Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника

ДИССЕРТАЦИЯ
Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника - диссертация, тема по медицине
АВТОРЕФЕРАТ
Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника - тема автореферата по медицине
Ведина, Любовь Александровна Новосибирск 2006 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
14.00.36
 
 

Автореферат диссертации по медицине на тему Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника



На правах рукописи

ВЕДИНА ЛЮБОВЬ АЛЕКСАНДРОВНА

Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск-2006

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук,

профессор Сенников Сергей Витальевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор Аутеншлюс Александр Исаевич

Кандидат медицинских наук Шевела Екатерина Яковлевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

(г.Москва)

Защита состоится << >> Р 2006 г. в /6- часов

на заседании диссертационного совета Д 0cfl.001.01 при Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН по адресу:

630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан << >> НСХ&$/1\Л?_2006 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук О.Т. Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Активное исследование соматических стволовых клеток позволило к настоящему времени сформировать общие представления, характеризующие данные клеточные элементы. Установлено, что стволовые клетки обладают способностью к самоподдержанию, пролиферативной и дифференцировочной активностями [Козлов В.А. с соавт., 1982; Чертков с соавт., 1984]. Новый взрыв интереса к стволовым клеткам особенно сильно проявился в последние годы в связи с накопившимися данными о том, что стволовые клетки взрослого организма в определенных условиях способны дать начало целому спектру клеточных типов независимо от того, из какого зародышевого слоя они происходят [Чертков с соавт., 2004; Filip et al., 2003; Wagers et al., 2004]. Изучение данной характеристики соматических стволовых клеток открывает новые возможности в заместительной клеточной терапии многих заболеваний, в том числе кроветворной и иммунной систем [Чертков, 2004; Зуева с соавт., 2005]. Свойство «пластичности» продемонстрировано для стволовых клеток костного мозга, мышечной ткани, кожи, головного мозга, тонкого кишечника и т.д. [Jiang et al., 2002; Cao et al., 2003; Toma et al., 2005; Wiese et al., 2006]. Более того, в серии работ показано, что многие из соматических стволовых клеток вышеперечисленных тканей могут обладать гемопоэтическим потенциалом [Bjornson et al., 1999; Jackson et al., 1999; Lako et al., 2002; Cousin et al., 2003].

Уникальную модель для изучения стволовых клеток взрослого организма представляет эпителий тонкого кишечника, поскольку является одной из наиболее быстропролиферирующих тканей организма и содержит большой пул стволовых клеток и клеток-предшественников [Potten et al., 1998, 2006]. В ряде работ была показана способность клеток тонкого кишечника in vivo в организме летально облученных мышей к дифференцировке в клетки кожи [Не et al., 2005], а также к трансдифференцировке in vitro в клетки, содержащие маркеры нервной, печеночной и поджелудочной ткани [Wiese et al., 2006]. Несмотря на филогенетическое значение кишечника в процессе кроветворения [Хрущев, 1966], продукцию интестинальными клетками широкого спектра гемопоэтических ростовых факторов [Stadnyk et al., 2002], в литературе отсутствуют данные о гемопоэтическом потенциале клеток эпителиального слоя тонкого кишечника. В этой связи представлялось актуальным в данной работе изучить in vivo способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний и восстановлению гемо- и иммунопоэза у летально облученного реципиента. Цель работы - изучить гемо- и иммунопоэз-

восстанавливающую активность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью гистологических и генетических методов способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний (КОЕс-9) в селезенке летально облученных мышей.

2. Исследовать возможность влияния на колониеобразующую активность клеток тонкого кишечника кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), культивируемых с добавлением и без добавления различных ростовых факторов.

3. Изучить наличие донорских клеток тонкого кишечника в различных тканях летально облученного реципиента через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации.

4. Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению кроветворения.

5. Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению функций клеток иммунной системы.

Научная новизна. Впервые с помощью генетических и гистологических методов было доказано, что клетки эпителиального слоя тонкого кишечника способны к образованию в селезенке летально облученных мышей-реципиентов гемопоэтических колоний (КОЕс-9), которые представляют собой клон донорских клеток.

В работе продемонстрировано, что на способность клеток тонкого кишечника к образованию КОЕс-9 оказывают влияние кондиционные среды от клеток эмбриональной печени, полученные в период активного гистогенеза кроветворной ткани.

Впервые показано, что у летально облученного реципиента через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника происходит восстановление численной популяции клеточных элементов периферической крови. Более того, клетки эпителия тонкого кишечника обладают способностью восстанавливать и функциональную активность клеток иммунной системы. Полноценное проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа и 1§М антителообразование у летально облученных мышей наблюдается через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника. Нами также было впервые продемонстрировано, что донорские клетки эпителиального слоя тонкого кишечника, экспрессирующие маркер У-хромосомы ген Бгу, длительное время персистируют в организме самок-реципиентов и обнаруживаются в различных тканях через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты расширяют представление о гемопоэтическом потенциале клеток эпителия тонкого кишечника мыши, вносят существенный вклад в понимание явления «пластичности» соматических

стволовых клеток, демонстрируют возможность влияния гуморальных факторов на способность клеток тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний, формируют представление о гемо- и иммунопоэз-восстанавливающей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.

Основные положения выносимые на защиту.

Клетки эпителиального слоя тонкого кишечника мыши характеризуются способностью образовывать гемопоэтические колонии (КОЕс-9), восстанавливать кроветворение и функциональную активность клеток иммунной системы у летально облученных мышей.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005г.); 2) семинарах группы лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2005г.); 3) Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005г.); 4) 7-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН. (Новосибирск, 2006г.); 5) симпозиуме «Клуб профессиональных иммунологов» (Анталия, Турция, 2006г.); 6) семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006г.).

Публикации.

По теме кандидатской диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 статья в центральной печати.

Объем и структура работы.

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, представленных результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов.

Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, включающего 11 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 195 литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объекты исследования

Лабораторные животные:

• мыши (самцы и самки) (CBAxC57Bl/6)Fl в возрасте 3-6 месяцев;

• 12-14 дневные мышиные эмбрионы.

Взрослые животные были получены из питомника лабораторных животных СО РАМН (пос. Нижняя Ельцовка г. Новосибирска) и НИЛ ЭБМ

Томского Научного Центра СО РАМН.

Эмбрионы были получены в виварии ГУ НИИКИ СОРАМН. Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N755).

Методы выделения клеток

Метод выделения клеток крипт тонкого кишечника

Выделение клеток осуществлялось химическим (1,5 мМ ЭДТА) и механическим способами [Speekenbrink et al.,1987].

Для проведения морфологического анализа исследуемой популяции использовалась окраска клеточных препаратов по методу Гимза-Романовского [Гольдберг с соавт., 1992].

Метод выделения тотальной популяции клеток

эмбриональной печени (КЭП) Выделение КЭП от 12-14 дневных мышиных эмбрионов осуществлялось механическим способом. Жизнеспособность клеток определялась с помощью трипанового синего и составляла 98%. Получение кондиционных сред (КС) от КЭП Для получения КС тотальная популяция КЭП (Зх106кл/мл) инкубировалась в культуральной среде RPMI-1640 (содержащей 2 мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина) в различных вариантах:

• 24, 48, 72 часа при 37°С во влажной атмосфере с 5% С02;

• 24 часа с добавлением в среду:

a) конканавалина А (10 мкг/мл),

b) интерлейкина-ip (8,4 нг/мл),

c) эритропоэтина (2 МЕ/мл).

По завершении инкубации КС отделялись от клеток центрифугированием при 1500 об/мин.

Выделение тотальной популяции клеток костного мозга (ККМ) Выделение осуществлялось механическим способом [Гольдберг с соавт., 1992].

Оценка колониеобразующей активности клеток кишечника Оценка проводилась с помощью метода экзогенного селезеночного колониеобразования [Till et al., 1961; Чертков с соавт., 1984]. Мыши-реципиенты (CBAxC57Bl/6)Fl облучались на аппарате РУМ-25 в летальной дозе (8,5-9 Гр). Введение клеток от мышей-доноров мышам-реципиентам осуществлялось на следующий день после облучения. Перед трансплантацией клетки эпителиального слоя тонкого кишечника (Зх106кл/мл) и клетки костного мозга (3x106 кл/мл) от мышеи-доноров инкубировались в течение 2 часов в культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в следующих вариантах: а) клетки; б) клетки с добавлением 30% КС, полученной от КЭП. Перенос клеток кишечника осуществлялся в концентрации 1,5x106 клеток на мышь; ККМ — 5x104 клеток/мышь. Мыши

умерщвлялись на 9 сутки после облучения путем дислокации позвонков шейного отдела. Селезенки извлекались и фиксировались в растворе Телесницкого (5 мл ледяной уксусной кислоты, 5мл формалина, 90 мл 70° этилового спирта). Через 2 часа подсчитывались визуально определяемые колонии на поверхности селезенки.

Генетический анализ селезеночных колоний (КОЕс-9)

Для исследования того, что отдельно взятая селезеночная колония является клоном донорских клеток кишечника, клетки кишечного эпителия от самцов, которые несут ген sry, кодируемый Y-хромосомой, трансплантировались сингенным летально облученным самкам. Из единичных КОЕс-9 получалась суспензия клеток, которые культивировались (5x104 кл/мл) в полувязкой среде, содержащей метилцеллюлозу MethoCult М3430 (Stemcell Tech.Inc.Vancouver,B.C.). Выделение ДНК из полученных in vitro гемопоэтических колоний осуществлялось щелочным лизисом [Rolfs et al., 1992].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ПЦР проводилась в амплификаторе «РТС-200 DNA Engine» (MJ Reseach inc., USA). Реакционная смесь в объеме 20 мкл содержала: 2 мкл ДНК в качестве матрицы, 1 ед. акт. Taq-ДНК полимеразы, 0,5 мкМ каждого из праймеров, 250 мкМ смеси четырех dNTP.

Реакционный буфер прилагался к ДНК- полимеразе. Режим термоциклирования зависел от состава праймеров и длины амплифицируемого фрагмента и рассчитывался с использованием программы «Primer Premier» (Primer Biosoft International, USA).

Продукты амплификации анализировались с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буфере (ТАЕ). В качестве маркера молекулярного веса использовался гидролизат плазмиды pUC19, полученный при расщеплении рестриктазой Kzo9I. После проведения электрофореза гель окрашивался водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Продукты полимеразной цепной реакции визуализировались в ультрафиолетовом свете, молекулярный вес фрагментов и интегральная оптическая плотность бэндов (IOD) оценивалась с помощью видеоденситометра и пакета прикладных программ «ImageMaster®VDS» (Pharmacia Biotech, USA).

Праймеры к последовательности гена sry были синтезированы в НИИ ХБиФМ СО РАН, г. Новосибирск. Структура праймеров :

SRY, размер продукта 720 п.о. [Pang çt al., 2000] 5' - CTG CTG TGA АСА G AC ACT AC - 3' и 5' - GAC ТСС ТСТ GAC TTC ACT TG -3'.

«Вложенная» ПЦР применялась для более точного анализа и уменьшения доли побочных продуктов реакции. В качестве матрицы использовался 1 мкл амплификационной смеси первичной ПЦР. Последовательности праймеров, с которых амплифицировался участок ДНК внутри продукта первой реакции, были следующие:

SRY, размер продукта 320 п.о. [Cousin et al., 2003] 5'- CTC TG С ATT GGT GGT С TT TG - 3' и 5'- AAA CCA ТС A ССТ CTC АСА GG - 3'.

При изучении способности клеток тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза в эксперименте использовались 3 группы мышей: контрольная - группа необлученных мышей, 2 опытные группы летально облученных мышей, которым трансплантировали:

а) клетки эпителиального слоя тонкого кишечника (1,5x10б клеток/мышь),

б) клетки костного мозга в концентрации 1,5x104 клеток/мышь.

Подбор доз вводимых клеток костного мозга осуществлялся таким образом, чтобы количество образованных колоний в селезенке было равно количеству колоний, образующихся при трансплантации клеток кишечника.

Определение параметров периферической крови

Определение параметров периферической крови: количество эритроцитов (RBC), тромбоцитов (PLT), общее число лейкоцитов (WBC) и показатель гематокрита (HCT) проводилось при помощи автоматического гематологического анализатора CELL-Dyn 900.

Определение уровня первичного гуморального ответа (IgM АО К) на Т-зависимый антиген (эритроциты барана (ЭБ))

Способность мышей к иммунному ответу на ЭБ оценивалась на пятые сутки - на пике ответа (IgM-AOK) - по количеству локальных зон гемолиза в жидкой среде после внутрибрюшинного введения ЭБ [Cunningham, etal., 1965].

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ)

Клеточный иммунитет оценивался по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ): величины отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным [Yoshikai et al., 1979].

Статистический анализ результатов

Представленные данные были воспроизведены минимум в 3-х и максимум в 10-ти однотипных экспериментах. Статистическая обработка данных проводилась при помощи программы "Statistica 5.0". Для статистической проверки гипотез о достоверности различий между группами данных использовались непараметрические критерии MannWhitney, Kruskal-Wallis ANOVA, так как исследуемые выборки не подчинялись нормальному распределению. Данные представлялись в виде среднего значения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Гистологический и генетический анализ колоний,

образованных в селезенке летально облученных мышей после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника.

Исходя из филогенетического значения кишечника в процессе гемопоэза [Хрущев, 1966] и учитывая демонстрируемую в ряде работ способность ряда соматических стволовых клеток к дифференцировке в клеточные элементы других тканей [Wagers et al., 2004], мы предположили, что стволовые элементы эпителиального слоя кишечника могут в определенных условиях генерировать клетки кроветворного ряда. В исследованиях, ранее проводимых в нашей лаборатории, была продемонстрирована способность клеток кишечника к образованию колоний (КОЕс-8) у летально облученных мышей на 8 сутки [Темчура В.В., 2001]. В настоящем исследовании мы продолжили изучение колониеобразующей активности клеток эпителиального слоя кишечника. С помощью гистологического исследования нами было показано, что образованные популяцией клеток эпителия тонкого кишечника мыши КОЕс-9 в селезенке летально облученных мышей являются гемопоэтическими колониями. Для доказательства того, что отдельно взятая селезеночная колония представляет собой клон донорских клеток кишечника, мы трансплантировали клетки интестинального эпителиального слоя от самцов сингенным летально облученным самкам. Клетки, полученные из единичных селезеночных колоний (КОЕс-9), культивировали 14 суток в полувязкой метил целлюлозной среде, предназначенной для выращивания мышиных гемопоэтических колоний. В результате с помощью ПЦР анализа было установлено, что полученные in vitro гемопоэтические колонии содержали маркер Y-хромосомы ген sry (рис. 1).

Mw 12 3 4 Mw 2 5 6

Рис. 1. Детекция гена sry (Y-хромосома) из клеток гемопоэтических колоний, полученных на 14 день in vitro от клеток КОЕ селезенок летально облученных мышей-рецнпнентов (самок), которым была проведена трансплантация клеток кишечника доноров-самцов. Mw- маркер молекулярного веса ДНК-риС19/Кго91 (955, 585, 341, 258 п.о). Стрелкой обозначен фрагмент ДНК размером 320 п.о., соответствующий ДНК гена sry. В качестве негативного контроля использовались клетки селезенки самки (проба 1), в качестве положительного контроля - клетки самца (проба 2). Пробы 3-6 - клетки из гемопоэтических колоний.

Таким образом, с помощью культуральных, гистологических и генетических методов было показано, что клетки кишечного эпителия способны образовывать гемопоэтические колонии (КОЕс-9), которые представляют собой клон донорских клеток.

Изучение влияния гуморальных факторов клеток

эмбриональной печени (КЭП) на колониеобразующую активность клеток кишечника и клеток костного мозга.

Поскольку метод Till & McCullch позволяет количественно оценить популяцию СКК в организме экспериментальных животных [Till et ah, 1961], а процесс колониеобразования регулируется ростовыми факторами и цитокинами [Janowska-Wieczorek et al., 2001], мы попробовали изменить колониеобразующую активность клеток кишечника с помощью кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП). Исходя из того, что на 12-й день эмбрионального развития печень становиться органом активного гемопоэза, в котором формируется оптимальное для созревания и дифференцировки гемопоэтических предшественников микроокружение [Sakane et al., 2004], мы предположили, что кондиционные среды от этих клеток могут оказывать стимулирующее влияние на способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний в селезенках летально облученных мышей.

Рис. 2. Влияние кондиционных сред (КС), полученных от клеток эмбриональной печени (КЭП), на способность клеток кишечника (А) и клеток костного мозга (В) образовывать КОЕс-9 ? селезенках летально облученных животных. Клетки эпителия тонкого кишечника вводились в количестве 1,5x10* клеток/мышь, клетки костного мозга - 5х104 клеток/мышь. *р<0.05; **р<0.01 по отношению к контролю; ### р<0.001 по отношению ко второй группе. 1 — контроль, или предварительная 2-х часовая инкубация клеток в среде без добавления КС; 2-е добавлением 30% КС от КЭП, культивированных 24 часа; 3-е добавлением 30% КС от КЭП, культивированных 48 часов; 4-е добавлением 30% КС от КЭП, культивированных 72 часа.

В ходе работы было установлено, что предварительное культивирование клеток кишечника в среде с добавлением КС, полученных от КЭП через 24 и 48 часов инкубирования, приводило к статистически значимому увеличению их способности образовывать гемопоэтические КОЕс-9 по сравнению с контрольной группой в 2,5 раза (рис.2).

Полученный эффект вероятно связан с тем, что КС от КЭП в период активного кроветворения содержат различные ростовые факторы, необходимые для поддержания, созревания и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток [Hata et al.,1993; Kale et al., 1999; Qiu et al., 2005]. Объяснение того, что использование КС от КЭП, полученной через 72 часа, не привело к стимулирующему эффекту в отношении колониеобразующей активности клеток кишечника, может быть результатом того, что на 3 сутки культивирования в КС от КЭП происходит изменение спектра ростовых факторов, продуцирующихся этими клетками in situ в первые 2 дня культивирования in vitro.

При проведении опыта с клетками костного мозга (ККМ) было продемонстрировано, что предварительная культивация ККМ в среде, содержащей 30% КС, полученной через 24 часа, приводит к статистически значимому увеличению их способности образовать КОЕс-9 по сравнению с контрольной группой только в 1,2 раза (рис.2).

Полученные результаты можно объяснить относительно низким пролиферативным потенциалом костного мозга (10,5% митозов) и более высоким пролиферативным потенциалом кишечного эпителия (данный показатель составляет 53,9% митозов) [Краскина с соавт., 1988].

Таким образом, данные указывают на возможность регуляции колониеобразующей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника посредством гуморальных факторов, продуцируемых КЭП.

Известно, что на пролиферативно-дифференцировочные процессы КЭП в период активного кроветворения оказывают влияние такие факторы, как эритропоэтин и ИЛ-1р [Keller et al., 1999; Khalaf et al., 2005; Ярилин,1999; Aoki et al., 1995], и, следовательно, могут изменять спектр продуцируемых этими клетками медиаторов. В связи с этим, представлялось важным оценить влияние гуморальных факторов, продуцируемых КЭП, которые, в свою очередь, культивировали в присутствии данных цитокинов, на колониеобразующую активность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника.

Результаты работы показали, что предварительная культивация клеток кишечника в среде, содержащей 30% КС от КЭП, культивируемых 24 часа в присутствии эритропоэтина или ИЛ-ip, приводит к отмене стимулирующего эффекта КС в отношении колониеобразующей активности клеток кишечника (рис.3).

Поскольку изменение функциональной активности КЭП может наблюдаться под действием митогенных стимулов [Rabinowich et al., 1983], в нашей работе изучалось влияние КС от КЭП, культивируемых 24 часа в

присутствии конканавалина А, на способность клеток кишечника к колониеобразованию в селезенке. В результате было продемонстрировано, что предварительная культивация клеток кишечника в среде, содержащей 30% КС от КЭП, культивируемых в присутствии конканавалина А, приводит к отмене стимулирующего эффекта в отношении колониеобразующей активности (КОЕс-9) интестинальных клеток эпителиального слоя (рис. 3).

Рис. 3. Влияние кондиционных сред (КС), полученных от клеток эмбриональной печени (КЭП), на способность клеток кишечника образовывать КОЕс-9 в селезенках летально облученных животных. Клетки эпителия тонкого кишечника вводились в количестве 1,5x10* клеток/мышь. *р<0.05 по отношению к контролю; # р<0.05 по отношению ко второй группе. 1 - контроль, или предварительная 2-х часовая инкубация клеток в среде без добавления КС; 2-е 30% КС от КЭП, культивированных 24 часа без добавления растворимых факторов; 3-е 30% КС от КЭП, культивированных с эритропоэтином (2 МЕ/мл); 4-е 30% КС от КЭП, культивированных с интерлейкином-ip (8,4 нг/мл); 5-е 30% КС от КЭП, культивированных с конканавалином А (10 мкг/мл).

Можно предположить, что отмена стимулирующего эффекта обусловлена изменением спектра гуморальных факторов, продуцируемых клетками эмбриональной печени под влиянием данных цитокинов и митогена.

Следующий этап работы был посвящен изучению распределения донорских интестинальных клеток по различным органам в организме летально облученных животных, поскольку данный аспект мог внести существенный вклад в понимание явления «пластичности» соматических стволовых клеток эпителиального слоя тонкого кишечника.

Изучение распределения клеток тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента после трансплантации.

В ряде работ изучение распределения стволовых клеток in vivo основано на обнаружении меченых клеток донора в различных тканях облученного реципиента [Verfaillie et al., 2002]. В нашем исследовании в качестве такого маркера использовался ген sry - маркер Y-хромосомы [Pang et al., 2000]. Для этого мы трансплантировали клетки кишечника самцов летально облученным самкам.

Наличие донорских клеток в тканях реципиента определялось с помощью ПЦР анализа через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации. В

ходе исследования клетки, содержащие маркер У-хромосомы ген Бгу, были найдены практически во всех органах, включая костный мозг, селезенку, печень, пейеровы бляшки, кишечник, кожу, почки, легкие, сердце (рис.4).

Полученные данные свидетельствуют о приживлении клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента.

Млу 1 2

Рис. 4. Детекция гена вгу (У-хромосома) из клеток различных органов летально облученных мышей-реципиентов (самок) через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации им 1,5 х 106 клеток кишечника доноров-самцов. М«'- маркер молекулярного веса ДНК-риС19/Кго91 (955, 585, 341, 258 п.о). Стрелкой обозначен фрагмент ДНК размером 320 п.о., соответствующий ДНК гена вгу. В качестве негативного контроля использовались клетки селезенки самки (проба 1), в качестве положительного контроля — клетки самца (проба 2). Проба 3 -ткань костного мозга; проба 4 - ткань селезенки; проба 5 — ткань печени; проба б - ткань кишечника; проба 7 — клетки пейеровых бляшек; проба 8 -ткань почки; проба 9 - клетки кожи; проба 10 - ткань легкого.

Учитывая выживаемость реципиентов, которым была проведена трансплантация клеток эпителиального слоя тонкого кишечника, более 6 месяцев и способность клеток кишечника к образованию гемопоэтических колоний в селезенке, представлялось важным изучить как происходит в динамике восстановление кроветворения у летально облученных мышей с трансплантацией интестинальных клеток.

Изучение способности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза у летально облученных мышей.

Согласно литературным данным восстановление кроветворения после трансплантации костного мозга преимущественно состоит из двух процессов - восстановления численной популяции клеточных элементов и функционального восстановления костного мозга, в частности, регенерации иммунной системы [Козлов В.А. с соавт., 1982]. Поэтому в нашей работе изучение в динамике показателей крови позволило исследовать численность популяции клеточных элементов, а изучение параметров клеточного и гуморального иммунного ответа - судить о состоянии иммунной системы у летально облученных реципиентов через 1, 3 и 6 месяцев после трансплантации клеток кишечника или клеток костного мозга.

В результате через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника у летально облученных мышей

4 5 6 7 М\у 1 2 8 9 10

было показано восстановление численности популяции клеточных элементов периферической крови (таблица 1).

Восстановление общего числа лейкоцитов наблюдалось через 3 месяца после трансплантации, количество эритроцитов и тромбоцитов достигало нормативных значений к 6 месяцам. Таблица № 1.

Исследование показателей периферической крови у летально облученных мышей через 1, 3 и 6 месяцев после трансплантации им 1,5х106 клеток кишечника (группа 1) или 1,5х104 клеток костного мозга (группа 2). Контроль — группа необлученных мышей. *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001 по отношению к контрольной группе; # р<0.05 по отношению к группе 1.

Общее количество лейкоцитов/литр крови (% от контроля)

месяцы после трансплантации 1 3 6

Группа 1 68,2** 83,7 92,6

Группа 2 59,8*** 79,1 85,3

Количество тромбоцитов/литр крови (% от контроля)

месяцы после трансплантации 1 3 6

Группа 1 50,6*** 72,7* 89,5

Группа 2 68,2***/# 62,5*** 94,8

Количество эритроцитов/литр крови (% от контроля)

месяцы после трансплантации 1 3 6

Группа 1 84,6*** 91,9* 100,9

Группа 2 92,1***/# 80,8** 90,2 #

Показатель гематокрита (%)

месяцы после трансплантации 1 3 6

Группа 1 46,1 ** 54,3 52,5

Группа 2 48,7 47,9 *** 47,3 **/##

контроль 50,9 59,2 51,8

Параллельно нами было проведено сравнение способности клеток кишечника и клеток костного мозга к восстановлению кроветворения. При этом подбор доз вводимых клеток костного мозга был осуществлен таким образом, чтобы количество образованных колоний в селезенке было равно количеству колоний, образующихся при трансплантации клеток кишечника. В результате было показано, что в опытной группе, которой была проведена трансплантация клеток костного мозга, через 6 месяцев также наблюдалось восстановление до - нормального уровня числа лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов. Однако эритроидный росток и показатель гематокрита в этой группе был статистически сниженным по отношению к опытной группе с трансплантацией клеток эпителия тонкого кишечника (таблица 1). Полученные данные можно связать с высоким пролиферативным потенциалом клеток кишечника [Краскина с соавт., 1988], благодаря чему происходит более интенсивное восстановление всех ростков кроветворения.

Рис. 5. Выраженность реакции ГЗТ к ЭБ у летально облученных мышей через 1, 3 и 6 месяцев после трансплантации им 1,5х10б клеток кишечника (группа 1) или 1,5х104 клеток костного мозга (группа 2). Контроль - группа необлученных мышей. *р<0.05; ***р<0.001 по отношению к контрольной группе. Данные представлены как % от контроля.

■ контроль ш группа 1 □ группа 2

Показатели клеточного иммунитета, оцениваемые по реакции ГЗТ, у летально облученных мышей, восстанавливались через 6 месяцев после трансплантации клеток кишечника, достигая к этому сроку уровня показателей контрольной группы, в качестве которой использовались необлученные мыши (рис. 5).

Рис. 6. Содержание относительного (на 10б кл) (А) и абсолютного (В) числа ^М АОК в селезенках у летально облученных мышей через 1, 3 и 6 месяцев после трансплантации им 1,5х106 клеток кишечника (группа 1) или 1,5х104 клеток костного мозга (группа 2).

Контроль — группа необлученных мышей. *р<0.05; ***р<0.001 по отношению к

контрольной группе; ии р<0.01 по

отношению к группе 1. Данные представлены как % от контроля

В контроль ш группа 1 □ группа 2

В это же время происходило и восстановление гуморального иммунитета, оцениваемое с помощью модели первичного 1§М иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ). В обеих опытных группах в течение первых 3

~ 120 т £

й юо >1

| 80 | 60

| 40 I 20

1 мес. 3 мес. б мес.

после трансплантации

120 100 80 60

У 40 О

20 0

* * *

##

***

» * * * * *

В

1 мес. 3 мес. б мес.

после трансплантации

месяцев на фоне статистически значимого снижения абсолютного и относительного числа антителообразующих клеток (АОК) наблюдался менее выраженный гуморальный ответ у реципиентов с трансплантацией клеток костного мозга, по сравнению с летально облученными мышами, которым трансплантировали клетки эпителиального слоя тонкого кишечника (рис.6).

Таким образом, нами было показано, что способность клеток кишечника к колониеобразованию в селезенке летально облученных мышей можно использовать для восстановления кроветворения, которое происходит постепенно и достигает нормального уровня через 6 месяцев после трансплантации.

ВЫВОДЫ:

1. Клетки эпителиального слоя тонкого кишечника мыши обладают способностью к образованию в селезенке летально облученных мышей на 9-е сутки гемопоэтических колоний (КОЕс-9), представляющих собой клон донорских клеток, что подтверждается с помощью гистологического и генетического анализа.

2. Гуморальные факторы оказывают влияние на способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к колониеобразованию в селезенке летально облученных мышей, об этом свидетельствуют данные об изменении колониеобразующей активности интестинальных клеток под действием кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), культивируемых с добавлением и без ИЛ-1Р, эритропоэтина или конканавалина А.

3. Выявленная с помощью ПЦР анализа длительная персистенция донорских клеток, экспрессирующих маркер У-хромосомы ген Бгу, в разных органах самок-реципиентов через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации, свидетельствует о приживлении клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента.

4. Трансплантация клеток эпителиального слоя тонкого кишечника приводит к восстановлению кроветворения у летально облученных мышей, что подтверждается восстановлением до нормального уровня показателей периферической крови у реципиентов через 6 месяцев после трансплантации.

5. Клетки эпителия тонкого кишечника способны восстанавливать функции клеток иммунной системы, что подтверждается полноценным проявлением реакции гиперчувствительности замедленного типа и ^М антителообразования у летально облученных мышей через 6 месяцев после трансплантации.

6. Данные по способности клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза свидетельствуют о высоком гемопоэтическом потенциале интестинальных клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Влияние кондиционных сред, полученных от мышиных эмбриональных клеток печени, на колониеобразующую активность стволовых клеток кишечника. // Медицинская иммунология, 2004, т.6, № 3-5. стр.224. Материалы 8 Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге».

2. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Стимулирующий эффект кондиционных сред, полученных от мышиных эмбриональных клеток печени, на колониеобразующую активность стволовых клеток кишечника. // Материалы ежегодной конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2005» Новосибирск, 2005, стр. 107-108.

3. Vedina L.A., Sennikov S.V., Kozlov V.A., Trufakin V.A. The influence of conditioned medium from mouse embryonic liver cells on the colony-forming activity of intestinal crypt stem cells: effect of interleukin-lbeta. // Experimental Hematology. - 2005. - Vol. 33. -Issue 7 (Supplement); ISEH 2005: 34th Annual Scientific Meeting of the ISEH. - p. 112

4. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Восстановление гемопоэза стволовыми клетками тонкого кишечника. // Сборник тезисов. Российско-американская конференция «Биотехнология и онкология»,Санкт-Петербург, 2931 мая 2005 года. Стр.95

5. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Влияние кондиционных сред от мышиных эмбриональных клеток печени, культивируемых с различными медиаторами на колониеобразующую активность стволовых клеток кишечника. // Дни иммунологии в Сибири. Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. (7-9 сентября 2005 год.) Красноярск, 2005.стр.22-23.

6. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Увеличение колониеобразующей активности стволовых элементов кишечника под действием кондиционных сред, полученных от мышиных эмбриональных клеток печени. // Цитокины и воспаление. — 2005.- Т.4. - № 2. - Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» Новосибирск, 19-21 июля 2005 г. стр.106

7. Ведина Л.А., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Роль растворимых медиаторов в регуляции колониеобразующей

активности стволовых клеток кишечника. // Иммунология Урала. — 2005.-№1(4).- Стр.3-4.

8. Ведина Л.А., Шурлыгина A.B., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Колониеобразующая активность клеток кишечника. // Медицинская иммунология, 2006, т.8, № 2-3. стр. 126-127. Материалы 10 Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге».

9. Ведина Л.А., Шурлыгина A.B., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Колониеобразующая активность клеток кишечника. // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Материалы 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. Под ред. В.А. Козлова.,Новосибирск, 2006, стр. 17-20.

10. Ведина Л.А., Шурлыгина A.B., Сенников C.B., Козлов В.А., Труфакин В.А. Влияние кондиционных сред, полученных от мышиных эмбриональных клеток печени, на колониеобразующую активность клеток кишечника. // Бюллетень СО РАМН. — 2006. - №

1 (119).-с.23-26.

Подписано к печати 16.11.2006 Формат - 60x84 - 1 печатный лист

Бумага: офсетная. Печать: Duplo DP-43S Тираж: 100 экз. Номер заказа № 534 Типография ООО «ЮГУС ПРИНТ» г .Новосибирск, ул.Залесского,4

 
 

Оглавление диссертации Ведина, Любовь Александровна :: 2006 :: Новосибирск

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Пластичность соматических стволовых клеток.

1.2. Стволовая клетка тонкого кишечника и ее основные свойства.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Гистологический и генетический анализ колоний, образованных в селезенке летально облученных мышей, после трансплантации клеток кишечника.

3.2.Изучение влияния гуморальных факторов клеток эмбриональной печени (КЭП) на колониеобразующую активность клеток кишечника и клеток костного мозга.

3.2.1. Изучение влияния кондиционных сред (КС) от КЭП на способность клеток кишечника к колониеобразованию в селезенке летально облученных мышей.

3.2.2. Изучение влияния КС от КЭП, культивированных с разными растворимыми медиаторами, на колониеобразующую активность клеток кишечника.

3.3. Изучение распределения клеток тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента после трансплантации.

3.4. Изучение способности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза у летально облученных мышей

3.4.1. Изучение восстановления численной популяции клеточных элементов периферической крови у облученных реципиентов после трансплантации клеток кишечника.

3.4.2. Изучение влияния трансплантации клеток кишечника на показатели иммунного ответа у летально облученных реципиентов.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

 
 

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Ведина, Любовь Александровна, автореферат

В настоящее время одним из перспективных направлений в области биологии и медицины является изучение соматических стволовых клеток [4]. Новый взрыв интереса к стволовым клеткам особенно сильно проявился в последние годы в связи с накопившимися данными о том, что стволовые клетки взрослого организма в определенных условиях способны дать начало целому спектру клеточных типов независимо от того, из какого зародышевого слоя они происходят [50]. Наиболее часто это явление описывается как «пластичность» стволовых клеток [50, 13]. Изучение потенциала пластичности соматических стволовых клеток открывает новые возможности в заместительной клеточной терапии многих заболеваний, в том числе кроветворной и иммунной систем [4].

Существует ряд работ, в которых продемонстрировано свойство пластичности уже для многих стволовых клеток взрослого организма. С помощью культуральных методов in vitro была показана способность стволовых клеток костного мозга [85, 86], клеток кожи [175, 176], мышечной ткани [86, 33, 145], головного мозга [86], тонкого кишечника [188] дать начало тканям различных зародышевых слоев. Изучение пластичности in vivo в большинстве исследований основано на трансплантации клеток, меченных зеленым флюоресцирующим белком или Р-галактозидазой, или клеток, отличающихся по половым хромосомам (например, клетки самцов, содержащие Y-хромосому, трансплантируются самкам) [180]. Так, экспрессия маркеров, присущих донорским клеткам костного мозга, была выявлена в негемопоэтических клетках кожи, эпителия легкого [101, 173], эпителия тонкого кишечника [101, 152] эпителия почки [89], паренхимы печени [101, 105, 137, 172, 179, 184], поджелудочной железы [78] скелетной мускулатуры [29, 32,

42, 49, 54, 66, 104], эндотелия [62, 82], миокарда [82] и нейронах центральной нервной системы [30, 123, 143, 185, 186]. Также существует ряд работ, в которых показано, что стволовые клетки негемопоэтических тканей способны обладать гемопоэтическим потенциалом. Это заключение основано на способности стволовых клеток центральной нервной системы [25], клеток мышечной ткани [83] или мышечных SP клеток [66], клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани [44], клеток сосочкового слоя дермы [106] восстанавливать различные линии клеток периферической крови у летально облученных мышей.

Уникальную модель для изучения соматических стволовых клеток представляет собой эпителий тонкого кишечника, поскольку, являясь одной из наиболее быстропролиферирующих тканей организма, содержит большой пул стволовых клеток и клеток- предшественников, обеспечивающих адекватную регенерацию ткани (в англоязычной литературе применительно к эпителию употребляется понятие «turnover») [141, 142]. Стволовым клеткам кишечника также присуще свойство пластичности, демонстрируемое в ряде работ последних лет [76, 188]. Известно, что клетки тонкого кишечника in vivo в организме летально облученных мышей могут дифференцироваться в клетки кожи [76], а также трансдифференцироваться in vitro в клетки, содержащие маркеры нервной, печеночной и поджелудочной ткани [188].

Учитывая филогенетическую роль кишечника в процессах кроветворения [11], а также продемонстрированную способность ряда стволовых клеток к дифференцировке в клеточные элементы других тканей, можно предположить, что стволовые клетки тонкого кишечника также при определенных условиях смогут демонстрировать и гемопоэтический потенциал. В исследованиях, проведенных ранее в нашей лаборатории В.В.Темчурой, была показана способность клеток кишечника к образованию колоний в селезенке (КОЕс-8) летально облученных мышей-реципиентов на 8 день [10]. Однако генетическое и гистологическое подтверждение этих результатов проведено не было. В этой связи нам представлялось важным продолжить изучение колониеобразующей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника, провести гистологический и генетический анализ колоний, образованных в селезенке летально облученных мышей после трансплантации клеток кишечника, изучить возможность влияния гуморальных факторов на колониеобразующую активность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника.

Исходя их того, что в литературе отсутствуют данные, описывающие гемопоэтический потенциал клеток эпителиального слоя эпшелия тонкого кишечника, их способность восстанавливать функциональную активность клеток иммунной системы, нам представлялось актуальным изучить данный аспект биологии клеток. В частности: изучить способность клеток кишечника восстанавливать численную популяцию клеточных элементов периферической крови, а также изучить возможность восстановления показателей гуморального и клеточного иммунного ответа у летально облученных мышей после трансплантации клеток эпителия тонкого кишечника.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель данной работы - изучить гемо- и иммунопоэз-восстанавливающую активность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью гистологических и генетических методов способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний (КОЕс-9) в селезенке летально облученных мышей.

2. Исследовать возможность влияния на колониеобразующую активность клеток тонкого кишечника кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), культивируемых с добавлением и без добавления различных ростовых факторов.

3. Изучить наличие донорских клеток эпителия тонкого кишечника в различных тканях летально облученного реципиента через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации.

4. Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению кроветворения.

5. Изучить способность клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению функций клеток иммунной системы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые с помощью генетических и гистологических методов было доказано, что клетки эпителиального слоя тонкого кишечника способны к образованию в селезенке летально облученных мышей-реципиентов гемопоэтических колоний (КОЕс-9), которые представляют собой клон донорских клеток.

В работе продемонстрировано, что на способность клеток тонкого кишечника к образованию КОЕс-9 оказывают влияние кондиционные среды от клеток эмбриональной печени, полученные в период активного гистогенеза кроветворной ткани.

Впервые показано, что у летально облученного реципиента через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника происходит восстановление численной популяции клеточных элементов периферической крови. Более того, клетки эпителия тонкого кишечника обладают способностью восстанавливать и функциональную активность клеток иммунной системы. Полноценное проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа и IgM антителообразование у летально облученных мышей наблюдается через 6 месяцев после трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника. Нами также было впервые продемонстрировано, что донорские клетки эпителиального слоя тонкого кишечника, экспрессирующие маркер Y-хромосомы ген sry, длительное время персистируют в организме самок-реципиентов и обнаруживаются в различных тканях через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные результаты расширяют представление о гемопоэтическом потенциале клеток эпителия тонкого кишечника мыши, вносят существенный вклад в понимание явления «пластичности» соматических стволовых клеток, демонстрируют возможность влияния гуморальных факторов на способность клеток тонкого кишечника к образованию гемопоэтических колоний, формируют представление о гемо- и иммунопоэз-восстанавливающей активности клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученных мышей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Клетки эпителиального слоя тонкого кишечника мыши характеризуются способностью образовывать гемопоэтические колонии (КОЕс-9), восстанавливать кроветворение и функциональную активность клеток иммунной системы у летально облученных мышей.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

1. Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005 г.);

2. Семинарах группы лаборатории молекулярной иммунологии ГУНИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2005, 2006).

3. Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005 г.);

4. 7-й отчетной сессии ГУНИИКИ СО РАМН. (Новосибирск 2006 г.);

5. Симпозиуме «Клуб профессиональных иммунолоюв» (Анталия, Турция, 2006 г.)

6. Семинаре научного отдела ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2006 г.).

САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕННОЙ РАБОТЫ.

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии ГУ НИИКИ СО РАМН г. Новосибирска.

Большую признательность автор выражает научному руководителю работы д.м.н, профессору С.В. Сенникову за подробное обсуждение полученных результатов, а также сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии и лично В.В. Осипову за взаимопонимание и содействие в ходе выполнения работы.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Восстановление гемо- и иммунопоэза летально облученных мышей клетками эпителиального слоя тонкого кишечника"

ВЫВОДЫ:

1. Клетки эпителиального слоя тонкого кишечника мыши обладают способностью к образованию в селезенке летально облученных мышей на 9-е сутки гемопоэтических колоний (КОЕс-9), представляющих собой клон донорских клеток, что подтверждается с помощью гистологического и генетического анализа.

2. Гуморальные факторы оказывают влияние на способность клеток эпителиального слоя тонкого кишечника к колониеобразованию в селезенке летально облученных мышей, об этом свидетельствуют данные об изменении колониеобразующей активности интестинальных клеток под действием кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), культивируемых с добавлением и без ИЛ-1Р, эритропоэтина или конканавалина А.

3. Выявленная с помощью ПЦР анализа длительная персистенция донорских клеток, экспрессирующих маркер Y-хромосомы ген sry, в разных органах самок-реципиентов через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации, свидетельствует о приживлении клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента.

4. Трансплантация клеток эпителиального слоя тонкого кишечника приводит к восстановлению кроветворения у летально облученных мышей, что подтверждается восстановлением до нормального уровня показателей периферической крови у реципиентов через 6 месяцев после трансплантации.

Клетки эпителия тонкого кишечника способны восстанавливать функции клеток иммунной системы, что подтверждается полноценным проявлением реакции гиперчувствительности замедленного типа и IgM антителообразования у летально облученных мышей через 6 месяцев после трансплантации.

Данные по способности клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению гемо- и иммунопоэза свидетельствуют о высоком гемопоэтическом потенциале интестинальных клеток.

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Обобщая полученные результаты можно заключить, что в результате трансплантации клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в селезенке летально облученного реципиента происходит формирование КОЕс-9, которые, как было продемонстрировано в нашей работе с помощью гистологического и генетического анализа, являются гемопоэтическими колониями и представляют собой клон донорских клеток кишечника.

Нами было показано, что увеличить в 2,5 раза способность клеток эпителия тонкого кишечника к колониеобразованию в селезенке можно с помощью кондиционных сред (КС) от клеток эмбриональной печени (КЭП), полученных в период активного гистогенеза кроветворной ткани. При этом под влиянием КС от КЭП также наблюдается и увеличение функциональной активности клеток костного мозга, но только в 1,2 раза. Полученные нами данные указывают на возможность регуляции колониеобразующей активности клеток тонкого кишечника посредством гуморальных факторов, продуцируемых КЭП.

Изучение влияния КС от КЭП, культивируемых с различными ростовыми факторами (эритропоэтин, интерлейкин-1|3) или митогеном (конканавалин А), на колониеобразующую активность клеток тонкого кишечника выявило отсутствие стимулирующего эффекта КС в отношении способности клеток тонкого кишечника к колониеобразованию в селезенке летально облученных мышей.

Изучение распределения трансплантированных клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме легально облученных мышей выявило персистирование донорских клеток, несущих маркер Y-хромосомы ген sry, в течение длительного срока в разных органах самок-реципиентов. С помощью ПЦР анализа наличие потомков клеток тонкого кишечника было показано через 2, 4 'и 6 месяцев после трансплантации в костном мозге, селезенке, печени, пейеровых бляшках, кишечнике, коже, почке, легком и сердце. Полученные данные свидетельствуют о приживлении клеток эпителиального слоя тонкого кишечника в организме летально облученного реципиента.

Трансплантация клеток эпителия тонкого кишечника приводила к восстановлению численности популяции клеточных элементов периферической крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов) у летально облученных мышей через 6 месяцев от начала трансплантации. Через 6 месяцев после трансплантации также наблюдалось полноценное проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа и IgM антителообразование, что свидетельствовало о восстановлении функциональной активности клеток иммунной системы. Также нами было проведено сравнение способности клеток кишечника и клеток костного мозга восстанавливать гемо- и иммунопоэз у летально облученных мышей-реципиентов. Подбор доз вводимых клеток костного мозга осуществлялся таким образом, чтобы количество образованных колоний в селезенке было равно количеству колоний, образующихся при трансплантации клеток кишечника. Результаты показали, что в опытной группе, которой была проведена трансплантация клеток костного мозга, через 6 месяцев также наблюдалось восстановление до нормального уровня числа лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов. Однако эритроидный росток и показатель гематокрита в этой группе были статистически снижены по отношению к опытной группе с трансплантацией клеток эпителия тонкого кишечника. Восстановление показателей гуморального и клеточного ответа происходило также через 6 месяцев, но при этом стоит отметить, что в данной опытной группе мышей наблюдался менее выраженный гуморальный ответ через 3 месяца после трансплантации клеток костного мозга по сравнению с группой летально облученных мышей, которым трансплантировали клетки кишечника.

Таким образом, данные по способности клеток эпителия тонкого кишечника к восстановлению гемо-, иммунопоэза сопоставимы с данными по восстановлению этих функций клетками костного мозга, что указывает на высокий гемопоэтический потенциал клеток эпителия тонкого кишечника. Способность клеток тонкого кишечника формировать гемопоэтические колонии в селезенке летально облученных мышей можно использовать для восстановления гемо- и иммунопоэза, а также регулировать с помощью гуморальных факторов, продуцирующихся КЭП.

 
 

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Ведина, Любовь Александровна

1. Голдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск, 1992, 272 с.

2. Гуськова Л.В. Экспрессия генов цитокинов в клетках эритроидного ряда // Автореф. канд. дисс., Новосибирск, 1995.

3. Егоров В.В., Иванов А.А., Пальцев М.А. Стволовые клетки человека. // Молекулярная медицина. -2003.- № 2.- с. 3-14.

4. Зуева Е.Е., Куртова А.В., Комарова Л.С. Стволовые клетки. Некоторые биологические особенности и терапевтические возможности. // Гематология. 2005. -Том 6. - с. 705-724.

5. Инжелевская Т.В. Продукция гемо-иммунорегуляторных цитокинов клетками эритроидного ряда мыши и человека. // Автореф. канд. дисс., Новосибирск, 2001.

6. Козлов В.А., Журавкин И.Н., Цырлова И.Г. Стволовая кроветворная клетка и иммунный ответ. Новосибирск: Наука, 1982, 222 с.

7. Максимов А.А. Основы гистологии. М.,1925.

8. Репин B.C., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. М., 2002

9. Ю.Темчура В.В. Роль растворимых факторов, продуцируемых эпителиальными клетками тонкого кишечника мыши, в регуляции гемо-, иммуно-, и энтеропоэза. // Автореф. канд. дисс., Новосибирск, 2001.

10. П.Хрущев Г.К. Эволюция кроветворных органов позвоночных. // Лимфоидная ткань в восстановительных и защитных процессах. Наука, 1966. - С.7-24.

11. Чертков И.Л., Гуревич О.А. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение.- М.: Медицина, 1984, 240 с.

12. Чертков И.Л., Дризе Н.И. «Пластичность» костномозговых стволовых клеток. // Терапевтический архив -2004.- № 7.- с. 5-11.13а. Чертков И.Л.,Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения. М.: Медицина, 1977. 274 с.

13. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., 1999.

14. Asakura A., Seale P., Girgis-Gabardo A., Rudnicki М.А. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. // J. Cell Biol. 2002. - Vol. 159. - №1. - pp. 123134.

15. AIonso L., Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - pp. 1 18301 1835.

16. Alvi A.J., Clayton H., Joshi C., Enver Т., Ashworth A., Vivanco M.M., Dale T.C., Smalley M.J. Functional and molecular characterisation of mammary side population cells. // Breast Cancer Res. 2003. - Vol. 5. - № 1. - Rl-8.

17. Anderson D.J., Gage F.H., Weissman I.L. Can stem cells cross lineage boundaries? // Nat. Med. 2001. - Vol.7. - pp. 393-395.

18. Anderson J.M. Multinucleated giant cells. // Curr. Opin. Hematol. 2000. - Vol.7, - pp. 40-47.

19. Aoki I., Homori M., Nakahara K., Higashi K., Ishikawa K. Effects of rhIL-1 alpha, rhIL-1 beta, and rhIL-1 receptor antagonist on erythroid progenitors (CFU-E and BFU-E) in human bone marrow. // Exp. Hematol. 1995. - Vol. 23. - № 3. - pp. 217-225.

20. Beltrami A.P., Barlucchi L., Torella D., Baker M., Limana F., Chimenti S., Kasahara H., Rota M., Musso E., Urbanek K. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. // Cell. 2003. - Vol.114. - pp. 763-776.

21. Bianco P., Cossu G. Uno, nessuno e centomila: searching for the identity of mesodermal progenitors. // Exp. Cell Res. -1999. Vol. 251. - pp .257-263.

22. Bjerknes M., Cheng H. Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors. // Gastroenterology.- 1999. -Vol.116.-pp. 7-14.

23. Bjornson C.R., Rietze R.L., Reynolds B.A., Magli M.C., Vescovi A.L. A turning brain into blood a hematopoietic fate adopted by neural stem cells in vivo. // Science. 1999. -Vol. 283. - pp. 534-537.

24. Blau H.M., Brazelton T.R., Weimann J.M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? // Cell. 2001. -Vol.105. - pp. 829-841.

25. Bonner-Weir S., Sharma A. Pancreatic stem cells. // J. Pathol. 2002. - Vol.197. - pp. 519-526.

26. Booth C., Potten C.P. Gut instincts: thoughts on intestinal epithelial stem cells.// J. Clin. Invest. -2000. -Vol. 105. -No. 11. pp. 1493-1499.

27. Brazelton T.R., Nystrom M., Blau H.M. Significant differences among skeletal muscles in the incorporation of bone marrow-derived cells. // Dev. Biol. -2003. Vol. 262. -pp. 64-74.

28. Brazelton T.R., Rossi F.M., Keshet G.I., Blau H.M. From marrow to brain: expression of euronal phenotypes in adult mice. // Science. 2000. - Vol. 290. - pp. 1775-1779.

29. Brockes J.P., Kumar A. Plasticity and reprogramming of differentiated cells in amphibian regeneration. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - Vol.3, - pp. 566-574.

30. Camargo F.D., Green R., Capetenaki Y., Jackson K.A., Goodell M.A. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. // Nat. Med.- 2003. Vol.9, - pp. 1520-1527.

31. Capela A., Temple S. LeX/ssea-1 is expressed by adult mouse CNS stem cells, identifying them as nonependymal. // Neuron. 2002. - Vol.35. - pp. 865-875.

32. Castro R.F., Jackson K.A., Goodell M.A., Robertson C.S., Liu H., Shine,H.D. Failure of bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. // Science. -2002. Vol.297, - pp. 1299.

33. Chandrasena G., Sunitha I., Lau C., Nanthakumar N.N., Henning S.J. Expression of sucrase-isomaltase mRNA along the villus-crypt axis in the rat small intestine. // Cell Mol Biol. 1992. - Vol. 38. - № 3. - pp. 243-254.

34. Chang K.T., Sefc L., Psenak O., Vokurka M., Necas E. Early fetal liver readily repopulates В lymphopoiesis in adult bone marrow. // Stem Cells. 2005. - Vol. 23. - № 2.- pp. 230-239.

35. Cheng H., Bjerknes M. Whole population cell kinetics and postnatal development of the mouse intestinal epithelium. // Anat. Rec. 1985.- Vol. 211. - № 4. - pp. 420-426.

36. Cheng H., Leblond С.P. Origin, differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. // Am. J. Anat. 1974. - Vol. 141. - № 4. - pp.537-561.

37. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress В., Nilsson E., Karlstrom H., Lendahl U., Frisen J. Generalized potential of adult stem cells. // Science. 2000. - Vol. 288. - pp. 1660-1663.

38. Corbel S.Y., Lee A., Yi L., Duenas J., Brazelton T.R., Blau H.M., Rossi,F.M. Contribution of hematopoietic stem cells to skeletal muscle. // Nat. Med. 2003. - Vol.9, - pp. 15281532 .

39. Cosentino L., Shaver-Walker P., Heddle J.A. The relationships among stem cells, crypts, and villi in the small intestine of mice as determined by mutation tagging. // Dev. Dyn. 1996. - Vol. 207. - № 4. - pp. 420-428.

40. Cousin В., Andre M., Arnaud E. et al. Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissue. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 301.- № 4.- pp. 1016-1022.

41. Cunningham A.J., Szenberg A. Further improvement in the plaque technique for detecting single antibody forming cells. // Immunol.- 1968.- Vol.14.- pp. 599-600.

42. Dekaney C.M, Rodriguez J.M, Graul M.C, Henning S.J. Isolation and characterization of a putative intestinal stem cell fraction from mouse jejunum.// Gastroenterology. -2005. Vol. 129.- № 5. - pp. 1567-1580.

43. Ema H., Douagi L., Cumano A.et al. Development of T cell precursor activity in the murine fetal liver. // Eur J Immunol. 1998. - Vol. 28. - pp. 1563-1569.

44. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. // Science. 1998. - Vol.279. - pp. 528-530.

45. Filip S., English D., Mokry J. Issues in stem cell plasticity // J. Cell. Mol. Med. 2004. - Vol. 8. - No 4. - pp. 572577.

46. Forbes S., Vig P., Poulsom R., Thomas H., Alison M. Hepatic stem cells. // J. Pathol. 2002. - Vol.197. - № 4. -pp. 510-518.

47. Foster C.S., Dodson A., Karavana V., Smith P.H., Ke Y. Prostatic stem cells. // J. Pathol. 2002. - Vol. 197. - № 4. -pp. 551-565.

48. Fu X., Sun X., Li X., Sheng Z. Dedifferentiation of epidermal cells to stem cells in vivo. // Lancet. 2001. -Vol. 358. - № 9287. - pp. 1067-1068.

49. Gandarillas A, Watt F.M. c-Myc promotes differentiation of human epidermal stem cells. // Genes Dev. 1997. - Vol.11.- № 21. pp. 2869-2882.

50. Giangreco A., Shen H., Reynolds S.D., Stripp B.R. Molecular pheno-type of airway side population cells. // Am. J. Physiol. 2004. - Vol.286. - pp. L624-L630.

51. Goodell M., Brose K., Paradis G., Conner A., Mulligan R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. // J. Exp Med. 1996.- Vol.183. pp. 1797-1806.

52. Goodell M., Rosenzweig M., Kim H. et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing lowor undetectable levels of 34 antigen exist in multiple species. // Nat. Med. -1997. -Vol.3. pp. 1337-1345.

53. Goodell M.A. Stem-cell „plasticity": befuddled by the muddle. // Curr. Opin. Hematol. 2003. - Vol. 10. - pp. 208-213.

54. Gordon J.I., Hermiston M.L. Differentiation and self-renewal in the mouse gastrointestinal epithelium.// Current Opinion in Cell Biology. 1994. - Vol. 6. - No.6.- pp.795803.

55. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J., Shi S., Graves S.E., Kortesidis A., Simmons P.J. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. // J. Cell Sci. 2003. - Vol.116, -pp. 1827-1835.

56. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C. et al. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. // Nature. 1999. - Vol.401. - pp. 390-394.

57. Gutierrez-Ramos J.C, Olsson C, Palacios R. Interleukin (IL1 to IL7) gene expression in fetal liver and bone marrow stromal clones: cytokine-mediated positive and negative regulation. // Exp. Hematol. 1992. - Vol.20. - № 8. - pp. 986-990.

58. Hakelien A.M., Landsverk H.B., Robl J.M., Skalhegg B.S., Collas P. Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts. // Nat. Biotechnol. 2002. -Vol.20.-№5.-pp. 460-466.

59. Hamad M., Whetsell M., Wang J., Klein J.R. T cell progenitors in the murine small intestine.// Dev. Сотр. Immunol.- 1997.- Vol.21.- No.5.- pp.435-442.

60. Hamad M. Preferential repopulation of the small intestine by gut-derived T cell precursors in the murine system.// Cytobios. 1999.- Vol. 97.- pp.35-44.

61. Harris H., Watkins J.F., Campbell G.L., Evans E.P., Ford C.E. Mitosis in hybrid cells derived from mouse and man. // Nature. 1965. - Vol.207. - pp. 606-608.

62. Harris H. Behaviour of differentiated nuclei in heterokaryons of animal cells from different species.// Nature. 1965. - Vol.206, - pp. 583-588.

63. Harris R.G., Herzog E.L., Bruscia E.M., Grove J.E., Van Arnam J.S., Krause D.S. Lack of a fusion requirement for development of bone marrow-derived epithelia. // Science. -2004. Vol.305. - № 5680. - pp. 90-93.

64. Hata M., Nanno M., Doi H. et al. Establishment of a hepatocytic epithelial cell line from the murine fetal liver capable of promoting hemopoietic cell proliferation. Ill J. Cell. Physiol. 1993. - Vol.154. - № 2. - pp. 381-392.

65. He D.N., Qin H., Liao L., Li N., Zhu W.M., Yu B.J., Wu X., Zhao R.C., Li J.S. Small intestinal organoid-derived SP cells contribute to repair of irradiation-induced skin injury. // Stem Cells Dev. 2005.- Vol. 14. -No. 3. - pp. 285-291.

66. Jackson K., Majka S.M., Wang H. et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. // J.Clin Invest. 2001. - Vol.107. - pp. 13951402.

67. Jackson K. A., Mi Т., Goodell M. A. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle.// Immunology. 1999. - Vol. 96. -Issue 25. - pp. 14482-14486.

68. Janowska-Wieczorek A., Majka M., Ratajczak J., Ratajczak M. Z. Autocrine/Paracrine Mechanisms in Human Hematopoiesis. // Stem Cells. 2001. - Vol. 19. - № 2. - pp. 99-107.

69. Jiang Y., Vaessen В., Lenvik Т., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C.M. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. // Exp. Hematol. 2002. - Vol.30, - pp. 896-904.

70. Johnson G.R., Barker D.C. Erythroid progenitor cells and stimulating factors during murine embryonic and fetal development. // Exp Hematol. 1985. - Vol. 13. - № 3. - pp. 200-208.

71. Jones R.O. Ultrastructural analysis of hepatic haematopoiesis in the foetal mouse. // J Anat. 1970. - Vol. 107.-pp. 301-314.

72. Kale S., Karihaloo A., Clark P.R., Kashgarian M., Krause D.S., Cantley,L.G. Bone marrow stem cells contribute to repair of the ischemically injured renal tubule.// J. Clin. Invest. 2003. - Vol.112. - pp. 42-49.

73. Kale V.P., Limaye L.S. Stimulation of adult human bone marrow by factors secreted by fetal liver hematopoietic cells: in vitro evaluation using semisolid clonal assay system. // Stem Cells. 1999. - Vol .17. - № 2. - pp. 107116.

74. Kashiwakura I., Murakami M., Hayase Y., Takagi Y. Partial purification and characterization of a factor for the enhancement of colony formation in vitro by myeloid progenitor cells.// Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1992.- Vol. 40.- No.4.-pp.961-964.

75. Kawada H., Ogawa M. Bone marrow origin of hematopoietic progenitors and stem cells in murine muscle. // Blood.2001. Vol.98. - pp. 2008-2013.

76. Keller G., Lacaud G., Robertson S. Development of the hematopoietic system in the mouse. // Exp Hematol. 1999. - Vol. 27. - № 5. - pp. 777-787.

77. Kennea N.L, Mehmet H. Neural stem cells. // J. Pathol.2002. Vol. 197. - № 4. - pp. 536-550.

78. Khalaf W.F., White H., Wenning M.J., Orazi A., Kapur R., Ingram D.A. K-Ras is essential for normal fetal liver erythropoiesis. // Blood. 2005. - Vol .105. - № 9. - pp. 3538-3541.

79. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature. -1975. Vol. 256. - pp. 495-497.

80. Komorowski S., Baranowska В., Maleszewski M. CD9 protein appears on growing mouse oocytes at the time when they develop the ability to fuse with spermatozoa. // Zygote.- 2006. Vol.14. - № 2 . - pp. 119-23.

81. Kondo M., Wagers A.J., Manz M.G., Prohaska S.S., Scherer D.C., Beilhack G.F., Shizuru, J.A. Weissman, I.L. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. // Annu. Rev. Immunol.- 2003.- Vol.21,-pp. 759-806.

82. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I., Henegariu O., Hwang S., Gardner R., Neutzel S., Sharkis S.J. Multiorgan, multi-lineage engraftment by a single bone marrowderived stem cell. // Cell. 2001. - Vol.105. - pp. 369-377.

83. Kurata H., Mancini G.C., Alespeiti G., Migliaccio A.R., Migliaccio G. Stem cell factor induces proliferation and differentiation of fetal progenitor cells in the mouse. // Br. J. Haematol. 1998. - Vol.101. - № 4. - pp. 676-687.

84. LaBarge M.A., Blau H.M. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell tomultinucleate muscle fiber in response to injury. //Cell. -2002. Vol.111,-pp. 589-601.

85. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M., Reitsma M., Dohse M., Osborne L., Wang X., Finegold M., Weissman I.L., Grompe M. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. // Nat. Med. 2000. -Vol. 6. - pp. 1229-1234.

86. Lako M., Armstrong L., Cairns P.M., Harris S., Hole N., Jahoda C.A. Hair follicle dermal cells repopulate the mouse haematopoietic system. // J. Cell Sci. 2002. -Vol.115.-pp. 3967-3974.

87. Bjerknes M., Cheng H. Intestinal epithelial stem cells and progenitors. // Methods Enzymol. 2006. - Vol.419. -pp.337-383.

88. Leedham SJ, Brittan M, McDonald SA, Wright NA. Intestinal stem cells. // J. Cell Mol. Med. 2005. - Vol. 9. -№ 1. - pp. 11-24.

89. Leon F., Roldan E., Sanchez L., Camarero C., Bootello A., Roy G. Human smali-intestinal epithelium contains functional natural killer lymphocytes. // Gastroenterology. -2003. Vol. 5. - pp. 345-356.

90. Lin C.S., Lim S.K., D'Agati V., Costantini F. Differential effects of an erythropoietin receptor gene disruption on primitive and definitive erythropoiesis. // Genes Dev. 1996. - Vol.10. - № 2. - pp. 154-64.

91. Lynch L., O'Donoghue D., fDean J., O'Sullivan J., O'Farrelly C., Golden-Mason L. Detection and Characterization of Hemopoietic Stem Cells in the Adult Human Small Intestine. // The Journal of Immunology. -2006.-Vol. 176.-pp. 5199-5204.

92. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D. Stem Cell Biology. // Cold Spring Harbor, New York, 2001.

93. Matsumoto Т., Okamoto R., Yajima Т., Mori Т., Okamoto S., Ikeda Y., Mukai M., Yamazaki M., Oshima S., Tsuchiya K., Nakamura Т., Kanai Т., Okano H., Inazawa J.,

94. Hibi Т., Watanabe M. Increase of bone marrow-derived secretory lineage epithelial cells during regeneration in the human intestine. //

95. Gastroenterology. 2005. - Vol. 128. - № 7. - pp. 18511867.

96. Mauro A. Satellite cells of muscle skeletal fibers. // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. - Vol. 9. - pp. 493-495.

97. McCune J.M., Rabin L.B., Feinberg M.B., Lieberman M., Kosek J.C., Reyes G.R., Weissman I.L. Endoproteolytic cleavage of gp 160 is required for the activation of human immunodeficiency virus.// Cell. 1988. - Vol.53. - pp. 5567.

98. McKinney-Freeman S.L., Majka S.M., Jackson K.A., Norwood K., Hirschi K.K., Goodell M. A. Altered phenotype and reduced function of muscle-derived hematopoietic stem cells. // Exp.Hematol.- 2003. Vol. 31. - pp. 806-814.

99. McKinney-Freeman SL, Jackson KA, Camargo FD, Ferrari G, Mavilio F, Goodell MA. Muscle-derived hematopoietic stem cells are hematopoietic in origin. // Proc Natl Acad Sci USA. -2002. Vol.99. - pp. 1341-1346.

100. Metcalf D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factor// Cell. -1985.- Vol.43.- No.l.- pp.5-6.

101. Mezey E., Chandross K.J., Harta G., Maki R.A., McKercher S.R. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. // Science. 2000. - Vol. 290. - pp. 1779-1782.

102. Miyado K., Yamada G., Yamada S., Hasuwa H., Nakamura Y., Ryu F., Suzuki K., Kosai K., Inoue K., Ogura A., et al. Requirement of CD9 on the egg plasma membrane for fertilization. // Science. 2000. - Vol.287. - pp. 321324.

103. Morrison S.J., White P.M., Zock C., Anderson D.J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. // Cell. 1999. - Vol.96. - pp. 737-749.

104. Murtaugh L.C., Melton D.A. Genes, signals, and lineages in pancreas development.// Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2003. - Vol. 19. - pp. 71-89.

105. Odelberg S.J., Kollhoff A., Keating M.T. Dedifferentiation of mammalian myotubes induced by msxl. //Cell.-2000.- Vol.103.-pp. 1099-1109.

106. Ohteki T.S., Ho H. Suzuki T. W., Мак Ohashi. P.S. Role for IL-15/IL-15 receptor 5-chain in natural killer 1.1 + T cell receptor-aP cell development. // J. Immunol. 1997. -Vol. 159. - pp. 5931-5935.

107. Окапо H. Two major mechanisms regulating cell-fate decisions in the developing nervous system. // Dev. Growth Diff. 1995. - Vol.37. - pp. 619-629.

108. Ono K., Yoshihara K., Suzuki H., Tanaka K.F., Takii Т., Onozaki K., Sawada M. Preservation of hematopoietic properties in transplanted bone marrow cells in the brain. // J. Neurosci. Res. 2003. - Vol.72. - pp. 503-507.

109. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. // Nature. 2001. -Vol. 410. - pp. 701-705.

110. Oyama K., Nakagawa H., Harada H., Andl C., Takaoka M., Rustgi A.K. Murine oral-epithelial cells have a subpopulation of potential stem cells. // Gastroenterology. -2003. Vol.124. - A-457.

111. Palis J., Robertson S., Kennedy M., Wall C., Keller G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. // Development. -1999. Vol. 126. - № 22. - pp. 5073-5084.

112. Pang W. Role of muscle-derived cells in hematopoietic reconstitution of irradiated mice. // Blood. 2000. - Vol. 95. - № 3. - pp. 1106-1 108.

113. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. // Science. 1999. - Vol.284. - pp. 1 168-1170.

114. Potten C.S., Booth C., Pritchard D.M The intestinal epithelial stem cell: the mucosal governor.// Int. J Exp. Path. 1997.- Vol. 78.-pp.219-243.

115. Potten C.S., Booth C., Tudor G.L., Booth D., Brady

116. G., Hurley P., Ashton G., Clarke R., Sakakibara S., Okano

117. H. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. // Differentiation. 2003. - Vol. 71. - № 1. - pp. 28-41.

118. Potten C.S, Ellis J.R. Adult small intestinal stem cells: identification, location, characteristics, and clinical applications. // Ernst. Schering Res Found Workshop.-2006. Vol.60. - pp. 81-98.

119. Potten C.S. Stem cells in gastrointestinal epithelium: numbers, characteristics and death. // Philos Trans R Soc1.nd В Biol Sci. 1998. - Vol. 353. - № 1370. - pp. 821830.

120. Priller J., Persons D.A., Klett F.F., Kempermann G., Kreutzberg G.W., Dirnagl U. Neogenesis of cerebellar Purkinje neurons from gene-marked bone marrow cells in vivo.// J. Cell Biol. 2001. - Vol. 155.-pp. 733-738.

121. Rabinowich H., Bahary C., Ben-Aderet N., Klajman A. Cellular and humoral suppressor activity induced by concanavalin A-stimulated human fetal liver cells. // Transplantation. 1983. - Vol. 35.-№ 5. - pp. 452-458.

122. Raff M. Adult stem cell plasticity: fact or artifact? //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. -2003. Vol.19. - pp. 1-22.

123. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. // Science. 1992. - Vol.255. - pp. 1707— 1710.

124. Rietze R.L., Valcanis H., Brooker G.F., Thomas Т., Voss A.K., Bartlett P.F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. // Nature. 2001. -Vol.412.-pp. 736-739.

125. Rizvi A.Z., Hunter J.G., Wong M.H. Gut-derived stem cells. // Surgery. 2005. - Vol.137. -№ 6. - pp. 585-590.

126. Rizvi A.Z., Swain J.R., Davies P.S. et al. Bone marrow-derived cells fuse with normal and transformed intestinal stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006. -Vol. 103. №16. - pp.6321-5.

127. Rolfs A., Schuller I., Finckh U. et al. PCR: clinical diagnostics and reseach. 1992, pp.271

128. Rutenberg M.S., Hamazaki T. Singh A.M., Terada N. Stem cell plasticity, beyond alchemy. // Int. J. Hematol. -2004. Vol. 79. - pp. 15-21.

129. Sakane N, Asano Y, Kawamura T, Takatani T, Kohama Y, Tsujikawa K, Yamamoto H. Aminopeptidase N/CD13 regulates the fetal liver microenvironment of hematopoiesis. // Biol. Pharm Bull. 2004. - Vol.27. - № 12. - pp. 20142020.

130. Schuldiner M., Yanuka 0., Itskovitz-Eldor J., Melton D.A., Benvenisty N. Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol.97. - pp. 11307-11312.

131. Seale P., Rudnicki M.A. A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells. //.Dev. Biol. 2000. - Vol. 218. - № 2. - pp. 115-124.

132. Shen C.N, Horb M.E, Slack J.M., Tosh D. Transdifferentiation of pancreas to liver. // Mech. Dev.2003. Vol.120. - № 1. - pp. 107-116.

133. Shen C.N., Slack J.M., Tosh D. Molecular basis of transdifferentiation of pancreas to liver. // Nat Cell Biol. -2000. Vol.2. - pp. 879-887.

134. Smith L.G., Weissman I.L., Heimfeld S. Clonal analysis of hematopoietic stem-cell differentiation in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88 .- pp. 27882792.

135. Spangrude G.J, Smith L, Uchida N, Ikuta K, Heimfeld S, Friedman J, Weissman I.L. Mouse hematopoietic stem cells. // Blood. 1991. - Vol.78. - pp. 1395-1402.

136. Speekenbrink А.В.J., Parrott D.M.V. Modulation of in vitro thymidine incorporation into crypt cells from the murine small intestine.// Cell Tissue Kinet. 1987. - Vol. 20.- pp 135-144.

137. Spradling A., Drummond-Barbosa D., Kai Т. Stem cells find their niche .// Nature. 2001. - Vol.414. - pp. 98104.

138. Stemple D.L., Anderson D. J. Lineage diversification of the neural crest: in vitro investigations. // Dev. Biol. -1993. Vol.159. - pp. 12-23.

139. Stocum D.L. Development. A tail of transdifferentiation. // Science. 2002. - Vol. 298. - № 5600. - pp. 1901-1903.

140. Suzuki A, Zheng YY, Kaneko S, et al. Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver. // J Cell Biol.- 2002.-Vol.156.-pp. 173-184.

141. Tachibana I., Hemler M.E. Role of transmembrane 4 superfamily (TM4SF) proteins CD9 and CD81 in muscle cell fusion and myotube maintenance. //J. Cell Biol. 1999. -Vol.146. - pp. 893-904.

142. Tanaka E.M. Cell differentiation and cell fate during urodele tail and limb regeneration. // Curr. Opin. Genet. Dev.- 2003.- Vol.13. pp. 497-501.

143. Tang D.G., Tokumoto Y.M., Apperly J.A., Lloyd A.C., Raff M.C. Lack of replicative senescence in cultured rat oligodendrocyte precursor cells. // Science. 2001. -Vol.291. - pp. 868-871.

144. Theise N.D., Badve S., Saxena R., Henegariu O., Sell S., Crawford J.M., Krause D.S. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. // Hepatology. 2000. - Vol.31. - № 1. - pp. 235-240.

145. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. // Radiat. Res. 1961. - Vol. 14. - pp. 213-222.

146. Toma J.G., McKenzie I.A., Bagli D., Miller F.D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. // Stem Cells. 2005. - Vol. 6. -pp. 727-37.

147. Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J., Barnabe-Heider F., Sadikot A., Kaplan, D.R., Miller, F.D. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis ofmammalian skin. // Nat. Cell Biol. 2001. - Vol. 3. - pp. 778-784.

148. Uchida N., Buck D.W., He D., Reitsma M.J., Masek M., Phan T.V., Tsukamolo A.S., Gage F.H., Weissman I.L. Direct isolation of human central nervous system stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - - pp. 14720-14725.

149. Vallieres L., Sawchenko P.E. Bone marrow-derived cells that populate the adult mouse brain preserve their hematopoietic identity.// J. Neurosci. 2003. - Vol. 23. -pp. 5197-5207.

150. Vassilopoulos G., Wang P.R., Russell D.W. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. // Nature . 2003. - Vol.422. - pp. 901-904.

151. Verfaillie C.M., Pera M.F., Lansdorp P.M. Stem cells, hype and reality. // Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). 2002. - pp. 369-391.

152. Vignery A. Osteoclasts and giant cells: macrophage-macrophage fusion mechanism.// Int. J. Exp. Pathol. 2000. Vol.81, - pp. 291-304.

153. Wagers A.J., Sherwood R.I., Christensen J.L., Weissman I.L.Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells.// Science. 2002. - Vol.297, -pp. 2256-2259.

154. Wagers A.J., Weissman I.L. Plasticity of Adult Stem Cells. // Cell. 2004. - Vol. 116. - pp. 639-648.

155. Wang X., Willenbring H., Akkari Y., Torimaru Y., Foster M., Al-Dhalimy M., Lagasse E., Finegold M., Olson S., Grompe M. Cell fusion is the principal source of bonemarrow-derived hepatocytes. // Nature. 2003. - Vol. 24. -№ 422. - pp. 897-901.

156. Weimann J.M., Charlton C.A., Brazelton T.R., Hackman R.C., Blau H.M. Contribution of transplanted bone marrow cells to Purkinje neurons in human adult brains. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol.100. - pp. 20882093.

157. Weimann J.M., Johansson C.B., Trejo A., Blau H.M. Stable reprogrammed heterokaryons form spontaneously in Purkinje neurons after bone marrow transplant. // Nat. Cell Biol.- 2003.- Vol.5.-pp. 959-966.

158. Welm B.E., Tepera S.B., Venezia Т., Graubert T.A., Rosen J.M., Goodell M.A. Sca-l(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. // Dev. Biol. 2002. - Vol.245. - pp. 42-56.

159. Wiese C., RoIIetschek A., Kania G., Blyszczuk P., Tarasov K.V., Tarasova Y., Wersto R.P., Boheler K.R., Wobus A.M. Nestin expression—a property of multi-lineageprogenitor cells? // Cell Mol. Life Sci. 2004. - Vol. 61. -№19-20. - pp. 2510-2522.

160. Winton D.J. Stem cells in the epithelium of the small intestine and colon. In: Marshak DR, ed. Stem cell biology. Cold Spring Harbor monograph series 40. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Har-bor Laboratories. 2001. -pp. A515-A536.

161. Wong M.H. Regulation of intestinal stem cells. // J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2004. - Vol.9. - № 3. -pp. 224-228.

162. Woodward J., Jenkinson E. Identification and characterization of lymphoid precursors in the murine intestinal epithelium. // Eur. J. Immunol. 2001. - Vol.31. -№ 11. - pp. 3329-3338.

163. Wulf G.G., Luo K.L., Jackson K.A., Brenner M.K., Goodell M.A. Cells of the hepatic side population contribute to liver regeneration and can be replenished with bone marrow stem cells. // Haematologica. 2003. - Vol.88. -pp. 368-378.

164. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto Т., Nomoto K., Takeya K. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice. // Immunology. 1979. - Vol. 38. - № З.-рр. 577-583.

165. Yoshimoto Т., Wang C.R., Yoneto Т., Matsuzawa A., Cruikshank W.W., Nariuchi H. Role of IL-16 in delayed-typehypersensitivity reaction. // Blood. 2000. - Vol. 95. - № 9.-pp.2869-2874.