Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антитоксинная, антитоксическая и иммунотропная активность некоторых производных имидазола

у\ и

г о ^ ^

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московский ордена Трудового Красного Знамени Медицинский стоматологический институт имени Н. Л. Семашко

На правах рукописи

НИКОЛАЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

УДК 547.781.1:0!5.373.3

АНТИТОКСИИНАЯ, АНТИТОКСИЧЕСКАЯ И ИММУНОТРОПНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИМИДАЗОЛА

14.00.25 — фармакология

Д И С С Е Р Т А Ц И Я

на соискание ученой степени доктора медицинских наук в форме научного доклада

Москва 1993

Работа выполнена в АО «Биотехнология» г. Москва.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских' наук, профессор П. В. РЯЖЕНОВ

доктор медицинских наук. А. И. МАЙСКИЙ

доктор медицинских наук, профессор А. А. ПОДКОЛЗИН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ —

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится « » 1993 г. в I ^ час.

на заседаинн специализированного совета Д 084.08.01 при Московском ордена Трудового Красного Знамени медицинском стоматологическом институте им. Н. А. Семашко но адресу: ул. Долгоруковская, 18, 'строение 4.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ММСП им. Н. 'А. Семашко по адресу: ул. Вучстича, д. 9 а

Автореферат разослан .^"У^У^^Ь . 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета в ММСИ им. Н. А. Семашко, доктор медицинских наук, профессор

Л.Л. КИРИЧЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛКОТЫ

КТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ'

Проблема лечения и профилактики диарейных заболеваний человека кивотных, вызываемых грамотрицателышми бактер..:аа1 и нтеровирусами, до настоящего времени не репзна до конца. По данным 03 ежегодно желудочно-кишечными заболевшими страдает более 1 лрд. человек, в том числе 7 млн. детей, си.огтность среди которых собенно высока. В ряду этих заболевший особую опасность рэдставляют: холера, сальмонеллезы, эшерихиозы. Напряженная пидемическая ситуация по холере за последние 10 лет не имеет енденции к ослаблении. Серьезного внимания заслуютвают случал этой нфокции, зарегистрированные в высокоразвитых странах, таких как, ША, Япония, Швейцария и др. Продолжают _ регистрировать елудочно-кишечные заболевания, в том числе, холеру и в нашей тране. В связи с вышеизложенным поиск препаратов для профилактики лячания диарей представляется актуальным и современным. За уоеком в эт">м направлении также проводятся исследовать (особенно, точен:-»-"1 последних 5-10 лет). Предложенные там препараты, среди ;оторых преобладают псяхотротые сродства !аниназин, галоперпдол, митриптилин и др.), обладают рядом существе.р;1х побо;кпх эффектов. :роме того, традицион::.;, лечение диарейных заболевак^- проводят с омощью антибиотиков широкого спектра действия, сул!>фан;:лакидов и с омоаью регидратационной терапии. Лечение этими препаратами имеет ледупчие недостатки: образуются лекарственноустойчияые штаммы актерий, подавляется полезная микрофлора галечника макроорганизма, ццавляется иммунологическая залита человока и кивотных.

Новым, разработанным naj.ni направлением в л-зчении диарей у :адей и сельскохозяйственных кивотных, является создание лтидкарейных препаратов, запзэдавдих от дойствия бактергальпых 'оксшюе, поэтому эти препараты получил:* название слт::токскнтах дтидиарейннх.

Современные достч-^ния науки, в частности, концепция ■ниверсальнкх Слкь'лоналыгах блоков (ак?д. А.М.Уголев), внесли сесй ювый вклад в пош'-мание специфической фармакологичее/ ой активности грепаратов. Это связано с сткрытием универсальных механизмов тутриклеточнои регуляции патологических процессов одними и теми же [ейромедиаторами, гормона»®, первичными и втори'-чшми мессэндаерами.

Конечный результат (ответ), в том числе, на фармакологичоси воздействие, зависит от фосфорллирования специфических бели различиих клоток-мтпеней. Изучение фармакологической активное ряда химических веществ выявляет порой у одного из них нескол! видов биологической активности: кардиотропную, иммунотропщ нойротрогшую, психотропную, антидиарейную и т.д. Таким образом о; и тот же фармакологический препарат может с успехом применят! для профилактики и лечения различных заболеваний. В связи с эт! особый интерес, по нашему мнению, представляет поиск и npuweiiei фармакологических препаратов по новому медицинскому назначен! Проимущоством создания таких препаратов является сокращение време и стоимости доклинических и клинических испытаний, экономия време и дшюхиых средств на разработку технологии их произь'одстг Широкое и длительное использование этих препаратов в лечебг практике мокет свидетельствовать также об отсутствии побочт i»|<I",i'fOB, связанных с различными осложнениями. НАУЧНАЯ ¡|01'П^НЛ ИССЛЕДОВАНИЯ состоит в изучении пекоторнх зсьнь пагог'снптичпокого процесса диаройяых зеболевш.':-: на моде яксиоркмонтвлыюй диареи у лабораторных пивотных. Впервые Оь покпчшю, что под действием холерного токсина (XT) и термсь:-иильы. Т'жсгна c.eoii(TJI-токсина) увеличивается не только концентра!

пнутfaí клетки организма млекопитающих, но и нроисход утнимчот.-; ее в трансудате тонкого коечшка лабораторных гивотнь И.М.И', дойг-влопгжй окзоггишо в изолированную петлю тонкого КИШЭЧГО jcpoxrPKOD вместо с культурой холерных. вибрионоЕ (штамм Б69Б Инабг отркиптрлыго влияет на выживаемость животных, т.е. вызывает пеЮль чероз 10-12 часов.

Экспериментально установлено, что добавление различи концентраций u\V.i> в культуру холерных вибрионов (штамм 569Б Ил ас in vitro пьпцвпот усиление роста вибрионов в экспоненциальной фс роста, уппличмше их подвижности и накопление биомассы черо\ час:ч. На модели экспериментальной холеры in vivo показано, s различные концентрации цАМ-3, добавленного экзогеъ (интерлшшально), увеличивают адгезию холерных вибрионов эпителиальным клеткам топкого кишечника кроликов. Известно, ч адгезия и колонизация микроорганизмами тонкого кишечника име принципиальное значение для развития патологического процесса

)гаш:змо хозяина.

Таким образом, в работе вперзые изучена новая закономерность ) взаимодействии 'микро- и макроорганлзма при диарейных 1болеваниях и выявлена новая роль холерного и холерсаодобных жсинов грамот рицате л ыш х бактерий. По-вшдамому, эти токсины шолняют защитную функцию для микроорганизмов, способствуя их «шванию в экстремальных условиях в организма хозяина в ответ на эздействие таких мощных защитных сил макрорганизма, как иммунитет, тстема неспецифической резистентности и др.

Показано, что, имидазол (И), и его производные НРА-1 и НРА-2 эдавляли действие холерного(XT) и тгармолабильного энтеротоксина .coli(ТЛ-токсина) в тесте кожной пробы по Крейгу на кроликах; пикали, или полностью, подавляли эффекты XT, ТЛ-токсина и фильтрата .typhimurium на модели экспериментальной диареи у взрослых роликов и мыгсей с В1/б.

1 Э 7

Установлено, что препарат НРА-2 обладает выраженной лечебной Ефективность'з на модели диареи новорожденных поросят, кспернмьнгально зараженных эгп-эропатогеннь'ми. штаммами е.coli, .а акже на модели экстр;.ментальной диареи, названной Т."-токсином и

ВДОТОКСИНОМ S.typhinur 1 um.

Изучено влияние iIPA-1 и НРА-? на функциональную активность агоцитирувдих клеток крови животных и человека. Показано, что репарат НРА-2 стимулирует выброс супорок?нданион радикала агоцитирупцими клетками перитониального эксудата мышей, защищает ышей от гибели при введении им культуры s.typhi.

& работе впервые рассмотрены некоторые звенья механизма анти-иарейного, антитокс^шого и иммунотрогаюго лзйствия препарата КРА-2. РАКТИЧЕСКАЯ ЦННМОСТЬ

В результате проведенных исследований предложен первый течественный антятоксишшй препарат для профилактики и лв1в\тя елудочно-кишечных заболеваний у людей и животных, вызываемых рамотрицателышми бактериями, обладающий, креме того, нтитоксическим. ш/муномодулирувдим и стимулирующим несгзцифическу.Г) езистентность действием.

Препарат НРА-2 разрешен :: применению в медицинской практике армакологическим Комитетом МЗ СССР (15 февраля 1988 ?., JipoT.N 1); ветеринарии для лечекш ¿злудочно-кишечъых заослеваний у

сельскохозяйственных животных и птицы Госветфарлкомисс; Министерства сельского хозяйства РФ (31 марта 19Э2 г., протокол I ЦЕДИ И ЗШИй ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы было: изучение механизма взаимодействия микромикроорганизма при патологическом процессе; изучение махани антитоксишюЯ, антитоксической и иммунотропной активности некото; производных ишдазола с целью отбора среди них самого эффективн соединения, используемого раньше по другому назначению, . , создания первого отечественного антитоксинного, антидиарей» препарата для медицины и ветеринарии.

Для этого предполагалось: изучить механизм взаимодейст) культуры V.cViolerae, XT, ТЛ-ТОКСИИа E.coli И Др. ТОКСИНОВ

веществ, изадншцих активность адеш1латциклазы(АЦ), уровег> цА! синтез ДИК, с клоткаки-?.пшеиями лабораторных животных и челове; изучить антитоксипную, антитоксическую и иммунотропную ЫСТИВНО' некоторых производных имздазола.

QbMWM\ СВЕЛШШЯ ОБ АПРОБАЦИИ РАБОТЫ •

Мптордалы работы были доложена и обсуздень ла Bceccmi сгоядях, *:c::iop0Him«xf симпозиумах: i Всесоюзный съозд ге.-.<атало; и трпнсфузкалогов, Баку, 1379 г., "Радиационная микроб;-.-:лота;. №му;»<исиш", Москва, 1977 г., "Эпидемиология, клиника диагност; м цр'у^гдпкгика инфекционных болезней", Таллинн, 1978 г., "Pain крппчл'чкч* ткпновоК несовместимости", ■ Москва, 1979 i "Крпоконсоргшрананио иммуног.омпетентшх тканой", Харьков, 1979 а "Циюг.пэ cicno нуклеотэды", Киев, 1980 г.; Минск. 1982 г.; Ряза! JW^r., "Молекулярная структура бактериальных tokciAob готшгтский контроль их биосинтеза", Москва, 1985 г., "Медицине! вн-.имология", Махачкала, 1986 г., "Изучение и применение лектино! Таллинн, 1989 г., "Создание лекарственных фор/ с заданнь био^яр'-шцовтическими свойствами", Харьков, 1990 г., 4 Всесоюз! сгпзд пнтоОнзиологое, Кишинев, 1939 г., "Актуальные во. и иммунологии и иммунопатологии в медицине и вурортологж Пятигорск, 1987 г..

Материалы были представлены на Международном конгрессе иммунологии, Париж, 1980 г., Международном конгрессе по биохтд Прага, 1988 Г., 22nd International Congress of Aviation and Spa Medicine, 1974 Г.

результаты и их обсуждение

1. изучение различных звеньев патогенеза диареи, вызывли.'ш

грамотринатилы-1'v;; бактериями

Этиологич'-:с:на я патогенетические факторы, вызывапгие елудочно-кишечны-j заболевания животных и человека разнообразны и ложны. К этиологическим £а'-:торам относятся грамстрицателыше

аКТврИИ: V-cholerae, E.noll, Salmonella, Yersinia, Cs-mpylobacter,

higeiia и др., а тики е ::тифилококки, некоирые анаэробы; нтеровирусы и т.д. За передние 10-15 лет были выделены, очищены и ¡характеризованы ведущие факторы патогенности этих микроорганизмов • белковые экзоэнтеротоксины, вызывающие основной скмптомоко.чилекс юлудочно-кишечных заболеваний - диарею. Диарея - это выход лектролитов и жидкости в просвет тонкого кишечника животных и [еловека и удаление их во внешнюю среду.

Среди экзоэнтеротоксинов грамотрицательных бактерий наиболее ¡ильными являются холерный токсин v.choiorae (XT), тегголабил'HUft шторотоксин е.coli (ТЛ-tokci:..;, термостабилыше токс;тчы е.coli STa) H(STb) и т.д. Известно, что XT и холероподоб}\/ токсин ;ТЛ-токсин E.coii) являются универсальными стимуляторам [денилатциклазы (АД) во всех клетках зукарлегов, в том числе, и в »нтерещитах животных и человека. Механизм эт:>го явле!шя достаточно [зучен: XI' АДФ-риболизирует а -субъедишщу регуляторного Qsбелка АЦ :истемы, подавляя тем самым ее ГТФ-азную активность. В результате 1тих событий образуется комплекс: адф-рибоза-<*5 -1ТФ, который 1апирает каталитическую субъединицу АЦ в ее активном состоянии на i6 часов. АЦ катализирует синтез циклического |'-5*-аденозинмонофосфата (цШФ) внутри клетки. Возрастание шутриклеточного уровня цАМФ является одной из причин подавления 1бсорбции На* и сГ в ворсинках апикальной мембраны злтероцитов и :тимуляции секреции с Г в клетках крипт тонкого кишечника. В млечном счете эти события приводят к диарее.

Дpvгaя группа знтеротоксинов - термостабилыше энтеротоксины гаинвазивных штаммов E.coii '¿Та и STb) действуют через систему 'уанилатциклазы (ПО. Эти токсины увеличивают внутриклеточный фовень циклического туанозинмонофосфата (цГМФ) в кл VT-.tax тонкого и толстого кишечника, что может быть связано с модулированием :аг*/кальмодулин-зависимых систем, которые, в свою очередь приводят

к подавлению абсорбции Na+; С1~ и, следовательно, к диарее.

Б слокном патогенетическом процессе диарейных забслевани вызываемых экзоэнтеротоксинами грамотрицательных бактерий, участв также и различные внеклеточные (горлоны, нейрогрансмиттеры) внутриклеточные (цАМФ, цГМФ, егг* , капьмодулин) медиато; макроорганияма человека и животных.

В связи с вышеизложенным в данном разделе нашей работе мы и чили биологическую активность экзоэнтеротокешгов и внутриклеточн медиаторов на моделях лабораторных животных и клетках 'эукариотов.

1.1. ВЛИЯНИЕ XT, ТЛ-токсина, E.coli , СТАФИЛ0К0КК0В0Г ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А И В И НЕКОТОРЫХ ВЕЩЕСТВ. И2МЕШШ1Щ ЗТОВЕНЬ цАМФ ВНУТРИ КЛЕТКИ, НА ВЫХОД КВДКОС В ПРОСВЕТ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Видовая чувствительность к энтеротоксинам, наряду с друга ф»1Кто{№ми, зависит от количества специфических рецепторо вгтрчмшнх. п плазматическую мембрану эпителиальных клеток тот.э [пчппчника Для XT и ТЛ-тотсс:ша тшеш рецептором является ганглиоз . Kjioticii человек связывают до 5000 молекул токсина, свиньи СПЫШЛ 120 тыс., коровы - 260 ТЫС.( Holmgron J. et al, 1975 ).

lkwTUMv. целью дашюго раздела исследований явилось изучен влияния mv'ü'pioro токсит, ТЛ-токсина е.coli, стафилококков piirojjoToicciii'on тага А и В, дабутирил-з'-5■ -аденозинмонофосфа (Ж*. НАШ'), 1\С>.'й'ЬЛ, Csz* ИОНОфОрНО^О айТИбИОТИКЯ А2310 тоофиллипа, мзмоиялдах уровень внутриклеточных модааторов ( с иАМТ>, цНИФ), на выход жидкости в просвет изолированной пет. топкого 1:;ч::г!Ч!шка разных вздов лабораторных животных.

Животным под эфирным или гексеналовым наркозом вводи рр'..мп.лу,мыо токсины и вещества в просвет изолированной ,пет. тонкого кшечника (интралюминалыю). Результаты учитывали через часов - у кроликов, через 3 часа - у мышой, через 4 часа - у крыс вырлжпли в индексе дилятации (ИД), представляющем собой отношен объема жидкости (в мл) или массы петли (в мг) к длине пет кигоочника (в см).

При исследовании влияния XT и ЛТ-токсина е.coli на тога< кишечник взрослых беспородных кроликов и мышей линии с57в1/6 бы выявлена неизвестная ранее закономерность: кривая доза - эффе »тих токсинов тлеет вид колокола (таблица 1). Чувствительное

ишксЕ к токсинам выше, чем мышей, однако, разброс результатов и у.¡я эксперимента на мышах значительно меньше, поэтому мыши гсяются очень удобной моделью для изучения биологической гивности токсинов.

зестно, что и животные и люди болепг желудочно-кишечными Золеваниями разлит.-.о'.» степени тяжести: токсичес.ссй тяжелой, эдней степени тяжести, легкой, стертой. Течение болезни может ть острым, подострим, хроническим. Все это зависит не только от епени патогенности штаммов бактерий, инфицирутглгдх макроорганизм, и от состояния ферментных систем, защитных иммунных сил кроорганизма. По-видимому, чувствительность человека и животных к йствшо энтеротоксинов может быть также игдивидуальной в пределах ного вида. ;

В связи с вышеизложенным представляло определенный интерес учить варианты внутривидовой чувствительности к ТЛ-токсину на спородных мышах и мышах линий: с57в1/6, ^ (с57вх/6 * сва). сза, Бп, ВАЬВ.

Таблица 1.

Влияние ТЛ-токсина на тонкий кишечник мышей разль-г-'и т. линий

МЫШИ ИД ТЛ-то.соин (мкг1, , Ь.со11

(самцы) 0,1 0,5 1,0 2,0 4,0 >5,0

7В1/6 ?98.7 1 4,1 + 136,7 4,2 174 ± 7 .146 - 11 .101 ' ± 15 .67,4 - 11,2

А - + 75 10,6 ± 7,8 .76,5 - 7,8 +87 1 7,1 -

(с57В1/6*СВА) - + 61 3,8 ,151 ± 2,5 ,107 - 3,8 +94 - 4,2 .105 ± 13,2

Бп - + 85 12,3 ,137 ± 13,2 - .107 - 8,7 .93.5 - 8,2

ХВ .30,2 ± 5,7 + 44,6 4,2 О <-. , -± 9,7 .46,2 - 8,5 - -

1СПородные - - .64,7 ± 5,3 ,'.3,8 ± 0,4 .58,.' ± 8,9 -

» - ИД - индекс далятадии: каяичествг. пяддостх т 1 си патл/, выраженное в мг/см.

Контрольный вес петли с физиологическим раствором составил для всох линий - 30 £ 3 мг/см. На каадую точку брали не менее 3-х мышей

Р < 0,05.

Как видно из данных на таблице 1, кривая зачксимо< доза-0'м>окт для tji-токсина е.coli у мышей линии с57и1/б, (cs7b1/6 к сва) и А/Sri шлеет вид колокола. Самыми чувствительным; ТЛ-токсину являются шш линии С57В1/6. Далее чувствительно! пвдпот в следующем ряду: с37в1/6 > f > a/sn > сва > беспородные balb. Низкая чувствительность мышей balb к термолаоильнс шгсеротоксшу E.coii может свидетельствовать либо о Mai количестве рецепторов к токсину, либо о малой индуцибельно< аденилптщгклазной системы у этих мышей.

В ответ на воздействие КГ и ТЛ-токсина е.coli запускав: каскад внутриклеточных событий в организме человека и нивотных, которых при/шмаюг участие такие внутриклеточные медиаторы, i цАМФ, С-2*, кальмодулин. Они изменяют абсорбции и секрецию Na+ ci" d тонком кишечнике, что приводит к выходу квдкости в е просвет.

В связи с этим, далее, мы исследовали влияние разлшп котшнтрздкй дб.цАШ», проникамцего через плазматическую мемс-.с клеток аналога цЛМФ, на тонкий кишечник мышей С57В1/6. Крш доза-оф^окт для дб.цД'Я> у мышей С57В1/6 имеет также вид колоколг максимумом, выше которого количество жидкости в тонком кишечш начинает уменьшаться.

Т.о., XT, ТЛ-токсин и дб.цАМФ имеют один и тот же характер! min зависимости доза-эффект на модели экспериментальной диареи кроликов и мышей С57В1/6. Результаты этих исследовш свидетельствуют о том, что увеличение доз токсинов и цАМФ опредолпцного уровня стимулирует гиперсекрецкю ir/цдк эсти в тош ютшпнико лабораторных хгивотных. Дальнейшее их уесличение привод к подавлению транспортных процессов в кишечнике.

В сирии экспериментов мы изучили влияние дб.ь'.МФ и ингибитс фооГодилстеразы цАМФ - теоф^члина на тонкий i ишечник мыи различных линий, чтобы 'исключить стадию связывания токсина рецептором и активацию АД. Кроме того, представляло штер

ВЫ ПСНИТЬ ВНУТРИВИДОВУЮ ЧуВСТВИТеЛЬНОСТЬ ТОПКОГО К'.ибЧШШ! мы II

реагировать на увеличение уровня цАМФ внутри клетки.

Установлено, что наиболее чувствительными к исследуемым дог дб.цАМФ оказались мыши линий С57В1/6, A/Sn. 'геофиллин котщнтрациях 103 Ы - КГ'м оказывал слабый эффею на кишечь

лышей всех 4-х линий. В то жо время, сочетанное применение дб.цАМй I теофиллина вызывало выраженный эффект потенциирования у кышеЕ ШШЙ С57В1/6 и г .

Высокая чувствительность мышей С57В1/6. ^ , и а/Бп к действию ГЛ-токсина и дб.цА^Ф с теофиллигом свидетельствует, пс-виднмому, не только о наличии большого количества специфических рецепторов на энтероцитах к лому токсину и высокой активности ЛЦ, но объясняет зависимость механизма диареи у ши. от увеличения урсьня ц\Ш> внутри -слетки. Низкий эффект ТЛ-токсина, дб.цАМФ и сочетанного применения цб.цАМФ с теофиллшюм на мышах свл можно объяснить разницей в количестве рецепторов с , меньшей активностью АЦ (в порвем случае ) и наличием изоформ ФДЭ, нечувствительных к теофиллину (во агорой случае).

Как уже упоминалось выше, механизм диарей' связан также с увеличением внутриклеточного Са2* . в этой связи мы изучили влияние За ионофора А23187 на выход шадкости в просвет тонкого кма'л'ика лабораторных животных. При добавлении в изолированные петли тонкого кишечника взрослых кроликов А23187 в дозах 0,1; 0,5; 1,0 ^г/петлю ИД возрастал до 1,0; 2,5; 1,8 , соответственно. Таким образом, увеличение концентрации Са2* в клетках эпителия тонкого кишечника лабораторных животных является, по-видилому, одшм из важных звеньев'в цепи патогенеза диареи.

Термостабильный токсин Е.соН вызывает диарею через систему гуанилатциклазы (ГЦ), увеличивая внутриклеточный уровень цГМФ.- На лзолированных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов мы изучили влиянио дб.цГМФ в концентрации 5 х 1СТ3 М. Ю4 М. Ш'м. Было установлено, что эти концентрации вызыва:зт выход жидкости в просвет лзолированных петель тонкого кишечника кроликов: ВД был равен 2,0; 2,0, 1,4,соотвотство}шо-

Для сравнения мы изучили влияние терлостабильных эк::оэнтеротоксинсв з.аш-еиз типа А и В на гиперсекрецию жидкости в гонком кишечнике взрослых кроликов, крыс и кошок. Эти токсины (0,01 чкг - 0,05 мкг/петлю) также выс-зают выход жидкости в изолированные петли лабораторных животных. Известно, что длинна токсины вызывают лщевыэ отр)авления участвуют в качестве главнпатогенных ¡факторов в клинике желудочно-кишечных заболеваний животных и «еловека.

1.2. ВЛИЯНИЕ ХТ, ТЛ-tokciraa, КАЛЬМОДУЛИНА, ТЕОСШЛИНА НА АКТИВНОСТЬ АЦ ЭНТЕРОЦИТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ, КОНЦЕНТРАЦИЮ цАМЭ ВНУТРИ КЛЕТОК МАКР00РГАНИЗМА И 1 ТРАНСУДАТЕ ТОНКОГО КИШЕЧНИКА КРОЛИКА.

Как ухо. было сказано выше, ХТ, ТЛ-токсин е.coli являюта универсальными стимуляторами АЦ во всех клетках эукариотов, в toi число, в энтероцитах животных. Поэтому, сначала, в данном раздел! мы изучили влияние ХТ, ТЛ-токсина на активность АЦ энтероцито! ВЗРОСЛЫХ кроликов И мышей С57В1/6.

В таблице 2 показано, что ХТ -активирует АЦ энтероцито1 взрослого кролика до уровня стандартного активатора этог фермента - NaF. Совместное применение ХТ и NaF приводит к увеличению активности АЦ, по сравнению с раздельным их использованием.

Таблица 2

Влияние ХТ на активность*АЦ энтероцитов тонкого кишечник;

КрОЛИКа In vitro.

ХТ дозы ■ ^ Активность АЦ пмоль/мил/мг балка мкг/петлю • Инкубация сХт-5 час. Инкубация с ХТ-18 час

0 12 100* 12 100%

1 27 225* 20 167*

0 - 20 167S .

1 - 25 217Х

Контроль ХТ

NaF 10 ММ NnF « ХТ ,

Результаты приведенные в таблице 3 свидетельствуют об ак'лгааци: ХТ и ТЛ-токсином АЦ энтероцитов мышей С57В1/6. Кривая зависимое?] доз»-г«М)"кт имеет такие вид колокола с максимумом гктивнссти АЦ при дозо ХТ 2,5 мкг/мл, после чего активность фермента умсльсчотся Выход жидкости в просвет тонкого кишечника мы/.эй увеличивается с увеличенном активности АЦ до определенного ма:сим.-.<п, после чег> также начинает падать.

Известно влияние внутриклеточных ме,г:аторэв капьмодулина (КМ) на физиологическое состояние клетки, в том числе на увеличение секреции ионов и воды в энтеро. >:тах лабораторны. ттвогных, поэтому, на следующем этапе мы изучили влияни

Таблица 3.

Влияние ХТ и ТЛ-токсина Е.-.-и на выход жидкости в просвет

кишечника и активность АЦ энтероцитов шшей С57В1/ь.

Дозы мкг/петлю Активность АЦ пмоль/мин/мг белка Индекс дилятации мг/см

етроль 0 3,3 i 0,5 29 i 3

1 12,6 - 1,4 ИЗ - а

» 2,5 16,1 ± 1,8 75-7

* 5,0 9,8 ± 1,3 69 - 3

-токсин 5,0 9,6 ± 0,4 81-4

Инкубация с ХТ в течение 5 час. in vivo ip < o.osi.

льмодулина и ХТ на активность АЦ мембран знте'роцитов мышей гг.1/6-. Из данных таблицы 4 видно, что уже через 30 минут хубации мембран энтероцитов с различными дозами ЮЛ активность АЦ эличивается. Кривая доза-эф^.<т имеет максимум при дозе КМ 2 г/мл, затем активность фермента падает. Пр.1. .':очетанн:'ж применении

Таблица 4.

Влияние кальмодулина (КМ) и ХТ на активность АЦ энтероцитов

МЫШеЙ C57BL/6.

Дозы вешеств АКТИВНОСТЬ АЦ Активность АЦ

мкг/мл пмоль/мин/мг белка s

итроль 0 4,0 - 0,5 6,7 ± 0,9 100

КМ о,ь 5,3 ± 1,3 132

1.0 5,8 - 1,4 145

и _ и 2,0 « С.6 ¿ 1,6 . - 155

п 10,0 »9,3 ± 1,4 . 139

(контроль) 0 13,1 ± 0,5 100

ХТ 5 » 16,3 - 2,3 125

КМ о 14.5 ^ 2,2 112

Г + КМ 5 + 5 * tP,9 í 0,7 i 45

Инкубация с ХТ и КМ 30 МИН In vitro ( « - Р < 0,СЗ!

КМ и ХТ наблвдается эффект синергизма (сложение результатов По видимому, и ХТ и КМ имеют одну точку приложения. Таким образа КМ нлпрнмую активирует АЦ энтероцитов мышей и способству пше рее кроши' конов и жидкости в тонком кишечнике при данн заболеваниях.

Активация АЦ под действием ХТ и TJI-токсина E.coli приводит увеличению .уровня цАМФ внутри клетки. Все клетки эукариотов име АЦ и гш1глиозид Gm , являющийся специфическим рецептором для эт токсинов, поэтому биологическую активность их можно исследовать, различных клетках человека и животных, "в том числе, иммунокомпетептных клетках человека.

Нп следующем этапа мы изучили влияние универсальнс стимулятора АД - ХТ и ингибитора ФДЭ цАМЭ - теофшшша концентрацию ц№Ф в интактных лимфоцитах периферической кре человека (ЛПКч).

Кек следует из таблицы 5, теофиллин практически не увеличизг концентрации цАМФ внутри лимфоцитов. В то же время ХТ значитель повышает внутриклеточный уровень цАМФ. Особенно сильный эффе вызывает сочетазшоо применение ХТ с теофиллином (так называем яффокт потонциирования).

Таблица 5.

Плшшие ХТ и теофиллина на концентрацию ц/Jв интактк лимфоцитах периферической крови человека (пмоль ЭОмин/Ю млн.клеток)

Контроль 3,8 100 *

Теофиллин 4,6 121 X

•ХТ 0,01 мкг/мл . 13,7 360 х

f Теофиллин 28,4 747 X

ХТ 0,1 мкг/мл 14,4 380 X

+ Тоофиллин 26,9 708 X

■ - в 1-мл - 0,5 млн клеток.

Мы показали выше, что действие Саг* ионофора А231Е измеияидего внутриклеточную концентрацию , приводит к выхе жидкости в просвет тонкого кишечника лабораторных животных, таблице 6 приведены данные, показывавши0, что инкубация А23187

мфоцитами человека в течении 25 мин приводит к увеличению уровня МФ внутри клеток в 2,7 - 4,6 раза. Совместное применение тибиотика .1 теофиллина приводит к большему увеличению

нцентрацни цАМФ, по сравнению с применением одного А23187.

Таблица 6.

Влияние Саг* ионофора ф23187 и теофиллина на уровень цАМФ в лимфоцитах периферической крови человека (пмоль/20 млн кл./25 мин)

Доза А23187 цАМФ пмоль/20 млн кл/25 мин

МКГ/Ш1 ' +~теофиллин 0,75 мМ

О 11,7 100% 13.1 112%*

0,32 18.7 160S 32,7 175«"

0,45 32,3 2745 34,4 107%*

0.64 31,4 2йЬ% 40,9 13Li3*

0,9 54,3 Í34S 55,3 102%*

* - по сравне;гаю с А23187.

Таким образом, увеличение концентрац'/и Са2 * внутри клеток теколитающих приводит к у;?энию внутриклеточного :.-ч.йня цАМФ, го в свою очередь запусчает ц.-rr,- событий, свяглгагих с переходом тетки из одного физиологическое состояния в ,;чугоь. /■ ::шд1оцлтах го связано, например, с переходом из одной фазы клеточного цикла в эугуго, в энтероцитах - с увеличением секреции Na' . сГ и пггходом едкости в просвет тонкого кишечника.

Из всего вышеизложенного следует, что такие внутриклеточные эдиаторы, как Cíf * , кальмодулин, цАМФ, участвуют в трей, вызываемых холерным и холероподобшми токсинами.

Как уже было показано, ХТ являясь универсальным стимулятором 1 во всех клетках эукариотод, уво-т^'мвает уровень л^МФ в -"-их потках. Поскольку цАМФ мо.:',.л- тага: о являться и первичным зссенджером и присутствует во всех биологических жидкостях акроорганизма, представляло особый интерес посмотреть, влияет ли Г на концентрацию цАМФ в трансудате тонкого кишечника при тепериментальной диарее у взрослых кроликол.

Из данных таблицы 7(а) следует, что количество цАМФ в 1 мл рансудата тонкого кишечника кролика возрастает (по сравнению с

контролем) при увеличении дозы ХТ, имеет максимум при дозэ ХТ а мкг/мл и- затем уменьшается. При сочетанном влиянии ХТ (О, мкг/петлю) и теофиллина (0,75 мМ) отмечается эффо потенщшрования. Количество трансудата и ВД такж ув'итчипается (таблица 76 и 7в), особенно при совместном применен ХТ и теофиллина.

Гоэкое увеличение внеклеточной концентрации цАМФ наблвдается общем количестве трансудата изолированной петли тонкого кишечник кролика (но сравнении с контролем). При дозе ХТ 0,25 мкг и 0,5 к при сочетанном применении с теофиллином выраген эффе потешргарования (таблица 7г).

Таблица 7.

Содержание цАМФ в 1 мл трансудата изолированной петл

(пмоль/мл) тонкого кишечника кролика. ____(а

Лоза ХТ (мкг/потлю) 0 0,1 0,25 0,5 1 2 4

ХТ 0,13 2,6 2,5 4,9 1,6 2,7 1,2

ХТ ♦ теофшшш 3,9 6,2 28,4 9,3 3,5 1,5 2,5 (0,75 ГАМ)

(О

Количество трансудата (мл)

ХТ (мкг/потлю) . - 8,9 8,0 5,7 8,5 7,9 8,6

ХТ * тоофиллин 5,5 5,8 16,5 10,6 7,;> 5,9 6,6

Индекс дилятации ИД (мл/см)

ХТ (мкг/потлю) - 1,8 1,6 1,2 1,7 1,9 1,7

ХТ ♦ Тбл1;шшн 1,3 1,2 3,3 2,1 1,5 1,2 1,3

(1

Количество цАМФ в трансудате изолированной петли

ХТ (мкг/петлю) - 23,1 20 28 13,7 21,3 10,С

ХТ + тоофшинш 21,5 35,9 463,6 104 26,3 8.9 16,Е

Таким образом, из приведенных данных следует, •■■то XI доПявлешгай интралшинально взрослым кроликам, увеллчивае

нцентрацию цАМФ в транссудате тонкого кипочника у этих животных, сравнению с контролем, в 10 - 40 раз. По-видимому увеличение еклеточного уровня мояет играть определенную роль а

тогенетическор г.рсцессе диарейных заболевшей.

1.3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КО.Т.£НТРАЩИ цЛМФ НА АДГЕЗИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ X-jJEFU У ВЗРОСЛЫХ КРОЛИКОЗ.

Известно, что критериями начального этапа патологического оцесса при холере и многих других кишечных заболеваниях являются: епень адгезии микроорганизмов к энтероцитам, последу кдая лонизация ими тонкого кишечника и наличие энтеротоксигеьности аммов.

В данном разделе мы решили выяснить, какое значение имеет ■сличение уровня цАМФ в трансудате тонкого кишечника куюлика.

Для этого мы разработали методику по учету степка адгс:ии .зличных'штаммов v.cholerae. й-аммы: RV, 430; 57, 202, 55, 542, 19Б Инаба - выращивали на сишсазной среде Финкелштейна с |бавле1шем s35 (1мкК/мл), затем вводила (10®мт - 1С]Рмт/мл) юликам интралюмшально. Через 6 часоЕ ¡оптимальное время для ;гезйи 50% культуры) животных забивали, из петель вырезали тменты, взвешивали, вносили их в вайлзы, добавляли солуэн, а |рез 24 часа - сцинтиллятор. Результаты выражали в процентах.

Мы показали, что штаммы обладают различной способностью ;гезировать к клеткам кишечного эпителия взрослых кроликов: 430 -12%; 57 - 4-7%; 542 - 11%; 55 - 15-18%; RV - 22-30%; 202 --207.; 569б Инаба - 23-27%.

Далее мы погасали, что при инкубировании штаммов 202 и 569Б ^ [аба в изолированных петлях тонкого кишечника взрослых кроликов з мсутствии различных концентраций цАМФ (10"6М - 1СГ4 М) адгезия 1лершх вибрионов 569Б Инаба увеличилась с 29% до 89*, а адгезия [брионсс штамма 202 зозросла до 147-173% (на 43 - 73%).

1.4. ВЛИЯНИЕ ЦАПФ НА РОСТ, РАЗМНОЖЕНИЕ, ПОДВИЗИ ,Х'ТЬ ХОЛЕРШХ ВИБРИОНОВ (ШтАШ 569Б ИНАЕ/. 1, IN VITRO.

Сначала, в процессе .эволюции цАМФ в качестве первичного [гнала играл большую роль в жизнедеятельности ;п"фоорганизмов.

R данном разделе мы решили посмотреть, как влияют шзл^чн концентрации цАМФ (10"9М - 10"4М), добавленного in vitro к культу v.choleras штамм 569Б Инаба, на рост, размножение и подвижное вибрионов. Культуру выращивали на синказной среде у. is пептонн воде s тачотте 18 часов. В опытные флаконы добавили цАМФ (ICJ'M 10'4М). Результаты учитывали по' включению С1Ч-лейцина и выражали количестве импульсов в минуту. В экспоненциальной фазе рос-v.cholnrae цАМФ в концентрации 1С6 - 1CJ4 М вызывает усиление ускорение роста, сдвигая фазу роста на один час вперед. П; культивирован™ холерных вибрионов в течение 17 часов на пвптонной воде цАМФ вызывал накопление биомассы в 5 - 10 р балыго, по сравнению с контролем (в концентрациях 10"э, 10"6, 10"' 10 9 М).

При добавлении цЛШ> в концентрации 10"6 - 10"4М в полужидю агар подттаюсть вибрионов штамма 563Б Инаба увеличилась с 3,0 мм в контроле до 5,8 мм - в опыте.

Определял методом агрегатгемагглютинации (АГА) (Л.Т.Гор.ии Л.М.олоышков, 1975 г.) энтеротоксигенность штамма 559Б Инаба присутствии наш, мы но обнаружили увеличения XT в супернатат штамма Г>09 Б Инаба в присутствии цАМФ. Синтез холерного токсина и опыте и в контроле оставался без изменения.

Суммируя наши данные, можно предположить, что цАМФ действует' кштчмом трпнеудате в качестве первичного мессендаера (сигнала; учлетпуя в усилении адгезии вибрионов к энтероцитам кишечгада: способствуя усилению, ускорению роста и подвижности холорнь

ШТЯрИОНОН .

Таким образом, XT, воздействуя на энтероциты лаборатории кшпгннх, увеличивает внутриклеточный уровень ЦАМФ, вызгвая те самым пшорсзкрецшо Na* и С1", что приводит к птерсекрещ-жидкости в просвет тонкого кишечника животных, т.е. к диарее Одновременно, он способствует увеличению концентрации цАМФ кишечном трансудате. В данном случае цАМФ начинает играть рол внешнего сигнала для запуска механизма, способствующего усиленн адгез1га, ускорению роста и размножения вибрионов, т.к. г.ри диаре большое количество микроорганизмов механически удаляется и кишечника, и патологический процесс может прерваться.

В 80-е годы было выявлено еще несколько механизмов влияния X

энтероциты животных, в том числе, показана стимуляция ХТ целения 5-гидрокситриптамина (серотонина) из энтерохрсмафияннх >ток (ЕС-клетки). В .кишечнике человека синтезируется 65* от гачества всего серотошша. Извостно, что серотонин участвует г юбождении аратадоновой кислоты, окислегаие продукты которой -ютагландини группы Е (ПГЕ), тоже вызывают диарею. Но, тага:е сазано, что арахидоновая кислота, простагландины и серотонин >собствуют увеличению адгезии клеток, в частности, сроорганизмов к поверхности клеток макроорганизма. По-видимому анизм воздействия ХТ в кишечнике животных довольно слоган: с юй стороны, он должен обеспечить выживаемость и сохранение [уляции бактерий во внешней среде через удаление их из организма 1яина (диарея); с другой стороны, обеспечить их адгезии, юнизацию и размножение, т.е. выживаемость, в организме хозяина.

1.5. ВЛИЯНИЕ ЦАЩ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КРОЛИКОВ НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХОЛЕРЫ.

В данном разделе мы изучили влишгае различных концентраций № (10~6М - 10"4 М), вводетюго интралюмишлыга взрослым кроликам фоне ХТ, культуры У.сЬо1егае 56ЭБ ИмаЗа, на выживаемость

ЮТ1ШХ.

В изолированные петли тонкого кишечника з-'еди в контроле: цАМЗ Гйм - 10"4М), цАШ в тех же концентрациях «а фоне ХТ (0,25 - 0,5 /МЛ), культуру V. сЬо1егае (1С?М.Т., 1С?М.Т., 1С7м.Т., м.т./мл). В опыте взрослым кроликам интралюминально на фоне ьтуры У.сЬо1егае (1С?м.т. - 1С?м.т.) ввели цАМФ в концентрации 6М - 10~4М. Результаты учитывали через 12-17 часов. Кролики, орым были введены различные концентрации цАМФ, через 17 часов ствовали себя хорош. При вскрытии жидкости в просвете лировашшх петель тонкого кишечника не било. При вскрытии янкчз с ХТ на фоне цАМФ в просвете петель была обнаружена кость, состояние животных через 17 часов было влетвепчтельным. При вскрытич кроликов, которым была введена ьтура V,сЬо1егав, пп амм 563Б Инаба, в гросвете петель было эружено различное количество жидкости: энтер:т;жсигенными зались дозы 1С?м.т., 1(7м.т., 1Срм.т./мл. Пчред Б_:фытием все этные чувствовали себя удовлетворительно.

Особую группу представили животные, которым на фоне различных

доз культуры v.cholerae были введены различные концентрации ца (!П"6М - 10"4М). Все животные через 10-12 часов погибли п явлениях нарастащей интоксикации, одышки, . тахикардии, высок температуры. У кролика с дозой культуры 1С?м.т. цАМФ (1СГ6М 10 4М) выпота в просвете изолированных петель не было. У остальн животных в просвете петель тонкого кишечника находился выпот, практически но отличался от контрольных животных (таблица 8).

Таблица 8.

Влияние цАМФ на ИД и выживаемость кроликов на моде экспериментальной холеры (in vivo).

+ цАМФ (10~ч- 10"6М)

ИД (мл/см)

токсикоз / жив

ИД (мл/см)

токсикоз-1-/ жив

ттпмм Ь69Б(мт/мл)

10' О

10' 2,4

101 2,7

10* 1,6

живы

И ft

О

2,3 1,7 1,6

ТОКСИКО. -I

XT (мкг/петлю)

О J 1,5

0,5 Л р 3

1.0 1,8

w — Н * — "

н Г»

2,9 Я, О

живы

плод (М)

ю:;

101 10 6

о о о

Учитывая данные, полученные нами в предк.чущих разделах, moj предположить, что у кроликов с живой культу].сй V.choleraэ на ф< цАМФ в изолированных петлях произошло значительное на.*опло1 биомассы вибрионов. Поскольку пет.ли были п/рсвязаны, то охлзалс невозможным удаление вибрионов из кишечник.'... В результате маосо! гиболи ВНбрИОНОВ НаКОПИЛОСЬ бОЛЬШОе количество lps, что и выс'В! типичную картину интоксикации и гибели животных от эндоток.\ v.cholerae. Эндотоксины (LPs) гр^ ./отрицательных баКТс.1 ответственны за симптомокомплек^ интоксикации i желудочно-кишечных и других заболевани-д. человека и жиботшх.

я . »

и

1.6. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ГГ. ТЛ-ТОКСИНА E.coli, ТЕОФИЛЛИНА, ДО. ЦАМФ. Са2* ИОНОФОРА А23187 НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЫ'КИ ЧЕЛОВЕКА И животных.

Извьотно, что патологический процесс, в частности, при диарейных заболеваниях, зависит'от состояния местного иммунитета в тонком кишечнике млекопитающих. Тонкий кишечник человек?: и животных имеет несколько уровней защитных систем: 1) механическая; 2) иммунная система (пейеровы бляшки, лимфоидная ткань червеобразного отростка); 3) иммунокомпетентные клетки эпители:-.: Т-лимфоциты (на 100 энтероцитов - 40 лимфоцитов), фагоцитирующие клетки: нейтрофилы, моноциты, макрофаги; 4) эщрплазматический ротикулум энтороцита с детоксицирующей функцией системы цитохрома Р-450 (И.А.Морозов и др., 1Г88); 5) гликокалекс.

В данном раздела мы изучили влияние ХТ, ТЛ-токсина, теофиллина, А23187, дб.цАМФ на лимфоциты периферической крови человека (ЛПКч), а также на функциональную активность фагоцитирующих клеток лзооратгрных животных, с целы, выяснения влияния данных веществ на систему иммунитета и нэспэцифической резистентности :оло:зека и животных.

Из данных таблицы 9 нидне, что при обработке j.^j'.ouhtob и

Таблица 9.

Содержание iUMJ1 и лимфоцитах, обработанных XV

Концентрации ХТ ■(мкг/мл) 0 0,0003 0,003 0,03 0.3

цАМФ (ПМОЛЬ/15МЛЙ/90М1Ш ) 26,2 23,0 4G.0 82,0 67.0

+ ТЕО 0,75 17,0 28,1 34,2 110,1 134,8

Содержат¿е цАМФ в полиморфноядерных лейкоцитах. обработанных ХТ

Концентрация ХТ (мкг/мл) 0 о,оос.з 0,С03 0,03 0.3

ЦАМФ (пмоль/1 Зчлн/ЭОмин) 14,7 17,4 15,7 20,8 22,5

+ ТЕО 0.75 17,3 20,4 ."•5,5 27,3 29,2

нейтро ?лов периферической крови человека ЛТ и теофиллином в них

увеличивается внутриклеточный уровень цАМФ, что в свою очередь связано с ингибированием синтеза ДНК в иммунокомпетентных клвткхх кропи человека.

На следующих таблицах 10,11 представлены данные по синтезу ДНК интактными и митогон-стимулированными Т-лимфоцитами периферической кропи человека (ЛПКч) при влиянии на них теофшшша и ХТ. результаты учитывали по включению 3 Н-тимидина в ДНК лимфоцитов и выражали в количестве импульсов в мин/1СЯ клеток. Видно, что ХТ вызывает снижение синтеза ДНК в ЛПКч на фоне СГА и А23187, особенно при сочетанном применении ХТ с ингибитором ФДЭ цА>.*"5 теофиллином ОМ^кт потенщшрования).

Аналогичные данные мы получили, изучив влияние ТЛ-токсина Е.со11 и дб.цАШ» на лимфоциты (ЛПКч), стимулированные ФГА-Р, КОН-А и Иг-Пвч.

Табл;г.;а 10.

Синтез ДНК в ЛПКч,стимулированных ФГА-Р

©ГА мкг/мл .1 2 5

40988 * 90006 58021

ТЕО 1мМ 21204 - 48638 54771

52 X 54 г 94 х

ХТ 0,005 мкг 27103 65793 д3753

66 г 73 х 93 х

ХТ » ТЕО 14517 32455 ;0258

35 X 36 X 69 X

ХТ 0.025 мкг 20858 56484 ' :.:865

51 х 63 X 74 х

ХТ > ТЕО 7222 18534 2:357

18 X 21 X .¡5 X

ХТ 0,1 мкг 17273 39793 4^75

42 X 44 X '3 X

ХТ + ТЕО 6033 14448 19' СЗ

15 х 16 г. С .; х

Контроль - синтез ДНК в интактных лимфоцитах - 683 импЛса/6- 0 клетс

• - имп/мин/106клеток

Таким образом, ХТ и ТЛ-токсин, синтезируемые в тонком

шочнике человека и животных холерными вибрионами и другими крсг.рганизмамн, а также внутриклеточный медиатор цАМО влияют на национальную активность иммунокомпетентных клеток макроорганизма, зывая ип иммунодеизессию, и способствуют ослаблению мастного мунитета в тонком хишечт^з, помогая при этом развитию тологического процесса у человека и животных.

' Таблица 11.

Синтез ДНК в ЛПКч,стимулированных А23187.

3187 мкг/мл 0 0,35 0,45 0,59 0,77 1,0

610 2839 6270 18011 27379 13127

ТЕО 1 мМ 313 7508 12813 15122 17901 6592

51 X 264 X 204 х 84 X 65 X 51 X

' 0,005 368 6092 16142 17337 19326 7147

60 х 214 X 257 X У6 х 71 7. 54 X

' + ТЕО _ 14511 26597 10374 13 2873

511 % 456 % 58 % 49 % 29 X

: 0.01 295 814С 14688 12539 124 4484

•13 2 287 X 234 7. 70 7. 46 34 X

' +ТЕ0 - 15765 -27186 7437 ы 1490

555 X 433 % 41 7. О 1 X 11 X

' 0.1 • ■94. 527Э 8968 14062 62Ь7 1307

32 х 186 X ПЗ X 78 X 23 X 10 X

: + тео _ ЮС 05 23854 7437 38ь-; 674

384 380 X 41 X 14 г 5 х

Известно, что резистентность организма к- различным

1болеваниям определяется также и функциональным состоянием агоцитирующих клеток - макрофагов и нейтрофилов. Активация этих неток приводит к так называемому респираторному взрыву, суть зторого состоит в увеличении поглощения кислорода клетками., эвышении активности гексозомонсфосфтгного сунта и у прении яслородного метаболизма вследствие активации ферлеита ДОН-оксидазы, катализирующего одноэлектронное восстановление лслорода в супероксидный анион радикал. Супероксид ( )

тонтанно и при ферментативной дисмутации переходит в перекись эдорода 0а ). В реакции супероксида с перекисью образуется

в и со ко ропктивны й гидроксильпый радикал ( ОН- ). Упомянутые актиглг формы ' кислорода, которые можно зарегистрировать метод хемолшишсценции, принимают участие в деградации микроорганизмов паразитов фагоцитами, поэтому интенсивность образовался кислорода метаболитов дает информацию о микробицидном потенциале макрофагов полнморфноядерных лейкоцитов.

На следующем этапе мы изучили влияние ХТ, дб.цАМФ функциональную активность фагоцитирующих клеток мышей линии С57В1 методом лп.'хнолзависимой хемолюминесценции и показали, что (0,01-0,1 1мкг/мл) и дб.цАМФ (1СГ4 - 10"э М) вызывают уменьшен хемолюмгаюсценции в 10-20 раз, по сравнению с контролем. Эти данн свидетельствуют о том, что ХТ и дб.цАМФ снижают функциональн активность фагоцитирующих клеток, ответственных за неспецифическ резистентность организма животных, что также снкжа сопротивляемость организма и способствуют развитию патологическо процесса.

2. изучение антитокс'.шои активности некоторых произво:,:'.

имидазола.

Известны способы лечения диарей путем применения антибиотико и/или нитрофурановых препаратов, и/или сульфаниламидов с учетом совместимости.

Однако, применение указанных препаратов имеет слодуиц нодостат1си: образуются лекарствэнноустойчивые штаммы; подавляет гюлопнап микрофлора кишечника, что усиливает явления дисбактериоз подпаляется иммунологическая защита организма животных.

За рубежом последние 5 - 10 лет для лечения диареи применя психотропные средства: трифторперазин, галоперидол, амитриптилин т.д. Эти препараты обладают серьезными побочшми эффектами на ЦН тгшрвит розкоо снижение АД, симптомы мышечной усталости и т.д.

Новым, разработанным нами направлением в лечении диарей людей и сельскохозяйственных (с/х) животных является создан антидиарейных препаратов, защищающих от действия бактериальн токсинов, поэтому эти препараты получили название алтитоксинн пнтидиаройных.

Прервать действие токсина на клетку можно, действуя различные механизмы внутриклеточной регуляции и впеклеточта

здиаторы, участвующие в патогенезе диарей.

Известно, что имидазол и его производные стимулируют фдэ цА?.г5, лгатя таким образом уровень последнего внутри 1слетки некопитагацих. Таким образом среди этой группы веществ можно искать этенциальные лекарственные средства, защищзкгае от действия XT и П-токсина Е.со 11 .

Мы выбрали в качестве потенциальных антитоксинных препаратов дадазол и 2 его производных: препараты, применяющиеся ранее по ругому назначению: НРА-1 и НРА-2.

2.1. ИЗУЧЕНИЕ АНТИТОКСИННОИ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИВДЦАЗОЛА В ТЕСТЕ К0Н2ГОИ ПРОБЫ ПО КРЕИГУ И НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ДИАРЕИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТИЫХ.

На первом этапе антитоксинную акттность имидазола, НРА-1 и РА-2 определяли экспресс-методом кожной пробы по Крейгу (1965 г.) а взросчых 1фоликах. Метод основан на увеличении проницаемости нутрикожных сосудов под действием XT, ТЛ-токсина. В связи с этим а коже животных появляется папула, которую окрашивают синькой ванса. Имидазол, НРА-1, ИРА-2 вводили через ?.0 мин после токсинов фильтрата s.typhi murium (1:1000) внутрнкожно(в/к). Наиболее 1фоктивно снижали про:тцаемость сосудов НРА-1 и HPA-i .таблица 12)

Таблица 12.

Кожная проба

Г (мкг) папула(мм) + НРА-2 10"4 М + НРА-1 10" * М

,25 8 0 0

,5 10 0 2

,0 14 2 4

ильтрат S.typhlmurium <ШТ.415) (1:1000) мл

,05 6 0 о

,1 8 0 2

.2 10 1 3

Т +■ аминазин О

миназин 10" М О

РА-1 О

РА-2 О

а каждый про'г-'.рат использовали по 3 кролика

Далее антидиарейную антитоксинную активность прлгар&то определяли по модели экспериментальной диареи, вызванной ХТ

ТЛ-ТОКСИНОМ, фИЛЬТраТОМ Б .гурМгаиг1ит, фИЛЬТраТОМ 3.+урЬ1, дс.цАМ и дб.цГМФ. В опытах использовали взрослых кроликов, .-.шшей С57В1/6 Всего в опытах было использовано >50 кроликов и 200 мышей. Данны представлены на таблицах 13 и 14.

Таблица 13.

Влияние НРА-1, НРА-2 и имидазола на экспериментальную диарею у взрослых кроликов. ( Loop - тест )

XT (мкг) И д (+ НРА-2)(+ НРА- 1)(+ имидазол)(+ аминаз:

мл/см 10"4 М 10~4 м 10"4 М 10"4 м

0,25 1.6 0 0,8 1.0 0

0,5 1.8 0 1,0 1.0 0

1.0 2,0 0 1.3 1.5 0

2,0 1.6 0

Фильтрат

S.typhimur1ит(ШТ .415) 2>0 0 0 1.3 _

'«пни. ■ 7 р* з X

Фильтрат

S.typhi 1.5 1.0 _ _

'комм. ■ 7 р«э!

до.ц ШЪ

.10 ' м 2,4 0 - - -

10"1 м 3,0 0 - - -

дб.цшз) 10 1 м 1.4

10 4 м 2,0 - - - -

10 ' м 2,0 0,8 - - -

Токсины,' концентраты и препараты введены интралюминалъно. ИД -

отношение жидкости в мл к длине петли в см.

Препараты вводили через 15 мин после токсинов, дб.цАЫФ, дб.цГМФ. Па каадый препарат использовали по 6 животных. В контрольные петли вводили препараты на фоне физ.р-ра(ИДч)).

Таблица 14.

Злияние НРА-1, НРА-2 и аминазина на выход жидкости в просвет тонкого ] ночника ммей С57В1/6 ( антитоксишшй эффект против ТЛ-токсина Е.соИ

ГЛ-токсин И Д + НРА-2 -I НРА-1 + аминазин

(мкг) (мл/мг) ю-ч м ю'4 м 10"4 М

0,1 70 + 4 - 32 + 3 -

0,25 63 + 3 - 58 + 5 -

0,5 58 + 3 36 + 2,2 33 + 2 45 + 4,3

1.0 50 f 2 30 + 3 38 + 4 40 + 3,3

(оптроль: 30-3 (петли с введенными в них препаратами). 3 < 0,001 п = 6

Щ - отношение веса петли в мг к длине петли в см. Токсин и препараты введены интралюминально.

Из данных этих экспериментов видно, что препараты НРА-2, {РА-1 и имидазол снижают эффект проницаемости внутрикожппх сосудов в :есте кожной прлбы и оказывают антитоксишый антидичр^ный эффект m модели экспериментальной диярои у взрослых кро.сг-'о.ч и мышей глнии. С57В1/6 против XT, ТЛ-токсина е. со и. Кроме того, препараты iPA-2 и НРА-1 частично снимают действие, оказываемое i-.a тонкий аппечник лабораторных животных фильтратами s.typhimui iun. п s.typhi. 1звестно, что сальмонеллы нарабатывают в числе других токсинов голероподобный термолабильный токсин. Препарат 1ГРА-2 отменяет выход адкости в тонгаШ кишечник, вызванный дб.цАМФ и дб.цГМФ. Опоена тшорсекреции жидкости (з первом случао) и частичное ее снижение :во втором случае) может свидетельствовать о том, что НРА-2 может шиять на ферменты, участвующие в метаболизме цАМФ и цГМФ, в том [исле, на ФДЭ цАМФ и цГМФ. Необходимо отметить, что исследуемый фепараты не влияли на эффект стафилококковых энтеротокс.^юв А и В.

Известно, что в мехш^зме проницаемости -'.¡нут'рикокных. ¡апилляров приниу.акт участие разлитые медиаторы, в том числе и :еротонин. При действии XT и ТЛ-токсина на энтероциты лабораторных сивотных в модел/ экспериментальной диареи из тлтерохромафинных меток выбрасывается до 70 % серотонина. Таким образом, НРА-2,

НРА-1,и га.и'дазол, отменяя эффект токсинов в тесте кожной пробы, могут действовать через механизм, ингибирувдий активность уж синтез серотонина.

?.Л. АНТИДИАРЕИНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА НРА-2 НА МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ДИАРЕИ У НОВОРОВДЕННЫХ ПОРОСЯТ, ВЫЗВАННОЙ ТЛ-ТОКСИНОМ E.coll И ПАТОГЕННЫМИ ШТАММАМИ

E.eoll.

На модели экспериментальной диареи у 5-дневных поросят мы исследовали действие ТЛ-токсина е.со и и эндотоксина s.typhimurium ( LPS ). Токсшш вводили интралюминально в изолированные петли тонкого кишечника, результаты учитывали по ИД через 17 час. ТЛ-токспн вызывал гиперсекрецию жидкости в просвет петель тонкого кипмчникя. Li's не вызывал выхода трансудата, но, в отличие от ТЛ-токсина, у животных развивался токсикоз: повысилась температура.

Таблица 15.

Выход жидкости в просвет изолированной петли тонкого кишечника

поросят (возраст 5 дней) в ответ на введение высокоочищенного

ТЛ-TOKCJIIia E.coll И ЭНДОТОКСИНа (ЛПС) S.typhimurium.

N Токсин Доза (мкг/0,5мл) Объем жидкости в петле (мл) L (см) И Д

1. Контроль 0,5 мл физ. раствора — 0,5 3 0,2

2. ТЛ-токсин 20 2,3 3 0,8

3. ТЛ-токсин 10 i.-о 3 0,3

4. ТЛ-токсин 5 2,2 3 ' 0,7

G. 2,5 5,0 3 1.7

6. ЛПС 125 0 3 0

7. ЛИС 250 0 3 0

8. ЛПС 500 0 3 0

ИД - отношение объема жидкости в мл к длине сегмента тонкого

кишечника в см.

явилась рвота, диарея. Животине находились в тяжелом а. стоянии аблица 15).

В ДРУГОЙ серии ОПЫТОВ МЫ ВВеЛИ TJI-ТОКСИН П LPS S.typhimirlum в

дключичную вену животным. При в/в введении lps у животных через мин. развился токсикоз: рвота, диарея, повысилась температура, явилось апноэ. Внутривенное введение ТЛ-то1:сина E.coii не вызвало -удиения состояния поросят: ни токсикоза, г.и диареи у них не блюдалось. На основании этих результатов можно сделать вывод, что патогенезе желудочно-кишечных заболеваний участвуют 2 токсина, 'ханизм действия этих двух энтеротоксинов различен: местом (йствия ТЛ-токсина являются энтероциты, тогда как lps действует, i-видимому, на клетки крови, вырабатывая нитокины, в том числе iKTop некроза опухолей (ФИО), что и вызывает резкую интоксикацию )ганизма при инфекциях и может служить пр:гчиной смерти, в том геле, при различных кишечных инфекциях.

Поросятам, КОТОРЫМ бЫЛ В/В ВВеДеН ЭНДОТОКСИН S.typhlmurium, 1утрибрюшиш:о ввели НРА-2 в дозе 5 мг/кг. Через 40 мин. состояние шотных улучшилось, температура упала, рвота и диарея сократились, поросятг стали пить, поднялись на ножки '-увствовали !бя удовлетворительно. На следующие сутки интоксикаглч полностью зчезЛа - животные выздоровели.

В третьей серии опытов мы изучили энтеротоксигешюсть азличных штаммов Е.coli, переданных нагл ВГНКИ. зторадиографическим методом (Вертиев и др.) мы определили наличие Ч-токсина E.coii у штамма 1111. Методом экспериментальной диареи 1 новорожденных поросятах мы обнаружьпи энтеротоксигешюсть гаммов 1111 и 320 е.со 11 (таблицы 16, 17!. Этими штаммами мы аразили новорожденных поросят в возрасте 1 суток в дозе 20 млрд .т./мл. На первые сутки все животные заболели. Лечение НРА-2 роводили с 1 дня заболевания перорально; в дозе 5 мг/кг, 2 раза в /тки в течение 3-х дней. Уже вг,чором диарея наблюдалась только у иного животного в I группе, у 2-х во п группе, в ш группе у сех животшх диарея отсутствовала. На вторые сутки вечером диарея гсутствовапа у всех животных. IIa протяжении 2-х недоль признаков аболевангя у животных не наблюдалось.

Таблица 16.

Определение LT - токсина в исследуемых штаммах бактерий

N • Исследуемый штамм Наличие LT - токсина

1. pLT 307 Е.соН • , •. LT*

2. н74 - 114 Е.соН LT*

3. S.dublin ; LT"

4. Е.соН Uli 0 : К : 149 91 Кв8 LT+

б. Е.соН 320 0 : К 78 во LT

6. E.coli 1092 0 : К : 147 89 Квв

7. E.coli 967 LT", ST+

8. Е.соН Е57 LT

NN 1,2,7,8 - тест-штаммы, содержащие(+) или не содержащие(-) токси

Таблица 17.

Выход кидкости в просвет изолированноГ петли тонкого 1<яшечник; поросят (возраст 5 дней) в отьдт на введение 24 часовы:

культур E.coli и S.dublin. ♦

Н Воп.пог.отпно Дозы И Д

Первый опыт Второй от

1. Фяз. раствор 0,5 мл 0,4 0,19

2. ТЛ-токсин E.coli 10 мкг/0,5 мл 2,2 2,4

3. E.coli N 1092 10е МТ * О 10 :К :К )

147 в 9 ввоС

4. Е.соН N Uli 10е ЫТ 1,6 1,3 СО :К :К > -

14V «1 ев

б. Е.соН N 320 108 МТ 1,6 0,07

<0 :К ) 7в 00

6. S.dublin Ю9 МТ 0,17 0,17

Токсин и изучаемые культуры вводили в пеглю тонкого кишечника в 0,5 мл фи°. раствора. ИД - отношение объема жидкости в ил с длине сегмента в см. * - механическое повреждение петли.

В контрольной группе нелеченнье животные заболели и ггал:: вг. ггые сутки. Живо?кие, которым была введена среда

Таблица 18.

Испытание лечебного антидиарейного действия Ь'?.ь-2 на поросятат , зараженных „■.,;теропатогенними контрольными шташамл г:.со11.

зуппы Кол-во Штаммы Лечение с 1-го дня '.т^болевания

животных E.coli НРА-2 per оз 2 раза в день (5 мг/кг)

в группе кол-ва поросят с диареей/кол-во животных в г

• Сутки после заражения

1 2 3 4 5 14

утро вечер 9ч 20ч

I 6 N 320 6/6 1/6 0/6 Q/S 0/6 С/6 0/6

II 6 N 1111 <°149:К9|:Кв8> 6/6 2/6 1/6 0'6 О/о 0/6 0/6

III 6 N 1092 3/6 ) 0/6 0/6 о/ь 0/6 Ü/6 0/6

энтроль 6 Среда культивирования 0/6 0/6 0/6 Г' 6 0/6 0/6 0/6

Без лечения

энтроль 6 N 1111 <°i«9:Ks,:Kae> 6/6 6/6 6/6 4/4 2/2 . все пали

аражение поросят в Еозрасте 1 суток проводил:! контрольный! штаммами нулевой день.

ультивирования, остались здоровыми, заболевания среди них не гм»чалось (таб^ица 18).

Таким образом, из приведенных данных следует, что препарат РА-2 обладает антитокешшым и антитоксическим действием против /1-токсина E.coli, против ;.ps s.typhimurium ка модели кспериментальной диареи у новорожденных порссгг. Преп,1р:,т обладает ыраженным терапевтичэс1:им эффектом у ново^жденны с поросят, кспериментально заражл«".ых энтеротоксигенными штаммами Ii.coli.

2.3. О МЕХАНИЗМЕ АНТИТОКСИШОИ АНТИДИАРЕЙНОИ АКТИВН0СТ1

ИМ1ЩА30ЛА, НРА-1 И НРА-2. Диареи, вызываемые холероподобными токсш!ами, обусловлен) изменением транспорта электролитов через эпителиальные клетк тонкого юнпечника в результате увеличения в цитоплазме клето: концентрации цА^-ЛФ.

Антитоксинное действие исследуемых препаратов может быт; обусловлено влиянием производных имидазола на ключевые ферменты участвующие в биохимических превращениях цАМФ: аденилатциклаз, (АД), фосфодиэстеразу, цАШ-зависимую протеинкиназу (А-киназу) 1

Таблица 19.

Активность АЦ в энтероцитах сегментов тонкого кишечник кролика и мышей С57В1/6 через 5 часов после введения препарат (пмоль/мин/мг белка)

Кролики

ХТ (1 мкг)

Контроль 12 100 х 27 100 X Контроль 3,3 12 100 *

ИГА-2 7 58 х 20 73 X НРА-2 3,5 9 75 X

регулятпрпий белок, связывающий гуаниновыо нуклеотиди ( с -белок)

Изучение активности различных с - белков, присутствующих з момлргитх лимфоцитов из тимуса крысы, позволило установить, чт< НРА-2 но влияет на и а - белки, однако, он подавляет ка1 базпльну»), так и стимулированную ХТ активность каталитическо! субьодикпцы АЦ системы в энтероцитах кроликов, мыпей Са7В1./б (тяПчицп 19).

Результаты пяти серий экспериментов, по изучению влияни) проггярпта НРА-2 па энтероциты крыс представлены в таблице 20.

Из таблицы 20 видно, что препарат НРА-2 в концентрации 2 м! подавлял активность аденилатциклазы энтероцитов кг. 17-22 х, ш сравнению с активностью аденилатциклазы в контрольных, Н( обработанных НРА-2 энтероцитах. Увеличение концентрации препарат: НРА-2 до 5 мМ не сопровождалось существенным возрастание» ингиоиторного эффекта.

Мыши

ХТ (1 мкг)

Таблица 20.

Влияние препарата ПРА-2 на активность АЦ энтероцитов крыс.

N Концентра!ня препарата Активность аценилатциклазы ( * )

1пыта НРА-2 (№■«) Контроль НРЛ-2 д

1 2 100 77 23

2 2 100 73 27

3 2 100 83 17

4 2 100 66 32

5 5 100 71 29

д - разница между контролем и опытом, когда клетки обрабатывали препаратом НРА-2.

На гомогенном препарате каталитической субъединицы гротеингагаазы А из мозга свиньи нами (совместно с Габ«^"оз::м А.Г.; ¡оказано, что НРА-2 конкурентно ингаО.рует зтот фермент. Конотаггга оптирования составляет 1,4 х ;о Н.

Следовательно, механизм антитоксипчого, антидпарейного тействия препарата НРА-2 может быть связан с его непосредственным злиянием на базальную и стимулированную ХТ каталитическую зубъединицу АЦ. Вторым механизмом антидиа.'.'е/гного эффекта НРА-2 ложет быть его способность блокировать действие цАМФ на уровне 1АМФ-зависимой протеинкиназы А.

Таблица 21.

Содержание цАМЭ в лимфоцитах, обработанных ХТ и имидазолом (пмоль/12 млн/90 мин)

Концентрация ХТ мкг/мл 0 0,01 0,1

2,92 3,56 7,25

+ '.'„МИД 10"л М 3,18 3,67 7,65

+ ютлд ю"4 и 2,64 3,33 6,31

+■ ИМИД 10"3 м 1,е- 2,46 4,93

Известно, что шщазол и пРА-1 инг-Оируют Ф.7Э цГМФ и стимулируют ФДЭ цАМФ, г.о., эти ьощества снижают внутриклеточный

уровень цАМФ, что может также являться причиной их антидиарейно! активности. .

Как видно из таблицы 21, имидазол снижает цАМФ в ЛПКч обработшпшх ХТ, особенно, в концентрации 10 ~3 М.

НРА-1 также снижал концентрацию цАМФ в интактных лимфоцита человека, а также в лимфоцитах, обработанных ХТ (таблица 22).

Таблица 22.

Содержание цАМФ в лимфоцитах, обработанных ХТ и НРА-1

(пмоль/8,9 млн/70 мин) •

Концентрация ХТ мкг/мл 0 0,01 0,1

3,25 5,97 7,98

♦ НРА-1 10"3 М 2,61 6,35 6,93

+ НГА-1 10"4 М : 1,54 4,94 5,5

+ ИГА-1 10"3 М 0,95 3,64 4,41

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что препарат снижают гиперсекрецию жидкости в просвете тонкого кишечник лабораторных животных по следующим механизмам: НРА-2, действуя н каталитический компонент АЦ и блокируя цАМФ-зависимую протешшиназ

А. Имидазол и НРА-1 снижают внутриклеточный уровень цАМФ интактных .мпч1к)цитах и в лимфоцитах, обработанных ХТ, по-видимому как стимуляторы ФДЭ цАМФ. По такому же принципу они могу действовать на энтероциты человека и животных.

3. ШШЯНИЕ ПРОИЗВОЛ! ШХ ИМИДАЗОЛА НА СИСТЕМУ ЦНТОХГРМА Р-450 И Р-448.

В нпстолщое время в многочисленных работах показано, чт различные химические соединения,, в том числе и лекарства, способн носпецифи.чоски увеличивать или подавлять активность микросомальны ферментов, т.е. при введении в организм они влияют на те форм цитохрома Р-450, которые участвуют не только в их собственно мотпболизме, но и метаболизме других лекарств. Таким образом, влия на активность микросомальных ферментов печени с помощью одног лекарственного соединения, увеличивая или подавляя ее, можн изменять скорость метаболизма, а следовательно,

эмакокшетические параметры других лекарственных соед^эаиД. (явление активности форментов мякрсгом, ответственных ~л »трансформацию лекарственных препаратов, позволяет увеличить в >ви концентрацию исходного лекарственного средства и снизить щентрациго токсических метаболитов, т.е. угжлть лекарственный ^>ект и снизить нежелательное действие метабо/итов.

3.1. ВЛИЯНИЕ НРА-1 И IIPA-2 НА АКТИВНОСТЬ ЯЮШГВДИНйЕМЕТИЛАЗЫ (АЦЦМ) И БЕНЗ-а-ПИРЕНМ0Н00КСИГЕНАЗЫ (ЕПМО).

Известно, что имидазол и его производные' в зависимости от ¡мы введения, могут подавлять или усиливать ферментативные 'изности, связанные с системой цитохрома- Р-450. Широко юльзуемые в ¡типической практике лекарственные препараты НРА-1 и 1-2 являются производными имидазола, поэтому нашей целью было нить в сравнительном плане способность названных препаратов :ять на актилность микросомальных ферментов печени'мышей.

В данном разделе мы определяли актизность аминопириндеметилазы U1M), зазислщую от цитохрома Р-450 и цлтохром Р-448 зависимую 13Пирекмонооксигеназу (БПМО). Обе форлы цитохромов относятся к ШГлОольным фермент.'ил однако механизм ;ч1гукции :л ix Фор/ -ппцтиально разный, "оэтому представляло несомненней интерес гчить влияние НРА-1 НРА-2 не только на базальную активность сросомалышх монооксигеназ, но и на активность этих фер/ентов :ле индукции. В качестве такого индуктора был выбран штилхолантрен (3-МХ), увеличивакший уровень и активность гохрома Р-448. Эти опыты проводились на мышах С57В1/6. Данная гая мышей относится к высокоиндуцибельлой, т.е. при действии 1Уктора 3-МХ степеь:- индукции цитохрома Р--.48 высока. Полученные ¡ультаты представлены tí таблице 23. Из таблицы следует, что 1-2 в значительной степени тормозит аминотфнидем-'-гилазную, а осе базальную и индуцированную 3-МХ бензпиренмонооксигенаг,иую живности в микросоиах тп-чсии »/,ышей. НРА-2 вызывал прп'лчрно 50 т. ибирование в концентрации 5-* 10 М.

Ингибирующб>,- действие второго препарата - Н?А--1 выражено 1Чительно слабее. На активность БПМО микросом, no.'>yiüHHi:x гз гени мышей, подвергнуты}- обработке 3-МХ, НРА-1 вообще не злиял.

Таблица 23.

Влияние НРА-2 и . НРА-1 на активность микросомальга монооксигоназ печени мышей С57В1/6.

Препарат

нрл ?,

НРЛ-1

Концентрация М

5 х 10' 10" 5 х 10' 5 * 10"

гз

г«

х активности

АЦЦМ

БПМО базальная

БПМО .

+ з-мх

85 76 54,9 70

54

84,2

45,5 104

•-АПДМ - аминопнридиндеметилаза, базальная активность 7 нмоль/мин

••-ВГ1М0 - бенз(а)пиренмонооксигеназа - базальная активность 0,7 нмоль/мин/мг

*»*-БПМО, индуцированная 3-метилхолантреном - 4,4 нмоль/мин/мг.

АНДМ активность связана с цитохромом Р-450, т.е. с те формами цитохрома, которые индуцируются фенобарбиталом(ФБ Индукторы второго типа (3-метилхолантрен и бенз-(а)пирон) индуцир цитохром P-448-зависимую БПМО. Именно эта форт цитохро осуществляет метаболические превращения ряда проканцерогенн полицикличоских ароматических углеводородов в истинные канцероген

Учитывая способность НРА-2 ингибировать базальную индуцированную З-МХ активность БПМО, связанную с цитохрюмом Р-44 ого можно рекомендовать для детоксикации токсических метаболито особенно, опразупдих эпоксиды.

3.2. ВЛИЯНИЕ С0ЧЕТА1Ш0Г0 ПРИМЕНЕНИЯ НРА-2 И ФУРОСЕМВДА

ФУНКЦИЮ ПЕЧЕНИ КРИС. В 'эксперименте на мышах высокие дозы фуросемида вызыва некротичоскио изменения в печени, что возможно обусловь образованием токсических метаболитов фуросемида эпоксидной природ Нами показало, что производные имидазола in vitro подавля активность цитохрома Р-450 и Р-448.

Целью исследования в данном разделе было изучение сочотанно применения фу]»семида и одного из производных имидазола - препарг

РА-2.

Введение НРА-2 (70 мг/кг) в перфузат через 20 минут после золяции печени крыс, предварительно индуцированных фенобарбиталов, е изменяло велчг'ину потребления кислорода ( л р02 ) и ле вызывало ¡ыхода ионов калия из клеток, что, очевидно, свид^уелт:ствует об 1тсутствии гечгтотоксическсго гч'фекта V НГА-2. Наблюдаемое при этом 'волпче1шо объемной скорости кровотока (О) от 5,0 до 5,8 мл/мин/г, ю-видимому, обусловлено спазмолитическим действием НРА-2. При юр/альном содеркашот 02 в перрузате фуросемнд в дозе 6 мг/кг шзывал значительное (-40 %) сшжепио величины О. Выхода I' прл этом и увеличения лрОг, свидетельствупцих о гепатотокспческсм ;ействга1 фуросемида, но наблюдалось. В условиях частичной аиокст,га (21 $ 02) - такая степень гипоксии является пороговой при величинах ) = 4-6 мл/мин/г, т.к. дальнейшее уменьигаше содержания кислорода в 1ерфузате вызывает выход [Г и? клеток печ^;;:!, фуросемил прлзсзи: не только к резкому уменьшению вшшчкни о. а таете к существенному выходу К* из гепатоцитов в перфузат. Предшествующее ьиедение (за 10 минут) в порфузат НРА-2 снижало гепатотоксическиЛ эффект фуросемида; в этом случае величины О ;; г^ход К+ на клеток существенно не отличались от контрольных уровней, регистрируемых до введения лекарств.

Моноташое снижение величины О на протяжении 90 минут перфузии, наблюдаемое при введении фуросемида, характерно для препаратоп, гепатотоксичоский эффект которых обусловлен токсичностью их метаболитов. Защитное действие НРА-2 связано, по-видимому, со способностью препарата ингибировать образование токсических метаболитов фуросемида.

Учитывая результаты наших исследований можно рекомендовать комбинированное назначение этих двух препаратов, что позволит снизить используемые дозы фуросемида при сохранении величины диуретичес&т'з эффекта, характерного для более высоких доз диуретик- и снизить риск возникновения гепг.тотоксического действия метаболитов фуросемзд;?. у больных, особешо, при г.ообходимости назначения им доз прзпарата, суаественн.-. ггревышг<а;их значения среднетерапевтически:'..

В заключение необходимо отметить, что данные по влиянию НРА-2

на систему цитогрома Р-450, Р-448, а также по изучению сочетанног влияния НРА-2 и фуросемида на функцию печени крыс получен) совместно с сотрудниками лаборатории антитоксинных препаратов НП< "Биотехнология". Автор благодарит Сарбаша В.И., Кошелеву H.A. Тюценкову И.Ф., Паутову И.С. и, особенно, А.З.Притоцько E.H.ACTbirj.uia, без которых данные исследования были бы невозможны,

4. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНОГО ИМИДАЗОЛА ПР?Л1АРАТА НРА-2 В СРАВНЕНИИ С ПОЛИСАХАРИДОМ B.prodleioaui (riF0flltTH03AH0M).

4.1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТА НРС-2 И ПР0ДИГИ03АНА (ПДГ) Н АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ПЕРИТОНЕАЛЬНОГ» ЭКСУДАТА МЫШЕИ c57bl/6 И НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ БЕСПОРОДНЫ МЫШЕИ ПРИ ВВЕДЕНИИ ИМ s.TYPHI.

Как уже было сказано выше, резистентность организма i различным заболеваниям определяется функциональным состояние! фягащтирушцих клеток - макрофагов и нойтрофилов (раздел 1.6).

Б дшшом разделе мы изучили влияние продигиозана и HPA-ü н; выброс активных форм кислорода фагоцитирующими клеткам1 ппритоноального экссудата мышей с57в1/6 методом ласинолзависимо! хемолимносионции. Препараты вводили по следующим схемам: I Продипгозон в дозе 0,05 мкг/мышь однократно в первый и 3-й день Ii. ILPA-2 0.1 мг/мышь однократно в 1-й, 2-й, и 3-й день. III. НРА-; 0,1 мг/мышь однократно в 1-й, 2-й и 3-й день и продигиозан в доз» 0,0? мкг/мышь в 1-й и 3-й день.

Нами было показано, что введение НРА-2 (II) не приводило i изменению общего количества кпеток перитонеального экссудата мытой, но сравнению с контролем, в то время как введет» продигиозана (I) и продигиозана с НРА-2 (Ш) сопровождалоа увеличением общего количества клеток до 214 * и 123 х, соответственно. При определении морфологического состава клето! поритонеального экссудата мышей в ответ на введение препаратов по 1 II и ill схемам отмечался сдвиг в сторон! макрофагально-моноцитарного ряда. Изучение функционально: активности фагоцитирующих клеток в ответ на введоние НРА-2 (II; (таблица 24) показало, что выброс активных форм кислород* увеличивался в основном в процессе адгезии клеток к стеклу - в 30,£

заза по сравнению с контролем, и в меньшей степени б грсчэг.се фагоцитоза - в 3,57 раза по сравнению с контролем. При инъекции лишам продигиозага • ) усиленно выброса свободных форм кислорода тблюдалось как г, процессе адгезии, так и в процесс? фагоцитоза (з 3,4 раза ив П раз по срарл^:т;ю с контролем, соответственно). Совместное применение этих препаратов по схеме III приводило к эффекту синергизма, т.е. ^обливало выброс свободных ферм ¡кислорода в процессе адгезии и ф;;гоцитс.З£,' (в 20 раз и в 13.9 раза по этноионию к контролю, с/;отвотс'гветга) в сравнение с ИРА-2 и [тродигиозансм, введенные раздельно.

Т.о., препарата ИРА-2 и продпгиозан увеличивают фушаигока.гьнуп активность фагоцитирующих клеток перитонеального экссудата мышей, усиливая процесс выброса свободных форм кислорода. Соьместкое [триманение НРА-2 и продигаозана приводит к эффекту синергизма в ¡гроцессе активации фагоцитирующих клеток.

Поскольку продпгиозан Екзывает ряд побочных эф^г-ктов при введении его в организм челоь^./л: высокую томперат.-иу, головную Золь, боли В' пояснице, по нашему мнению, МРС-2 можно с успехом применять в качестве стимулятора неспецифической резистент-.исти при различных патологических состояниях, т,-:м, ^де нежелательно применение продигаозана.

Таблица 24.

Злияние НРА-2 на активность поритонеальных фагоцитов мышей С57В1/6.

препарат Кол-по имп/мш/106 кл Общоо кол-по клеток Морфологический состав клотск

адгезия фагоцитоз

:£РА-2 3,1 мг/мышь 47387-1102 102465-7230 3,8 млн Макр/мон - 54 Я Лимфоц. - 39 % Кейтр. - 7 %

контроль 1565-102 28665-2059 3,5 млн Макр/мон - 39 X Лимфоц.» - 52 % Нейтр. -9 %

П = 6, р < 0,05.

Далее мы изучили зыживаемость мышей при защитный эффект ЯРА-2 и введении им вирулентного про;-.:1гиозана на штамма э^урМ.

Культуру вводили в дозе 1С? м.т., 107 м.т., 2 х 1Сf м.т внутрибршяшшо. При данных заражающих дозах наблюдали 100 х гибел: мытой.

Как видно из данных таблицы 25 , и продигиозан к НРА-2, введенные в различных дозах, защищают мышей от гибели при введегап им высоких смертельных доз культуры s.typhi. Препараты НРАт2 j продигиозан предотвращают гибель мышей, зараженных вирулентны? пггаммом s.typhi, по-видимому, влияя на функциональную активност] перитопоалышх фагоцитов через индукцию свободных форм кислорода i процессе адгезии и фагоцитоза.

В кячрптво препарата сравнения мы взяли препарат фторазо. (ЮС-15). Этот препарат, по нашим данным, ингибирует выброс активны: фо;м кислорода в процессе адгезии и фагоцитоза, поэтому он не оказал защитного эффекта на мышей.

Таблица 25 .

Влияние НРА-2, ДЦГ, ЮС-15 на выживаемость беспородных мышей

при заражении их вирулентными штаммами s.typhi.

Культура Доза заражения

s-tyfbi 10е м.т._107 м.т._2х106 t

Дни

0 1 4 8 12 * 0148 12 * 0148 II

Количество выживших животных

S. typhi 12 1 0 0 0 0 12 4 0 0 0 0 12 1 1 1 1

+ ИГА 2 0,1 мг 12 1 0 0 0 0 6 5 5 5 5 83 6 6 1 1 1

1ГРА 2 0,5 мг 6 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 •0 6 6 6 6 6

+ ИГЛ-2 0,05 МГ 6 3 0 0 0 0 6 5 3 1 1 16,6

♦ ЦДГ 0,005 мг 6 6 6 6 6 100 6 6 6 6 6 100 6 4 4 4 4

+ ЩЦ' 0,001 мг 6 6 6 6 6 100 6 6 6 6 6 100

* ЮС-15 0,025 мг 6 3 0 0 0 0 6 3 1 1 1 16,6 - - - - -

+ ЮС-15 0,005 мг 6 2 0 0 0 0 6 5 1 1 1 16,6

В контроле мышам вводили внутрибрюшинно НРА~3, ПДГ, ЮС-15 1 тех же дозах, по той же самой схеме, что и в опыте. Все животны* выжили при наблюдении за ними в течение 12 дней.

В настоящее время для профилактики брюшного тифа у людей :пользуют вакцинацта Сда^отифозными вакцинами. Утл?квал элучепные нами результаты, можно предложить НРА-Я и . ПДГ для рофилактики бргом^о тифа у людей.

4.2. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ШйШЮКЧ'Л'ЕТЕЯПШ: КЛСГ'К 'ЧЕЛОВЕК ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА СПШ^ИЧЕСКИИ ИММУНИТЕТ И СИСГШУ 1 [ЕСПЕЦИФИЧЕСКОН РЕЗИСТЕЛТНХТИ, ПРИ ПИЖЕНЕНИИ НРА-?, ПДГ ^ШАНТАДИНА С ЦЕЛЬЮ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСШЛС ИНФЕКЦИИ (ОРЕИ) И ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВ АШЛ У ЖЩЕП, НАХОДЯЩИХСЯ В УСЛОВИЯХ ЗАКРЫТЫХ КОЛЛЕКТИВОВ.

Известно, что в закрытых коллективах людей (детские сады, колы, училища) при • большом скоплении народа возникают сначала спышки острых респираторных заболеваний, затем желудочно-кишечных, в конце к ним присоединяется вирусный гепати1!.

Целью исследований настояг.ого раздела явилось изучен»: оздействия препаратов 1ЩГ, НГА-2*и ремантадина на функцгопальное остояние мембраны Т- и В-лимфоцитов, их функциональную акт'/ность, также на функциональную активность 'Ла.-отг-ирующих клеток нейтрофилов и моноцитов) крови людей. В далыг^шем мы предполагали редложить наиболее эффективные из них для профилактики всгшпек РВИ, желудочно-кишечных заболеваний у людей, находящихся в словиях закрытых коллективов.

Препараты вводили по схемам, предложенным и разработанным ами. В иммунологических исследованиях участвовали 80 учащихся в озрасте 18-20 лет. 15 человек в контрольной группе принимали донтичные по внешнему виду таблетки плацебо.

В предыдущих разделах исследований мы показали, что препарат РЛ-2 является стимулятором функциональной активности агоцитирующих клеток перитонеального экссудата мышей: индуцирует ыброс супероксвдашгсн радикала в процессе адгезии и фагоцитоза. По ашим данным он обладает тс/хе антитоксинным антидиарейным ействием.

Известно, что гюдигиозан обладает широким спектром иологической активности, в том число, сталулируит клетки, тветственные за неснецифиче'скую резистентность организма, является

индуктором эндогенного интерферона. Благодаря исследованиям акщ АМН СССР 3.В.Ермольевой (1976), этот препарат получил широкс клиническое применение. В предыдущих главах мы изучили механизм ег действия на фагоцитирующие клетки мышей.

Ремантадин - производное аминоадамантана, относится противовирусным препаратам и применяется для профилактики и лечет: 0FBU. Однако исследования по влиянию ремантадина на chcton иммунитета и неспецифической резистентности крайне немногочислент, выполнены на моделях животных, поэтому представляет определена интерес выяснить, как действует этот препарат i иммунокомпетентные, фагоцитируетее клетки человека и другие фактор иммунологической резистентности.

Иммунологические исследования проводили до и спустя 7 -суток после последнего приема препаратов.

Кг..» -lUlHO из данных таблицы 26, в ответ на применение ПДГ, П, +■ НРА-2 изменяется функциональное сотояние мембраны В-Т-лимфоцитов и нейтрофилов. Функциональная активность Т-лифоцитов FUT так жо изменяется в ответ на добавление к ним ь'гл-р и Кон-А, именно, поело применения ПДГ и ПДГ + НРА-2 синтез ДНК в н увеличивается, что свидетельствует об увеличении процес пролиферации Т-лимфоцитов периферической крови лодей.

Tarai:,1 образом, IDPA-2 и ЦПГ оказывают иммуностимулирупц действие на иммунокомпетентные клетки челозека.

При изучении функциональной активности фагоцитирующих клет крови человека (нейтрофилов и моноцитов) методом хемолюминесцени мы показали, что применение препарата НРА-2 вызывает увеличен функциональной активности фагоцитирующих клеток при адгезии -27,5 рпп, при фагоцитозе - в 6,3 раза у 93 х обследопанных.

Применение ПДГ' увеличивает адгезию фагоцитов в 13,5 раз фагоцитоз - в 15,6 раза у 73 * обследованных. Совместное применен ПДГ и НРА-2 увеличивает выброс супероксиданион радикала в щх^ес адгезии - в 16,9 раза, в процессе фагоцитоза - в 16 раз у 100 обследуемых. Гемантадкн ингибирует выброс свободных форм кислорс у 78 х обследуемых.

Таблица 26.

Влияние препаратов на функциональную активность Т-лимфоцитов в

РБТ и функциональное состояние мембран В- и Т-лимфоцитов и

нейтрофилов ПКч.

ГБТ К-стиму-ля'.ди ' М-РСК ?0К

ФГА Кон-А (В-лимфоциты) (Т-лимфоциты/нейтрофилы)

ДО после ДО после

нтроль .1,08 ± 0,26 .1,03 ± 0,27 .21,5 ± 1.8 .22 ± 1,7 55,8 ± 2,7 /25,7 - 1.3 +57 ± 1,9 /,25,3 ± 1.2

А-2 .1,07 - 0,16 ,0.92 - 0,10 ,17,4 - 2,7 ,21,2 - 2,6 .50 - 2 /23,6 - 2,8 +55.8 ± 2,4 /,25,4 - 2,5

р .2,65 ± 0,45 ,1,44 - 0,24 ,20,5 ± 3,5 ,23,1 ± 3,9 .49,5 - 3,5 Л21,4 - 2,3 ,55,3 - 2,5 /,25 ± 2,1

А-2+1ЩГ ,1,39 - 0,16 + 1,60 - 0, + 16 ± 2 ,22,9 ± 1,8 .45,3 ± 3,3 /21,6 ± 2,2 - 2,8 /27,6 1 1,9

иалтадош .1,14 ± 0,14 ,1,04 0,13 + 16 ,16,6 - 2,1 .49,2 - 2,9 / +46,8 - 2,3 / 17

о - до введении препарате^ р . 0,05

осле - после введения препаратом

-РОК - розеткообр&зующие ;-./етки с эритроцитами мыши ^-лимфоциты) -РОК - розоткообразующио клетки с эритроцитами барана (Т-лимфоциты/ нейтрофилн)

эффициент стимуляции(К) - ИС после введения препаратов/ИС до ВЕеде-я препаратов. ИС - индекс стимуляции - синтез ДНК в опыте/сютез К в контроле.

На следующем эт.'ле мы определили уровень р-интерфер;на в ытной и контрольной группе учалчтея (до и поелч вввдетля РРА-2).

Статистически достоверное усиленно инторФоронообразочяния в ытной и контрольной группах позволяет считать НРА-2 гаи"".<тором терферона, активность синтеза которого варьирует г. зависимости от дивидуального иммунологического реагировали I' :бследуемого.

Таблица 27..

Динамика показателей уровня лейкоцитарного интерферона опытной и контрольной группах

Группы До введения пр-та После введения пр-та г

ср.геом. о довер. ср.геом. о довер.

титр ин-л. титр ' ин-л.

НРА-2 50,8 0,3 32,5 + 707,9 0,5 373,5 + > 2 <

79,3 1341,9

Контроль 84,4 0,4 50,5 + 92,6 0,5 50,5 + > 2 <

141,0 169,8

Учитывая проведенные выше исследования, мы показали, чт< ИГА 2, ПДГ являются иммуностимуляторами и стимуляторам: носнецифичоскоП резистентности. Кроме того, НРА-2 по нашим данным облапает антитоксинным антидиарейным и антитоксическим действием Поэтому, эти препараты, особенно НРА-2, можно предлагать дл: профилактики ОРВИ, желудочно-кишечных заболеваний, а также вирусны; гепатитов у людей, находящихся в закрытых коллективах.

Ремантадин неоднозначно влияет на иммунологический стату! организма. Являясь, как известно, с одной стороны индуктора пнтпрГпроип, с другой стороны он угнетает функциональную активност: фагоцитирумких клеток периферической крови, роль которых при эти: патологических процессах трудно переоценить. По-видимому, назначат: его в профилактических и лечебных целях нужно более ответственно : осторожно.

Исследования данного раздела были выполнены автором совместно с научными сотрудниками отдела эпидемиологии НИИЭМ ил.Н.Ф.Гамале] (зап.отделом В.И.Васильева). Автор выражает глубокую благодарност] Т.Л.Семенпико, Т.П.Грушко, Н.Каражас, В.И.Васильевой.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлена новая роль холерного, хаперопедобнол токсинов и цАМФ в патогенезе диарей, вызываемых грамотрицательным] бактериями. Показано, что эти энтеротоксины и цАМФ вызывают ш только гиперсокрецию жидкости в просвет тонкого кишечник! лабораторных животных и диарею, но и необходимы для начала 1

вития инфекционного процесса, влияя на адге?;та микроорганизмов к ткам эпителия и колонизацию ими тонкого кишечника животных.

2. Установлено, что под действием холерного токсина личивается концентрация цАМФ внутри клетки млекопигаэдих и исходит увеличение его концентрации в тоансудате тонкого ечника лабораторных животных.

3. цАМФ, добавленный in vitro в культур: холерных вибрионов амм 569Б Инаба) , вызывает .ускорение и усиление их роста в поненциальной' фазе, увеличение их подвижности, накопление массы через 24 часа;

4. цАМФ. добавленный интралюминально взрослым кроликам, !личивает адгезию холершх вибрионов к эпителиальным клеткам :кого кишечника этих животных; добавленный в изолированные петли :кого кишечника кроликов вместе с культурой холерных вибрионов ■амм 5>"ЭБ Ииабя), вызывает гибель животных на фоне сильного т4коза, вызванного эндотоксином холерных вибрионов.

Ь. Изучо.-:а различная внутривидовая чувствительность тонкого ючника к действию холерного токсина, тэрмолабильного токсина oll, дб.цАМФ У м'ллей различных ли,;иГ. Обил р ,-жено, что ютвителыюсть к Т1-"оксину е.coli падьет в слпд.эдем ряду:

131/6 > F'(C57Bl/6xCÖA) > A/Sn - СБА > 00"П0р0Д.--_.е > EALB.

;с'твительность тонкого кишечника к дб.цАМФ выше всего такае у зей C57B1/G.

6. Холерный токсин, TJI-токсин е.coli, дб.цАМФ подавляют синтез ; в РБТ лимфоцитов периферической крови человека и выброс героксиданион радикала фагоцитируи^и клетка;® крзви ¡ораторных животных з процессе адгезии и ^м-оцитоза, снижая таким >азом, местный иммун'/тот и неспецифическую резистентность в IKOM кишечнике млекопитающих.

7. XT, ТЛ-токсин E.coii, Ca2' ионофор А23187, внутрклсльточшя шатор кальмодулин увеличивают активность ЛЦ ь энтеро'П'тах мышей B1/6 и концентрации цл,МФ внутри лимфоцитов периферической крови ювека. Соче n-'i н'ле применение* XT и тзофиллина приводит к [Чительному увеличению кст.знтрапии цЛМФ ннутр-: интактных фоцитов периферической кров:: чоловг>%а, так называемому эффекту ■енциирования. Активация .Щ и увеличение уровня шJv5 з клетках

эпителия тонкого кишечника млекопитаицик служит пр'чш гиперсокреции кидкости в просвет тонкого кишечника и приводит диярое.

8. Показано, что холерный токсин, термолабильный toki е.col 1, стафилококковые энтеротоксины А и В, фильтрг S. typlilmurlum, S.typhi, Дб.ЦАМФ, ИОНОфОрНЫЙ аНТИбИОТИК А231! дб.цШЗ), добавленные интралюминально взрослым кроликам, mhi различных лгап1й, крысам, новоровдешшм поросятам, вызыв; гипорспкр5цию жидкости в просвет изолированных петель тоню кишечника этих животных.

9. Импдозол и его производные лекарственные препараты HFA-: Ш'А-2 подавляют действие холерного токсина, TJI-токсина е.со фильтрата s.typhimurium в тесте кожной пробы по Крейгу на взрос, кроликах; .снижают или полностью подавляют гиперсекрецию жидкое вызваную холерным и холероподобным токсинами, фильтра'

S.typhimurium, S.typhi, Дб.ЦАМФ, Дб.цГМФ В ИЗОЛИрОВаНЫХ П в Т.

тонкого кишечника лабораторных животных. /

10. Лекарственный препарат НРА-2 обладает выраженной лече! эффективностью на модели диареи новорожденных порос: эксперимонтапьно зараженных энтеропатогенными штаммами E.coli, также на модели экспериментальной диареи, вызванной ТЛ-токсш

E.coli И ЭНДОТОКСИНОМ (LPS) S.typhimurium.

11. Антиднарейный аититоксинный эффект НРА-2 зависит от i способности ингибировать каталитический компонент аденилатциклаз] системы, a Taiote активность протеинкиназы А. Антидиарейные эффе1 имидпзола и НРА--1 обусловлены их ингибированием синтоза ц. внутри клетки.

12. Выявлено, что ПРА-2, в зависимости от схемы вводе] лпЯпрлтпрним животным, может увеличивать содержание цитохрома Р-в микросомалыгай фракции печени крыс или подавлять его активное ИГА- 2 подавляет также базальную и индуцированную фэрментатив] активность, связанную с различными изоформами цитохрома Р-450 vit.ro); снижает гепатотоксический эффект фуросемида у крыс.

13. Показано, что НРА-2 и продигиозан индуцируют выб] супероксиданион радикала в процессе адгезии и фагоцип фагоцитирующими клетками перитонеального эксудата мышей С57В1,

щпцают мышей от гибели при заражении их внсоковирулент^.им птажгм :урЫ , вызывающим 100 % гибель животных.

14. НРА-2' л ародига^ан, примененные с целью профилактики ЗИ у людей 1= закрытых коллективах, изм«няют функ.згональноо зтояние мембран Т-; В-лим$оии?о2 и нвйтрофилов периферической эви человек?; изменяют ф^штэнальнуп активность Т-лимфоцитов риферической крови человека р РБТ лимфоцитов ПКч; индуцируют брос супороксиданион радикала нейтрофилак-* и ."еноцлтами риферической крови чоловь-л в процессе адгезии и фагоцитоза.

На основании проведенных исследований был предложен ¡.'-грвый зчественннй антитоксишшй антидиареЯннй препарат (НРА-2) для цицинской и ветеринарной практики, обладающей, кроме того, гитоксическим, иммуномодулирующкм и стимулирующим неспецифкческуа зистентность действием. Этот препарат разрешен в качестве гидиарейного средства Фармакологическим комитетом МЗ СССР; ротокол N 1 от 15 февраля 1988 года). 31 марта 1992 .'. зветфармкомиссией Министерства сельского хозяйства ГО НРА-2 зрешен для профилактики и лечения диарей, вы/.ь }аемых ■шотрицательными бактериями у сельскохозяйственных животных и .тцн.

Автор выратает глубокую благо; тгность профессору И.ГайлонскоЯ, зав.лабораторией эпидемиологии энторалышх инфекций ДОМ им. Гамалеи, на базе которой были выполнены экспериментальные шые по антитоксинному антидиарейному действию препаратов,

3.Гябиченко, О.А.тарасонко, Г.К.Ферапонтову , А.М.Сурину, ^.Ходоровой, И.Г.Паутовой, Е.П.Крупновой за помощь в зпериментальной части работы, А.М.Сурину, А.В.Лазареву за помощь обсуждении результатов.

Особую благодарность ' автор выражает своему соавтору д.б.н.

4.Асташкину, с которым на протяжении 10 лет разрабатывалось ■шое напр.гпле;гие по созданию антитоксинных антидиарейных эпарато?.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ф.С.Флуер, И.С.Николаева, Энтеротоксины, продуцируемы стафилококками и Bacilua cereus.//Вестник Академии Медицинских Hay СССР, 1973. - N 12. - С. 61-66.

2. J.V.Ezepchuk, I .S.Nikolaeva, V.I.Bugrova, Staphylococca enterotoxln A: purification- arid comparative study the two - toxl form*(heat-treated and untreated).//Int.J.Biochemistry, 1974. V.5. - pp. 443-449.

3. J.V.Ezepchuk, I.S.Nikolaeva, S.V.Guolazizov, The isolatic of stafylococcal enterotoxln type A and investigation of it ullra.itructure .//22nd International Congress of Aviation and Spac Mr-fHolne, 1974 , Abstracts of Papers, p.46.

4. S.D.GJulazlzov, I.S.Nikolaeva, L.G.Gorina, Yu.V.EzepchuV В.1.Bu^rova, A.M.01ovnikov.//0n detection of the stafylococci enterotoxln A by agregate-hemagglutlnation technique and electron microscopic data on this toxin.//Aviation, Space and Environments Mndlnlnn, 1976. - N.2. - pp. 199-201.

5. Езопчук Ю.В., Николаева И.С., Бугрова Р.Я., Выделет индивиду0".'. наго компонента стафилококкового энтеротоксина тш Л.//Биоорглшпоскяя химия, 1975.- T.l. - N.4. - С. 546-553.

6. Е.И.Асташкин, И.С.Николаева, И.Е.Ковалев, Использованш ионофорных антибиотиков и протонофоров для выяснения poj оцнопчлонтных катионов в реакции бласттрансформации лют{юцитс человека.//ДАН СССР, 1977.- Т.237.- N.5.- С. 1238-1240.

7. И.С.Николаева, И.Н.Гайлонская, Г.К.ФерапонтоЕ Е.И.Лстшпкин, Два возможных мехага1зма действия холерного токсина i неспецифическую реакцию бласттрансформации лимфоцитов человека./ Сборник научных трудов "80 лет В.Л.Троицкого".- Москва, 1977. - ( ВЯ-РЯ.

0. И.С.Николаева, И.Н.Гайлонская, Г.К.Ферапонто! Е.И.Лстошкин, Влияние холерного энтеротокс./л)

холерогон-анатоксина и культуральных фильтратов штатов холерно] вибриона на реакцию бласттрансформации лимфоцитов человека.> Всесоюзный симпозиум "Эпидемиология и профилактика кишечт инфекций". Тез. докл. - Таллинн, 1978. - С. 320-322.

9. И.С.Николаева, И.Н.Гайлонская, Г.К.Ферапонтов, И.Е.Ковале!

1.Асташкин. Влияние веществ, такенявдил уровень внутриклеточного ,1Ф на реакцию СласттрансхЬ^рмации лимфо;щтов человека.// гология. - 1978. - T.¿С. » 12. - С. 1407-1412.

10. Асташкил Й.М., }{иколаева И.С., Ковалав И.Е. Исюльзованл: юфорных антибиотиков для изучения неспецифичопсой реакции юттрансформапии лимфоцитов человека.// 1-Я Всесс;ссн. съезд латологов, трансфузиолоюв. Тез. докл. - Баку,1379. - с. 98.

И. Николаева И.О., Гайлонская И.Н., Ковг.^в И.Е.. Асташкин Î. Выяснение роли циклических нуклеотидов в пролиферации лфоцитов человека с помощью веществ изменяют^ их внутриклг'-эвень.// Там se. - С. 100.

12. Николаева И.О., Асташкин Е.И., Гайлонская И.Н., Ферапонтов i., Ковалев И.Е., Марчук JI.M. Изменение функциональной активности лфоцитов человека под действием факторов, влияющих на утриклеточную концентрация цАМФ./.' Криококоерг ггтзспзгке «унокомпететгтных тканей. - Ньукова Д^ка, Кие:», 1979. - С. 1С.--.

13. Асташкин Е.И., Никола^:;-! U.C., Коптев И.С., ;'ябиченко 3. Влияние теофиллина и имидазола на митогзнное действие i23187 и А в культуре лимфоцитов человека.// Циклические нуклеотиды. -з. докл. ni Всесоюзн. симпоз. М., 1380. - С. 7.

И". Николаева И.С., Асташкин Е.И., Гслизловя Л.А., Порцева К., Коззлев И.Е., РЛбиченко В.Ь. Комнтогеннсе и иунодепрессивное действие ДДТ и его производных на лимфоциты ловека, стимулированные ФГА.// ДАН СССР. - 1980. - Т. 256, н 2. -503-505.

15. Деревицкая В.А., Лихошерстов Л.М., Асташкин Е.И., Пискаров Е., Сенченкова И.Н., Николаева И.С., Кочетков Н.К. Гликопрстеин мембран тимоцитоз теленка, обладающий комитогенным действием.// 'Л же. - 1981. - Т.257, N 4. - С. 1003-1006.

•с. Николаева И.С., Асташкин Е.И., Гайлонская И.Н., Ковалев Е. Связь мгтду митогенным эффектом А23187 и системами циклических клоотк^.'.в в лимфоцитах.// 4-ый Международный конгресс мунологов. Тез. докл..Париж. - 198G. - N е.¿.09.

17. Николаева И.С., 'Гайлонская H.H., Фецч оитов Г.К,, Асташкин И. Применение реакш"'. бласттрансфср'/ации лимфоцитов -зловека для наружения биологически. активного холерного токсина в

культуральиых фильтратах холерных вибрионов.// Вестник A'fií CGC) 1981. - T. 12. - С. 62-67.

10. Асташкин Е.И., Рябиченко В.В., Николаева И.О. Влияние < на 'активность аденклатциклазы и гуанилатциклазы лимфощ человека.// Циклические нуклеотиды. Тез. докл. 4-го Bcecoi симпоз. Минск., 1982. - С. 123.

19. Гуковская A.C., Зинченко В.П., Николаева И.С., Асташ] Е.И. Ыемлрап:шй потенциал лимфоцитов периферической крови челов! Влияние А23187 и Кон А.// Биол. мембраны. - 1984. - Т. 1. -317-323.

20. Николаева И.С., Рябиченко В.В., Гайлонская И.Н., Астапл Е.И. Влияние холерного токсина и теофиллина митоген-индуцированный синтез ДНК лимфоцитов человека.// Те: доклада 5-го Всесоюзного симпозиума "Циклические нуклеотиды" Глппиь. - 1935. - С. 173.

2.1. Николаева И.С., Гайлонская И.Н., Асташкин Е.И., Тарт-.ç O.A., Форшюнтов Г.К., Рябичонко В.В. Изменение водно электролитного гомеостаза при действии на тонкий кишес лабораторных животных некоторых энтеротоксинов.// Молекуля^ структура ппктериалышх токсинов. Тез. докл. 1-ой Всесоюзн. кс М., 1985. - С. 7-8.

22. Николаева И.С., Гайлонская И.Н., Асташкин Е.И., Тарасеь O.A. Действие. тормолабильного токсина с.со и на разные ли мышей.// Там ко. - С. 12-13.

23. Гайлонская И.Н., Николаева И.О., Асташкин Е.И., Tapacet O.A., Рябичонко В.В., Ферапонтов Г.К. Сравнительное изуче ДгАггИНШ знторотоксина Vibrio cholerae, ТОрМОЛабИЛЬНОГО TOKC E.f'ol I И фильтрата Salmonella typhlmiirlum На ТОНКУЮ KU лабораторных животных.// ЯШИ. - 1985. - n 11. С. 10-14.

24. Аставдш Е.И., Гуковская A.C., Сурин A.M., Николаева И.С Слапич К).В., Коломиец А.Ф., Фокин A.B. Изучение влия 2-(« гидротетрафторэтил)бензимидазола на внутриклеточный уров свободных ионов Ca2 * и величину мембранного потенциала в тимоци крыс.// ДАН АН СССР. - 1988. - Т. 300, N 1. - С. 2Д9-252.

25. Nlkolaeva M.Ya.. Surin A.M., Nlkolaeva I.S., Astashk

2 +

Y*.I. Role of Ca and cAMP In regulation of transplaama-membr.

ldo-réf'uctase ti human granulocytes.// 14 th Inter. Congress of OTieralstry. - Prague, 1988. - Mo:288.

2t>. Аста^.^ин Е.И., Сурин A.M., Гуковская A.C., Николаева И.С., зарев A.B. Изучение влияния vверного токс;ша и его В-субъединицы концентрацию свсбодных ионов кальки? в кленах.// Биол. мбраны. - 1989. - Т. Ч, N 4. - С. 395-493.

27. Гуковская A.C., Асташкин Е.;1., Гуреева A.A., Николаева С., Сурин A.M., Зинченко В.П., Вертиев Ю.В. Влияние ктериальных токсинов на индуцированное ми:.;геном повышение нцентрации Ca2* в цитоплазме тимоцитов крысы. Роль белков.//Вюлл. эксперимент, биологии и медицины. - 1989, N 5. -598-600.

2S. Асташкин Е.И,, Сурин A.M., Николаев-- 'Л.С., Гуковская A.C., зарев A.B. Изу-ение влияния холерного токсина и его В-субъединицы концентрацию свободных ионов <"а2' с цитогшазке глоток.// Тез. кл. IV Всесоюз. съезда патофизиологов. Кишинев, 1S89. - Т. -520.

29. Мотков-:кп.я Е.Ю., Гуковская A.C., Борин М.Л.. Асташкин И., Сурин / /í. . Николаева И.С. Изменение внутриклеточной

о +

нцентрации Car в митогенс'П'муллрсианных '^мфощ-тах реферическсО >:рови человека, влияние ^локатора кальщ.еб1;- каналов верапамила.// Там же. - С. 541;'.

30. Асташкин Е.И., Нилп/аевь У..С., Глезер М.Г., ьаутова И.Г., тникова Л.А. Изучение эффективности и механизмов действия новых тидиарейных препаратов.// Актуальные проблемы создания карственных форм с заданными биофармацевтическими свойствами, з. докл. Всесоюзной конференции. Харьков, 1989. - С. 143.

•31. Асташкин Е.И., Сурин A.M., Гуковская A.C., Николаева И.С., зарев A.B. Лектшгоподобное действие холерного токсина.// Изучена применение лектинов. Т. 2. "Локтины в биологии и мед^хлке", рту, 1989. - С. 199-205.

32. AstanhkIn E.I., Surin A.M., Mlkhna M.G,, Nlkolaeva I.S., zarev A.V., Gukovskay.^ A.S. Choiera toxi.-, and its В siOanlt do t change cytosollc fioo calcium concentration.// Cell calcium. -90. - V.l 1 . - P. 419 -423.

33. Астгщош Е.И.. Паутова И.Г., Круш/ва Е.П., Николаева

И.О., Дячевко В.И., Коломиец А.Ф., Фокин A.B. Влияние ингибитс метаболизма ерахидоновой кислоты на экспериментальную да\_. индуцированную холерным токсином.// ДАН СССР. - 1991. - Т. 31G 5. - С. 12G8-1270.

34. Астаплош Е.И., Сурин A.M., Ходорова А.Б.,"Николаева И.С Дпчеико L3.И., Коломиец А.Ф., Фокин A.B. Исследование влия фенофторазола на концентрацию ионов Саг* в цитоплазме тимоци крысы и па изменение этого параметра, индуцированные конканавали А.// ДАН ССОР. - 1991. - Т. 317, N 2. - С. 499-502.

35. Асташюш Е.И., Николаева И.С., Паутова И.Г., Крупнова Е. Изучение антидиарейной эффективности нового препарата фторазол Проблемы качества лекарственных средств, Сб. науч. трудов, "Пиотехнология" Ы., 1991. - С. 6-9.

36. И.С.Николаева, Е.И.Асташкин, И.Н.Гайлонская, В.В.Рябичеи Г.К.Ферапонтов, Л.А.Пирузян, Приоритет изобретения 1.09.1S Авторское свидетельство N 316451, 1.08.90.

37. С.В.Прозоровский, В.С.Порепелкин, В.И.Василье Е.И.Асташкин, Т.А.Семененко, И.С.Николаева, А.И.Катков, Приорите изобретения 21.04.1986, Авторское свидетельство к 316457, 1.08,