Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль растворимых факторов, продуцируемых клетками тонкого кишечника мыши, в регуляции гемо-, иммуно- и энтеропоэза

ргб од

2 9 ВНЗ 2002

Нл правл.х рукописи

ТЕМЧУРЛ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ

Роль растворимых факторов, продуцируем и д-клетками тонкого кишечника мыши, в регуляции гемс-, нммуно- и эктерсгюэза,

¡4.00.36 - аллергология н иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск 200'

Работа выполнена в ГУ НИИ клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук С.В. Сенников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е. Р. Черных

доктор медицинских наук A.B. Шурлыгина

Ведущая организация:

ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ

Зашита состоится «_» _ 2002 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 001.001.01 ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядриниевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан <<_>>_2001 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ¿г*, * » у О.Т. Кудаева

' г о л ,-?

' у л ' > г- ку • у , О

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АГ - антиген

АОК - антителообразующая клетка

БОЕ-Э - бурстобразующая единица эритроидная

ГМ-КСФ - гранулоцит-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

ИЭК - интестинальные эпителиальные клетки

ИЭЛ - интраэпителиальные лимфоциты

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КонА - конканавалин А

КОЕс-8- колониеобразующие единицы, формирующие

колонии в селезенке на 8-е сутки. КС - кондиционная среда ЛПС - липополисахарид

рмГМ-КСФ- рекомбинантный мышиный гранулоцит-макрофагальный

колониестимулирующий фактор ТФР - трансформирующий фактор роста СК - стволовая клетка СКК - стволовая кроветворная клетка Фр - фракция кондиционной среды ФНО - фактор некроза опухоли ФСК - фактор стволовой клетки ЭБ - эритроциты барана ЭХЛ - электорохемилюминесценция

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Эпителиальные клетки тонкого кишечника находятся в постоянном контакте с множеством чужеродных антигенов, носгупаюшлх с нишей, и относятся к так называемым биологическим барьерам, основной задачей которых является поддержание гомеостаза организма. Необходимая для этого целостность эпителия обеспечивается интенсивными процессами клеточной регенерации

Многочисленными работами последнего десятилетия на различных эпителиальных клеточных линиях было показано, что в роли гуморальных регуляторов процессов дифференцировки, созревания, функционирования, миграции и гибели интестинальных эпителиальных клеток (ИЭК) активно выступают ряд цитокинов и ростовых факторов гемопоэза [Dignass AU„ 1996; Peterson RL„ 1996; McGee DW., 1996; Ко ТС, 1998; Ruemmele KM., 1998; Goke M., 1998; Kojima H., 1998; Jehle PM., 1999J.

Другая важная функция барьерных органов заключается в презентации антигенных воздействий. ИЭК реализуют эту функцию, являясь АГ-презентнрующими клетками, продуцируя цитокины и меняя уровень их продукции в ответ на различные регуляторные стимулы [Puddington L., 1994; Panja А., 1995; Standyk AW., 1995; Winesett MP., 1996; Varikh A A, 1997; Fujihashi K., 1997; Hirose K., 1998; Jehle PM., 1999; Daig R„ 2000].

Кроме того, в настоящее время показано, что кишечный эпителий является местом внетимичеекою развития лимфоцитов и содержит пул Т-клеточных предшественников, которые способны восстановить популяцию ин1рал(и1елиальных лимфоцитов (ИЭЛ) при трансплантации летально облученным животным [Letrancois L., 1995; Hamad М, 1997, 1999]. При этом считается, что продукцию основных геморегуляторных факторов для роста и дифференцировки предшественников лимфопоэза обеспечивают именно интестинальные эпителиальные клетки [Beagley K.W., 1998; Murray A.M., 1998].

Dee это говорит о том, что эпителиальные клетки тонкого кишечника повлечены в универсальную систему цнтокииооой регуляции клеточных функций. Предполагается, чю ИЭК способны не только аутокринно регулировать процессы собственной дифференцировки, созревания и функционирования, но и оказывать паракринное модулирующее влияние на процессы гемопоэза и на функциональную активность близлежащих компонентов иммунной системы слизистых оболочек [Panja А., 1995, 1998; Fujiliablii К, 1997].

Вместе с тем конкретные гуморальные механизмы данных влияний во многом остаются малоизученными. В частности, в литературе практически отсутствуют данные о регуляторной роли молекул, продуцируемых нативными ИЭК. В этой связи представляется актуальным изучение молекулярных основ взаимодействия ИЭК с клеточными компонентами гематопоэтической и иммунной систем, а так же роли продуцируемых ИЭК растворимых факторов в процессах пролиферации, происходящих в регенеративной зоне крипт.

Цель работы.

Целью данной работы было исследование гуморальных механизмов влияния нативных ИЭК мыши на функциональную активность клеток эпителия тонкого кишечника крипт, стволовых кроветворных и иммунокомпетентных клеток.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние кондиционной среды от интестинальных эпителиальных клеток на пролиферативную активность клеток крипт тонкого кишечника.

2. Изучить продукцию ИФН-у и ГМ-КСФ интестинальными эпителиальными клетками нормального кишечника мыши.

3. Изучить гемопоэтическую колониеобразуюшую активность клеток эпителия крипт тонкого кишечника мыши.

4. Изучить влияние кондиционной среды от интестинальных эпителиальных клеток на колониеобразующую и пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток.

5. Изучить влияние кондиционной среды от интестинальных эпителиальных клеток на процессы антителогенеза и пролиферативной активности иммунорегуляторных клеток.

Научная новизна. Впервые было показано, что клетки эпителия нормального кишечника мыши продуцируют значимые количества ГМ-КСФ.

Была установлена роль ГМ-КСФ в процессах регуляции пролнферативных процессов в регенеративной зоне кишечного эпителия (криптах). Показано, что влияние ГМ-КСФ на пролиферативную активность клеток крипт зависит от концентрации этого медиатора.

Была продемонстрирована способность ИЭК оказывать гуморальное влияние на пролиферативную и колониеобразуюшую

активность КОЕс-8 и доказана роль ГМ-КСФ в реализации данного влияния. Так же впервые показано наличие в кишечном эпителии гемопоэтических предшественников, обладающих колониеобразующей активностью.

На модели первичного IgM ответа на Т-зависимый АГ было показано ингибирующее влияние КС от ИЭК на процесс антителогенеза в селезенке мыши, опосредованное фактором(ами) с молекулярной массой ниже 10 кДа. Установлено, что КС от ИЭК подавляет пролиферативный ответ митогенстимулированных клеток селезенки.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты раскрывают новые аспекты регуляторных межклеточных и межсистемных взаимодействий. Позволяют обнаружить более тонкую взаимосвязь таких процессов как гемопоэз и кишечная регенерация. Формируют дополнительные представления о гемо- и иммунорегуляторной роли клеток кишечного эпителия и о вовлеченности этих клеток в универсальную систему цитокиновой регуляции клеточных функций. Эти данные дают возможность найти новые подходы к регуляции местного иммунитета и регенеративных процессов слизистых оболочек кишечника при различных патологиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интестинальные эпителиальные клетки нормального кишечника мыши являются продуцентами ГМ-КСФ, который оказывает регулируляторное влияние на функциональную активность клеток крипт и СКК.

2. Растворимые факторы, продуцируемые интестинальными эпителиальными клетками мыши, обладают иммуномодулирующей активностью.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1. 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. (Новосибирск 2000г.); 2. Семинарах группы молекулярной иммунологии лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2000, 2001); 3. 24th Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation (Leipzig, Germany, 2001); 4. Семинаре ИКИ CO РАМН (Новосибирск, 2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных

исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 107 страницах машинописного текста, включающего 13 рисунков и 1 таблицу. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 136 литературных источников, в том числе 124 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторные животные. В работе использовались мыши-самцы линии (CBAxC57Bl/6)Fl и (DBAxC57Bl/6)Fl в возрасте 3-6 месяцев (1450 голов). Животные были получены из питомника лабораторных животных СО РАМН (пос. Нижняя Ельцовка г. Новосибирска) и НИЛ ЭБМ Томского Научного Центра СО РАМН. Забой животных проводился методом цервикальной дислокации.

Экспериментальные воздействия.

1. Облучение проводили на аппарате РУМ-25. Летальная доза для мышей линий (CBAXC57BL/6)F1 и (DBAxC57Bl/6)Fl составляет 8,5-9 Гр.

2. Иммунизацию проводили внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе

2х 108 на мышь.

3. Кондиционные среды от ИЭК и их фракции вводились внутривенно по

0,5 мл непосредственно после иммунизации.

Выделение популяции ИЭК. Тотальную популяцию клеток кишечного эпителия крипт мышей (CBAxC57BL/6)Fl получали используя химический (1,5 мМ EDTA, SERVA, Germany) и механический способы [Speekenbrink A.B.J 1987]. Полученные суспензии клеток фильтровали для освобождения от слизи, центрифугировали (1000 об/мин., 5 мин., 4°С) и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 0,25% БСА (Sigma, USA). Интраэпителиальные лимфоциты удаляли центрифугированием в градиенте плотности перколла (Sigma,USA) (р=1,060; ЮООоб/мин., 35 мин., 4°С) [Beagley K.W 1998]. Чистота выделенной популяции ИЭК оценивалась морфологически и составляла 98%. Жизнеспособность составляла 90-95%(оценивали по включению трипанового синего).

Получение кондиционных сред от ИЭК и их фракционирование. ИЭК в концентрации 5х10б/мл инкубировали 2 часа в культуральных флаконах в среде RPMI-1640 (20 mM HEPES, 0,25% BSA, антибиотики) при 37°С, в 5% СОг. По завершении инкубации КС отделяли от клеток центрифугированием. Разделение КС на фракции (Фр) проводили на фракционной ячейке фирмы "AMICON", USA с использованием ультрафильтрационных мембран на 30 кДа (DIAFLO® РМ 30, AMICON, USA) и на 10 кДА (PLGC- 025-10, MILLIPORE®, USA). Были получены

5

фракции с молекулярным весом > 30 кДа (Фр1), 10-30 кДа (Фр2) и < 10 кДа (Фр 3). Получение кондиционных сред от спленоцитов. Суспензию клеток селезенки мышей (CBAxC57Bl/6)Fl концентрации 5х106/мл в полной среде RPMI-1640 (с 0,3 мг/мл, L-глютамина, 2мМ HEPES, антибиотики и 5% FCS) культивировали в 24-х луночных планшетах (Costar USA) 24 часа при 37°С, в 5% С02. Для активации синтеза цитокинов использовали КонА (Sigma, USA) [7мкг/мл]. По завершении инкубации кондиционные среды отделяли от клеток центрифугированием.

Определение количественного содержания цитокинов электрохемилюминисцентным (ЭХЛ) методом. Подготовку реактивов и определение цитокинов проводили как описано ранее [Blackburn G.F. 1991; Yang Н. 1994; Крысов С.В 2000]. В качестве специфических антител против рекомбинантных мышиных (рм) ГМ-КСФ и ИФН-у были использованы поликлональные (Peprotech, inc. USA.) и моноклональные (R&D System, UK) антитела (AT). Все использованные AT не способны перекрестно связывать другие цитокины. Для построения калибровочных кривых были использованы рмГМ-КСФ (Peprotech, inc.), мышиный ИФН-Y (R&D,System). Стрептавидиновые бусы были приобретены в фирме IGEN Inc. (USA).

Нейтрализацию биологической активности ГМ-КСФ в КС от ИЭК и их фракциях проводили предварительной 90 мин. инкубацией с блокирующими анти-мГМ-КСФ AT (согластно протоколам производителя).

Оценка пролиферативнон активности ИЭК крипт in vitro. ИЭК

крипт в концентрации 5 млн/мл. вносили в 96-ти луночные плоскодонные планшеты Linbro®(ICN, USA) в объеме 150ц] на лунку. В опытных группах в лунки вносили по 40ц1 КС и ее фракций; КС и Фр2 предварительно инкубированных с анти-ГМ-КСФ AT; среды с рмГМ-КСФ; в начальных концентрациях 125 нг/мл, 25нг/мл, 5нг/мл и 0,5 нг/мл; среды с анти-чИЛ-10 и анти-мГМ-КСФ (2 мкг/мл). В контрольных группах в лунки вносилось соответственное количество среды для культивации ИЭК. Н3-тимидин вносили в начале 2-х часовой инкубации по 1 мкКю/лунку. Результаты представлены в виде % пролиферативной активности: [среднее количество импульсов от трёх идентичных культур в опыте/ среднее количество импульсов от трех идентичных культур в контроле] х 100%.

Оценка гемопоэтической колониеобразующей активности клеток кишечного эпителия. Перенос клеток кишечного эпителия

6

осуществлялся сингенным леталыго-облученным мышам-реципиентам DBF1. Тотальная популяция клеток крипт (ИЭК + ИЭЛ) переносилась в следующих концентрациях: 2,5x105, 1,5x106 и 2,5x106 клеток на мышь. Выделенную на перколле популяцию ИЭК крипт переносили в концентрации 2,5x106 клеток на мышь. Забой производили на 8 сутки после трансплантации. Количество колоний подсчитывали визуально.

Оценку колониеобразующей и пролиферативной активности СКК производили, как описано [Чертков И.Л., 1984]. Клетки костного мозга интактных мышей (CBAxC57BL/6)Fl (1х106кл/мл) культивировали 4 часа в присутствии 20% содержания КС от ИЭК и ее фракций, обработанных и необработанных анти-ГМ-КСФ AT. В качестве цитостатика использовали оксимочевину (1мг/мл). Далее клетки переносили летально облученным сингенным реципиентам (5х104кл/мышь). Селезеночные колонии подсчитывали визуально на 8-е сутки. Процент клеток в S-фазе вычисляли по формуле ((а-Ь)/а)х100%, где а - число гемопоэтических колоний от клеток, инкубированных без оксимочевины, b - с оксимочеминой.

Колонии на метил целлюлозе. Клетки костного мозга мышей (CBAxC57BL/6)Fl в концентрации 2x106 инкубировали 3,5 часа при 37°С в 2-х вариантах: а) клетки + 20% среды для культивации ИЭК и б) клетки + 20% КС от ИЭК. Затем клетки вносили в среду, содержащую метил целлюлозу MethoCult М3430 (Stemcell Tech. Inc. Vancouver, B.C.) в концентрации 1-2,5х105 и культивировали 10 суток в 96-ти луночных планшетах. По окончании культивирования колонии визуально подсчитывались и характеризовались.

Определение содержания антнтелобразующих клеток (АОК) в селезенках мышей, иммунизированных ЭБ. Число IgM АОК определяли в селезенках иммунизированных реципиентов на 4-е сутки после введения ЭБ по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде [Cunningham A.J., 1968].

Оценка пролиферативной активности спленоцитов. Спленоциты мышей (CBAxC57BL/6)Fl культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций в полной среде в конечной концентрации ЗхЮ6 кл/мл. Для стимуляции пролиферативного ответа использовали КонА (Sigma, USA) в концентрации 7мкг/мл, ЛПС 055 (Sigma, USA) и ЛПС Olli (Sigma, USA) в концентрации 12 мкг/мл. В опытных пробах клетки были прокультивированы в присутствии исследуемых КС от ИЭК и их фракций. Интенсивность пролиферации оценивали через 24 часа, Н3-

тимидин вносили по 1 мкКю/лунку за 18 часов до конца культивирования. Результаты представлены в виде % пролиферативной активности: [среднее количество импульсов от трёх идентичных культур в опыте/ среднее количество импульсов от трех идентичных культур в контроле] х 100%.

Статистическая обработка данных. Представленные данные были воспроизведены минимум в 6 однотипных независимых экспериментах. На рисунках и в таблицах даны значения среднего и стандартной ошибки среднего. Достоверность полученных результатов оценивали t-критерием. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы «Statistica 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Гуморальное влияние ИЭК мыши на пролиферативную активность клеток крипт.

Изучение проводилось на модели оценки включения 3Н-меченного тимидина в первичной культуре ИЭК крипт. [Speekenbrink A.B.J 1987]. Основной пул клеток, детектируемых в данной модели, составляют коммитированные предшественники энтеропоэза с быстрым клеточным циклом [Pottern C.S 1997].

В ходе нашей работы было показано, что КС от ИЭК вызывает снижение пролиферативной активности клеток крипт (рис.1). После разделения КС на фракции различного молекулярного веса (м.в.) регуляторное воздействие оказывали фракции, содержащие растворимые факторы с м.в. свыше 30 кДа(Фр1) и от 10 до 30 кДа (Фр2) (рис. 1).

Это позволило предполагать, что мы имеем дело с цитокин-опосредованным влиянием. Согласно литературным данным, полученным на клеточных линиях, на процессы пролиферации ИЭК оказывает влияние широкий спектр цитокинов. Однако проанализировав известные данные как об экспрессии ИЭК генов цитокинов, рецепторов к ним, а также сопоставив полученные результаты со значениями м.в. цитокинов мы пришли к выводу, что наиболее вероятными медиаторами, опосредующими ингибирующее влияние КС и Фр1 на пролиферативную активность клеток крипт, являются ИФН-у и ГМ-КСФ [Jung НС, 1995; Panja А. 1998; RuemmeleFM, 1998].

Методом ЭХЛ нами было показано, что кондиционные среды эпителиальных клеток мышей линии (CBAxC57Bl/6)Fl содержат ГМ-КСФ (20,9±6,9 нг/мл). Так же наличие ГМ-КСФ было обнаружено во Фр1(20,3±5,5 нг/мл) и Фр2 (7,3+1,8). Во ФрЗ данный цитокин обнаружен не был. При этом уровень продукции ГМ-КСФ клетками кишечника был

сопоставим с продукцией ГМ-КСФ митогенстимулированными спленоцитами (11,5+1,6). В то же время, присутствия ИФН-у в КС и ее фракциях обнаружено не было.

160 I 140

0

1 120 -3 100 -

80 60 40 20 -I

1 23456789

Рис. 1. Влияние кондиционной среды ИЭК (КС) и ее фракций (Фр) на иролиферативную активность клеток эпителия крипт тонкого кишечника мыши [5х106/мл] до и после обработки анти-мГМ-КСФ АТ |2мкг/мл]. 1 - контроль; 2 - КС; 3 - Фр1; 4 - Фр2; 5 -ФрЗ; 6 - КС + анти-мГМ-КСФ АТ; 7 - Фр2 + анти-мГМ-КСФ АТ; 8 -анти-мГМ-КСФ АТ; 9 - анти-чИЛ-10 АТ [2мкг/мл]. *р < 0,001

Для оценки влияния ГМ-КСФ, продуцируемого ИЭК, на пролиферативную активность свежеизолированных клеток крипт мы нейтрализовали биологическую активность данного цитокина в КС и Фр2 с помощью блокирующих моноклональных АТ к мышиному ГМ-КСФ. В качестве контроля использовалась среда с равноценным количеством АТ к ГМ-КСФ и среда с АТ сходной биологической природы, но к человеческому ИЛ-10 (изотипический контроль). В результате была продемонстрирована отмена как ингибирующего эффекта КС, так и стимулирующего влияния Фр2 (рис.1).

Сопоставив полученные результаты, мы предположили, что в зависимости от концентрации ГМ-КСФ оказывает оппозитное влияние на пролиферативную активность клеток крипт, т.е. высокое содержание (около 5 нг/мл) ГМ-КСФ в культуральной среде после добавления КС и Фр1 приводит к подавлению пролиферативного ответа, в то время как низкий уровень (около 1 нг/мл), обусловленный добавлением Фр2, вызывает стимуляцию пролиферативной активности.

Для проверки данного предположения нами была проведена оценка влияния различных концентраций рмГМ-КСФ в культуральной среде на пролиферативную активность клеток крипт. Было установлено,

что концентрации 25 и 5 нг/мл вызывают снижение пролиферативной активности, а концентрация в 1 нг/мл приводила к ее достоверному повышению. Эти подавляющие и стимулирующие эффекты рмГМ-КСФ, как и в случае с КС и Фр2, полностью отменялись добавлением анти-ГМ-КСФ AT (рис. 2).

Известно, что многие цитокины в зависимости от концентрации могут оказывать различное функциональное влияние на определенные типы клеток. Это связано с наличием рецепторов разной аффинности [Spivak JL. 1986, Landschulz KT, 1989.] Для ГМ-КСФ так же было показано существование высоко- и низко-аффинных рецепторов [Weiss М, 1993, Evans С А.,1999]. В этой связи можно предположить, что обнаруженные нами оппозитные эффекты низкой и высокой дозы ГМ-КСФ связаны с активацией различных типов рецепторов на поверхности клеток регенеративной зоны кишечного эпителия.

S ь 140 -|

X m s 120 -

Ё <0 100 -

о X 80 -

S »- t*J 60 -

•е- 40 -

с; о 20 -

с 0 -I

i

1

h л

1

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 2. Влияние рекомбинантного мышиного ГМ-КСФ [0,1-25 нг/мл] на пролиферативную активность клеток эпителия крипт тонкого кишечника мыши [5хЮ6/мл]. 1 - контроль; 2 - 0,1 нг/мл ; 3 - 1 нг/мл; 4-5 нг/мл; 5-25 нг/мл; 6 - 1нг/мл + анти-ГМ-КСФ AT [ 2мкг/мл]; 7 - 5 нг/мл + анти-ГМ-КСФ AT [ 2мкг/мл]. * р < 0,05 ; ** р < 0,005

Таким образом, полученные нами данные говорят об участии ГМ-КСФ, продуцируемого энтероцитами тонкого кишечника, на процессы регуляции пролиферативной активности клеток регенеративной зоны крипт.

В то же время ГМ-КСФ является классическим цитокином, вовлеченным в регуляцию клеток различных ростков кроветворения. Высокий уровень продукции ИЭК данного цитокина, а так же их способность экспрессировать гены других факторов, регулирующих кроветворение (ФСК, ИЛ-lß, ИЛ-6) [Meyer ТА 1994; Puddington L., 1994; Woywodt А 1994; Fujihashi К., 1997; Waterhouse СС 1999],

свидетельствует о возможности участия энтероцитов в обеспечении микроокружения для клеток-предшественников гемо- и иммунопоэза, присутствие которых в кишечнике было показано рядом работ [Mattapallil J. J., 1995, Hamad M, 1997, 1999]. Однако в литературе нет данных ни о функциональной оценке колониеобразующей активности этих геомпоэтических предшественников, ни о непосредственном гуморальном влиянии ИЭК на СКК.

В этой связи нам представлялось важным оценить гемопоэтическую колониеобразующую активность клеток эпителия тонкого кишечника мыши и изучить влияние КС от ИЭК на функциональную активность СКК.

Гуморальное влияние ИЭК на пролиферативную и колониеобразующую активность.

Нами была произведена трансплантация тотальной популяции эпителиальных клеток крипт тонкого кишечника мышей линий (DBAxC57Bl/6)Fl летально облученным сингенным мышам реципиентам. В качестве контроля использовались летально облученные животные не подвергшиеся трансплантации и мыши, которым трансплантировали выделенную в градиенте перколла (р=1,06 г/л) популяцию интестинальных эпителиальных клеток крипт. В результате было показано присутствие в кишечном эпителии клеток-предшественников гемопоэза, обладающих способностью к образованию селезеночных колоний на 8-е сутки (рис 3.)

10

4 -

Рис. 3. Число КОЕс-8 в селезенках летально-облученных мышей линии (ОВАхС57В1/6)П после сингенной трансплантации клеток кишечника. 1 — клетки не вводились (контроль); тотальная популяция эпителиальных клеток крипт в количестве: 2 - 2,5х105, 3 - 1,5х106, 4 - 2,5х10б на мышь; 5 - ИЭК крипт (2,5х106 на мышь).

Это согласуется с данными о наличии в эпителии макак-резусов С034+ клеток, экспрессирующих с-кк рецептор, что свидетельствует об их принадлежности к субпопуляции примитивных предшественников

т

8

6

т

2

о

гемопоэза [МайараШ1.1. I., 1995].Поскольку ИЭК крипт выступают в роли непосредственного микроокружения данных клеток-предшественников, то представлялось важным оценить влияние кондиционной среды от ИЭК на функциональную активность СКК.

Для этого изучалось действие КС и ее фракций на пролиферативную и колониеобразующую активность КОЕс-8 с использованием методов экзогенного селезеночного колониеобразования и клеточного самоубийства. Было показано, что культивация клеток костного мозга мышей-доноров в среде, содержащей КС, Фр1 или Фр2 приводила к достоверному увеличению пролиферативной активности КОЕс-8 по сравнению с контрольной группой, в то время как культивация с ФрЗ не изменяла % КОЕс-8, находящихся в Б-фазе клеточного цикла. Наряду с этим отмечалось и усиление колониеобразующей активности, так же соответствующее фракциям, содержащим ГМ-КСФ (рис. 4).

зо

10-

Л

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 4 Влияние кондиционной среды ИЭК (КС) и ее фракций (Фр) на пролиферативную (А) и колониеобразующую (Б) активность КОЕс-8 до и после обработки АТ к ГМ-КСФ [6 мкг/мл]. 1 - контроль; 2 - КС; 3 - Фр1, 4 - Фр2; 5 - ФрЗ; 6 - Фр1 + АТ, 5 - Фр2 + АТ, 6 - среда + АТ. * р <0,05

Для фактического определения роли продуцируемого ГМ-КСФ в процессах активации пролиферации и колониеобразования активности мы инкубировали ГМ-КСФ-содержащие Фр1 и Фр2 с биотинилированными блокирующими поликлональными АТ, с последующим удалением стрептавидиновыми бусами как комплексов АТ+ГМ-КСФ, так и свободных антител. Эта процедура отменяла стимулирующие эффекты данных фракций на пролиферативную и частично на колониеобразующую активность (рис.4). В качестве контроля в этой серии экспериментов была использована среда, обработанная аналогичным образом.

25

20

5

I

5

О

В ходе дальнейшей работы нами было оценено влияние КС на морфологические параметры гемопоэтических колоний в метилцеллюлозе. Предварительная инкубация клеток костного мозга в среде, содержащей КС, приводила к достоверному повышению колониеобразования на 10-е сутки и вызывала достоверное увеличение процентного содержания числа эритроидных (КОЕ-Э + БОЕ-Э) колониеобразующих единиц с 32% в контрольной группе до 46% в экспериментальной.

Таким образом, нами было показано, что эпителий тонкого кишечника мыши содержит популяцию клеток-предшественников гемопоэза, обладающих способностью к образованию селезеночных колоний на 8-е сутки. В свою очередь эпителиальные клетки способны влиять на функциональную активность СКК посредством продукции ГМ-КСФ. В то же время для эпителиальных клеток ранее была показана экспрессия и продукция ряда иммунорегуляторных цитокинов (ИЛ-1 [}, ИЛ-6, ИЛ-8, ТФР-а,р, ФНО-а), что указывает на их способность не только обеспечивать гемопоэтическое микроокружение, но и оказывать паракринное модулирующее влияние на близлежащие компоненты иммунной системы слизистых оболочек [Раща А., 1995, 1998; Рщ'ШаБЫ К, 1997].

Гуморальное влияние ИЭК на функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Слизистая пластинка кишечника содержит по меньшей мере 80% всех продуцирующих иммуноцитов (бластных В-клеток и

плазматических клеток), а основными гуморальными компонентами специфического слизистого иммунного ответа являются секреторные ^А и антитела [Brandtzaeg Р, 1995]. Поэтому важным аспектом является изучение регуляторного влияния эпителиальных клеток кишечника на секрецию иммуноглобулинов В-клетками.

На модели первичного ^М иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) нами было показано, что внутривенное введение КС в день иммунизации приводило к достоверному снижению абсолютного и относительного числа АОК (рис.5). При этом клеточность селезенок оставалась статистически неизменной.

Так же было показано, что фракции КС, содержащие секреторные продукты с молекулярной массой свыше 10 кДа, достоверно не изменяют количество ^М АОК селезенки. В то время как введение ФрЗ приводило к достоверному снижению числа АОК. И этот эффект численно был сопоставим с влиянием цельной КС (рис.5).

140 120 I 100

е

I во

¡-1+

100 | 8tH

i 60

■ 40

о <

S 20 2 Г"

о

rb

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Рис. 5. Влияние кондиционной среды (КС) эпителиальных клеток и ее фракций (Фр) на содержание относительного (на 106 кл) (А) и абсолютного (Б) числа АОК в селезенках мышей иммунизированных ЭБ. 1 - контроль; 2 - КС; 3 - Фр1; 4 - Фр2; 5 - ФрЗ. * р< 0,05.

Известно, что иммунный ответ на Т-зависимые антигены происходит при кооперативном взаимодействии B-клеток, макрофагов и Т-клеток. В этой связи представлялось интересным изучить влияние КС на спонтанную и стимулированную митогенами пролиферативную реакцию различных популяций иммунокомпетентных клеток селезенки.

Было показано, что культивирование спленоцитов в присутствии кондиционной среды эпителиальных клеток приводит к достоверному снижению как спонтанной, так и ЛПС 055 и ЛПС 0111 стимулированной пролиферативной активности (рис. 6).

h 120 -|

О

а> 100 -

W 80 -

О

01 60 -

н

Q. 40 -

20 -

и

с 0 -1

#

-f-

1 2 спонт.

1 3 4

ЛПС 055

"f

1 3 4 ЛПС 0111

Рис. 6. Влияние кондиционной среды эпителиальных клеток (КС) на спонтанную и ЛПС -стимулированную [12 мкг/мл] пролиферативную активность спленоцитов [Зх106/мл|. 1 - спонтанная пролиферация; 2-спонт. + 30% КС; 3 -ЛПС-стимулированная пролиферация; 4 — ЛПС+30% КС. * достоверное отличие от ЛПС-стимулированной и спонтанной пролиферации (р < 0,005).

При добавлении кондиционной среды к КонА-стимулированным

спленоцитам наблюдался выраженный эффект дозозаииснмой супрессии пролпфератпвнои активности. Более того, гфи содержании КС свыше 10% от общею обьема кулыуральной среды иролиферажвный ответ спленоцитов на стимуляцию КонА достоверно не отличался от показателей спонтанной пролиферации (рис. 7). Однако при культивировании Кон-А стимулированных спленоцитов в присутствии фракций кондиционной среды ни одна из них достоверно не воспроизводила эффекты неразделенной КС. Это может свидетельствовать о том, что данный эффект является совокупным результатом действия не одного, а целого ряда растворимых факторов, возможно, потенцирующих действие друг друга. И в этом процессе могут играть роль как известные цитокины и растворимые факторы, так и специфические и еще неидентифицированные молекулы, продуцируемые клетками кишечного эпителия.

120 -| 100 -80 60 Н 40 20 Н 0

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Дозозависимое влияние процентного содержания кондиционных сред ИЭК (КС) и 30% содержания их фракции (Фр) на КоиА-стимулпрованную [7 мкг/мл| пролиферативную активность спленоцитов [Зх10б/мл|. 1 — спонтанная пролиферация; 2 - КонА; 3 -10% КС; 4-20% КС; 5-JU% КС; 6-30% Фр1; 7-30% Фр2; 8-30% ФрЗ. *достоверность в сравнении с КонА-стимулированной пролиферацией (р < 0,005); ** достоверность в сравнении как со стимулированной, так и со спонтанной пролиферацией (р< 0,005).

Таким образом, в нашей работе было установлено, что ИЭК нормального кишечника мыши за счет продукции ими ГМ-КСФ могут влиять как на регенеративные процессы в кишечном эпителии, так и на функциональное состояние пула СКК, что указывает на более тонкую взаимосвязь таких процессов, как гемопоэз и кишечная регенерация. Кроме того, показано, что ИЭК продуцируют растворимые факторы, оказывающие модулирующее влияние на формирование клона IgM АОК in vivo и митогенстимулированную пролиферативную активность различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток селезенки in virio. Полученные данные раскрывают ряд аспектов регуляторных межклеточных и межсистемных взаимодействий и дают возможность

найти новые подходы к регуляции местного иммунитета и регенеративных

процессов слизистых оболочек кишечника.

ВЫВОДЫ

1. Интестинальные эпителиальные клетки нормального кишечника мыши являются продуцентами ГМ-КСФ и не продуцируют ИФН-у, что определялось по содержанию данных факторов в кондиционных средах от первичных клеточных культур.

2. ГМ-КСФ, содержащийся в кондиционных средах от интестинальных эпителиальных клеткок мыши, в зависимости от концентрации оказывает оппозитное влияние на пролиферативную активность клеток крипт in vitro, что указывает на участие данного цитокина в регуляции регенерации эпителия тонкого кишечника.

3. Эпителий тонкого кишечника мыши содержит популяцию клеток-предшественников гемопоэза, обладающих способностью к образованию селезеночных гемопоэтических колоний на 8-е сутки.

4. ГМ-КСФ, содержащийся в кондиционных средах от интестинальных эпителиальных клеткок мыши, оказывает стимулирующее влияние на функциональную активность СКК, о чем свидетельствует увеличение колониеобразующей способности КОЕс-8 и их процентного содержания в S-фазе клеточного цикла.

5. Кондиционные среды от интестинальных эпителиальных клеток стимулируют формирование КОЕ-Э и БОЕ-Э в экспериментах с культивированием гемопоэтических клеток в полутвердой среде in vitro.

6. Интестинальные эпителиальные клетки мыши продуцируют растворимые компонент(ы) с м.в ниже 10 кДа, которые оказывают влияние на выраженность гуморального иммунного ответа, снижая количество первичных IgM АОК селезенки в ответ на Т-зависимый антиген ЭБ in vivo.

7. Интестинальные эпителиальные клетки мыши продуцируют растворимые факторы, которые оказывают влияние на пролиферативные процессы в кишечном эпителии, функциональную активность СКК и иммунокомпетентных клеток. Что свидетельствует о их регуляторной роли в функционировании данных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Темчура В.В., С.В. Сенников, В.А.Труфакин, В.А.Козлов. Влияние гуморального фактора, продуцирующегося энтерошггами, на ряд параметров иммунной системы. Иммунная система: функционирование в норме, при экстремальных экологических воздействиях, при иммунопатологии. Материалы 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. Новосибирск 2000г., Стр.139.

2. В.В.Темчура, С.В.Сенников, В.А.Труфакин. Влияние супернатантов эпителиальных клеток кишечника мыши на функциональную активность клеток иммунной системы. Аллергология и иммунология т.1,№2 2000г. Тезисы докладов 3 съезда иммунологов и аллергологов СНГ. Стр.128.

3. V.V. Temchura, S.V. Sennikov, V.A. Trufakin, V.A. Kozlov.The influence of humoral factor produced by enterocytes on the activity of the immune cells and haematopoetic precursors. Immunol. Lett 2000, Vol.73, Issues 2-3: p.588.

4. Sennikov S., Temchura V., Trufakin V., Kozlov V. The influence of humoral factors(s) prodused by enterocytes on the activity of the immune ceils, and haematopoietic precursors./ European Federation of immunological Societies - EFIS 2000. - Monduzzi Editore, 2001, p.423-428.

5. V.V. Temchura, S.V. Sennikov, T.V. Injelevskaya, V.A. Trufakin and V.A. Kozlov. Stimulatory effect of enterocyte-derived factors) on proliferative activity of haematopoietic precursors in vitro JI Cell prolif. 2001, Vol. 34, № 3, p. 194.

6. V.V. Temchura, S.V. Sennikov, T.V. Injelevskaya, V.A. Trufakin and V.A. Kozlov. Stimulatory effect of enterocyte-derived GM-CSF on proliferative activity of haematopoietic precursors.//.!. Leukoc. Biol. Suppl. 2001; p.38

Зак.^ШУГир. 100. Печ.л. 1,0 Тип. ЗАО «ТамКон»

Эпителиальные клетки тонкого кишечника находятся в постоянном контакте с множеством чужеродных антигенов, поступающих с пищей и относятся к так называемым биологическим барьерам, основной задачей которых является поддержание гомеостаза организма. Необходимая для этого целостность эпителия обеспечивается интенсивными процессами клеточной регенерации, изучение механизмов регуляции которых относятся к разряду наиболее интенсивно разрабатываемых научных направлений.

Изучение процессов клеточного деления и дифференцировки, происходящих в регенеративной зоне кишечника (криптах), показало их структурное сходство с процессами кроветворения, протекающими в гемопоэтических органах. Было показано наличие стволовых клеток (СК) кишечника, которые обладают теми же свойствами, что и стволовые кроветворные клетки (СКК): это недифференцированные клетки способные к миграции, пролиферации, самоподцержанию и к дифференцирвке в по меньшей мере пять фенотипически и функционально различных клеточных популяций. [20, 107]. Но в отличие от СКК механизмы, лежащие в основе регуляции коммитирования и пролиферативной активности СК кишечника, а, следовательно, и общей регенерации кишечного эпителия являются менее изученными.

Работами отечественных авторов было показано участие клеток иммунной системы в регуляции восстановительных процессов в слизистом эпителии [1, 9, 119]. В этой связи предполагалось, что иммунным клеткам принадлежит роль «носителей регенерационной информации» [1], однако вопрос о механизмах передачи данной информации и ее биологической природе остается открытым [9]. В то же время многочисленными работами последнего десятилетия на различных клеточных линиях было показано, что в роли гуморальных регуляторов процессов дифференцировки, созревания, функционирования, миграции и гибели интестинальных эпителиальных клеток (ИЭК) активно выступают ряд цитокинов и ростовых факторов гемопоэза [37, 49, 62, 70, 71, 86, 105, 115, 116] ИЭК не только несут на своей поверхности рецепторы к цитокинам и отвечают на их активацию изменением клеточных функций, но и сами являются продуцентами широкого спектра цитокинов [35, 44, 58, 62, 100,102,108, 131].

Продукция клетками кишечного эпителия гемо- и иммунорегуляторных молекул согласуется с эволюционной ролью кишечника в процессах кроветворения: у позвоночных он является филогенетически первым локализованным органом гемопоэза [10]. Однако несмотря на эволюционное обособление кроветворных органов, кишечный эпителий млекопитающих не утратил своей взаимосвязи с процессами созревания и дифференцировки гемопоэтических клеток. В настоящее время показано, что кишечный эпителий является местом внетимического развития лимфоцитов и содержит пул Т-клеточных предшественников, которые способны восстановить популяцию интраэпителиальных лимфоцитов (ИЭЛ) при трансплантации летально облученным животным [53, 54]. При этом считается, что продукцию основных геморегуляторных факторов для роста и дифференцировки предшественников лимфопоэза обеспечивают именно ИЭК [16, 93].

Другая важная функция барьерных органов заключается в презентации антигенных воздействий - информации, необходимой для адекватного взаимодействия организма с внешней средой [4]. ИЭК реализуют эту функцию являясь АГ-презентирующими клетками, продуцируя иммунорегуляторные цитокины и меняя уровень их продукции в ответ на различные регуляторные стимулы.

Таким образом очевидно, что эпителиальные клетки тонкого кишечника вовлечены в универсальную систему цитокиновой регуляции клеточных функций. Предполагается, что ИЭК способны не только аутокринно регулировать процессы собственной дифференцировки, созревания и функционирования, но и оказывать паракринное модулирующее влияние на процессы гемопоэза и на функциональную активность близлежащих компонентов иммунной системы слизистых оболочек.

В то же время в литературе практически отсутствуют данные по влиянию молекул, продуцируемых нативными ИЭК, на пролиферативные процессы в кишечном эпителии, гемопоэтическую активность СКК и функциональную активность иммунокомпетентных клеток. В этой связи представляется актуальным изучение молекулярных основ взаимодействия ИЭК с клеточными компонентами гематопоэтической и иммунной систем, а так же роли продуцируемых ИЭК растворимых факторов в процессах пролиферации, происходящих в регенеративной зоне крипт.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы было исследование гуморальных механизмов влияния нативных ИЭК мыши на функциональную активность клеток эпителия тонкого кишечника крипт, СКК и иммунокомпетентных клеток.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1.Изучить влияние кондиционной среды от интестинальных эпителиальных клеток на пролиферативную активность клеток крипт тонкого кишечника.

2.Изучить продукцию ИФН-7 и ГМ-КСФ интестинальными эпителиальными клетками нормального кишечника мыши.

3.Изучить гемопоэтическую колониеобразующую активность клеток эпителия крипт тонкого кишечника мыши.

4.Изучить влияние кондиционной среды на колониеобразующую и пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток.

5.Изучить влияние кондиционной среды от интестинальных эпителиальных клеток на процессы антителогенеза и пролиферативной активности иммунорегуляторных клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые было показано, что клетки эпителия нормального кишечника мыши являются продуцентами ГМ-КСФ.

Была установлена роль ГМ-КСФ в процессах регуляции пролиферативных процессов в регенеративной зоне кишечного эпителия (криптах). Показано, что влияние ГМ-КСФ на пролиферативную активность клеток крипт зависит от концентрации этого медиатора.

Была продемонстрирована способность ИЭК оказывать гуморальное влияние на пролиферативную и колониеобразующую активность КОЕс-8 и доказана роль ГМ-КСФ в реализации данного влияния. Так же впервые показано наличие в кишечном эпителии гемопоэтических предшественников, обладающих колониеобразующей активностью.

На модели первичного IgM ответа на Т-зависимый АГ было показано ингибирующее влияние КС от ИЭК на процесс антителогенеза в селезенке мыши, опосредованное фактором(ами) с молекулярной массой ниже 10 кДа. Установлено, что КС от ИЭК подавляет пролиферативный ответ митогенстимулированных клеток селезенки.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные результаты раскрывают новые аспекты регуляторных межклеточных и межсистемных взаимодействий, позволяют обнаружить более тонкую взаимосвязь таких процессов, как гемопоэз и кишечная регенерация. Формируют дополнительные представления о гемо- и иммунорегуляторной роли клеток кишечного эпителия и о вовлеченности этих клеток в универсальную систему цитокиновой регуляции клеточных функций. Эти данные дают возможность найти новые подходы к регуляции местного иммунитета и регенеративных процессов слизистых оболочек кишечника при различных патологиях.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1 .Интестинальные эпителиальные клетки нормального кишечника мыши являются продуцентами ГМ-КСФ, который оказывает регулируляторное влияние на функциональную активность клеток крипт и СКК. 2.Растворимые факторы, продуцируемые интестинальными эпителиальными клетками мыши, обладают иммуномодулирующей активностью.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на : 1. 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. (Новосибирск 2000г.); 2. Семинаре лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2000); 3. Семинарах группы молекулярной иммунологии лаборатории регуляции иммунопоэза ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2000, 2001); 4. 24th Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation (Leipzig, Germany, 2001); 5. Семинаре ИКИ CO РАМН (Новосибирск, 2001).

САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории регуляции иммунопоэза. Большую признательность автор выражает научному руководителю работы к.м.н. С.В. Сенникову за подробное обсуждение полученных результатов, а так же сотрудникам группы молекулярной иммунологии за благожелательное отношение в ходе выполнения работы: С.В. Крысову, А.Н Силкову, В.В. Темчура, Д.Х. Курамшину, Л.В. Гришиной и А.П. Хабаровой.

ВЫВОДЫ:

1. Интестинальные эпителиальные клетки нормального кишечника мыши являются продуцентами ГМ-КСФ, и не продуцируют ИФН-7, что определялось по содержанию данных факторов в кондиционных средах от первичных клеточных культур.

2. ГМ-КСФ, содержащийся в кондиционных средах от интестинальных эпителиальных клеткок мыши, в зависимости от концентрации оказывает оппозитное влияние на пролиферативную активность клеток крипт in vitro, что указывает на участие данного цитокина в регуляции регенерации эпителия тонкого кишечника.

3. Эпителий тонкого кишечника мыши содержит популяцию клеток-предшественников гемопоэза, обладающих способностью к образованию селезеночных гемопоэтических колоний на 8-е сутки.

4. ГМ-КСФ, содержащийся в кондиционных средах от интестинальных эпителиальных клеткок мыши, оказывает стимулирующее влияние на функциональную активность СКК, о чем свидетельствует увеличение колониеобразующей способности КОЕс-8 и их процентного содержания в S-фазе клеточного цикла.

5. Кондиционные среды от интестинальных эпителиальных клеток стимулируют формирование КОЕ-Э и БОЕ-Э в экспериментах с культивированием гемопоэтических клеток в полутвердой среде in vitro.

6. Интестинальные эпителиальные клетки мыши продуцируют растворимые компонент(ы) с м.в ниже 10 кДа, которые оказывают влияние на выраженность гуморального иммунного ответа, снижая количество первичных IgM АОК селезенки в ответ на Т-зависимый антиген ЭБ in vivo.

7. Интестинальные эпителиальные клетки мыши продуцируют растворимые факторы, которые оказывают влияние на пролиферативные процессы в кишечном эпителии, функциональную активность СКК и иммунокомпетентных клеток. Что свидетельствует о их регуляторной роли в функционировании данных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенная оценка влияний КС от ИЭК мыши на пролиферативную активность клеток крипт, функциональную активность СКК, а так же на ряд параметров иммунной системы показала наличие регуляторных воздействий, опосредованных растворимыми молекулами, продуцируемыми клетками кишечного эпителия.

Показано, что ИЭК мыши продуцируют ГМ-КСФ, который оказывает регуляторное влияние на пролиферативную активность клеток эпителия тонкого кишечника крипт in vitro, что было доказано инактивацией биологической активности данного цитокина блокирующими AT. Было установлено, что высокие дозы ГМ-КСФ приводят к подавлению пролиферации, в то время как низкие дозы стимулируют ее. Этот дозовый эффект ГМ-КСФ на клетки крипт воспроизводился в экспериментах с использованием рмГМ-КСФ. Полученные нами данные указывают на активное участие ГМ-КСФ в процессах регуляции регенеративных процессов в эпителии тонкого кишечника.

В экспериментах на клетках костного мозга было показано, что ГМ-КСФ, содержащийся в КС от ИЭК и ее фракциях оказывает дозозависимый стимулирующий эффект как на пролиферативную, так и на колониеобразующую активность КОЕс-8. Предварительная культивация костномозговых предшественников гемопоэза в присутствии КС меняла % соотношение основных типов гемопоэтических колоний в пользу КОЕ-Э и БОЕ-Э.

Так же было показано, что тотальная популяция клеток эпителия тонкого кишечника содержит КОЕс-8. Эти результаты свидетельствуют о том, что продукция ГМ-КСФ ИЭК может играть важную роль в поддержании адекватного микроокружения для СКК, находящихся в кишечном эпителии.

Установлено ингибирующее влияние КС от ИЭК на формирование клона IgM АОК в модели первичного иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) in vivo. Данный эффект опосредован молекулярными продуктами от 10 кДа и ниже.

Кроме того, КС от ИЭК вызывала снижение спонтанной и митогенстимулированной активности спленоцитов. Причем, если в случае с ЛПС 055 и ЛПС 0111 стимулированной пролиферацией это снижение было в среднем на 40% и было достоверно выше не стимулированного контроля, то в случае с КонА - стимулированными спленоцитами наблюдалась достоверная отмена эффекта митогена. Полученные эффекты не могли быть опосредованы ИФН-у, поскольку нами было показано отсутствие детектируемых концентраций данного цитокина в КС от ИЭК.

Таким образом, в нашей работе было установлено, что ИЭК нормального кишечника мыши за счет продукции ими ГМ-КСФ могут влиять как на регенеративные процессы в кишечном эпителии, так и на функциональное состояние пула СКК. Кроме того, ИЭК продуцируют растворимые факторы, оказывающие влияние на формирование иммунного ответа путем подавления митогенстимулированной пролиферативной активности различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток и снижая процессы антителогенеза.