотической программы.

4. Окислительный стресс, развивающийся как при остром воспалении, так и индуцированный in vitro (200 мкМ Н202), сопровождается снижением редокс-сгатуса тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови, что проявляется низким содержанием восстановленного глутатиона, тиоловых групп белков и активности глутатионпероксидазы на фоне высокой концентрации глутатион-дисульфида и повышения глутатионилирования белков. В условиях блокады SH-групп в глутатионе и белках 5 мМ N-этилмалеимидом in vitro сохраняется

повышенное глутатионилирование белков в нейтрофилах; при ингибировании синтеза глутатиона de novo 1 мМ бутионин-сульфоксимином клеточный пул глутатиона перераспределяется в пользу белковосвязанной формы.

5. При остром воспалении и окислительном стрессе in vitro (200 мкМ Н202) в нейтрофилах крови возрастает карбонилирование белков, что сопровождается увеличением содержания карбонильных производных белков, битирозина и окисленного триптофана в плазме крови у пациентов с острым воспалением.

6. В защите белков нейтрофилов крови от окислительного повреждения участвует восстановленный глутатион: снижение его содержания в клетках при культивировании с ингибитором синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимином или ингибитором каталазы 2 мМ 3-амино-1,2,4-триазолом сопровождается увеличением содержания карбонилированных белков, а. увеличение его содержания при культивировании клеток с протектором SH-групп 1,4-дитиоэритритолом приводит к снижению карбонилирования белков.

7. Блокада SH-групп белков и глутатиона N-этилмалеимидом в нейтрофилах крови у пациентов с острым воспалением и при индукции окислительного стресса in vitro (200 мкМ Н202) сопровождается снижением активности миелопероксидазы, продукции гидроксильного радикала и цитокинов (IL-8 и TNF-a), а ингибирование синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимином угнетает активность миелопероксидазы и продукцию гидроксильного радикала, не влияя на продукцию провоспалительных цитокинов. Влияние дефицита восстановленного глутатиона на кислород-зависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (продукция активных форм кислорода) при остром воспалении однотипно таковому в условиях экспериментального окислительного стресса.

8. При остром воспалении и экспериментальном окислительном стрессе (5 мМ Н202) возрастает продукция метаболитов N0 нейтрофилами крови. Оксид азота обладает ингибирующим эффектом в отношении развития апоптоза нейтрофилов, о чем свидетельствует ограничение развития программированной гибели клеток при культивировании с L-аргинином в условиях окислительного стресса in vitro.

9. Нарушения процесса программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе в эксперименте in vitro (5 мМ Н202) не связаны с влиянием оксида азота на баланс про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков, а опосредованы внутриклеточными сигнальными молекулами — цГМФ (увеличение содержания), а также цАМФ и ионами кальция (снижение концентрации). Влияние оксида азота на реализацию апоптоза нейтрофилов при остром воспалении имеет однонаправленный характер с моделью окислительного стресса in vitro и сопряжено с увеличением содержания в клетке цГМФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Значение системы глутатиона для адаптивной компенсации функций эритроцитов при воспалении / O.JI. Носарева, Т.В. Жаворонок. В.Н. Бутусова и соавт. // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - Т.4, Приложение 1. - С. 140.

2. Нарушение физиологического баланса в системе прооксиданты-антиоксиданты при остром воспалении / Т.В. Жаворонок. O.JI. Носарева, В.Н. Бутусова, Ю.В. Стариков // Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - Т.4, Приложение 1.-С. 174.

3. Проявления окислительного стресса в красных клетках крови при острых воспалительных заболеваниях / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Е.А. Степовая и соавт. // Сб.: «Научные труды I съезда физиологов СНГ». - M.: «Медицина-Здоровье», 2005. - Т. 2. - С. 155.

4. Особенности структурной организации и транспортных систем мембран эритроцитов при остром воспалении / Т.В. Жаворонок. Ю.В. Стариков, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «Научные труды I съезда физиологов СНГ». - М.: Медицина-Здоровье, 2005. - Т. 2. - С. 155-156.

5. Erythrocyte and blood plasma antioxidant system status during the community-acquired pneumonia acute period / T.V. Zhavoronok. T.S. Ageeva, E.A. Stepovaya et al. II European Respiratory Journal. - 2006. - Vol. 28, Sup. 50. - Is.

6. Особенности детоксикации с участием ферментов микросомального окисления и глутатион-зависимых ферментов при псевдотуберкулезе у детей / Т.В. Жаворонок. O.JI. Носарева, А.П. Помогаева, В.Н. Бутусова, Ю.В. Стариков, Е.М. Климанова, Г.В. Петина, Е.А. Степовая И Бюллетень сибирской медицины. -2006.-Ks 1.-С. 18-22.

7. Система глутатиона при окислительном стрессе в дебюте внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Е.А. Степовая и соавт. // Сб.: «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований»: материалы научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2006. - С. 24.

8. Состояние нейтрофилов и окислительная модификация белков при внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Т.С. Агеева и соавт. // Сб.: «Новая технологическая . платформа биомедицинских исследований»: материалы научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2006.-С. 25.

9. Активность Na+/K+-АТФазы, 5-нуклеотидазы и особенности окислительной модификации липидов мембран эритроцитов в острый период внебольничной пневмонии I Т.В. Жаворонок. Ю.В. Стариков, Г.В. Петина и соавт. // Сб.: «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований»: материалы научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону: Изд-во ЮНЦ РАН, 2006. - С. 26.

10. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Е.А. Степовая, Е.Б. Кравец, В.В. Иванов, Т.В. Жаворонок. P.M. Чудакова, В.Н. Бутусова, Н.М. Яковлева // Бюллетень сибирской медицины. — 2006,-№2.-С. 62-69.

11. Механизмы антиперекисной защиты и система глутатиона при острой иерсиниозной инфекции / Т.В. Жаворонок. O.JI. Носарева, А.П. Помогаева, В.Н. Бутусова, Ю.В. Стариков, Е.А. Степовая // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - №2. - С. 28-31.

12. Система антиоксидантной защиты при окислительном стрессе в дебюте внебольничной пневмонии /Т.В. Жаворонок, Т.С. Агеева, Г.В. Петина и соавт.//Сб.: «XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания. II Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества»: сборник трудов.-СПб, 2006. -С. 452.

13. Функциональная активность нейтрофилов и оценка окислительной модификации белков при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата / Т.В. Жаворонок. Т.С. Агеева, Г.В. Петина и соавт. // Сб.: «XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания. II Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества»: сборник трудов. - СПб, 2006. - С. 453.

14. Активность мембранозависимых ферментов и особенности окислительной модификации мембран эритроцитов в острый период внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Т.С. Агеева, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «XVI Национальный конгресс по болезням органов дыхания. II Конгресс Евроазиатского Респираторного Общества»: сборник трудов. - СПб, 2006. - С. 454.

15. Закономерности нарушения окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях/ Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Н.В.Рязанцева, Г.В. Петина, Е.Г. Соколович, Ю.В. Стариков, М.А. Дума, В.В. Иванов, О.М. Чудакова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - № 12. - С. 10-14.

16. Дез адаптивные изменения структурно-метаболических свойств нейтрофилов при пневмонии / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Е.А. Степовая и соавт. // Вестник Томского государственного университета. Приложение № 21. -2006. -Ks 12.-С. 48-49.

17. Дополнительные возможности в диагностике внебольничной пневмонии / Ф.Ф. Тегенев, Т.С. Агеева, Т.В. Жаворонок. Н.Г. Кривоногое, A.B. Дубоделова, Г.В. Петина, Ю.В. Стариков, Н.В. Рязанцева, Е.А. Степовая // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - Т. 68, № 1. - С. 54-57.

18. The effect of NO synthesis modulators on calcium accumulation and neutrophil apoptosis during the community-acquired pneumonia / T.V. Zhavoronok. Yu.V. Starikov, T.S. Ageeva et al. // European Respiratory Journal. - 2007. - Vol. 30, Sup. 51. -No 3138.

19. Внебольничные пневмонии: клинико-сцингиграфическая характеристика и окислительный дисбаланс клеток / Т.С. Агеева, Т.В. Жаворонок. Ф.Ф. Тетенев и соавт. // Клиническая медицина. - 2007. - №7. - С. 43-48.

20. Influence of oxidative stress on redox-state and peripheral blood heterophilic leucocytes apoptotic program realization / T.V. Zhavoronok. Ye.A. Stepovaya, N.V. Ryazanceva et al. // Eur. Journal of Nat. History. - 2007. - № 6. - P. 63-64.

21. Оценка процессов окислительной модификации белков нейтрофилов и эритроцитов в условиях окислительного стресса / Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Г.В. Петина и соавт. // Фундаментальные исследования. - 2007. - № 12 (ч. 2). - С. 383-384.

22. Мембранозависимые ферменты и особенности структуры мембран эритроцитов при внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Т.С. Агеева, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «Актуальные вопросы медицинского обеспечения войск, подготовки и усовершенствования военно-медицинских кадров»: материалы научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава ТВМедИ. - Томск, 2007. - Вып. 10. - С. 70-71.

23. Окислительный метаболизм клеток в дебюте внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «XX съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова»: тезисы докладов. - Москва, 2007. -С. 226-227.

24. Механизмы реализации апоптотической программы нейтрофилов при ингибировании и активации синтеза N0 в условиях окислительного стресса in vitro / T.B. Жаворонок. Ю.В. Стариков, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине»: материалы международного междисциплинарного симпозиума. — Судак, Новосибирск, 2007. - С. 46-48.

25. Оценка окислительной модификации белков и метаболический статус нейтрофилов при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Ю.В. Стариков и соавт. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 9. - С. 85.

26. Участие системы глутатиона в редокс-регуляции нейтрофилов при внебольничной пневмонии и окислительном стрессе in vitro / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Ю.В. Стариков и соавт. // Вятский медицинский вестник, специальный выпуск. - 2007. - № 4. - С. 98-99.

27. Окислительный метаболизм и ало птоз нейтрофильных лейкоцитов при внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок, Г.В. Петина, Т.С. Агеева и соавт. // Сб.: «XVII национальный конгресс по болезням органов дыхания»: сборник трудов. - Казань, 2007. - С. 128.

28. Тиол-дисульфидная составляющая редокс-регуляции нейтрофилов при внебольничной пневмонии / Т.В. Жаворонок. Г.В. Петина, Ю.В. Стариков и соавт. // Сб.: «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации»: материалы II национального конгресса терапевтов. - Москва, 2007.- С. 75-76.

29. Дифференциально-диагностические признаки тромбоэмболии дистальных ветвей легочной артерии и внебольничной пневмонии / Т.С. Агеева, Н.Г. Кривоногое, Т.В. Жаворонок и соавт. // Сб.: «Актуальные вопросы кардиологии»: тезисы докладов 14 научно-практической конференции с международным участием. - Тюмень, 2007. - С. 5-6.

30. Вклад глутатиона в редокс-регуляцию нейтрофильных гранулоцитов при окислительном стрессе in vitro / Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «VI Сибирский физиологический съезд»: тезисы докладов. - Барнаул, ,, 2008, Т. И.-С. 65-66.

31. Community-acquired pneumonia acute period: neutrophil redox-potential and protein oxidative modification process / T.V. Zhavoronok, E.A. Stepovaya, N.V. Ryazanceva et al. // European Respiratory Journal. - 2008. - VoL 32, Sup. 52. - N 1538.

32. Участие тиолдисульфидной системы в редокс-регуляции нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении / Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «Физиология и здоровье человека»: труды II съезда физиологов СНГ. - Кишинев, 2008. - С. 40.

33. Система антиоксидантной защиты при окислительном стрессе в дебюте внебольничной пневмонии в зависимости от протяженности инфильтративного поражения легких / Т.В. Жаворонок, Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева и соавт. // Сб.: «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации»: материалы III национального конгресса терапевтов. - Москва, 2008. -С. 84-85.

34. Функциональная активность нейтрофилов и оценка окислительной модификации белков при внебольничной пневмонии в зависимости от протяженности легочного' инфильтрата / Т.В. Жаворонок. Е.А. Степовая, Г.В. Петина и соавт. // Сб.: «XVIII Национальный конгресс по болезням органов дыхания»: сборник трудов. - Екатеринбург, 2008. — С. 105-106.

35. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Степовая, Т.В. Жаворонок. Ю.В. Стариков, В.А. Бычков, Н.Ю. Часовских, Е.Г. Старикова, Г.В. Петина, В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 12. - С. 646-650.

36. Antioxidant defence at the beginning of community-acquired pneumonia with lung infiltrative affection of different duration / T. Zhavoronok. E. Stepovaya, N. Ryazanceva et al. // European Respiratory Journal. - 2009. - Vol. 34, Sup. 53. -N 2923.

37. Функциональные свойства и окислительная модификация белков нейтрофилов и плазмы крови при внебольничной пневмонии / Е.А. Степовая, Г.В. Петина, Т.В. Жаворонок. Н.В. Рязанцева, В.В. Иванов, Т.С. Агеева, Ф.Ф. Тетенев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 3. - С. 18-21.

38. Роль тиолдисульфидной системы в механизмах изменений функциональных свойств нейтрофилов при окислительном стрессе / Е.А. Степовая, Г.В. Петина, Т.В. Жаворонок. Н.В. Рязанцева, В.В. Иванов, Т.С. Агеева, Ф.Ф. Тетенев, В.В. Новицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - № 8.-С. 161-165.

39. Жаворонок Т.В. Участие системы глутатиона в поддержании функционального состояния нейтрофилов при остром воспалении / Т.В. Жаворонок // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - Т. 9, № 5. - С. 28-31.

40. Редокс-зависимое изменение продукции ИЛ-8, -10 и апоптоза моно-нуклеарных лейкоцитов / Е.В. Кайгородова, Е.Г. Старикова, O.E. Чечина, Н.Ю. Часовских, Т.В. Жаворонок. А.К. Биктасова, Е.В. Сазонова, Н.В. Рязанцева, В.В.Новицкий // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, №5. - С. 6-10.

41. Окислительный стресс в модуляции апоптоза нейтрофилов в патогенезе острых воспалительных заболеваний / Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева, Т.В. Жаворонок. Ю.В. Стариков, Т.С. Агеева, В.Я. Митасов, Е.Г. Соколович И Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т.30, №5. - С.58-63.

42. Участие тиолдисульфидной системы в регуляции окислительной модификации белков в нейтрофилах при окислительном стрессе / Е.А. Степовая, Г.В. Петина, Т.В.Жаворонок. Н.В. Рязанцева, В.В. Иванов, Ф.Ф. Тетенев, Т.С. Агеева, В.В. Новицкий // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т.30, №5 - С.64-69.

43. Роль индукции и ингибирования синтеза оксида азота в регуляции апоптоза нейтрофилов крови в условиях окислительного дисбаланса / Н.В.Рязанцева, Т.В.Жаворонок. Е.А.Степовая, Ю.В.Стариков, В.А.Бычков // Биомедицинская химия: - 2010. - Т. 56, вып 5. - С. 587-595.

44. Участие глутатиона в регуляции окислительной модификации внутриклеточных белков при окислительном стрессе / Т.В. Жаворонок. ЕА Степовая, Г.В. Петина, Е.В. Шахристова // Сб.: «Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII Международной конференции». - М.: РУДН, 2010. - С. 152-153.

45. Вклад глутатиона в поддержание функций нейтрофилов в условиях окислительного дисбаланса при остром воспалении / Т.В. Жаворонок, Е.А.

Степовая, Г.В. Петина // Сб.: «Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII международной конференции». - М.: РУДН, 2010. - С. 153-155.

46. Клинико-сцинтиграфическая характеристика и окислительные процессы в зависимости от распространенности инфильтративного поражения легочной ткани при внебольничных пневмониях / Т.С. Агеева, Т.В. Жаворонок, Ф.Ф. Тетенев, Н.Г. Кривоногое, Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева И Терапевтический архив. - 2011. -Т.83, №3. - С. 31-37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ТДС - тиолдисульфидная система ЦП - церулоплазмин AT - 3-амино-1,2,4-триазол BSO - бутионин-сульфоксимин Вах - проапоптотический белок X,

АФК - активные формы кислорода

Б-БН - сульфгидрильные группы белков

Б-БЗО - белково-связанный глутатион

ВП — внебольничная пневмония

ГПО - глутатионпероксидаза

КПБ - карбонильные производные белков

МПО - миелопероксидаза

ОА - острый аппендицит

ОМБ — окислительная модификация белков

ОС - окислительный стресс

ОВ - острое воспаление

ОВЗ - острые воспалительные заболевания

ПОЛ - перекисное окисление липидов ТБК-

РП - продукты, реагирующие с

тиобарбитуровой кислотой

ассоциированный с Вс1-2 Вс1-2 - антиапоптотический белок лейкемии В-клеток-2 DTE— 1,4-дитиоэритритол GSH - восстановленный глутатион GSSG - окисленный глутатион IL — интерлейкин NEM - N-этилмалеимид NOs - синтаза оксида азота TNFa- фактор некроза опухоли a

Отпечатано ■ ООО "Вайар" г. Томск, Московский тракт, 2г. Тел./факс: 52-98-11 Заказ N«301 от 19 апрели 2012 г. Тираж 100 экз. 43 стр.

Оглавление диссертации Жаворонок, Татьяна Васильевна :: 2012 :: Томск

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные представления о роли редокс-метаболизма в развитии окислительного стресса, дизрегуляции функций и апоптоза нейтрофилов при остром воспалении

1.1. Роль окислительного стресса в патогенезе острого воспаления

1.2. Кислород-зависимые механизмы цитотоксичности нейтрофилов как эффекторных клеток острого воспаления

1.3. Механизмы окислительной модификации макромолекул клетки свободными радикалами

1.3.1. Молекулярные мишени при окислительном повреждении клеточных мембран

1.3.2. Окислительная модификация белковых молекул клетки

1.4. Молекулярные механизмы антиоксидантной защиты клетки

1.4.1. Неферментативные антиоксиданты

1.4.2. Ферментативные антиоксиданты

1.5. Окислительная модификация белков и состояние тиолдисульфидной системы при окислительном стрессе и остром воспалении

1.6. Редокс-состояние и программированная гибель клеток в патогенезе острого воспаления

1.6.1. Современные представления о молекулярных механизмах реализации апоптоза

1.6.2. Молекулярные основы взаимодействия окислительного стресса и апоптоза: механизмы участия активных метаболитов кислорода

1.6.3. Роль программированной гибели нейтрофилов в реализации острого воспаления

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика клинического и экспериментального материала

2.1.1. Клиническая характеристика пациентов с диагнозом острый аппендицит

2.1.2. Клиническая характеристика пациентов с диагнозом внебольничная пневмония

2.1.3. Оценка развития окислительного стресса в организме при остром аппендиците и внебольничной пневмонии

2.2. Экспериментальный блок исследований in vitro

2.3. Методы исследования

2.3.1. Фракционирование венозной крови при подготовке к исследованиям

2.3.1.1. Выделение и культивирование нейтрофилов крови

2.3.1.2. Выделение эритроцитов и получение мембран эритроцитов

2.3.1.3. Определение концентрации белка в нейтрофилах, взвеси мембран эритроцитов и плазме крови

2.3.2. Методы оценки функционального состояния нейтрофилов, альвеолярно-капиллярной мембраны легких, процессов перекисного окисления липидов мембраны эритроцитов и плазмы крови

2.3.2.1. Оценка концентрации активных форм кислорода в нейтрофилах!

106 ИЗ

2.3.2.2. Оценка продукции конечных метаболитов оксида азота нейтрофилами

2.3.2.3. Оценка продукции гидроксильного радикала нейтрофилами

2.3.2.4. Определение активности миелопероксидазы в нейтрофилах

2.3.2.5. Оценка продукции провоспалительных цитокинов нейтрофилами

2.3.2.6. Оценка альвеолярно-капиллярной проницаемости и вентиляционно-перфузионного соотношения легких

2.3.2.7. Оценка активности №+/К+-АТФазы в мембране эритроцитов

2.3.2.8. Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в мембране эритроцитов

2.3.2.9. Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в мембране эритроцитов и плазме крови

2.3.3. Методы оценки окислительной модификации белков и антиоксидантной системы в нейтрофилах и плазме крови

2.3.3.1. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона в нейтрофилах

2.3.3.2. Определение концентрации SH-групп белков и белково-связанного глутатиона в нейтрофилах

2.3.3.4. Определение активности глутатионпероксидазы в нейтрофилах

2.3.3.5. Определение активности тиоредоксинредуктазы в нейтрофилах

2.3.3.6. Определение содержания карбонильных производных белков в нейтрофилах и плазме крови

2.3.3.7. Определение содержания битирозина и окисленного триптофана в плазме крови

2.3.3.8. Определение активности каталазы в плазме крови

2.3.3.9. Определение содержания церулоплазмина в плазме крови

2.3.4. Методы изучения апоптоза и внутриклеточных систем вторичных мессенджеров нейтрофилов

2.3.4.1. Оценка содержания белков-регуляторов апоптоза (Вс1-2, Вах) в нейтрофилах

2.3.4.2. Оценка реализации апоптоза нейтрофилов

2.3.4.3. Оценка содержания ионов кальция в цитоплазме нейтрофилов

2.3.4.4. Оценка содержания циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) в нейтрофилах

2.4. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Клинический блок исследования

3.1.1. Функциональное состояние нейтрофилов крови при остром воспалении

3.1.2. Перекисное окисление липидов и активность Ыа+/К+-АТФазы мембраны эритроцитов и показатели состояния альвеолярно-капиллярной мембраны легких при остром воспалении

3.1.3. Оценка показателей перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и антиоксидантной системы плазмы крови при остром воспалении

3.1.4. Состояние тиолдисульфидной системы и окислительная модификация белков нейтрофилов крови при остром воспалении

3.1.5. Индукция апоптоза нейтрофилов крови при остром воспалении 153 3.2. Экспериментальный блок исследования

3.2.1. Сравнительная оценка функционального статуса, редокс-состояния тиолдисульфидной системы и индукции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.1.1. Функциональный статус нейтрофильных лейкоцитов, состояние тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.1.2. Индукция программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.2. Оценка молекулярных механизмов участия тиолдисульфидной системы в поддержании функционального статуса нейтрофилов и защите белков от окислительной модификации при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.2.1. Функциональное состояние нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора синтеза глутатиона de novo или каталазы при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.2.2. Состояние тиолдисульфидной системы нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибиторов синтеза глутатиона de novo и каталазы при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении *

3.2.2.3. Окислительная модификация белков нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора синтеза глутатиона de novo или каталазы при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.3 Оценка молекулярных механизмов участия оксида азота в регуляции программы апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.3.1. Продукция активных форм кислорода и метаболитов оксида азота нейтрофилами в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.3.2. Реализация программированной гибели и содержание белков-регуляторов апоптоза в нейтрофилах в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

3.2.3.3. Состояние систем внутриклеточных мессенджеров (циклических нуклеотидов и ионов кальция) в нейтрофилах в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Жаворонок, Татьяна Васильевна, автореферат

Актуальность исследования. Одним из наиболее актуальных вопросов медицины остается проблема идентификации молекулярных и клеточных механизмов воспаления, лежащего в основе большинства заболеваний. Течение и исходы острого воспаления (OB) во многом зависят от функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов [МеньшиковаЕ.Б. и соавг., 2006; Маянский А.Н., 2007; Rutkowski R. et al., 2007].

Нейтрофил является ключевой клеткой в развитии острого воспаления. С одной стороны, он относится к клеткам-эффекторам очага воспаления, где запускает целый каскад молекулярных механизмов, от которых зависит, перейдет ли процесс в хроническую фазу или наступит разрешение воспаления. С другой стороны, нейтрофил играет важную роль в качестве продуцента веществ, принимающих участие в развитии и поддержании воспаления, к числу которых относятся: активные формы кислорода (АФК), ферменты азурофильных и специфических гранул, провоспалительные цитокины (фактор некроза опухоли -ос (TNFa), интерферон-у, интерлейкины (IL) 1, 8 и др.), простагландины, лейкотриены, факторы сосудистой проницаемости и иные биологически активные вещества [Kupper R.W. et al., 1992; Yamamoto К, et al., 2003; Коваленко E. И. и соавг., 2007; Grimstad О. et al., 2011].

При остром воспалении гиперпродукция АФК нейтрофилами носит адаптивный характер; она же предполагает возможность нарушения редокс-зависимых путей регуляции клетки [Маянский H.A., 2004; Лущак В.И., 2007; Rutkowski R. et al., 2007; Зенков Н.К. и соавт., 2009]. Накопление АФК в нейтрофильных гранулоцитах может приводить к окислительной модификации макромолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот), нарушению функций и повреждению клеток, активации программированной гибели вследствие развития окислительного стресса (ОС) [Владимиров Ю.А., 2000; Peake J., 2004; Nathan С., 2006; Бурлакова Е.Б., 2006; Дубинина ЕЕ., 2006; Чеснокова Н.П.,2007; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2008; Catala А, 2009].

Ведущую роль в защите от повреждающего действия АФК и поддержании редокс-статуса нейтрофилов, от которого зависит эффективность их функционирования, играет тиолдисульфидная система (ТДС) [Stadtman E.R, Levine RL., 2000; Chappie IJL., 2002; Калинина E.B. и соавт., 2008]. Эффекты этой системы основаны на восстановительном потенциале глутатиона (GSH) [Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; Кулинский В.И., Колесниченко JI.C., 2009]. Глутатион выступает акцептором АФК, кофактором ряда ферментов антиоксидантной и детоксикационной систем [Zhu Y et al., 2007; Калинина Е.В. и соавт., 2008], участвует в экспрессии редокс-чувствительных генов, регуляции внутриклеточной сигнализации [Pietarinen-Runtti P., et aL, 2000; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007; Кулинский В.И., Колесниченко КС., 2009].

Глутатион и сопряженные с ним ферментативные редокс-белки тиолдисульфидной системы (перокси-, глута-, тиоредоксины и др.) обеспечивают процесс S-тиоляции/детиоляции активных центров протеинов, защищая их от необратимой окислительной модификации и инактивации [Дас ДК, Молик Н, 2004; Nakamura Н, 2004; Tmdel S. et al., 2009; Liu G. et aL, 2010], что способствует поддержанию функциональной активности клеток. Изучение-механизмов оптимизации редокс-состояния тиолдисульфидной системы в нейтрофилах актуально в плане поиска путей возрастания эффективности функционирования данных клеток в условиях острого воспаления.

Механизмом контроля гомеостаза в организме является апоптоз [Kerr J.F.R., 1972; Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Активация программированной гибели клетки напрямую связана с развитием окислительного стресса. АФК участвуют в реализации танатогенной программы посредством изменения редокс-регуляции, экспрессии генов [Белушкина Н.Н. с соавт., 1998; Дубинина Е.Е., 2006], открытия пор в мембране митохондрий с высвобождением ионов кальция и проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) [YI J. et al., 2002; Лущак В.И., 2007]. Несмотря на очевидность взаимных связей между ОС и апоптозом, роль АФК в ограничении срока жизнедеятельности нейтрофилов посредством реализации программированной гибели не вполне ясна. Среди АФК уникальной химической природой и множеством внутриклеточных мишеней обладает NO, что обеспечивает ему как проапоптотические [Hortelano S. et al., 1997; Bruene В., 1999; Лущак В.И., 2006; Кулинский В.И., 2007], так и антиапоптотические эффекты [De Nadai С. et al., 2000; Choi B.M. et al., 2002]. Остается открытой проблема выяснения молекулярных механизмов влияния молекул NO на программированную гибель нейтрофилов в условиях окислительного стресса, развивающегося при остром воспалении.

Таким образом, идентификация редокс-зависимых механизмов нарушения функций нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе в настоящее время лежит в плоскости понимания ряда молекулярных процессов: определения роли тиолдисульфидной системы в регуляции функционального статуса клетки, оценки выраженности окислительной модификации макромолекул регуляторных систем клетки, а также изучения молекулярных механизмов сопряжения окислительного стресса и апоптоза^ нейтрофилов. Сосредоточение фундаментальных исследований на этом направлении необходимо для разработки технологических основ селективного управления воспалительным процессом.

Цель: установить общие закономерности и особенности нарушений редокс-зависимых механизмов регуляции функциональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе.

Задачи:

1. Оценить функциональные свойства (активность миелопероксидазы, продукция активных форм кислорода и цитокинов - фактора некроза опухоли ос и интерлейкина-8) и апоптоз нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro.

3. Дать комплексную характеристику тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro, оценить ее функциональный резерв в условиях действия блокатора (N-этил-малеимид) или протектора (1,4-дитиоэритритол) SH-групп, ингибитора каталазы (3-амино-1,2,4-триазол) или синтеза глутатиона (бутионин-сульфоксимин).

5. Установить роль оксида азота в механизмах дизрегуляции апоптоза нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro в р условиях индукции (L-аргинин) и ингибирования (N -нитро-Ь-аргинин метиловый эфир) NO-синтаз.

6. Идентифицировать молекулярные мишени влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов, оценив содержание белков-регуляторов с про- (Вах) и антиапоптотической (Вс1-2) активностью и концентрацию внутриклеточных

Л I сигнальных молекул (Са , цАМФ и цГМФ) при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro на фоне индукции и ингибирования NO-синтаз.

Научная новизна. Получены новые знания фундаментального характера о молекулярных механизмах изменения редокс-регуляции эффекторного потенциала и апоптоза нейтрофильных лейкоцитов крови при остром воспалении. Выявлено, что молекулярные механизмы изменений функциональных свойств нейтрофилов при остром воспалении и моделировании окислительного стресса с помощью 200 мкМ Н2О2 являются однотипными и сопряжены с повышением карбонилирования и глутатионилирования белков в клетке.

Установлено, что дисбаланс редокс-статуса тиолдисульфидной системы, возникающий при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro вследствие блокады SH-rpynn 5 мМ N-этилмалеимидом (NEM), снижает функциональный статус нейтрофилов в отношении синтеза активных форм кислорода и продукции провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNF-a) и сопровождается сохранением уровня глутатионилирования белков. Показано, что при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro действие протектора SH-rpynn 5 мМ 1,4-дитиоэритритола (DTE) способствует снижению содержания карбонильных производных белков нейтрофилов, а дефицит восстановленного глутатиона при ингибировании синтеза de novo 1 мМ бутионинсульфоксимином (BSO) приводит к накоплению карбонильных производных белков и перераспределению клеточного пула глутатиона с целью сохранения его белковосвязанной формы. Ингибирование синтеза глутатиона с помощью BSO снижает кислород-зависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (продукция 'ОН и активность миелопероксидазы), необходимые для обеспечения микробицидной функции, и не влияет на продукцию интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли а. Ингибирование каталазы с помощью 2мМ 3-амино-1,2,4-триазола (AT) при остром воспалении компенсируется участием тиолдисульфидной системы в поддержании редокс-статуса и функциональной активности нейтрофилов, которые снижают только продукцию 'ОН.

Показано, что при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro, моделируемом с помощью 5 мМ Н2Ог, оксид азота ограничивает реализацию программированной гибели нейтрофилов в условиях индукции синтеза N0 500 мкМ L-аргинином. Продемонстрировано, что молекулярные механизмы антиапоптотического влияния N0 на программированную гибель нейтрофилов при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro не связаны с изменением баланса про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков, а опосредованы участием цГМФ, цАМФ и ионов кальция.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в результате проведенного исследования фактические данные расширяют существующие фундаментальные представления о процессах дизрегуляции редокс-статуса и функциональной активности нейтрофилов крови при остром воспалении. Выявлен редокс-зависимый характер нарушений функций нейтрофильных гранулоцитов, сопряженный с состоянием тиолдисульфидной системы, и определена роль восстановленного и белковосвязанного глутатиона в регуляции процессов окислительной модификации белков и поддержании функционального статуса нейтрофилов у пациентов с острым воспалением и при моделировании окислительного стресса in vitro. Данные о роли глутатиона в поддержании функциональной активности нейтрофилов и регуляции процессов окислительной модификации белков позволяют разработать подходы для эффективного патогенетически обоснованного использования антиоксидантов в комплексной терапии острых», воспалительных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту: 1. При окислительном стрессе, индуцированном в условиях острого воспаления и in vitro с использованием 200 мкМ Н2О2, имеют место однотипные редокс-зависимые механизмы изменений функциональных свойств нейтрофилов крови (увеличение активности миелопероксидазы, продукции радикала 'ОН и провоспалительных цитокинов - интерлейкина-8 и фактора некроза опухоли а).

2. Нарушения состояния тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови при остром воспалении и окислительном стрессе in vitro (200 мкМ Н202) характеризуются снижением содержания восстановленного глутатиона, SH-групп белков и активности глутатионпероксидазы при повышении концентрации окисленного и белковосвязанного глутатиона.

4. Молекулы оксида азота ограничивают реализацию апоптотической гибели нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении и экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 5 мМ Н2О2, что сопряжено с изменением внутриклеточной концентрации вторичных I мессенджеров (цГМФ, цАМФ и Са ) и не зависит от содержания про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков.

Заключение диссертационного исследования на тему "РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ"

277 ВЫВОДЫ

2. При окислительном стрессе, развивающемся при острых воспалительных заболеваниях, в мембране эритроцитов возрастает содержание метаболитов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой) и снижается активность №+/К+-АТФазы, что сопровождается нарушением рекокс-баланса в плазме крови: повышением концентрации продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, и церулоплазмина на фоне • угнетения активности каталазы. Проявления окислительного стресса при различиях в клинической картине острых очаговых воспалительных заболеваний (моно- и полисегментарная внебольничная пневмония с альвеолярным и интерстициальным типом инфильтрата; острый, флегмонозный и гангренозный аппендицит) носят однотипный характер.

4. Окислительный стресс, развивающийся как при остром воспалении, так и индуцированный in vitro (200 мкМ Н202), сопровождается снижением редокс-статуса тиолдисульфидной системы нейтрофилов крови, что проявляется низким содержанием восстановленного глутатиона, тиоловых групп белков и активности глутатионпероксидазы на фоне высокой

I I t концентрации глутатиондисульфида и повышения глутатионилирования белков. В условиях блокады SH-групп в глутатионе и белках 5 мМ N-этилмалеимидом in vitro сохраняется повышенное глутатионилирование белков в нейтрофилах; при ингибировании синтеза глутатиона de novo 1 мМ i бутионин-сульфоксимином клеточный пул глутатиона перераспределяется в пользу белковосвязанной формы.

5. При остром воспалении и окислительном стрессе in vitro (200 мкМ Н2О2) в нейтрофилах крови возрастает карбонилирование белков, что сопровождается увеличением содержания карбонильных производных белков, битирозина и окисленного триптофана в плазме крови у пациентов с острым воспалением.

6. В защите белков нейтрофилов крови от окислительного повреждения участвует восстановленный глутатион: снижение его содержания в клетках при культивировании с ингибитором синтеза глутатиона бутионин- » сульфоксимином или ингибитором каталазы 2 мМ 3-амино-1,2,4-триазолом сопровождается увеличением содержания карбонилированных белков, а увеличение его содержания при культивировании клеток с протектором SH-групп 1,4-дитиоэритритолом приводит к снижению карбонилирования белков.

7. Блокада SH-групп белков и глутатиона N-этилмалеимидом в нейтрофилах крови у пациентов с острым воспалением и при индукции окислительного стресса in vitro (200 мкМ Н2О2) сопровождается снижением активности миелопероксидазы, продукции гидроксильного радикала и цитокинов (IL-8 и TNF-a), а ингибирование синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимином угнетает активность миелопероксидазы и продукцию гидроксильного радикала, не влияя на продукцию провоспалительных цитокинов. Влияние дефицита восстановленного глутатиона на кислород-зависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (продукция активных форм кислорода) при остром воспалении однотипно таковому в условиях экспериментального окислительного стресса.

8. При остром воспалении и экспериментальном окислительном стрессе (5 мМ Н2О2) возрастает продукция метаболитов NO нейтрофилами крови. Оксид азота обладает ингибирующим эффектом в отношении развития апоптоза нейтрофилов, о чем свидетельствует ограничение развития программированной гибели клеток при культивировании с L-аргинином в условиях окислительного стресса in vitro.

9. Нарушения процесса программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе в эксперименте in vitro (5 мМ Н2О2) не связаны с влиянием оксида азота на баланс про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков, а опосредованы внутриклеточными сигнальными молекулами — цГМФ (увеличение содержания), цАМФ и ионами кальция (снижение концентрации). Влияние оксида азота на реализацию апоптоза нейтрофилов при остром воспалении имеет однонаправленный характер с моделью окислительного стресса in vitro и сопряжено с увеличением содержания в клетке цГМФ.

Заключение

Функционирование нейтрофилов в качестве ведущего звена неспецифической защиты при остром воспалении сопряжено с гиперпродукцией АФК, индуцирующих окислительный стресс в организме. Однако сами полиморфноядерные лейкоциты в первую очередь подвержены токсическому влиянию избытка активных форм кислорода, которые вызывают необратимую окислительную модификацию макромолекул (белков, липидой, нуклеиновых кислот), повышение проницаемости мембран, выход в цитозоль Са и проапоптотических факторов, способствующих быстрому удалению нейтрофилов, ставших функционально неполноценными.

Центральное место в механизмах утилизации АФК и функционировании антиоксидантной защиты в нейтрофилах занимает тиолдисульфидная система, с помощью которой представляется возможным регулировать редокс-потенциал и функциональную активность эффекторных клеток в очагах воспаления и их элиминацию посредством апоптоза. В проведенном нами исследовании показано, что в условиях ОС значительную часть восстановительного потенциала тиолдисульфидной системы клетка использует для защиты SH-групп белков от необратимого окисления, в том числе путем глутатионилирования, с целью сохранения активных цистеиновых центров ферментов и белков. Тиоловые группы важны для поддержания клеточной редокс-регуляции и функционально активной конформации полипептидных цепей за счет процессов «образованиядиссоциации» SS-связей. При пониженном содержании, низкой скорости регенерации и синтеза GSH de novo растет степень риска окислительного повреждения белков свободнорадикальными и другими видами АФК.

Активные формы кислорода могут окислять молекулы структурных, рецепторных, транспортных белков клеточной мембраны, ферментов антиоксидантной защиты. Ведущие антиоксидантные ферменты (глутатион-зависимые энзимы, каталаза, супероксиддисмутаза) теряют функциональную активность, усугубляя дисбаланс в системе «про-/ антиоксиданты», процессы окислительной деградации макромолекул и дальнейшее повреждение клетки [Болдырев АА, 1998; Дубинина Е.Е., 2006; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В целом, при угнетении мощности ТДС и снижении АОЗ патологическое влияние процессов свободнорадикального окисления на белки проявляется в нарушении их функцонирования вследствие изменения физико-химического состояния, карбонилирования, образования межмолекулярных сшивок, что в итоге способствует накоплению дериватов белков, которые организм не в состоянии элиминировать [BerlettB.S., StadtmanE.R, 1997; RamirezD.C. etal., 2005].

Исход воспаления может быть благоприятным лишь в случае включения систем репарации клеток, направленных на восстановление или удаление поврежденных макромолекул. Эффективным способом поддержания целостности мембран является удаление поврежденных фосфолипидов активированными фосфолипазами [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Марри Р. и соавт., 2009]. Окислительно модифицированные белки становятся более уязвимыми для действия протеолитических ферментов [Дубинина Е.Е., 2006]. Защитный эффект протеолиза заключается в элиминации поврежденных молекул белков путем расщепления до аминокислот, которые могут вновь включаться в процессы биосинтеза при разрешении воспаления. Однако глубокая степень окисления может снижать протеолитическую чувствительность белков из-за образования дополнительных сшивок, выраженной агрегации и снижения растворимости, что способно приводить к их внутриклеточной аккумуляции, нарушению функционирования клеток и дальнейшей активации апоптоза.

• I s

При состояниях ОС, сопровождающихся повышением ПОЛ и ОМБ, I t истощением внутриклеточного содержания восстановленного глутатиона и нарастанием концентрации глутатиондисульфида, отмечается снижение экспрессии белков-антиоксидантов и рост продукции провоспалительных цитокинов (TNF-a и IL-8) нейтрофилами. Чрезмерная активация процессов окислительной модификации белков, в частности, при ингибировании каталазы или синтеза глутатиона de novo, сопровождается, в свою очередь, изменениями функционального состояния нейтрофилов - снижением способности к продукции 'ОН и активности миелопероксидазы, обеспечивающих микробицидность. Подобные нарушения эффекторных функций нейтрофильных гранулоцитов при остром воспалении могут, наряду с повреждением тканей, приводить к диссеминации и хронизации воспалительного процесса. Острый воспалительный процесс переходит в хроническую форму, если патоген не полностью удален или нарушена регуляция экспрессии провоспалительных медиаторов, или иммунная система не распознает измененный self-protein (собственный белок) [Маянский Д.Н., 1991; Ильина НИ., Гудима Г.О., 2005]. Окислительная модификация меняет антигенные свойства белков, а активация перекисного окисления липидов способствует образованию хемоаттрактантов, увеличивающих миграцию фагоцитов, и в очагах воспаления может сформироваться порочный круг.

Эффекторный потенциал нейтрофилов целиком направлен на экстренную защиту организма от флогогенов, поэтому важным моментом в благополучном разрешении острого воспаления становится не только адекватное функционирование, но и своевременное удаление этих клеток путем апоптоза. Полученные нами фактические данные позволили выявить модель ОС, сопоставимого с окислительным дисбалансом, развивающимся в нейтрофилах крови при остром воспалении и способного активировать апоптоз максимального количества клеток без индукции некротических изменений. К достоинствам модели можно отнести то, что она дает возможность проводить широкий спектр исследований потенциально различных типов клеточных систем при патологических состояниях, в развитии которых доказано участие ОС. На данной модели в проведенном нами исследовании конкретизирован ряд вопросов, затрагивающих 4 взаимосвязь внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в реализации программированной гибели нейтрофилов в условиях ОС, формирующегося при ОВЗ. При этом важная роль в системе вторичных мессенджеров, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность и функционирование клетки в условиях воспаления, принадлежит одной из ведущих активных форм кислорода - оксиду азота. С помощью индукции и ингибирования N0-синтаз показана протекторная роль N0 в плане ограничения реализации конституционального апоптоза нейтрофилов при окислительном дисбалансе, формирующемся на фоне ОВ и в условиях модели ОС in vitro. Выявлены закономерности модуляции молекулой NO изменений гомеостаза кальция и содержания циклических нуклеотидов (и отсутствие влияния на апоптогенные белки-регуляторы семейства Вс1-2) при реализации программированной гибели нейтрофилов в условиях острого воспаления и моделирования ОС.

Полученные в ходе исследования результаты представляют собой I теоретическую основу для последующей разработки методов профилактики, I диагностики и коррекции острых воспалительных процессов, связанных с развитием окислительного стресса. Разработка методологии редокс-регуляции на уровне системы тиолдисульфидных антиоксидантов, может стать основой для создания селективных технологий управления нейтрофилами при остром воспалении, нацеленных на оптимизацию функционирования эффекторных клеток и ограничение аутотоксических эффектов, приводящих к чрезмерно быстрой апоптотической элиминации. Дальнейшая идентификация молекулярных мишеней действия N0 позволит уточнить картину регуляции клеточных функций, что в конечном итоге будет способствовать разработке подходов управления программированной гибелью нейтрофилов при широком спектре воспалительных процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса. J

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Жаворонок, Татьяна Васильевна

1. Активированные кислородные метаболиты в монооксигеназных реакциях / В. В. Ляхович, В. А. Вавилин, Н. К Зенков и соавт. // Бюллетень СО РАМН. 2005. -Т. 118,№4.-С.7-13.

2. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксиданг-респонсивный элемент : Обзор / В. В. Ляхович, В. А. Вавилин, Н. К. Зенков, Е. Б. Меньшикова // Биохимия. -2006. -Т. 71, № 9. С. 1183-1198.

3. Антонов, В. Г. Патогенез онкологических заболеваний. Цитоплазматические и молекулярно-генетические механизмы иммунной резистентности малигнизированных клеток / В. Г. Антонов, В. К. Козлов // Цитокины и воспаление. -2004.-Т. 3, № 2. -С. 23-33.

4. Арнхольд, Ю. Свойства, функции и секреция миелопероксидазы человека / Ю. Арнхольд // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 1. - С. 8-15.

5. Аруин, М. Апоптоз при патологических процессах в органах пищеварения /. М. Аруин // Клиническая медицина 2000. - № 1. - С. 5-10.

6. Арупонян, А. В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты организма / А.В. Арупонян, Е.Е. Дубинина, НЕ Зыбин. СПб.: Фолиант. -2000. -103 с.

7. Арцукевич, А.Н. Биохимические аспекты жизнедеятельности биологических f систем /А. Н. Арцукевич, А. Н. Мальцев, В. В. Зинчук // Сборн. Научн. Трудов съезда биохимиков Белоруссии. 2000. - С. 19-23.

8. Биленко, М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов/ М.В. Биленко. -М: Медицина -1989.-368 с.

9. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. М: Мир, Бином. Лаборатория знаний. - 2009. - 800 с.

10. Болдырев, А. А Введение в биомембранологию / А. А Болдырев. М: МГУ. -1990.-208 с.

11. Болдырев, А А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения вмедицине / А. А Болдырев. М. : Издательство МГУ. - 1998. - Разд. IV, гл. 1 :i

12. Окислительный стресс. С. 119-139.

13. Болдырев, A.A. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса / A.A. Болдырев. М.: Диалог-МГУ. -1999. - 364 с.

14. Болдырев, А. А Na/K-АГРаза как олигомерный ансамбль / А А. Болдырев // Биохимия.-2001.-Т. 66,№ 8.-С. 1013-1025.

15. Болдырев, А. А. Является ли ИаД-АТРаза мишенью окислительного стресса / А А. Болдырев, Е. Р. Булыгина, Г. Г. Крамаренко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1996. -Т121, № 3. С. 275-278.

16. Бондарь, Т. Н. Восстановление органических гидроперекисей глутатион-пероксидазой и глутатион-8-трансферазой: влияние структуры субстрата / Т. Н. Бондарь, В. 3. Ланкин, В. Л. Антоновский// Докл. АН СССР. 1989. - Т. 304, № 1.-С. 217-220.

17. Брюне, Б. Апоптогическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А. фон Кнетен / Биохимия. -1998. Т. 63, вып. 7. - С. 966-976.

18. Брюханов, АЛ. Каталаза и супероксиддисмутаза: распространение, свойства и физиологическая роль в клетках строгих анаэробов / А. Л. Брюханов, А. И. Нетрусов//Биохимия. -2004. -Т. 69, вып. 9. -С. 1170-1186.

19. Бурлакова, Е. Б. Блеск и нищета антиоксидантов / Е. Б. Бурлакова // Наука и жизнь. -2006.-№2.-С. 37-43.

20. Ванин, АФ. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований/А Ф.Ванин//Биохимия.-1998.-Т. 63, вып. 7.-С. 867-869.

21. Ванин, АФ. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозошолы две возможности формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах / А Ф. Ванин // Биохимия. - 1998а - Т. 63, вып. 7. - С. 924-938.

22. Ванин, АФ. Оксид азота в биомедицинских исследованиях / А Ф. Ванин // Весгаик РАМН.-2000. -№ 4. -С. 3-5.

23. Ванин, А Ф. Оксид азота и его обнаружение в биосистемах методом электронного парамагнитного резонанса / А. Ф. Ванин // Успехи физиологических наук. -2000 а.-Т. 170, №4.-С. 455-458.

24. Васильева, Е. М. Влияние системы Ь-аргинин-МЭ на активность АТФаз и ПОЛэритроцитов / Е.М. Васильева, М.И. Баканов, ХМ. Марков // БюллетеньIэкспериментальной биологии и медицины. -1999.—Т. 128, № 9. С. 321-323.

25. Веденов, А. А. Моделирование элементов мышления / А. А. Веденов. М.: Наука. -1988.-108 с.

26. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекиснош окисления липидов, роль активных форм кислорода и азота / И. В. Заббарова, К. Б. Шумаев, А. Ф. Ванин и соавт. // Биофизика. 2004. - Т. 49. - С. 659-665.

27. Викторов, И. В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга / И. В. Викторов // Вестник РАМН 2000 - № 4. - С. 5 -10.

28. Владимиров, Ю. А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков. -М: Наука. -1972. 252 с.

29. Владимиров, Ю. А. Роль нарушений свойств липиднош слоя мембран в развитии,, патологических процессов / Ю. А. Владимиров // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -1989. -№ 4. -С. 7-19.!

30. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы в живых системах / Ю. АВладимиров,' О. А. Азизова, А. И. Деев и соавт. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. -1991. -Т.29.-С. 1-249.г».

31. Владимирская, Е. Б. Апоптоз и его роль в регуляции клеточного равновесия / Е. Б. Владимирская // Кгшнич. лабораторная диагностика. 2002. - № 11. - С. 25-32.

32. Влияние супероксидного радикала на пролиферацию лимфоцитов, стимулированную митогеном / Н Н Вольский, Н В. Капшакова, В. А. Козлов // Цитология. -1988. -Т. 30, № 7. С. 898-902.

33. Влияние факторов воспаления на течение внебольничной пневмонии / В. В. Агаджанян, И.М. Устьянцева, МА. Скопинцев, О. В. Петухова // Цитокины и воспаление. -2006. -Т. 5, № 3. -С. 16-20.

34. Возможные механизмы регуляции апоптоза нейтрофилов при аллергическом воспалении / Е. Г. Моисеева, А. В. Пасечник, Г. А. Дроздова и соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2007. Т. 143, № 3. - С. 273-275.

35. Гаврилов, В. Б. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / В. Б. Гаврилов, М. И. Мишкорудная // Лабораторное дело. -1983.-№3.-С. 33-35.

36. Гамалей, И. А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И. А. Гамалей, И В. Кль1бин//Цитология.-1996.-Т. 38.—№ 12.-С. 1233-1247.

37. Генес, Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. // Р Генес М : Мир. -1997.-624 с.

38. Гланц, С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / С. Гланц. М.: Практика, 1999.-459 е.

39. Голиков, П. П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П. П. Голиков. -М: Медпрактика-М. 2004. -180 с.

40. Голиков, П.П Роль оксида азота в патологии / П.П. Голиков, А. П. Голиков // Международный медицинский журнал. ТОП. Медицина -1999. -№ 5. С. 24-27.

41. Гольдберг, Е. Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. П. Шахов. Томск: Изд-во Том. ун-та. -1992. - 264 с.

42. Гомеостаз селена при экспериментальной анафилаксии у крыс на фоне приема' восстановленного глутатиона и селенобогащенной спирулины / Н. А. Голубкина, В. К. Мазо, И В. Гмошинский и др. // Вопросы медицинской химии. 2000. - Т. 46, № 1.-С. 22-27.

43. Гордеева, А В. Взаимодействие между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках / А. В. Гордеева, Р. А. Звягилевская, Ю. А. Лабас // Биохимия. -2003.-Т. 68, № 10.-С. 1318-1322.

44. Григорьева, ИВ. Особенности регуляции перекисного окисления липидов при пневмонии и пневмонии в сочетании с сахарным диабетом / ИВ. Григорьева, Д. Р. Ракита, В. Я. Гормаш // Терапевтический архив. -1993. № 3. - С. 27-31.

45. Гриппи, М А Патофизиология легких: пер. с англ. / М. А Гриппи; под ред. Ю.В. Наточина. 3-е изд., испр. -М.: БИНОМ; СПб.: Невский Диалект, 2001. - 318 с.

46. Гуревич, К. Г. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции / К. Г.

47. Гуревич, Н. Л. Шимановский // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2000. - № 4. - С. 16-22.

48. Гусев, Н. Б. Протеинкиназы: строение, классификация, свойства и биологическая роль / Н. Б. Гусев // Сорос, образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12. - С. 4-12.

49. Гюлиханданова, НЕ. Изучение регуляции активности гена церулоплазмина у, млекопитающих / НЕ. Гюлиханданова, НВ. Цымбаленко, НА. Платонова // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. 2004. - Т. 137, № 5. - С. 553-558.

50. Дас, Д. К. Превращение сигнала гибели в сигнал выживания при редокс-сигнализации / Д. К Дас, Н Молик // Биохимия. 2004. - Т. 69, № 1. - С. 16-24.

51. Деев, А. И. Уменьшение площади поверхности фосфолипидных мембран при перекисном окислении липидов / А. И. Деев, Г.Е. Добрецов, И. Арнхольд, Ю. А. Владимиров//Биологические мембраны.-1989.-Т. 6,№11.-С. 1227-1240.

52. Диагностическое и прогностическое значение исследования белков острой фазы при аппендикулярном перитоните у детей / В. А. Шалыгин, Л. Б. Ерошенко., А Л;. Солнышко и соавт. // Клиническая лабораторная диагностика. 2002. - № 7. - С. 7-9.'

53. Динитрозильные комплексы железа новый тип гипотензивных препаратов / А А

54. Тимошин, Ц. Р. Орлова, А. Ф. Ванин и соавт. // Российский химический журнал. — > > 2007.-Т. Ы, № 1.-С. 88-93.

55. Дромашко, С.Е. Моделирование генетических процессов / С.Е. Дромашко. —£ Минск: Издательский дом «Право и Экономика», 1999. 200 с.

56. Дубинина, Е.Е. Окислительная модификация белков / Е.Е. Дубинина, НВ. Шугалей // Успехи современной биологии. -1993.-№ 113. С. 71-81.

57. Дубинина, Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е.Е. Дубинина II Вопросы медицинской химии. -2001. Т.47, № 6. - С. 561-581.

58. Дубинина, Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клиникобио-химические аспекты / Е. Е. Дубинина. СПб.: Медицинская пресса, 2006. -400 с.

59. Жукова, О. Б. Апоптоз и вирусная инфекция / О. Б. Жукова, Н В. Рязанцева, В. В. Новицкий. Томск: Изд-во Том. ун-та. -2006. -142с.

60. Заводник, И Б. Механический лизис мембран эритроцитов человека. Стабилизациямембран белками плазмы / И.Б. Заводник, Т.П. Пилецкая, И.И. Степуро // Украинский биохимический журнал. -1991. -Т.63, №6. С. 72-78.

61. Зайцев, В. Г. Связь между химическим строением и мишенью действия как основаклассификации антиоксидантов прямого действия / В. Г. Зайцев, О. В. Островский,

62. В. И. Закревский // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. - Т. 66, №4.-С. 66-70.

63. Зайцев, В. Г. Методологические аспекты исследований свободнорадикального окисления и ангиоксидантной системы организма / В. Г. Зайцев, В. И. Закревский // Вестник Волгоградской медицинской академии. -1998. Вып. 4. - С. 49-53.

64. Зенков, Н. К. Некоторые принципы и механизмы редокс-регуляции / Н К. Зенков, Е. Б. Меныцикова, В. О. Ткачев // Кислород и антиоксиданты. 2009. - Вып. 1. - С. 3-64.

65. Зенков, Н.К. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Н К. Зенков, В. 3. Ланкин, Е. Б. Меньшикова М.: МАИК Наука / Интерпериодика, 2001. - 343 с.

66. Зиновьева, В. Н Свободнорадикальное окисление ДНК и его маркер окисленный гуанозин / В. Н. Зиновьева, О. В. Островский // Вопросы медицинской химии. -2002. -Т. 48, № 5. -С. 419431.

67. Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний / ДА. Винк, И. Водовозов, Д А. Кук и соавт. // Биохимия. 1998. — Вьш.7.-С. 948-957.

68. Ильина, Н.И Воспаление и иммунитет в общеклинической практике / Н.И. Ильина, Г. О. Гудима // Цигокины и воспаление. 2005. - Т. 4, № 3. - С. 42-44.1

69. Исследование хемилюминесценции изолированных полиморфноядерных лейкоцитов и цельной крови у больных острыми пневмониями / Н. В. Балтийская, Л. Г. Коркина, И И Селиванов и соавт. // Терапевтический архив. -1991.—№ 12. -С. 23-27.

70. Калинина, Е. В. Участие тио-, перокси- и глугаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах / Е. В. Калинина, К Н. Чернов, А. Н. Саприн // Успехи» биологической химии. 2008. -Т. 48. - С. 319-358.

71. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике / В. С. Камышников: В 2т. Т. 2. Мн.: Беларусь. - 2000. - 463 с.

72. Кансон, К. П. Програмированная клеточная гибель (апоптоз): молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине / К. П. Кансон // Вопросы медицинской химии. -1997.-Т. 43, вьш. 5. С. 402-415.

73. Кардиолипин активирует пероксидазную активность цитохрома с, потому что увеличивает доступность железа гема для Н2О2 / Ю. А. Владимиров, Е.В. Проскурнина, Д.Ю. Измайлов и соавт. // Биохимия. 2006. - Т. 71, вьш. 9. -С. 1225-1233.

74. Кашкин, К. П. Цитокины иммунной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность / К.П. Кашкин // Клиническая лабораторная диагностика-1998.-№ 11.-С. 21-23.

75. Кленова, Н. А. Биохимия патологических состояний : учебное пособие / НА. Кленова—Самара: Самарский университет.—2006. -216 с.

76. Климов, АН О способности липопротеинов высокой плотности удалять продукты перекисного окисления фосфолипидов из эритроцитарных мембран/

77. А.Н. Климов, К. А Кожевникова, АА. Кузьмин // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып. 3. -С. 371-373.

78. Колесниченко, JL С. Глутатионтрансферазы / JI. С. Колесниченко, В. И. Кулинский //Успехи современной биологии. -1989. -Т. 107. -С. 179-194.

79. Косухин, А. Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения' диеновых коньюгатов/ А. Б. Косухин, Б. С Ахметова // Лаб. дело. — 1987.—№ 5.—С. 335-337.

80. Крайнова, ТА Церулоплазмин. Биологические свойства, клиническое применение / Т. А. Крайнова, Л М. Ефремова Нижний Новгород: НГМА. -2000. - 30 с.

81. Критические состояния: качественные уровни системной воспалительной реакции / Е. Ю. Гусев, Л Н Юрченко, Н В. Зотова и соавт. // Журнал интенсивной терапии^ -2006.-№1.-С. 18-21.

82. Крыжановский, Г.Н. Дизрегуляционая патология / Г.Н Крыжановский // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2002. -№ 3. С. 2-19.

83. Кулинский, В. И. Биологическая роль глутатиона / В. И. Кулинский, Л С. Колесниченко//Успехи современной биологии. -1990.-Т. 110, вып. 1.-С. 20-23.

84. Кулинский, В. И, Биохимические аспекты воспаления / В. И. Кулинский // Биохимия. -2007. -Т. 72, № 6. -С. 733-746.

85. Кулинский, В. И Глутатион митохондрий / В. И Кулинский, Л С. Колесниченко // Биохимия. -2007. Т. 72, № 7. - С. 856-859.

86. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин.-М.: Высшая школа. -1980. -293 с.

87. Ларкий, Э. Г. Методы определения и метаболизм металлобелковых комплексов /

88. Э. Г. Ларкий // Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. -1990. Т. 41 С. 34-38.

89. Лебедев В. В. Супероксидная теория патогенеза и терапии иммунных расстройств / В. В. Лебедев // Вестник РАМН -2004. № 2. - С. 34 - 40.

90. Логвиненко, Н И. Тяжелые пневмонии. Состояние проблемы / НИ. Логвиненко // Бюллетень сибирского отделения РАМН. 2003. - № 3. - С. 86-88.

91. Лущак, В. И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий / В. Н Лущак // Биохимия. 2001. - Т. 66, вьш. 5.-С. 592-609.

92. Лущак, В. И Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма/В. И. Лущак//Биохимия. 2007.—Т. 72, №8-С. 995-1015.

93. Маеда, X. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке/ Х.Маеда,Т. Акаике// Биохимия.-1998.-Т. 63,вьш. 7.-С. 1007-1019.

94. Марусин, А. В. Проблемы изучения антиоксидантной системы организма / Марусин А. В. -Томск: ТГУ. -1998. -290 с.

95. Мацкевич, Ю. А. Активность транспортных АТФаз и некоторые характеристики;, белок-липидного состава мембран безъядерных эритроцитов ряда млекопитающих

96. Ю. А. Мацкевич, А. М. Казеннов. М. Н. Маслова // Эволюционная биохимия и физиология. -1994. -№ 4. С. 497-504.

97. Маянский, Д Н. Хроническое воспаление / Д. Н. Маянский М.: Медицина. -1991.-272 с.

98. Маянский, Д Н Лекции по клинической патологии: Руководство для врачей / Д. Н Маянский, И Г. Урсов. Новосибирск: Наука. -1997.-249 с.

99. Маянский, АН Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.НМаянский, Д. Н Маянский. -Новосибирск: Наука. -1989. -264 с.

100. Маянский, НА Внутренний пуп» апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптознош эффекта гранулоцитарнош колониестимулирующеш фактора / Н А Маянский // Иммунология. 2004. - № 6.-С. 327-330.

101. Маянский, Н А. Митохондрии нейгрофилов: особенности физиологии и значение в апоптозе /НА Маянский // Иммунология. 2004а - №5. - С. 307-311.

102. Маянский, НА НАДФН-оксидаза нейгрофилов: активация и регуляция / АН.

103. Маянский // Цитокины и воспаление. 2007. - № 3. - С. 24-29.

104. Маянский, НА. Субклеточное перераспределение Вах и его слияние с митохондриями при спонтанном апоптозе нейгрофилов / НА. Маянский // Иммунология. 2001. - № 6. - С. 29-32.

105. Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах. / Под ред. А И Карпшценко Т. 2 / А. И. Карпшценко. - СПб.: Интермедика -1999.—656 с.

106. Меньшикова, Е.Б. Биохимия окислительного стресса (оксиданты и антиоксиданты) / Е. Б. Меньшикова, Н К. Зенков, С. М. Шергин. Новосибирск. — 1994-397 с.

107. Меньшикова, Е.Б. Метаболическая активность гранулоцитов при хронических неспецифических заболеваниях легких / Е.Б Меньшикова, НК. Зенков //.' Терапевтический архив. -1991. № 11. - С. 85-87.

108. Меньшикова, Е. Б. Оксид азота и М>синтазы при различных функциональных состояниях / Е. Б. Меньшикова, Н К. Зенков, В. П. Реутов // Биохимия. 2000. - Т. 65, №4.-С. 485-503.

109. Меньшикова, Е.Б. Примирование гранулоцитов крови при воспалении / Е.Б:. Меньшикова, НК Зенков // Патологическая физиология и экспериментальная терапия -1992.-№3.-С. 14-16.

110. Метод определения активности катапазы / М.А. Короток, Л. И. Иванова, И. Г. Майоров, В. Е. Токарев // Лабораторное дело. -1988. № 1 - С. 16-19.

111. Метода изучения метаболизма оксида азота / Т. В. Звягина, И Е. Белик, Т. В. Аникеева и соавт. // Вестник гигиены и эпидемиологии.—2001. Т.5, №2. - С. 253256.

112. Механизмы передачи сигнала оксидант N0 в сосудистой ткани / М С. Волин, К Дэвидсон, П. Камински и соавт. // Биохимия. -1998. - вып. 7. - С. 958-965.

113. Микроэлемент селен:роль в процессах жизнедеятельности /И.В.Гмошинский,

114. B. К. Мазо, В. А. Тутельян, С. А Хотимченко // Экология моря. 2000. - № 54.1. C. 5-19.

115. Нестерова, HB. Пептидная регуляция продукции интерлейкина-8iнейтрофильными гранулоцитами в эксперименте in vitro /НВ. Нестерова, Е. Ю. Синельникова, И. Н Швыдченко // Иммунология. 2006. - № 5. - С. 274-278.

116. Новицкий,В.В. Физиология и патофизиология эритроцитов / В.В.Новицкий, Н В. Рязанцева, Е. А. Степовая. Томск: изд-во Том. ун-та, 2004. -202 с.

117. Новые мутации в гене р53 человека регуляторе клеточного цикла и канцерогенеза / К Н Кашкин, С. В. Хлгатян, О. В.Гурова и соавт. // Биохимия. - 2007. - Т. 72, вып.З.- С. 346-357.

118. Образование свободных радикалов при взаимодействии пшохлорита с ионами железа (И) / Э. Ш. Якутова, Е. С. Дрёмина, С. А. Евгина и соавт. // Биофизика. -1994.-Т.39.-С. 275-279.

119. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меньшикова, Н К. Зенков, В. 3. Панкин и соавт. Новосибирск: APTA. - 2008. -284 с.

120. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е. Б. Меньшикова, В. 3. Ланкин, Н К. Зенков и соавт. М.: Слово. -2006. - 556 с.

121. Окислительный стресс и эндогенная интоксикация у больных в критических состояниях / Г. А. Рябов, Ю.М Азизов, И.Н. Пасечник и соавт. // Вестник интенсивной терапии. -2002. № 4. - С. 4-7.

122. Окороков, АН Диагностика болезней внутренних органов / АН Окороков М : Мед. лит. - 2000. - Т. 3.: Диагностика болезней органов дыхания. - С. 460-464.

123. Октябрьский, О.Н Редокс-регуляция клеточных функций / О.Н Октябрьский, Г. В. Смирнова//Биохимия. -2007. -Т. 72, № 2. -С. 158-174.

124. Осипов, А.Н Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии пшохлорита с ионами железа / А. Н. Осипов, Э. Ш. Якутова, Ю. А. Владимиров // Биофизика. -1993. -Т. 38. С. 390-396.

125. Осипов, А.Н Активированные формы кислорода и их роль в организме / АН Осипов, О. А. Азизова, Ю. А. Владимиров // Успехи биологической химии. -1990. -Т. 31.-С. 180-208.

126. Оценка устойчивости к оксидативному стрессу плазмы крови по уровню окисляемости белков и липидов при металлкатализируемом окислении / Э.М

127. Бекман, О. А. Баранова, Е. В. Губарева и соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. - Т. 142, № 9. - С. 268-272.

128. Панасенко, О. М. Опосредованная миелопероксидазой деструкция ненасыщенных фосфатидилхолинов в составе липосом / О.М. Панасенко, Г. Шпальтехольц // Биологические мембраны. 2004. - Т. 21, № 2. - С. 138 -150.

129. Пасечник, И.Н. Механизмы повреждающего действия активированных формIкислорода на биологические структуры у больных в критических состояниях / И. Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. 2001. - № 4.—С. 3-9.

130. Пасечник, И. Н. Окислительный стресс и критические состояния у хирургичеоагс больных / И. Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. 2004. - №3. - С. 27-30.

131. Патология клеточных мембран при шизофрении/ЕВ. Рязанцева, В. В. Новицкий, А. П. Агарков, Е. А. Степовая // Томск: изд-во Том. ун-та, 2004. -122 с.

132. Перекисное окисление и стресс / В. А. Барабой, И. И. Брехман, В.Г.Глоткин, Ю. Б. Кудряшов. Санкт-Петербург: Наука. -1992. -142 с.

133. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке / О. Ю. Плетюшкина, Е. К. Фетисова, КГ Лямзаев. и соавт. // Биохимия. 2006. - Т. 71, вып. 1. - С. 75-84.

134. Петрова МП. Методика получения мембран эритроцитов / МП. Петрова, Т. А. Сербинова, П. С. Васильев // Лабораторное дело. -1978. №8. - С. 503.

135. Поленов, М. А. Окись азота в регуляции функции желудочно-кишечного тракта / М А. Поленов // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -1998. № 1. - С. 53-61.

136. Потапнев, М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М П. Потапнев // Иммунология. 2002. -№4. - С. 237-243.

137. Радионуклидная диагностика для практических врачей / под редакцией Ю. Б. Лишманова, В. И Чернова. Томск: STT, 2004. - 394 с.

138. Раевский, К. С. Роль оксида азота в глутаматергической патологии мозга / К. С. Раевский, В. Г. Башкатова, А. Ф. Ванин // Вестник РАМН. 2000. - № 4. - С. 11-15.

139. Регуляция пероксидазной активности цитохрома с с помощью оксида азота и лазерного излучения / А. Н Осипов, Г. О. Степанов, Ю. А Владимиров и др.'// Биохимия.-2006.-Т. 71, вьш. 10.-С. 1392-1398.

140. Реутов, В. П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности /В. П. Реутов // Биохимия.—2002. Т. 67, №3.-С. 353-376.

141. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, A.B. Шестопалов и др. // Вопросы медицинской химии. 2000. - Т. 46, вьш. 2. - С. 35-8.

142. Рубин, М.П. Радионуклидная перфузионная сцинтиграфия легких: методика исследования и интерпретации результатов / М П. Рубин, О. Д. Кулешова, P. E. Чечурин // Радиология практика. - 2002. - № 4. - С. 16-21.

143. Руднов, В. А. От локального воспаления к системному: выход на новые представления патогенеза критических состояний и перспективы терапии / В. А. Руднов // Журнал интенсивная терапия. -2006. № 1. - С. 35-38.

144. Рябов Г. А. Окислительный стресс и эндогенная интоксикация у больных в критических состояниях / Г. А Рябов, Ю. М. Азизов, И. Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии.-2002.-№4.-С. 4-7. -л.

145. Сапей, А. П. Роль оксида азота в формировании мотивационнош поведения и обучения /А.П. Сапей, М.И. Рецкий // Вестник ВГУ. Серия химия, биология, фармация. 2003. - № 1. - С. 75-80.

146. Северина, И. С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов / И. С. Северина // Вопросы медицинской химии. — -2002.-Вьш 1.-С.4-30.

147. Сейфулла, Р. Д. Проблемы фармакологии антиоксидантов / Р. Д. Сейфулла, И. Г. Борисова// Фармакология и токсикология. -1990. -№ 6. С. 3-10.

148. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / В. А Тутельян, В. А Княжев, С. А Хотимченко и др. М. : Издательство РАМН, 2002. -224 с.

149. Семенов, В. JI. Перекисное окисление липидов как механизм биоэнергетической регуляции при воспалении органов дыхания / B.JI. Семенов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия -1989. № 2. - С. 17-20.

150. Симбирцев, A.C. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма/АС. Симбирцев//Цитокины и воспаление.-2002.-Т. 1,№1.-С.9-17.

151. Симбирцев, АС. Цитокины: классификация и биологические функции / АС.

152. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. - Т. 3, № 2. - С. 16-22.

153. Скулачев, В. П. Энергетика биологических мембран / В. П. Скулачев. М: Наука, 1989.-564 с.

154. Соловьева, M. Е. Прооксидантное и цитотоксическое действие N-ацетилцистеина и глутатиона в сочетании с витамином Bi2 / M. Е. Соловьева, В. В. Соловьев, А. А. Фасхутдинова и соавт. // Цитология. 2007. - Т. 4, № 1 - С. 70-78.

155. Сомова, Л. М. Оксид азота как медиатор воспаления / JI. M Сомова, H Г. Плехова // Вестник ДВО РАН—2006. № 2. - С. 77-80.

156. Сторожек, С. А. Молекулярные дефекты белков мембран эритроцитов / С. А. Сторожек, А. Г. Санников//Вопросы медицинской химии.-1996.-№2.-С. 14-16

157. Стресс-ответ и апоптоз в про- и антивоспалительном фенотипе макрофагов / И Ю. Малышев, С. В. Круглов, JL Ю. Бахтина и соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. - Т. 138, № 8. - С. 162-165.

158. Талаева, В. В. Механизмы взаимодействия клеток крови и сосудистой стенки в реализации воспалительного и иммунного ответов / В. В. Талаева // Украинский ревматологический журнал. 2001. - № 3. - С. 45-53.

159. Типовые изменения эритроцитов при хроническом воспалении / Е. А. Степовая, В. В. Новицкий, H В. Рязанцева и соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2004.-Т. 137,№1.-С. 66-70. ' Г

160. Тодоров, И. H Митохондрии: окислительный стресс и мутации митохондриальной ДНК в развитии патологий, процессе старения и апоптозе / H H Тодоров // Российский химический журнал. 2007. - Том LI, № 1. - С. 93-107.

161. Тотолян, А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин СПб. : Наука.-1999.-231 с.

162. Турпаев, К. Т. Редокс-зависимая регуляция экспрессии генов, индуцируемых-sокисью азота / К. Т. Турпаев, Д. Ю. Литвинов // Молекулярная биология. 2004. -Т. 38, № 1. - С. 56-68.

163. Федоров, H А. Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине/НА Федоров, M Г. Радуловацкий, Г. Е. Чехович. -М: Медицина. -1990. -176 с.

164. Хаитов, P. M Физиология иммунной системы / P. M Хаитов М. : ВИНИТИ РАН - 2001.—224 с.

165. Циклические превращения оксида азош в организме млекопитающих / В.П. Реутов, Е. Г. Сорокина, В. Е. Охотин, Н. С. Косицын.-М.: Наука. -1998. -159 с.

166. Черницкий Е.Н. Структура и функция эритроцитарных мембран / Е.Н. Черницкий, А. В. Воробей // Минск: Беларусь. -1981.- 423с.

167. Чеснокова, НП. Механизмы структурной и функциональной дезорганизациибиосистем под влиянием свободных радикалов / Н. П. Чеснокова, Е. В.t

168. Понукалина, М. Ы Бизенкова // Фундаментальные исследования. 2007. - № 4. -С. 7-18.

169. Чучалин, А. Г. Пневмония / А. Г. Чучалин, А. И. Синопальников, JI. С. Страчунский. М.: ООО Медицинское информационное агентство. -2006. - 464 с.

170. Штрыголь, С. Ю. Нитраты: побочное действие, его профилактика и коррекция / Штрыголь С. Ю. // Провизор. 2003. - № 9. - С. 30-36.

171. Яровая, ГА Биорегулирующие функции и патогенетическая роль протеолиза. Физиологическая роль и биохимические механизмы протеолитической деградации белков / Г. А. Яровая // Лабораторная медицина. 2003. - № 6. - С. 48-54.

172. A hierarchical role for classical pathway complement proteins in the clearance of apoptotic cells in vivo /P.R. Taylor, A. Carugati, V. A. Fadok et al. // J. Exp. Med. 2000. - VoLf 192.-P.359-366.

173. A mathematical model of glutathione metabolism / M. С Reed, R L Thomas, J. Pavisic et al. //Theor. Biol. Med. Model. -2008. Vol. 5. -P. 8-13.

174. Abu-Soud, H. M. Nitric oxide is a physiological substrate for mammalian peroxidases / H. M. Abu-Soud, S. L. Hazen //J. Biol. Chem. -2000. Vol. 275. -P. 37524-37532.

175. Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poly-S-nitro-sylation / L. Xu, J. P. Eu, G. Meissner et al. // Science. -1998. Vol. 279. - P. 234-237.

176. Al-Abrash, A.S. Catalase evaluation in different human diseases associated with oxidative stress / A. S. Al-Abrash, F. A. Al-Quobaili, G. N. Al-Akhras // Saudi Med. J.-2000. Vol. 21, N 9. - P. 826-830.

177. Allen, & C. Evidence for the generation of an electronic excitation state(s) in humanpolymorphonuclear leukocytes and its participation in bactericidal activity / R. C. Allen,t

178. R. L. Stjernholm, R. H. Steele // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - Vol. 47. -679-689.

179. Allen, R. G. Oxidative stress and gene regulation /R.G. Allen, M. Tresini // Free Radic. Biol.-2000.-Vol.28.-P. 463-499. i

180. Arner, E. S. J. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase / E. S. J. Amer, A. Holmgren//Eur. J. Biochem. -2000. Vol. 267. -P. 6102-6109.

181. Amhold, J. Role of functional groups of human plasma and luminol in scavenging of NaOCl and neutrophil-derived hypoclorous acid / J. Arnhold, S.Hammerschmidt, K. Amold//Biochim.etbiophis. acta.-1991.-Vol. 1097.-P. 145-151.

182. Analysis of nitrate, nitrite, and 15N. nitrate in biological fluids / L.C. Green, D.A. Wagner, J. Glogowskietal.//Anal. Biochem.-1982.-Vol. 126,N l.-P. 131-138.

183. Anderson, M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological^ samples / M. E. Anderson // Methods Enzymol. -1985. Vol. 113. - P. 548-555.

184. Annexin V-afEnity assay: a review,on an apoptosis detection system based on, phosphatidylserine exposure / M. Van Engeland, L. J. W. Nieland, F. C. S. Ramaekers et al. // Cytometry. -1998. Vol. 31. -P. 1-9.

185. Antonsson, B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family «killer-proteins» and their victim^ the mitochondrion/B. Antonsson//Cell Tiss. Res. -2001. Vol. 306. -P. 347-361.

186. Apoptosis and airway inflammation in asthma / A. M. Vignola, G. Chiappara, R. Gagliardo et al. //Apoptosis. -2000. -N 5. -P. 473^85.

187. Aqilina, J. A. Polypeptide modification and crosslincing by oxidized 3-hydroxykynurenine / J. A. Aqilina, J. A. Carver, R. J. W. Truscott // Biochemistry. 2001. - Vol. 39, N 51. -P. 16176-16184.

188. Anigo, A. P. Small stress proteins: Chaperones that act as regulators of intracellular redox state and programmed cell death / A.P. Arrigo // Biol. Chem. -1998. Vol.379. - P. 19-26.s •»s

189. Asaho, T. Various pathogenetic factors revolving around the central role of protein kinase . C activation in the occurrence of cerebral vasospasm / T. Asaho, T. Matsui // Critical Rev.inNeurosuigeiy.-1998.-Vol. 8,N3.-P. 176-187.t

190. Asian, M. Modulation of redox pathways in neutrophils from sickle cell disease patients /i

191. M Asian, D. Canatan // Exp. Hematol. 2008.—Vol. 36, N11. - P. 1535-1544.

192. Aslund, F. Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thiol-disulfide status / F. Aslund^ M. Zheng, J. Beckwith et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. Vol. 96, N11. -P. 6161-6165.

193. Association of Bax and Bak homo-oligomers in mitochondria Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome c release / V. Mikhailov, M Mikhailova, K. Degenhardt et al. //J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278, N 7. -P. 5367-5376.

194. Bactericidal potency of hydroxyl radical in physiological environments / R G. WolcotV

195. B. S. Franks, D. M. Hannum et al. //J. Biol. Chem. -1994. Vol. 269. -P. 9721-9734. *7 > ' ?r

196. Baeuerle, P. A. Function and activation ofNF-kB in the immune system / P. A. Baeuerle,:

197. T. Henkel // Annu. Rev. Immunol. -1994. Vol. 12.-P. 141-179. t!H

198. Baeuerle, P. A. Ik-NF-kB structures: at the interface of inflammation control / P. A. Baeuerle // Cell. -1998. Vol. 95, N 6. - P. 729-731.

199. Barnes, P. Reactive oxygen species and airway inflammation / P. Barnes // Free Radical Biol, and Med. -1990. Vol. 9. -P. 235-243.

200. Bast, A. Oxidants and antioxidants state of the art / A. Bast, G. R M. Haenen, C. J. A. Doelman// Amer. J. Med. -1991. Vol. 91. -P. 2-13.

201. Baty, J. W. Proteomic detection of hydrogen peroxide-sensitive thiol proteins in Juikat cells / J. W. Baty, M. B. Hampton, C. C. Winteibourn // Biochem. J. 2005. - Vol. 389, N 3.-P. 785-795.

202. Beier,J. Novel perspectives ofCOPD pharmacotherapy: focus on neutrophils/J. Beier, K.M. Beeh // Pneumologie. 2005. - Vol. 59,N ll.-P. 770-782.

203. Berg, J. T. Endotoxin protection of rats from O2 toxicity: chemiluminescence of lungneutrophils / J. T. Berg, R M. Smith // Res. Commun. Chem. Pathol, and Pharmacol. -1984.-Vol. 44.-P. 461-476. |

204. Berlett, B. S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress / B. S. Berlett, E. R Stadtman//Journal forBiochemistiy.-1997.-Vol. 272,№ 33.-P. 20313-20316.

205. Betteridge, D. J. What is oxidative stress? / D J. Betteridge //Metabolism.-2000.-Vol. 49.-P. 3-8. 5

206. Bielski, B. H. A study of the reactivity of HO2/O2' with unsaturated fatty acids / B. H. Bielski, R L. Arudi, M. Sutherland//J. Biol. Chem. -1983. Vol. 258. -P. 4759-4761.

207. Bignold, L. P. Mechanism of separation of polymorphonuclear leucocytes from whole blood by the one step hypaque ficoll method / L. P. Bignold, A. Ferrante // J. Immunol.ymethods. -1987. -Vol. 96, N1. -P. 29-33.

208. Blokhina, O. Antioxidants, Oxidative Damage and Oxygen Deprivation Stress: a Review / .

209. O. Blokhina, E. Virolainen, K. V. Fagerstedt // Annals of Botany. 2003. - Vol. 91. - P.179.194. J*f ^

210. Blum, J. Inactivation of glutathione peroxidase by superoxide radical / J. Blum, I." Fridovich // Arch. Biochem. Biophys. -1985. Vol. 240, № 2. -P. 500-508. :>

211. Bonizzi, G. The two NF-kB activation pathways and their role in innate and adaptive * '•fimmunity / G. Bonizzi, M. Karin // Trends Immunol. 2004. - Vol. 25. - P. 280-288. ; '

212. Bose, M. Proinflammatory cytokines can significantly induce human mononuclear^ phagcx^tes to produce nitric oxide by a cell maturation-dependet process / M Bose, P. Famia // Iimmunol. Lett. -1995. Vol. 48. - P. 59-64.

213. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford //Analyt. Biochem.-1976.- Vol. 7,N1-2.-P. 248-254. f ,r

214. Britigan, B. E. Pseudomonas and neutrophil products modify transferrin and lactoferrin to create conditions that favor hydroxyl radical formation / B. E. Britigan, B. L. Edeker // J. Clin. Invest. -1991. Vol. 88. - P. 1092-1098.

215. Candeias, L.P. Formation of hydroxyl radicals on reaction of hypochlorous acid with ferrocyanide, a model iron (II) complex / L. P. Candeias, M. R L. Stratford, P. Wardman // Free Radical Res. -1994. Vol. 20. -P. 241-249.

216. Carotenois, tocopherols and thiols as biological singlet molecular oxygen quenehers / P.* -Dimascio, T. P. A. Devasagauam, S. Raiser, H. Sies // Biochem. Soc. Trans. 1990. -, Vol. 18.-P. 1054-1056.v'

217. Carr, A. C. Oxidation of neutrophil glutathione and protein thiols by myeloperoxidase derived hypochlorous acid / AC. Carr, C. C. Winterboum // Biochem. J. 1997. - Vol. 327.-P. 275-281.

218. Catala, A. Lipid peroxidation of membrane phospholipids generates hydroxy-alkenals and oxidized phospholipids active in physiological and/or pathological conditions / A Catala// Chem.Phys. Lipids.-2009.-Vol. 157,N l.-P. 1-11.

219. Catalase and glutathione reductase protection of human alveolar macrophages during oxidant exposure in vitro / P. K. Pietarinen, R B. Raivio J. D. Devlin et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. -1995. Vol. 13. -P. 434-441.

220. Catalytic consumption of nitric oxide by prostaglandin H synthase-1 regulates platelet function / V.B. O'Donnell, B. Coles, M.J. Lewis et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. -P. 38239-38244.

221. Cellular sources and inducers of cytokines present in acute wound fluid / O. Grimstad, O. Sandanger, L. Ryan et al. // Wound Repair Regen. 2011. - V. 19, N 3. - P. 337-347.

222. Ceruloplasmin gene expression in the central nervosus system/L.W.Klomp, Z.S.

223. Farhangrasi, L.L. Dugan, J.D. Gitlin//J. Clin. Invest -1996. Vol. 98, N1. -P. 207-215.i

224. CFTR mediates apoptotic volume decrease and cell death by controlling glutathione effluxand ROS production in cultured mice proximal tubules / S. lHoste, A. Chargui, R. Belfodili

225. Am. J. Physiol. Renal. Physiol.-2010 Vol. 298, N 2. - P. F435-F453.

226. Chakraborti, S. Oxidant-mediated activation of phospholipase A2 in pulmonaiy endothelium / S. Chakraborti, G. H. Gurtner, J. R Michael // Amer. J. Physiol. -1989. -Vol. 257.-P. 430-437. |

227. Chang, L. C. Signal transduction pathways for activation of extracellular signal-regulated kinase by arachidonic acid in rat neutrophils / L. C. Chang, J. P. Wang // J. Leucocyte Biol. -2001.-Vol. 69.-P. 659-665.

228. Chemistry, physiology and pathology of free radicals / L. Bergendi, L. Benes/Z. Durackova, M Ferencik//Life Sci.-1999.- Vol. 65.-P. 1865-1874. " * V.

229. Chen, K. Beyond LDL oxidation: ROS in vascular signal transduction / K. Chen, S.R Thomas, J.F.Jr. Keaney // Free Radie. Biol. Med. 2003. - Vol. 35, N 2. - P. 117-132.y

230. Chen, Q. Redox regulation of apoptosis before and after cytochrome C release / Q. Chen, M Crosby, Almasan A. // Korean J. Biol. Sci. 2003. - Vol. 7, N1. - P. 1-9.

231. Ciolino, H. P. Modification of proteins in endothelial cell death during oxidative stress / HP. Ciolino, RL. Levine//Free-Radic-Biol-Med.-1997.-Vol. 7, N22.-P. 1277-1282.

232. Ciurea, D. Superoxide dismutase and compounds with SOD-like activity / D. Ciurea // Rev. Roum. Neurol. etPsychiat -1992. Vol. 30. -P. 89-98.

233. Coexistence of translocated cytochrome c and nitrated protein in neurons of the rat cerebral cortex after oxygen and glucose deprivation. / D. Alonso, J. M. Encinas, L. O. Uttenthal et al. //Neuroscience. -2002. Vol. 111. -P. 47-56.

234. Concentration-dependent effects of nitric oxide on mitochondrial permeability transition and cytochrome c release. / P. S. Brookes, E. P. Salinas, K. Darley-Usmar et al. // J. Biol. Chem.-2000.-Vol. 275.-P. 20474-20479.

235. Condell, R A Evidence suitabiliti of glutathione peroxidase as a protective enzyme: studies of oxidative damage, renaturation, and proteolysis / R A Condell, A L. Tappel // Arch. Biochem. Biophis. -1983. Vol. 223, N 2. -P. 407-417.

236. Copper-catalyzed Protein Oxidation and Its Modulation by Carbon Dioxide. Enhancementof protein radicals in cells / D. C. Ramirez, E. Sandra, G. Mejiba, R P. Mason // J. Biol.,

237. Chem.-2005.-Vol. 280, N 29.-P. 27402-27411.

238. Coxon, A. Cytokine-activated endothelial cells delay neutrophil apoptosis in vitro and in \ * vivo. A role for granulocyte/macrophage colony-stimulating factor/ A Coxon, T. Tang, T.;^ N. Mayadas //J. Exp. Med. -1999. Vol. 190. -P. 923-934.

239. Curi, T. C. Percentage of phagocytosis, production of 02*~, H2O2 and NO, and antioxidant!/, enzyme activities of rat neutrophils in culture / T. C. Curi, M. M. P. De, A C. Palanch et al. // Cell Biochem. Funct -1998. Vol. 16. -P. 43-49.

240. Current smoking of elderly men reduces antioxidants in alveolar macrophages / T. Kondo, S. Tagami, A Yoshioka et al. // Am. J. Respir. Crit Care Med. 1994. - Vol. 149. - P. 178-182.

241. Curzio, M. Interaction between neutrophils and 4-hydroxyalkenals and consequences on neutrophil motility / M Curzio // Free Rad. Res. Comm. -1988. Vol. 5, N 2. - P. 55-66.

242. CXC chemokine suppression of polymorphonuclear leukocytes apoptosis and preservation of function is oxidative stress independent / A L. Dunican, S. J. Leuenroth, A Ayala et al. // Shock. -2000. Vol. 13. -P. 244-250.

243. Cyclic AMP delays neutrophil apoptosis via stabilization of Mcl-1 / T. Kato, H. Kutsuna, N. Oshitani et al. //FEBS Lett -2006. Vol. 580. -P. 4582-4586.i *

244. Cyclic AMP regulation of neutrophil apoptosis occurs via a novel protein kinase A-independent signaling pathway / M C.' Martin, I. Dransfield, C. Haslett et al. // J. Biol. Chem. -2001. Vol. 276, N48. -P. 45041-45050.

245. Darr, D. Irreversible inactivation of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole / D. Darr, I. Fridovich // Biochem. Pharmacol.-1986.-Vol. 35.-P. 36-42.

246. Davies, K. J. Protein damage and degradation by oxygen radicals. 1. General aspects / K. J. Davies//J. Biol. Chem.-1987.-Vol. 262.-P. 9895-9901.

247. Day, R, M. Cell Proliferation, Reactive Oxygen and Cellular Glutathione // R M. Day, Y. J. Suzuki // Dose Response. 2005. - Vol. 3, № 3. - P. 425-442.

248. Dean, R. T. Reactive species and their accumulation on radical-damaged proteins / R. T. Dean, S. Gieseg,M J. Davies//Trends Biochem. Sci.-1993.-Vol. 18.-P. 437-441.

249. Denlsov, E. T. Handbook of Antioxidants / E. T. Denisov, T. G. Denisova. New York r CRC Press. - 2000. - P .35-38.

250. Detecktion of multiple forms of human ceruloplasmin / M. Sato, M. L. Schilsky, R. J. Stockeit et al. //J. Biol. Chem. -1990. Vol. 265, N 5. -P. 2533-2537.

251. Differential regulation of antioxidant enzymes in response to oxidants / S. Shull,N.H. Heintz, M. Periasamy et al. // J. Biol. Chem. -1991. Vol. 266, N 36. - P. 24398-24403.

252. Difiusion-limited reaction of free nitric oxide with erythrocytes / X. Liu, M. J. Miller, M. S. Joshi et al. //J. Biol Chem. -1998. Vol. -273. -P.18709-18713.

253. Direct demonstration of delayed eosinophil apoptosis as a mechanism causing tissue eosinophilia / H U. Simon, S. Yousefi, C. Schranz et al. // J. Immunol. -1997. Vol.t158.-P. 3902-3908.

254. Direct evidence of ceruloplasmin antioxidant properties / R. L. Atanasiu, D. Stea, M. A Mateescu et al. //Mol. Cell Biochem. -1998. Vol. 189. -P. 123-132.

255. Disruption of Fas receptor signaling by nitric oxide in eosinophils / H. Hebestreit, B. Dibbert, I. Balatti et al. //J. Exp. Med. -1998. Vol. 187. -P. 415-425.

256. Distinct and specific functions of cGMP-dependent protein kinases / S. M Lohmann, A. Vaandrager, A. Smolenski et al. // Trends Bioch. Sei. -1997. V. 22. -N 8. - P. 307-312.

257. Distinct roles of thioredoxin in the cytoplasm and in the nucleus. A two-step mechanism of redox regulation of transcription factor NF-kB / K. Hirota, M. Murata, Y. Sachi et al. // J. Biol. Chem. -1999. Vol. 274, N 39. -P. 27891-27897.

258. Do human neutrophils form hydroxyl radical? Evaluation of an unresolved controversy / M. S. Cohen, B. E. Britigan, D. J. Hassett et al. // Free Radie Biol Med. -1988. Vol. 5. -P. 81-90.

259. Dormandy, T. L. Ceruloplasmin: acute-phase antioxidant / T. L. Dormandy // Agents and Actions. -1981.-Vol. 8.-P. 185-197.

260. Droge, W. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function / W. Droge // Physiol. Rev. -2002. Vol. 82. -P. 47-95.

261. Dunlop, R A Recent developments in the intracellular degradation of oxidized proteins/ R A. Dunlop, K. J. Rodgers, R T. Dean // Free Radie. Biol. Med. 2002. - Vol. 33, N 7. -P. 894-906.

262. Eaton, J. W. Catalases and peroxidase and glutatione and hydrogen peroxide: Mysteries of the bestiary / J. W. Eaton//J. Lab. and Clin. Med. -1991. Vol. 118. -P.3-4.

263. Edwards, R M Interaction of L-arginine analogs with L-arginine uptake in rat renal brush border membrane vesicles / RM. Edwards, E. J. Stack, W. Trizna // JPET. -1998. Vol. 285, N3.-P. 1019-1022.

264. Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and cAMP interaction on human neutrophil apoptosis / C. Tortorella, G. Piazzolla, F. Spaccavento et al. // Mediators Inflamm. -1998. Vol. 7, N 6. -P. 391-396.

265. Effect of nitroso compounds on Na/K-ATP-ase / ABoldyrev, E.Bulygina, G. Kramarenco et al. //Biochim. et Biophis. Acta. -1997. Vol. 1321. -P. 243-251.

266. Effects of vitamin E on oxidative stress and membrane fluidity in brain of streptozotocininduced diabetic rats / J. H. Hong, M. J. Kim, M. R Park et al. I I Clin. Chim. Acta. -2004.' -Vol. 340 (1-2). -P. 107-115. , .

267. Endogenous Reactive Oxygen Intermediates Activate Tyrosine Kinases in Human Neutrophils / J. H Brumell, A. L. Buikhardt, J. B. Bolen et al. // J. Biol. Chem. 1996. -Vol.271,N3.-P. 1455-1461.

268. Endothelial cell determinants of susceptibility to neutrophil-mediated killing / H.S. Murphy, R L. Warner, N. Bakopoulos et al. // Shock. -1999. Vol. 12. -P. 111-117. "

269. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders / D. B. Cines, E. S. Pollak, C. A. Buck et al. //Blood. -1998. Vol. 91. -P. 3527-3561.

270. England, K. Direct oxidative modifications of signalling proteins in mammalian cells and their effects on apoptosis / K. England, T. G. Cotter // Redox Rep. 2005. - Vol. 10, N 5. -P. 237-45.

271. Esterbauer, H Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes / H. Esterbauer, R J. Schaur, H. Zollner // Free Radic Biol Med. -1991. -Vol. 11,N1.-P. 81-128.

272. Evidence for the involvement of cGMP and protein kinase G in nitric oxide-induced apoptosis in the pancreatic (3-cell line, HIT-tl5 / A. C. Loweth, G. T. Williams, J. H B. Scarpello et al. //FEBB Lett. -1997. Vol. 400. -P. 285-288.

273. Excretion of superoxide by phagocytes measured with cytochrome c entrapped in resealed erythrocyte ghosts / D. Roos, C. M. Eckmann, M. Yazdanbakhsh et al. // J. Biol. Chem. -1984.-Vol. 259.-P. 1770-1779.

274. Expression of antioxidant enzymes in human inflammatory cells /P.Pietarinen-Runtti,E. Lakari, K. O. Raivio, V. L. Kinnula / J. Physiol. Cell Physiol.-2000.-Vol. 278, N l.-P. 118-125.

275. Expression, characterization, and tissue distribution of a new cellular selenium-dependent glutatione peroxidase, GSHPx-GI / F. F. Chu, J. H Doroshow, R S. Esworthy // J. Biol. Chem.-1993.-Vol. 268.-P. 2571-2576.

276. Extracellular matrix regulates apoptosis in human neutrophils / R. Kettritz, Y. X. Xu, T. Kerren et al. // Kidney Int -1999. Vol. 55.-P. 562-571.

277. Fenton, H J. R Oxidation of tartaric acid in the presence of iron / R J. HFenton // J. Chem. Soc.-1984.-Vol. 65.-P. 899-910.

278. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: A graded response to membrane stimulation / D. A. Bass, J. W. Parce, L. R Dechatelet et al. // J. Immunol. -1983.-Vol. 130.-P.1910-1917.

279. Forman R J. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers / R J. Forman, J. M. Fukuto, M. Torres //J. Physiol. Cell Physiol.-2004.-Vol. 287.-P. 246-256.

280. Free hydroxyl radicals are formed on reaction between the neutrophilderived species superoxide and hypochlorous acid / L. P. Candeias, K. B. Patel, M. R L. Stratford et al. // FEBS Lett. -1993. Vol. 333. -P. 151-159.

281. Fridovich, I. Superoxide dismutases /1. Fridovich // J. Biol. Chem. -1989. Vol. 264. - P.: 7761-7764.

282. Friebe, A. Regulation of Nitric Oxide-Sensitive Guanylyl Cyclase / A. Friebe, D. Koesling // Circ. Res. -2003. Vol. 93. -P. 96-105.

283. Fuentealba, C. Animal models of copper-associated liver disease / C. Fuentealba, E. M. Aburto//Comparative Hepatology.-2003.-Vol. 2.-P. 1-12.

284. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis/ N. A. Maianski, J. Geissler, S. M. Srinivasula et al. // Cell Death Differ. 2004. - Vol. 11. -P. 143-153. :

285. G-protein activation by interleukin 8 and related cytokines inhuman neutrophils plasma membranes / R W. Kupper, B. De Wald, K. R Jakobs et al. // Biochem. J. -1992. Vol. 19.-P. 429-436.

286. Garrison, W. M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides, and proteins / W. M. Garrison, M. E. Jaiko, W. Bennett // Radial Res. 1962. - Vol. 16. - P. 487-502.

287. Genome-wide comparison of human keratinocyte and squamous cell carcinoma responsestto UVB irradiation: implications for skin and epithelial cancer / J.E. Dazard, H. Gal, N. Amariglio et al. //Oncogene. -2003. Vol. 22. -P. 2993-3006.

288. Ghosh, M. Role of oxidative stress and nitric oxide in regulation of spontaneous tone in aorta of DOCA-salt hypertensive rats / M. Ghosh, H.D. Wang, J.R. McNeill // Br. J. Pharmacol.-2004.-Vol. 141.-P. 562-573.

289. Girotti, A. W. Cellular detoxification of photochemically-generated lipid hydroperoxides (LOOHs) / A. W. Girotti // Free radical Biol, and Med. -1990. Vol. 1. - P.76-84.

290. Glutathione in gingival crevicular fluid and its relation to local antioxidant capacity in periodontal health and disease /1. L. Chappie, C. G. Brock, C. Eftimiadi et al. // J. Biol. Mol. Pathol. -2002. Vol. 55, N 6. -P. 367-373.

291. Glutathione metabolism and its implications for health / G. Wu, Y. Z. Fang, S. Yang et al. //J. Nutr. -2004. Vol. 134, N 3. -P. 489-492.

292. Glutatione peroxidase protects against peroxynitrite-mediated oxidation / H. Sies, V. S. Sharov, L. O. Klotz et al. //J. Biol. Chem. -1997. Vol. 272. -P. 27812-27817.

293. Gordon, D.M. Mechanisms of mitochondrial protein import / D.M. Gordon, A. Dancis, D. Pain // Essays Biochem. 2000. - Vol. 36. -P.61-73.

294. Gottlieb, R.A. Mitochondria: execution central / R.A. Gottlieb // FEBS Lett 2000. - Vol. 482.-P. 6-12.

295. Green, D. R Mitochondria and apoptosis / D. R. Green, J. C. Reed // Science. 1998. -Vol. 281.-P.1309-1312.

296. Gregory, C. D. CD14-dependent clearance of apoptotic cells: Relevance to the immune system/CD. Gregory//Curr. Opin. in Immunol. 2000. - N 12.-P. 27-34.

297. Grune, T. Degradation of oxidized proteins in K562 human hematopoietic cells by proteasome / T. Grune, T. Reinheckel, K. J. A. Davies // J. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. -C. 15504-15509.

298. Guanylyl cyclases and signaling by cGMP / K. A Lucas, G. M. Pitari, S. Kazerounian et al. // Pharmacol Rev. 2000. - Vol. 52, N 3. - P. 375-414.

299. Guardians of cell death: the Bcl-2 family proteins / P. T. Daniel, K. Schulze-OsthofF, C. Belka et al. // Essays Biochem. -2003. Vol. 39. - P. 73-88.

300. H2O2 induces DNA repair in mononuclear cells: Evidence for association with cytosolic Ca2+ fluxes / A. Korzets, A. Chagnac, T. Weinstein et al. // J. Lab. Clin. Med 1999. -Vol. 133.-P 362-369.

301. Haberland, A Modulation of the xanthine oxidase/xanthine dehydrogenase ratio by reaction of maJondialdehyde with NHrgroups / A. Haberland, T. Rootwelt, O.D. Saugstad, I. Schimke // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1994. - Vol. 32, N 4. - P. 267-272.

302. Haddad, J.J. Pharmaco-redox regulation of cytokine-related pathways: from receptor,, signaling to pharmacogenetics / J. J. Haddad // Free Radical Biol. Med. 2002. - Vol. 33.' -P. 907-926.

303. Halliwel, B. The antioxidants of human extracellular fluids / B. Halliwel, M. Vasil., M/ Grootveld//Arch. Biochem. and Biophys.-1990.-Vol. 280.-P. 1-8.

304. Halliwell, B. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview B.Halliwell, J.M. C. Gutteridge//MetodsEnzymol.-1990.-Vol. 186.-P. 1-85.

305. Halliwell, B. Free radicals, antioxidants and human disease where are now? / B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge//J. Lab. Clin. Med. -1992. - Vol. 119. -P. 598-620.

306. Halliwell, B. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? / B. Halliwell, M. Whiteman // British J. of Pharmacology.-2004.-Vol. 142.-P. 231-255.

307. Hampton M.B. Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase, and Bacterial Killing / M. B. Hampton, A J. Kettle, C. C. Winterbourn // Blood. -1998. Vol 92, N9.-P. 3007-3017.

308. Hanafy, K. A. NO, nitrotyrosine, and cyclic GMP in signal transduction / K. A. Hanafy, J. S. Krumenacker, F. Murad//Med Sci Monit -2001. Vol. 7, N 4. -P. 801-819.

309. Hancock, J. T. Superoxide, hydrogen peroxide and nitric oxide as signaling molecules / J. T. Hancock//Br. J. Biomed. Sci. -1997.-Vol. 54.-P. 38-46.

310. Hansen J.M. Compartmentation of Nrf-2 redox control: regulation of cytoplasmic activation by glutathione and DNA binding by thioredoxin-1 / J.M.Hansen, W.H Watson, D.P.Jones//Toxicol. Sci.-2004.-Vol. 82,N l.-P. 308-317.

311. Hausladen, A. Nitrosative stress: activation of the transcription factor QxyR / A.tf'f

312. Hausladen, C. T. Privalle, T. Keng et al. // Cell. -1996. Vol. 86, N 5. - P. 719-729. ;

313. Hayden, M. S. Signaling to NF-kB / M S. Hayden, S. Ghosh // Genes Dev. -2004. Vol." 18.-P. 2195-2224. I1'

314. Hayes, J. D. Glutathione-transferases / J. D. Hayes, J. U. Flanagan, I. R Jowsey // Annu., Rev. Pharmacol. Toxcol. -2005. Vol. 45. - P. 51-88. * ¡&

315. Hejnecke, J. W. Free radical modification of low-density lipoprotein: mechanisms and biological consequences / J. W. Hejnecke // Free Rad. Biol. Med. -1987. Vol. 3, N. 1. -P. 65-73.

316. Heinecke, J.W. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase hydrogen peroxide system of human neutrophils and macrophages / J. W. Heinecke, W. Li, H. L. Daehnke // J. Biol. Chem. -1993. Vol. 268. - P. 4069.

317. Hellman, N. E. Ceruloplasmin metabolism and function / N. E Hellman, J. D. Gitlin // Annu Rev Nutr. -2002. Vol. 22. -P. 439-458.

318. Heparin-binding protein targeted to mitochondrial compartments protects endothelial cells from apoptosis / A. M. Olofsson, M Vestberg, H Herwald et al. // J. Clin. Invest 1999. -Vol. 104.-P. 885-894.

319. Hirayama, K. Effect of oxidative stress on interoigan metabolism of glutatione / K. Hirayama, A. Yasutake, M. Inoue // Medical, Biochemical and Chemical Aspects of Free Radical. Amsterdam: Elsevier. -1989. - P. 559-562.

320. Hofmann, F. Rising behind NO: cGMP-dependent protein kinases / F. Hofmann, A. Ammendola, J. Schlossmann//!. Cell Sei.-2000.- Vol. 113.-P. 1671-1676.

321. Holmgren, A. Thioredoxin and Glutaredoxin Systems / A. Holmgren // J. Biol. Chem. -1989.-Vol. 264.-N 24.-P. 13963-13966.

322. Human lung mononuclear cell induce nitric oxide synthase in murine airway epithelial cells in vitro: Role of TNF-alpha and IL-1 beta / RA. Robbins, J.H Sisson, D.R Springall etal. //Annex. J. Respirat. Crit. Care Med. -1997. Vol. 155, N l.-P. 268-273.

323. Hurst, J. K. Myeloperoxidase: active site structure and catalytic mechanisms / J. K. Hurst // Peroxidases in Chemistry and Biology // in J. Everse, K. E. Everse, M. B. Grisham (eds). -Boca Raton: FL. CRC. -1991. 37 p.

324. Hydrogen peroxide as a potent bacteriostatic antibiotic: Implications for host defense / P. A. Hyslop, D. B. Hinshaw, I. U. Scraufstatter et al. // Free Radic. Biol. Med. 1995.-Vol. 19.-P.3147.

325. Hydrogen peroxide modulates meiotic cell cycle and induces morphological features characteristic of apoptosis in rat oocytes cultured in vitro / S. K. Chaube, P. V. Prasad, < S. C. Thakur et al. / Apoptosis. -2005. Vol. 10, N 4. - P. 863-874. "

326. Hydroxylation of salicylate by activated neutrophils / W. B. Davis, B. S. Mohammed, D. C. Mays etal. //BiochemPharmacol.- 1989.-Vol. 38.-P.4013-4019.

327. Identification by redox proteomics of glutathionylated proteins in oxidatively stressed human T lymphocytes / M. Fratelli, H Demol, M. Puype et al. // Proc Natl Acad Sei U S A-2002.-Vol.99.-P. 3505-3510.

328. Importance of various antioxidant enzymes for cellstability. Confrontation between theoretical and experimental data / J. Remade, D. Lambert, M. Raes et al. // Biochem. J. -1992.-Vol. 286.-P. 4246.

329. Increasing intracellular cAMP and cGMP inhibits cadmium-induced oxidative stress in rat submandibular saliva / M. Abdollahi, A. Bahreini-Moghadam, B. Emami et al. // Comp. Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2003. - Vol. 135. -N 3. - P. 331-336.

330. Induction of MnSOD in human monocytes without inflammatory cytokine production by a mutant endotoxin / L. J. Tian, E. White, H. Y. Lin et al. // J. Physiol. Cell Physiol. -1998. Vol. 275. - P. 740-747.

331. Inhibition of human surfactant protein a function by oxidation intermediates of nitrite/ A C. Davis, S. Zhu, J. B. Sampson et al. // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol. 33. - P. 1703-1713.

332. Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: A critical steps in Fas signaling / B. Beltran, M Quintero, E. Garcia-Zaragoza et al. // Proc Natl Acad Sci USA. -2002.-Vol. 99.-P. 8892-8897.

333. Interleukin-8 delays spontaneous and tumor necrosis factor-a-mediated apoptosis of human neutrophils / R Kettritz, M. L. Gaido, H. Haller et al. // Kidney Int. -1998. Vol.53.-P. 84-91.

334. Involvement of reactive oxygen intermediates in spontaneous and CD95 (Fas/APO-l)-I mediated apoptosis of neutrophils / Y. Kasahara, I. Kazuyuki, A. Yachie et al. // Blood. -1997. Vol. 89. -P. 1748-1753. V

335. Jacob, C. The sulfinic acid switch in proteins / C. Jacob, A. L. Holme, F. H. Fry // Org. Biomol. Chem. 2004. - Vol. 2, N14. - P. 1953-1956.

336. Jore, D. Vitamin E and correlated antioxidants: A y-radiolysis study / D.Jore, MN. Kaouadji, C. Ferradini // Antioxidants in Therapy and Preventive Medicine. New-York: Plenum Press, 1990.-P. 151-154.

337. Kerr, J. F. R Apoptosis: a basic biological phemomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics/ J. F. R Kerr, A. H. Wyllie, A. R Curne //Br. J. Cancer. 1972. - Vol. 26, N2.-P. 239-257.

338. Kettle, A. J. Myeloperoxidase: Akey regulator of neutrophil oxidant production. / A J. Kettle, С. C. Winterboum//Redox Rep.-1997.-Vol. 3.-P. 3-11.

339. Khan, S. A. The role of nitric oxide in the physiological regulation of Ca cycling / S. A Khan, J. M. Hare // Curr Opin Drug Discov Devel. -2003. Vol. 6, N 5. - P. 658-666.

340. Kiley, P. J. Exploiting thiol modifications / P. J. Kiley, G. Storz // PLoS Biol. 2004. -Vol. 2,N11.-P. 400-411. ?

341. Kim,S.O. OxyR: a molecular code for redox-related signaling / S. O. Kim, K Merchant,' R. Nudelman et al. // Cell. -2002. Vol. 109,№3.-P. 383-396.

342. Kim, Y. C. Thioredoxindependent redox regulation of the antioxidant responsive element (ARE) in electrophile response // Y.C. Kim, Y. Yamaguchi, N. Kondo et al. // Oncogene. -2003.-Vol. 22, N12.-P. 1860-1865.

343. Klebanoff, S. J. Oxygen metabolites from phagocytes / S. J. Klebanoff // Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. -New-York: Raven Press. -1992. -P. 541-588.

344. Klebanoff, S.J. Role of the superoxide anion in the myeloperoxidase-mediated antimicrobial system/ S. J. Klebanoff//J. Biol. Chem. -1974. Vol. 249. -P. 3724.

345. Klomp, L. W. Expression of the cemloplasmin gene in the human retina and brain: implications for a pathogenic model in aceruloplasminemia / L. W. Klomp, J. D. Gitlin // Hum Mol. Genet -1996. Vol. 5. -N12. -P. 1989-1996.

346. Kojma, S. Low dose j-rays actrate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / SXojma, K. H. Nadayama, H Ishida // J. Radiat Res. 2004. - Vol. 45.-P. 33-39.

347. Kowaltowski, A.J. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress / A. J. Kowaltowski, R. F. Castilho, A. E. Vercesi // FEBS Lett 2001. - Vol. 495. - P. 12-15. '

348. Krammer, P. H. CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis: Live and let die / P. H Krammer // Adv. Immunol. -1999. Vol. 71. - P. 163-210.

349. Laemmli, U. K, Clevage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4 / U. K Laemmli //Nature. -1970. Vol. 227. -P. 680-685.

350. Lanick, J. W. Cytotoxic mechanism of tumor necrosis factor-a / J. W. Lanick, S. C. Wright//FASEB J. -1990. Vol. 4. -P. 3215-3223.

351. Lee, S-L. Superoxide as an intermediate signal for serotonin-induced mitogenesis // S-L. Lee, W.W. Wang, B.L. Fanburg // Free Rad. Biol. Med. -1998. Vol.24, N 5. - P. 855858.

352. Lefer, A. M. Endothelial dysfunction in myocardial ischemia and reperfusion: role of oxygen-derived radicals /AM Lefer, D. J. Lefer // Basic Res. Cardiol. -1991. Vol. 86. -P. 109-116.

353. Leff, J. A. Serum antioxidants as predictors of adult respiratory distress syndrome in patients with sepsis /J. A LefF//Lancet-1993.-Vol. 341.-P. 1731-1737.

354. Leichert, L. I. Protein thiol modifications visualized in vivo / L. I. Leichert, U. Jakob //

355. PLoS Biol. -2004. Vol. 2, N11. -P. 333-340.i i

356. Line, E. M. Why is H2Q2 cytotoxicity pH dependent? / E. M. Line // Free raricals, methodology and concepts. London: Richelieu Press. -1988. - P. 539-550.

357. Lindley, P. F. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity/P. F. Lindley// J. Biol. Chem. -1997. Vol. 2. -P. 454-463.

358. Liu, L. Ametabolic enzyme for S-nitrosothiol conserved from bacteria to humans / L. Liu, A. Hausladen, M. Zeng // Nature. 2001. - V. 410. - P.490-494. „

359. Lonidamine triggers apoptosis via a direct, Bcl-2-inhibited effect on the mitochondrial-permeability transition pore / L.Ravagnan, LMarzo, P. Costantini etal.//Oncogene:-1999. Vol. 18. -P. 2537-2546.

360. Lovaas, E. Free radical generation coupled thiol oxidation by lac^peroxidase/SCN7H202,4

361. E. Lovaas //Free Radical Biol, and Med -1992. Vol. 13. -P. 187-195.

362. Lung surfactant suppresses oxygen-dependent bactericidal functions of human blood monocytes by inhibiting the assembly of the NADPH oxydase / M. F. Geertsma, H. R. Broos, M. T. Van den Barselaar et al. //J. Immunol. -1993. Vol. 150. -P. 2391-2400.

363. Maianski, N.A. Tumor necrosis factor a induces a caspase-independent pathway in human neutrophils /N. A. Maianski, D. Roos, T. W. Kuijpers // Blood. 2003. - Vol. 101. -P. 1987-1995.

364. Maltsev, G. Antioxidant index of erythrocytes in therapeutic nutrition monitoring / G. Maltsev, A V. Vasilev//Vopr. Pitan. -1999. Vol. 68, N2. -P. 41-43.

365. Mannick, J. B. Fas-induced caspase denitrosylation / J. B. Mannick, A. Hausladen, L. Liu // Science. -1999. Vol. 284. -P.651-654.

366. Marginal copperrestricted diets produce altered cardiac ultrastructure in the rat / R. E.

367. Wildman, R Hopkins, M. L. Failla et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1995. Vol. 210, N 1.-P.43 - 49.

368. Markers of protein oxidation by hydroxy! radical and reactive nitrogen species in tissues of aging rats / C. Leeuwenburgh, PA Hansen, A Shaish et al. // Am. J. Physiol. 1998. -V. 274, N 2, Pt 2. -P. R453-461. ;

369. Marklund, S. L. Caeruloplasmin, extracellular superoxide dismutase, and scavenging of superoxide anion radicals / S. L. Marklund // Free Radical Biol, and Med -1987. Vol. 2. -P. 255-261.

370. Marquez, L. A. Kinetics of oxidation of tyrosine and dityrosine by myeloperoxidase compounds I and II / L. A. Marquez, H. B. Dunford // J. Biol. Chem. -1996. Vol. 270. -P. 30434-30441.

371. Maruyama, Y. Inflammation and oxidative stress in ESRD the role of myeloperoxidase/ Y. Maruyama, B. Lindholm, J. Stenvinkel //Nephrol. - 2004. - Vol. 17, N 8. -P. 72-76.

372. Mass spectroscopic characterization of protein modification by malondialdehyde // T. Isshii, S. Kumazawa, T. Sakurai et al. // Chem. Res. Toxicol. 2006. - Vol. 19, N1. - P. 122-129.

373. Mates, J. M. Role of reactive oxygen species in apoptosis: Implications for cancer therapy / J. M. Mates, F. M. Sanchez-Jimenez //Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. - Vol. 32. - P., 157-170. ' '

374. Matsunaga, T. Modulation of reactive oxygen species in endothelial cells by peroxynitrite-treated lipoproteins / T. Matsunaga, T. Nakajima // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 130. - P. 285-283-1744.

375. McDonald, R J. Alveolar macrophage antioxidants prevent hydrogen peroxide-mediated lung damage / R J. McDonald, E. M. Berger, J. E. Repine // Am. Rev. Respir. Dis. -1991. -Vol. 143.-P. 1088-1091.

376. Mcl-1 expression in human neutrophils: Regulation by cytokines and correlation with cell survival / D. A. Moulding, J. A. Quayle, C. A Hart et al. // Blood -1998. Vol. 92. -P. 2495-2502.

377. MCLP-dependent chemiluminescence suggests that singlet oxygen plays a pivotal role in myeloperoxidase-catalysed bactericidal action in neutrophil phagosomes / F. Arisawa, H TatzusaraY.Kambayashietal.//Luminescence.-2003.-Vol. 18.-P. 229-238.

378. Mechanism of platelet inhibition by nitric oxide: in vivo phosphorylation of thromboxane receptorby cyclic GMP-dependent protein kinase / Wang G. R, Zhu Y., Halushka P. V. et al. /Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. Vol. 95, N 9. -P. 4888-4893.

379. Melley, D. D. Redox regulation of neutrophil apoptosis and the systemic inflammatory response syndrome / D. D. Melley, T. W. Evans, G. J. Quinlan // Clinical Science. 2005. -Vol. 108.-P. 413-424.

380. Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage / R Levine, B. Barlett, J. Moskovitz et al. //Mech. Ageing. Dev. -1999. Vol. 107, N 3. -P. 323-332. ~

381. Methionine sulfoxide reductase A protects neuronal cells against brief hypoxia/reoxygenation. / O. Yermolaieva, R Xu, C. Schinstock et al. // Proct Natl. Acad. Sci.USA.-2003.-Vol. 101, N 5.-P1159-1164.

382. Michiels, C. Use of the inhibition of ensimatic antioxidant systems in order to evaluatet >their physiological importance / C. Michiels, J. Remade // Eur. J. Biochem. -1988.—Vol. 177.-P. 435-441.

383. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human" polymorphonuclear leukocytes / B.RBurchill, J.MOliver, C.B.Pearson etal. // J.of Cell Biology. -1978. Vol. 76,N2.-P. 439-447.

384. Miller, R A. Protease-cleaved iron-transferrin augments oxidant-mediated endotelian cell injury via hydroxyl radical formation / R A. Miller, B. E. Britigan // J. Clin. Invest -1995. -Vol. 6.-P. 2491-2500.

385. Mitochondria in Ca2+ signaling and apoptosis / S. S. Smaili, Y. T. Hsu, R J. Youle et al. // J. Bioenerg. Biomembr. -2000. Vol. 32. - P. 35-46.

386. Moncada, S. Does nitric oxide modulate mitochondrial energy generation and apoptosis? / S. Moncada // Nat Rev Mol Cell Biol. -2002.-N3.-P. 214-220.

387. Mongkolsuk, S. Regulation of inducible peroxide stress responses / S. Mongkolsuk, J. D. Helmann // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 45, N1. - P. 9-15.

388. Nakagawara, A. Hydrogen peroxide metabolism in human monocytes during -differentiation in vitro / A. Nakagawara, C. F. Nathan, Z. A. Cohn // J. Clin. Invest -1981.-Vol. 68.-P. 1243-1252.

389. Nakamura H. Thioredoxin as a Key Molecule in Redox Signaling / H. Nakamura //

390. Antioxidants and Redox Signaling. 2004. - Vol. 6. - P. 15-17.j. v

391. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunites / C. Nathan //1.munol. -2006. Vol. 6. -P. 173-182.

392. Nathan, C. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls / C. Nathan, Q. Xie // Cell. -1994,-Vol. 78.-P. 915-923.

393. Neutrophils and respiratory tract DNA damage and mutagenesis: review / A. M Knaapen, N. Gundor, R. P. Schinsetal.//Mutagenesis.-2006.-Vol. 21.-P. 225-236.

394. Nitric Oxide as a Unique Bioactive Signaling Messenger in Physiology and Pathophysiology / N. Tuteja, M. Chandra, R Tuteja et al. // J. Biomed Biotechnol. 2004. -N4.-P. 227-237.

395. Nitric oxide as apro-apoptotic as well as anti-apoptotic modulator / B.-M. Choi, H.-0. Pae, * S. I. Jang et al. // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2002. - Vol. 35, N1. —» P.l 16-126. 4

396. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition/ S.¿ Hortelano,B. Dallopoita,N. Zamzami//FEBS Letters.-1997.- Vol. 410.-P. 373:377.41

397. Nitric oxide inhibits lipopolysaccharide-induced apoptosis in pulmonary artery endothelial cells / G. D. Ceneviva, E. Tzeng, D. G. Hoyt et al. // Am. J. Physiol. -1998. Vol. 19. - P. L717-L728.

398. Nitric oxide inhibits tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by reducing the generation of ceramide / C. De Nadai, P. Sestili, O. Cantoni et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA-2000.-Vol. 97.—P. 5480-5485.

399. Nitric oxide signaling: systems integration of oxygen balance in defense of cell integrity / L. Gong, G. M Pitari, S. Schulz et al. // Curr Opin Hematol. 2004. - № 11. - P. 7-14.

400. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome c release / Y. M Kim, T. H. Kim, D. W. Seol et al. // J. Biological Chem. -1998. Vol. 273. -P. 31437-31441.

401. Nîu, X.-F. A balance between nitric oxide and oxidants regulates mast cell-dependent neutrophil-endothelial cell interactions /X.-F. Niu, G. Ibbotson, P.Kubes //Circulation Research. -1996. Vol. 79. -P. 992-999.

402. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps / T. A. Fuchs, U. Abed, C. Goosmann et al. //J. Cell Biol. -2007. Vol. 176, N2. -P. 231-241.

403. Olivares, M Copper as an essential nutrient / M. Olivares, R Uauiy // Am. J. Clin. Nutr. -1996.-Vol. 63, N 5.-P. 791-796.

404. Oxidative damage to neutrophils in glutathione synthetase deficiency / S. P. Spielberg, L. A. Boxer, J. M Oliver et al //Br. J. Haematol -1979. Vol. 42. -P. 215-223. f1

405. Oxidative stress in mouse plasma and lungs induced by cigarette smoke and lipopolysaccharide / S. S. Valenca, F. Silva Bezerra, A. A. Lopes et al. // Environ. Res. -2008.-Vol. 108, N2.-P. 199-204.

406. Oxidative stress-induced phospholipase c-gamma activation enhances cell survival / X. T. Wang, K. D. McCullough, X G. Wang et al. // J. Biol Chem. 2001. - Vol 276, N 30. -P. 28364-28371.

407. Peachman, K.K. Mitochondria in eosinophils: function role in apoptosis but not respiration / K. K. Peachman, D. S. Lyles, D. A. Baas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2001.-Vol. 98.-P. 1717-1722. ;

408. Peake, J. Neutrophil activation, antioxidant supplements and exercise-induced oxidative stress / J. Peake,K. Suzuki//Exerc. Immunol. Rev.-2004.-Vol. 10.-P. 129-141.

409. Peers, C. Acute oxygen sensing: Diverse but convergent mechanisms in airway and arterial chemoreceptors / C. Peers, P. J. Kemp //Respir Res. 2001. - Vol. 2. - P.145-149.

410. Peroxiredoxin 6 fails to limit phospholipid peroxidation in lung from Cftr-knockout mice t subjected to oxidative challenge / S. Trudel, M Kelly, J. Fritsch et al. // PLoS One. 2009. - V. 4, N 6.—P. e6075.

411. Phagocyte-derived free radicals stimulated by ingestion of ironrich Staphylococcus aureus: Aspin-trapping study / M. S. Cohen, B. E. Britigan, Y. S. Chai et al. // J. Infect Dis. -1991. -Vol. 163.-819-826.v

412. Phosphorylation of NF-kB and IkB proteins: implications in cancer and inflammation / P. ' Viatour, MP. Merville, VBours et al. //Trends Biochem. Sci. -2005. Vol.30. -P.43-52.

413. Pierce, G. B. Hydrogen peroxide as a mediator of programmed cell death in the blastocyst / G. B. Pierce, R E. Parchment, A. L. Lewellyn // Differentiation. -1991. Vol. 46. - P. 181-186.

414. Pieri, C. Melatonin regulates the respiratory burst of neutrophils and their depolarization / -C. Pieri, R Recchioni, F. Moroni //J. of Pineal Res. -1998. Vol. 24. -P. 43-49.

415. Pigeolet, E. Susceptibiliti of glutathione peroxidase to proteolysis after oxidative alteration by peroxides and hydroxyl radicals / E. Pigeolet, J. Remade // Free Radic. Biol. Med. -1991.-Vol. 11, N2.-P. 191-195.

416. Poole, L. P. Protein sulfenic acids in redox signaling / L. P. Poole, P. A. Karplus, A. Claiborne // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. - Vol. 44. - P. 325 -347.

417. Poot, M. Oxidans and antioxidans in proliferative senescence / M Poot // Mutat Res. -1991. Vol. 256. - P. 177-189.

418. Possible involvement of free radical scavenging properties in the action of tumor necrosis factor-a / N. Matsubara, M. Hiramatsu, R Edamatsu et al. // Free Radic. Biol. Med.*-1997.-Vol. 22.-P. 679-687.

419. Possible role of bacterial siderophores in inflammation-Iron bound to the pseudomonas siderophore pyochelin can function as ; a hydroxy 1 radical catalyst/T. J. Coffman,C.D. Cox, B. L. Edeker et al. / J. Clin. Invest -1990. Vol. 86. -P. 1030-1038.

420. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked / J. Yang, X. Liu, K. Bhalla et al. // Science. -2003. Vol. 275. -P. 1129-1132.

421. Properties of the permeability transition pore in mitochondria devoid of Cyclophilin D // E. Basso, L. Fante, J. Fowlkes et al. / J Biol Chem. -2005. Vol. 280. - P. 18558-18561., '

422. Protection of phagocytic leukocytes by endogenous glutathione: studies in a family with glutathione reductase deficiency / D. Roos, R S. Weening, A. A. Voetman et al. / Blood. -1979,-Vol. 53.-P. 851-866.

423. Protective effect of docosahexaenoic acid against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human lymphocytes / S. Bechoua. M. Dubois, Z. Dominguez et al. // Biochem-Phaimacol.-1999.-Vol. 57,N9.-P.1021-1030.

424. Protein disulfide bond formation in the cytoplasm during oxidative stress / RC. Cumming, N. L. Andon, P. A. Haynes et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, N 21. -P. 21749-21758.

425. Protein interactions with nitric oxide synthases: controlling the right time, the right place, and the right amount of nitric oxide / B. C. Kone, T. Kuncewicz, W. Zhang et al. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. -2003. Vol. 285. -P. F178-F190.

426. Radiation induced generation of chlorine derivatives in N20-saturated phosphate buffered saline: Toxic effects on Escherichia coli cells / G. Czapski, S. Goldstein, N. Andom et al. // Free Radic. Biol. Med. -1992. Vol. 12. -P. 353-361.

427. Raes, M. Comparative study of the enzymatic defence systems against oxygen-derived free radicals: the key role of the glutathione peroxidase / M Raes, C. Michiels, J. Remade //Free Radic. Biol, and Med.-1987.-Vol. 3.-P. 3-7.

428. Rahman, I. Oxidative stress in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease: cellular and molecular mechanisms /1. Rahman // Cell Biochem. Biophys. 2005. -Vol. 43,Nl.-P. 167-188.

429. Reactive oxygen and nitrogen species in inflammatory process / R. Rutkowski, S. A. Pancewicz, IC Rutkowski, J. Rutkowska // Pol. Merkur. Lekarski. 2007. - V. 23, N134. -P. 131-136.

430. Reactive oxygen species and nitric oxide mediate plasticity of neuronal calcium signaling / O. Yermolaieva, N. Brot, H. Weissbach et al. // Proct Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -Vol. 97.-P 448-453.

431. Reactive oxygen species and antioxidants in apoptosis of esophageal cancer cells induced by AS2O3 / Z.-Y. Shen, W.-Y. Shen, M.-H. Chen et al. // International Journal of Molecular Medicine.-2003.-Vol. ll.-P.479484.

432. Red blood cells inhibit apoptosis of human neutrophils / K Aoshiba, Y. Nakajima, S. Yasui et al. //Blood. -1999. Vol. 93, N11. -P. 4006-4010.

433. Redox regulation of human thioredoxin network / Kondo N., Nakamura R, Masutani H., Yodoi J. // Antioxid. Redox. Signal.-2006.-Vol. 8,N9-10.-P. 1881-1890.

434. Redox Potential of Human Thioredoxin 1 and Identification of a Second Dithiol/Disulfide Motif / W. H. Watson, J. Pohl, W. R. Montfort et al. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N35.-P. 33408-33415.

435. Redox regulation of surface protein thiols: Identification of integrin -4 as a molecular target by using redox proteomics / T. Laragione, V. Bonetto, F. Casoni et al. // PNAS. 2003. -Vol. 100, N25.-P. 14737-14741.

436. Redox-regulated signaling by lactosylceramide in the proliferation of human aortic smooth muscle cells /A, K. Bhunia, H. Han, A. Snowden, S. Chattegee // J. Biol. Chem. -1997. -Vol.272,N.25.-P. 15642-15649.

437. Regulation of Fas antibody induced neutrophil apoptosis is both caspase and mitochondrial dependent / R W. Watson, A. O'Neill, A. E. Brannigen et al. // Febs Lett. -1999. Vol. 453.-P. 67-71.

438. Regulation of macrophage phagocytosis of apoptotic cells by cAMP / A. G. Rossi, J. C. Mc Cutcheon,N. Roy etal.// The Jour, oflmmunol.-1998.-Vol. 160.-P. 3562-3568. *

439. Regulation of manganese superoxide dismutase and other antioxidant genes in normal and leukemic hematopoietic cells and their relationship to cytotoxicity by TNF / M. Kizaki, A Sakashita, A Karmakar etal.//Blood.- 1993.-Vol. 82.-P. 1142-1150.

440. Regulation of neutrophil apoptosis / S. W. Edwards, D. A. Moulding, M. Derouet et al. // Chem Immunol Allergy. -2003. Vol. 83. -P.204-224.

441. Remick, D. G. Regulation of cytokine gene expression by reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates / D. G. Remick, L. Villarete // J. Leucocyte Biol. -1996. Vol. 59. -P. 471-475.

442. Renin-Angiotensin System Modulates Oxidative Stress-Induced Endothelial Cell Apoptosis in Rats / M. Akishita, K. Nagai, H Xi et al. // Hypertension. 2005. - Vol. 45. -P. 1188-1194.

443. Reth, M. Hydrogen peroxide as second messenger in lymphocyte activation / M Reth // Nat Immunol. 2002. - Vol. 3, N. 12.-P. 1129-1134.

444. Revisiting the kinetics of nitric oxide (NO) binding to soluble guanylate cyclase: the simple NO-binding model is incorrect / D. P. Ballou, Y. Zhao, P. E. Brandish et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA-2002.-Vol. 99.-P. 12097-12101.

445. Robinson, J. M The NADPH oxidase complex of phagocytic leukocytes: a biochemical and cytochemical view / J. M. Robinson, J. A. Badwey // Histochem. Cell. Biol. -1995.— Vol. 103.-P. 163-180.

446. Role for IgE in airway secretions: IgE immune complexes are more potent inducers than1. Jrantigen alone of airway inflammation in a murine model /RI. Zuberi, J. R Apgar, S. S. Chen et al. //J. Immunol. -2000. Vol. 164. -R 2667-2673.

447. Role for tyrosine phosphorylation and Lyn tyrosine kinase in Fas receptor-mediated apoptosis in eosinophils /H. U.Simon, S.Yousefi, B.Dibbert etal. // Blood.-1998.-Vol. 92.-P. 547-557.i

448. Role of cAMP-dependent pathway in eosenophil apoptosis and survival / H. S. Chang, K. W. Jeon, Y. H. Kim et al. // Cell. Immunol. -2000. Vol. 103. -P. 29-38.

449. Role of cytokines, tyrosine kinase, and protein kinase C on production of superoxide and induction of scavenging enzymes in human leukocytes / Y. Niwa, Y. Ozaki, T. Kanoh et al. // Clin. Immunol. Immunopathol. -1996. Vol. 79. -P. 303-313.

450. Role of Glutaredoxin in Metabolic Oxidative Stress. Glutaredoxin as a sensor of Oxidative Stress mediated H2O2 / J. J. Song, J. G. Rhee, M. Suntharalingam et al. // J. Biol. Chem/-2002. Vol. 277, N 48. -P. 46566-46575.

451. Role of neutrophil elastase in ozone-induced airway responses in guinea-pigs / K. Matsumoto, H. Aizawa, H. Inoue et al. // Eur. Respir. J. -1999. Vol. 14, N 5. - P. 10881094.

452. Rosen, G. M. Free radicals and phagocytic cells / G. M. Rosen, S. Pou, C. L. Ramos // FASEB J. -1995. Vol. 9. -P. 200-211.

453. Sahaf, B. Lymphocyte surface thiol levels / B. Sahaf, K. Heydari, L. A. Herzenberg'// PNAS-2003.-Vol. 100, N7.-P. 4001-4005.

454. Sandstrom, P. A. Autocrine production of exracellular catalase prevents apoptosis of the human CEM T-cell line in serum-free medium / P. A. Sandstrom, T. M Buttke // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. Vol. 90. -P. 4708-4712.

455. Sandstrom, P.A. Inhibition of activation-induced death in T-cell hydridomas by thiol antioxidants: Oxidative stress as a mediator of apoptosis / P. A. Sandstrom, M D. Mannie, T. M Buttke //J. Leukoc. Biol. -1994. Vol. 55, N 2. -P. 221-226.

456. Savill, J. Apoptosis. Phagocytic docking without shoking / J. Savill // Nature. 1998. -Vol. 392.-P. 442-443.

457. Scheel-Toellner, D. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling / D. Scheel-Toellner, K. Wang, R Craddock et al. // Blood. 2004. -Vol. 104, N 8. -P. 2557-2564.

458. Schmidt, H. W. NO at work. / H. W. Schmidt, U. Walter // Cell. 1994. - Vol. 78. - P. 919-928.

459. Schreck, R. Nuclear factor kB: an oxidative stress-responsive transcription factor of eukaiyotic cell (a review) / R. Schreck, PC Albermann, P. A. Baeuerle // Free Radic. Res. Commun.-1992.-Vol. 17,N4.-P. 221-237.

460. Segelmark, M. Binding and inhibition of myeloperoxidase (MPO): a major function of ceruloplasmin? / M. Segelmaik, B. Persson, T. Hellmark et al. // J. Clin. Exp. Immunol. -1997.-Vol. 108.-P. 167-174.

461. Serum proteins modified by neutrophil-derived oxidants as mediators of neutrophil stimulation / G. F. Koimoczi, U. M. Wolfel, A. R. Rosenkranz et al. // J. Immunol. 2001. -Vol. 167,N1.-P. 451-460.

462. Sethi, S. Inhibition of phagocyte-endothelium interactions by oxidized fatty acids: A natural anti inflammatory mechanism / S.Sethi, A. Y.Eastman, J.W.Eaton // J. Lab. Clin.Med.-1996.-Vol. 128.-P. 536-546.

463. Shacter, E. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by western blot immunoassay / E. Shacter, J. A. Williams, M. Lim, R. L. Levine//Free Radic. Biol. Med. -1994. Vol. 17. -P. 429-437.

464. Shen Chada, Q. S. Regulation of the human cellular glutathione peroxidase gene during in vitro myeloid and monocytic differentiation / Q. S. Shen Chada, C. Whitney and P. E. Newburger//Blood.- 1994,-Vol. 84.-P. 3902-3908.

465. Shen, Y. H. Nitric oxide induces and inhibits apoptosis through different pathways / Y. IL Shen, X. L. Wang, D. E. Wilcken//FEBS Letters. -1998. Vol. 433. -P. 125-131.

466. Siems, W. Changes in the glutathione system of erythrocytes due to enhanced formation of oxygen free radicals during short-term whole body cold stimulus / W. Siems, R. Brenke // Arctic Med. Res.- 1992.-Vol. 51.-P. 3-9.

467. Simon, H.-U. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction / H-U. Simon, A. Haj-Yehia, F. Levi-Schaffer//Apoptosis. -2000. -N 5. -P.415-418.

468. Soderdahl, T. Visualization of the compartmentalization of glutathione and protein-glutathione mixed disulfides in cultured cells / T. Soderdahl, M. Enoksson, M. Lundberg et al.//.TheFaseb J.-2003.-Vol. 17.-Pjl24-126.

469. Speier, C. Changes in superoxide dismutase, catalase, and the glutathione cycle during induced myeloid differentiation / C. Speier and P.E. Newburger // Arch. Biochem. Biophys.-1986.-Vol. 251.-P. 551-557.

470. Spin trapping evidence for myeloperoxidase-dependent hydroxyl radical formation by human neutrophils and monocytes // C. L. Ramos, S. Pou, B. E. Britigan et al. // J. Biol. Chem. -1992. Vol. 267. -P. 8307-8312.

471. Splettstoesser, W.D. Oxidative stress in phagocytes «the enemy within» / W.D. Splettstoesser, P. Schuff-Wemer // Micros. Res. Tech. - 2002. - Vol.57, N 6. - P. 441-455.

472. Spolarics, Z. Role of glutathione and catalase in H2O2 detoxification in LPS-activated hepatic endothelial and Kupffer cells / Z. Spolarics, J.-X. Wu // J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. -1997. Vol. 273. -P. 1304-1311.

473. Stadtman, E R Protein oxidation / E. R Stadtman, R L. Levine // Ann N. Y. Acad. Sci. -2000.-Vol. 899.-P. 191 -208.

474. Stadtman, E.R Protein oxidation and aging / E.R Stadtman // Free Radic Res. 2006. -V.40,N 12.-P. 1250-1258.

475. Stamler, J. S. Nitrosylation. The prototypic redox-based signaling mechanism / J. S. Stamler, S. Lamas, F. C. Fang//Cell.-2001.-Vol. 106.-P. 675-683.

476. Stefek,M Pyridoindole stobadine is a potent scavenger of hydroxyl radicals / M. Stefek, L. Benes//FEBS Lett -1991.-Vol. 294.-P. 264-266.

477. Steinbeck, M. J. Intracellular singlet oxygen generation by phagocytosing neutrophils in response to particles coated with a chemical trap / M. J. Steinbeck, A.U. Khan, M.J. Kamovsky//J. Biol. Chem. -1992. Vol. 267; -P. 13425-13432.

478. Stoiz, G. Transcriptional regulator of oxidative stress inducible genes: direct activation by oxidation / G. Storz, L. Tartaglia, B. Ames // Science. -1990. - Vol. 248. - P. 189-194.

479. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins / Z. A. Wood, E. Schroder, R. J Harris, L. B. Poole // Trends Biochem Sci. -2003. Vol. 28, N1. - P. 32-40.

480. Superoxide generation by the human polymorphonuclear leukocyte in response to latex beads / M. J. Thomas, C. C. Hedrick, S. Smith et al. // J. Leukocyte Biol. -1992. Vol. 51. -P. 591-599.

481. Suzuki, Y. J. Ingibition of Ca -ATPase of vascular smoot mascle sarcoplasmic reticulum by reactive oxygen intermediates / Y. J. Suzuki, G. D. Ford // Amer. J. Phisiol. -1991. -Vol. 261.-P. 568-574.

482. Swallow, A. J. Effect of ionizing radiation on proteins, RCO groups, peptide bond cleavage, inactivation, -SH oxidation / A. J. Swallow // Radiation Chemistry of Organic Compounds. -1960.-P. 211-224.

483. Synergy between sulforaphane and selenium in the induction of thioredoxin reductase 1 requires both transcriptional and translation^ modulation / J.Zhang, V.Svehlikova,Y. Bao et al. // Carcinogenesis. -2003. Vol. 24, N 3. -P. 497-503.

484. Tamura, T. A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: purification, properties, and thioredoxin reductase activity / T. Tamura, T. C. Stadtman IfTProc. Natl. Acad. Sci. USA -1996.-Vol. 93.-P. 1006-1011.

485. Tauber, A. I. Evidence for hydroxyl radical production by human neutrophils / A. I. • Tauber, B. M. Babior/J. Clin. Invest -1977.-Vol. 60.-P. 374-380.

486. Taurine chloramines, a product of activated netrophils, inhibits in vitro the genetation of nitric oxide and other macrofage inflammatory mediators / J. Marcinkiewiez, A Grabowska, J. Bereta et al. // J. Leukocyte Biol. -1995. Vol. 58. - P. 667-674.

487. Terada, L. S. Specificity in reactive oxidant signaling: think globally, act locally / L. S. Terada//J. Cell Biol.-2006.-Vol. 174,N5.-P. 615-623.

488. Thannickal, V.J. Reactive oxygen species in cell signaling / V.J.Thannickal, B.L. Fanburg//J. Physiol.-2000.-Vol. 279.-P. 1005-1028.

489. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survivalor death / B. Beltran, A. Mathur, M.R Duchen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -Vol. 97.-P. 14602-14607.

490. The inherent cellular level of reactive oxygen species: One of the mechanisms detemiining apoptotic susceptibility of leukemic cells to arsenic trioxide / J. Yi, F. Gao, G. Shi et al. // Apoptosis. 2002.-Vol. 7, N. 3.-P. 209-215.

491. The involvement of thioredoxin and thioredoxin binding protein-2 on cellular proliferation and aging process / Yoshida T., Nakamura H., Masutani H., Yodoi J. // Ann. N. Y. Acad. Sci.-2005.-Vol. 1055.-P. 1-12.

492. The localization of catalase in the pulmonary alveolar macrophage / P.Davies, D.B. Dmth, E. E. Engel et al.//Lab. Invest -1979.-Vol. 40.-P. 221-226.

493. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis,: respiratory bust activation, and commitment to apoptosis / G. Fossati, D. A. Moulding, D. G. Spiller et al. // J. Immunol. -2003. Vol. 170. - P. 1964-1972

494. The role of glutathione reductase in maintaining human granulocyte function and sensitivity to exogenous H2O2 / H. J. Cohen, E. H. Tape, J. Novak et al. // Blood. -1987. -Vol. 69.-P. 493-500.

495. The role of GSH efflux in staurosporine-induced apoptosis in colonic epithelial cells / C. L. Circu, S. Stringer, C. A. Rhoads et al. // Biochem. Pharmacol. 2008. - Vol. 77, N 1. - P. 76-85.

496. The role of oxidative stress in the pathogenesis of pulmonary emphysema / D. Vucevic, T. Radosavljevic, S. Zunic et al. //Med. Pregl. -2005. Vol. 58, N 9-10. -P. 472-477.

497. The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes / V. A. Fadok, D. L. Bratton, S. C. Frasch et al. // Cell Death Differ. -1998. -N 5. P. 551-562.

498. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase / C. Van Dalen, M. Whitehouse, C. Winterboum et al. //Biochem. J. -1997. Vol. 327. -P. 487-495.

499. Thioredoxin reductase in human hepatoma cells is transcriptionally regulated by sulforaphane and other electrophiles via an antioxidant response element / K. J. Hintze, K. A.Wald,H. Zengetal. //J. Nutr.-2003.-Vol. 133, N. 9.-P. 2721-2727.

500. Thom, S. R. Oxygen-dependent antagonism of lipid peroxidation / S. R Thom, M. E. Elbuken//Free Radical Biol. Med. -1991. Vol. 10. -P. 413-426.

501. Thomas, E.L. Oxidation of chloride and thiocyanate by isolated leukocytes / E.L. Thomas, M. Fishman//J. Biol. Chem -1986-Vol. 261. -P. 9694-9703.c

502. To be, or not to be: NF-kB is the answer role of Rel/NF-kB in the regulation of apoptosis /J. Kucharczak, M. J. Simmons, Y. J. Fan et al. // Oncogene. -2003. - Vol. 22. -P. 89618982.

503. Towbin, H Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications / H Towbin, T. Staehelint, J. Gordon.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1979. Vol. 76, N 9. -P. 4350-4354.

504. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms / D. Wallach, E.E. Varfolomeev, N. L. Malinin et al. //Annu. Rev. Immunol. -1999. Vol. 17. -P. 331-367.

505. Turpaev, K. T. Two pathways of the nitric oxide indused cytotoxycal action / K. T. Turpaev, A. M. Amchencova, A.N. Narovgansky // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. -Vol. 41.-P. 1025-1033

506. Uchida, K. Covalent modification of 4-hydroxynonenal to glyceraldehyde-3-phosphate / K. Uchida, E. R Stadtman // J. Biol. Chem. -1993. Vol. 268. -P. 6388-6393.

507. Udupi, V. Thiol compounds as protective agents in erythrocyte under oxidative stress / V. Udupi, C. Rice-Evans // Free Radical Res. Commun. -1992. Vol. 16.-P. 315-623.

508. Ursini, F. The role of selenium peroxidases in the protection against oxidative damage of membranes /F. Ursini, A. Bindoli // Chem. Phys. Lipids. -1987. Vol. 44. - P. 255-276.

509. Vissers, M. C. The role of oxidants and vitamin C on neutrophil apoptosis and clearance / M. C. Vissers, M Hampton // Biochem. Soc. Trans. 2004. - Vol. 32, N 3. - P. 499-501.

510. Vitamin E administration and reversal of neurological deficits in protein-energy mainutrion / V. Kalra, J. K. Grover, G. K. Ahuja et al. // J. Trop. Pediatr. 2001. - Vol. 47, N1.-P. 39-45.

511. Voetman, A. A. Endogenous catalase protects human blood phagocytes against oxidative damage by extracellularly generated hydrogen peroxide / A. A. Voetman, D. Roos // Blood. -1980. Vol. 56. -P. 846-852.

512. Weiss, S. J. Human granulocyte generation of hydroxyl radical / S. J.Weiss, P. K. Rustagi, A. F. LoBuglio // J. Exp. Med. -1978. Vol. 147. - 316-327.

513. Wendel, A. Enzymes acting against oxygen / A. Wendel // Enzymes Tools and Targets. -Basel: Karger. -1990. -P. 1-25.

514. Wenger, R. H. Mammalian oxygen sensing, signaling and gene regulation / R H. Wenger //J.Exp. Biol.-2000.-Vol.23.-P.1253-1263.

515. Winterbourn, C.C. Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production: Implications for the oxidative reactions of neutrophils / C. C. Winterbourn // J. Clin. Invest -1986. Vol. 78. -P. 545-557.

516. Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase-dependent generation of a tyrosine peroxide by neutrophils / C. C. Winterbourn, H. Pichomer, A. J. Kettle // Arch. Biochem. Biophys. -1997.-Vol. 338.-P. 15-26.

517. Yallow, R S. A. Radioimmunoassay of gastrin / RS. Yalow, S.A. Berson // Gastroenterology. -1970.-Vol. 58.-P. 1-14.

518. Zanma, A. Conjugates of superoxide dismutase with the Fc fragment of immunoglobulin G/A. Zanma//J. Biochem. -1991. Vol. 110. -P. 868-872.

519. Zhang, H. 4-Hydroxynonenal increases y-glutamyl transpeptidase gene expression through mitogen-activated protein kinase pathways / H. Zhang, D. A. Dickinson, R M. Liu, H. J. Forman//FreeRadic. Biol. Med.-2005.-Vol. 38, N4.-P. 463-471.

520. Zhu, L. Bactericidal activity of peroxynitrite / L. Zhu, C. Gunn, J. S. Beckman // Arch. Biochem. Biophys. -1992. Vol. 298. -P. 452-461.

521. Zhu, Y. Altered glutathione homeostasis in animals prenatally exposed to lipopolysaccharide / Y. Zhu, P. M. Carvey, Z. Ling // Neurochem. Int. 2007. - Vol. 50, N4.-P. 671-680.

Оглавление диссертации Жаворонок, Татьяна Васильевна :: 2012 :: Томск

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Жаворонок, Татьяна Васильевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Жаворонок, Татьяна Васильевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций