Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в лимфоцитах крови в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий

На правах рукописи

Рогалева Анна Викторовна

РОЛЬ ПРООКСИДАНТНО-АНтаОКСИДАНТНОГО ДИСБАЛАНСА В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ АУТОИММУННЫХ ТИРЕОПАТИЙ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2009

003468495

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высш профессионального образования «Сибирский государственный медицине университет Федерального агентства по здравоохранению и социальн развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Уразова

Ольга Ивановна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Кравец

Елена Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Жданов

Вадим Вадимович

доктор медицинских наук, профессор

Хлусов

, Игорь Альбертович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высш профессионального образования «Новосибирский государствен! медицинский университет Федерального агентства по здравоохранени социальному развитию»

Защита состоится «

2009 г. в

часов на заседа!

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российс академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028 Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учрежде Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «с&О» апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Амосова Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время аутоиммунные тиреопатии (АИТП) остаются одной из наиболее актуальных проблем современной эндокринологии, что во многом объясняется не только достаточно высоким уровнем заболеваемости лиц разного возраста, но и многочисленностью органов и систем, реагирующих на воздействие тиреоидных гормонов и вовлекаемых в патологический процесс при нарушении их продукции. Однако остаются нерешенными вопросы, касающиеся патогенетических механизмов, объективных и надежных методов диагностики, прогноза и профилактики заболеваний щитовидной железы [Аппельганс Т.В., Маклакова Т.П., 2006; Кияев A.B. и соавт., 2006; Фадеев В.В. и соавт., 2007].

Диффузиый токсический зоб (болезнь Грейвса) и аутоиммунный тиреоидит являются наиболее распространенными аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, имеющими сходную этиологию, но различный патогенез, специфичность которого на уровне организма проявляется, в том числе, различающимся уровнем продукции тиреоидных гормонов [Петунина H.A., 2002; Петунина H.A., 2003; Кияев A.B. и соавт., 2007; Кандрор В.И., 2008].

Исследованиями последних лет определен ряд специфических структурно-функциональных особенностей клеток щитовидной железы. Тиреоциты относятся к немногочисленным клеткам, метаболизм которых предполагает постоянное образование высоких концентраций активных форм кислорода (АФК) в ответ на физиологическое стимулирующее действие тиреотрошюго гомона. В этой связи поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза представляется чрезвычайно важным условием сохранения структурной целостности и жизнедеятельности тиреоцитов [Martiner-Cayuela М., 1995]. Существенную опасность в аспекте АИТП представляют также опосредованные свободными радикалами деструкция и преждевременная гибель иммунокомпетентных клеток, регулирующих силу иммунного ответа, что ведет к срыву процессов иммунологической толерантности с формированием антитиреоидного аутоиммунитета [Нагоев Б.С. и соавт., 2002; Петунина H.A., 2003].

В условиях окислительного стресса судьба клетки определяется совокупностью различных адаптационных метаболических процессов, индуцированных как воздействием АФК, так и конституциональными, генетическими особенностями ее защитных биохимических систем. К числу механизмов активации прооксидантных реакций в организме относится функциональная недостаточность системы антиоксидантной защиты клеток, одного из первостепенных «охранных» эшелонов, обеспечивающих

поддержание свободнорадикалыюго окисления на стационарном уровне. Механизмы антиоксидантной защиты универсальны и одинаковы для всех типов клеток независимо от их структурно-тканевой организации [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Это объясняет возросший интерес к поиску способов поддержки и стимуляции этих процессов с целью повышения жизнеспособности клеток при угрозе их повреждения. В последние годы в литературе появились сообщения об антиокислительных свойствах тиреоидных гормонов, их способности предотвращать свободно-радикальное окисление ДНК, белков хроматина и ферментов ДНК-репарации, препятствовать гибели клеток [Арутюнян A.B. и соавт., 2000].

Общеизвестно, что одной из форм ответной реакции клетки на стрессирующее воздействие, причиной которого могут быть повреждение ДНК и других структурных элементов клетки, отсутствие необходимых факторов роста, гормонов, цитокинов и др., является активация программированной суицидальной программы клетки - апоптоза [Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006]. Актуальность проблемы апоптоза определяется сопряженностью нарушений его регуляции с широким спектром заболеваний, в том числе АИТП. Накопление в клетке АФК предшествует апоптозу, что свидетельствует о существенной значимости окислительных процессов в реализации этого феномена [Зенков H.A. и соавт., 2001].

Вместе с тем, сведения, касающиеся механизмов гиперактивации реакций окисления и их роли в развитии иммунного дисбаланса при АИТП и в патогенезе заболеваний щитовидной железы в целом, являются немногочисленными и фрагментарными. Нет четких указаний на связь между активностью про- и антиоксидантной систем с апоптозом иммунокомпетентных клеток при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе. Вскрытие же механизмов окислительного дисбаланса при АИТП, их взаимосвязи с активностью процессов апоптоза и дизрегуляцией продукции тиреоидных гормонов не только позволит получить новые фундаментальные знания о патогенезе аутоиммунного повреждения щитовидной железы, по и может оказаться основой для разработки новых подходов как в диагностике, прогнозировании течения и исходов, так и к терапии АИТП, направленной на медикаментозный контроль аутодеструктивных процессов.

Цель исследования: установить типовые проявления прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в лимфоцитах периферической крови и его роль в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в подростковом и зрелом возрасте.

Задачи исследования: 1. Установить общие закономерности и особенности нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-

субнопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у подростков 13-17 лет и взрослых пациентов 18-50 лет с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.

2. Определить взаимосвязь показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной защиты, апоптоза и CD-фракционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите с активностью аутоиммунного процесса.

3. Дать комплексную оценку значимости прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в модуляции апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови у пациентов подросткового и зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.

Научная новизна. По итогам сравнительной оценки показателей нрооксидаптно-антиоксидантного состояния и апоптоза лимфоцитов периферической крови у лиц зрелого и подросткового возраста при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе установлено, что их изменения являются однонаправленными, но более выраженными при эутиреозе и гипертиреозе у взрослых больных, чем у подростков. При этом у взрослых больных при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза и диффузном токсическом зобе активация свободнорадикального окисления (увеличение концентрации супероксидного анион-радикала, Н2Ог) и липопероксидации в условиях дефицита оксида азота и активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) в лимфоцитах крови имеет более выраженный характер, чем при субклиническом гипотиреозе на фоне заместительной терапии. У подростков течение аутоиммунных тиреонатий не сопровождается активацией перекисного окисления липидов в связи с компенсаторным увеличением в лимфоцитарных клетках активности глутатионпероксидазы при эутиреозе (в сочетании с дефицитом каталазы и глутатионтрансферазы) и глутатионредуктазы при гипертиреозе (при снижении концентрации восстановленного глутатиона).

Продемонстрировано, что недостаточность активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах при тиреопатиях определяет сопряженную с активностью аутоиммунного процесса предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу (сопряженную с уровнем антитиреоидных антител при эутиреозе), о нарушении реализации которого у пациентов зрелого возраста свидетельствует уменьшите числа annexin У+-клеток в крови. При этом дефицит активности антиоксидантов в сочетании с профицитом активных метаболитов кислорода в лимфоцитах крови рассматривается в качестве одного из факторов апоптоза и CD-субпопуляционного (Т- и В-клеточного) дисбаланса, более выраженного при гипертиреозе, чем при аутоиммунном тиреоидите как у подростков, так и у взрослых больных.

Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые фундаментальные знания о роли прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, активности гуморального антитиреоидного аутоиммунитета и возраста больных (подростки, взрослые). Установленные данные могут служить основой для коррекции программы лечебно-реабилитационных мероприятий у больных с аутоиммунной патологией щитовидной железы, а также обосновывают необходимость применения при эутиреозе антиоксидантной терапии для профилактики дальнейшего прогрессирования аутоиммунного процесса и развития гипотиреоза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и СЭ-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе носят однонаправленный характер, но более выраженный у взрослых больных с эу- и гипертиреозом, чем у подростков.

2. У больных зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом в фазе эутиреоза и диффузным токсическим зобом уровень прокосидантно-антиоксидантного дисбаланса, проявляющийся увеличением концентрации СЬ", Н2Ог, ТБК-активных продуктов на фоне дефицита оксида азота, активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутагаотрансферазы в лимфоцитах периферической крови, выше, чем при аутоиммунном тиреоидите в фазе гипотиреоза.

3. У подростков с диффузным токсическом зобом дефицит антиоксидантов в лимфоцитах крови менее выражен, чем при аутоиммунном тиреоидите, что в совокупности с повышением активности глутатионпероксидазы при эутиреозе и глутатионредуктазы при гипертиреозе обусловливает нормальный уровень перекисного окисления липидов в клетках.

4. Снижение активности антиоксидантных ферментов и накопление продуктов свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови при аутоиммунных тиреопатиях определяют сопряженную с активностью антитиреоидного аутоиммунитета предрасположенность клеток к Раэ-зависимому апоптозу, нарушение реализации которого опосредует повышение количества С020+ В-лимфоцитов в крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006, 2007), VII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке»

(Томск, 2006), научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинском университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре эндокринологии и диабетологии в лекционных и практических курсах по теме «Аутоиммунные тиреопатии».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 160 источников, из них 102 отечественных и 58 зарубежных авторов.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу исследования положены результаты обследования 200 пациентов, страдающих аутоиммунными тиреопатиями (АИТП). Все обследованные пациенты находились на амбулаторном лечении в Томском областном эндокринологическом диспансере и муниципальных лечебно-профилактических учреждениях г. Томска: поликлинике №8, поликлинике городской больницы №3, медицинском объединении «Здоровье» и в эндокринологическом отделении детской городской больницы №1.

Среди обследуемых лица зрелого (18-50 лет) возраста (средний возраст 38,92±2,09 лет) составили 87,5%, пациенты подросткового возраста (мальчики 14-17 лет и девочки 13-16 лет) (средний возраст 15,94±0,41 лег) - 12,5%. В связи с этим больные были разделены на две группы с учетом возраста (1 -взрослые, 2 - подростки), каждая из которых была дополнительно разделена на подгруппы с учетом диагноза и функционального состояния щитовидной железы.

Диагноз АИТ устанавливался на основании характерных клинических данных, результатов УЗИ, показателей функционального состояния щитовидной железы, наличия в сыворотке крови больных антител к тиреопероксидазе (АТ-ТПО), анализа содержания тиреотропного гормона

(ТТГ) и свободного Т4 (свТ4).

Диагноз ДТЗ устанавливался на основании характерных жалоб и клинической картины тиреотоксикоза, данных физикалышго обследования, наличия характерных ультрасонографических признаков, характерных показателей гормонального статуса (низкий уровень ТТГ в сочетании с повышенной концентрацией свТ4).

Группа 1 была разделена на три подгруппы. Первую подгруппу среди взрослых больных АИТП составили 78 пациентов, больных аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) с эутиреоидным состоянием щитовидной железы (11 мужчин и 67 женщин, стаж заболевания 7,3±1,3 года). Вторую подгруппу - 51 больной АИТ (13 мужчин и 38 женщин) в фазе субклинического гипотиреоза на фоне заместительной терапии L-тироксином (продолжительность заболевания с момента выявления 4,2±1,8 года). В третью подгруппу вошли 46 человек (5 мужчин и 41 женщина), страдающих диффузным токсическим зобом (ДТЗ). Длительность заболевания на момент их включения в исследование (наличие клинических проявлений, отмечаемых пациентами) составляла 5,6±1,4 года.

Группу 2 составили 15 подростков (2 мальчика и 13 девочек), больных АИТ с эутиреоидным состоянием щитовидной железы (стаж заболевания 1,2±0,3 года), и 10 подростков (1 мальчик и 9 девочек) с впервые выявленным ДТЗ, ранее не получавших тиреостатическую терапию.

В контрольную группу вошли практически здоровые доноры - 50 взрослых (12 мужчин и 38 женщин) и 15 подростков (4 мальчика и 11 девочек), сопоставимые по полу и возрасту с больными АИТП.

Материалом исследования служили лимфоциты гепаринизированной (25 Ед/мл) периферической крови, взятой утром натощак из локтевой вены. Выделение лимфоцитов проводили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3) [Новиков А.К., Новикова В.И., 1979]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счетной камере Горяева с использованием 0,5% раствора трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Концентрацию супероксид-аниона (по уменьшению содержания цитохрома С), активность супероксиддисмутазы (адренохромовый способ), каталазы (по убыли перекиси водорода), ферментов глутатионового цикла (глутатионпероксидазы, глутатионтрансферазы, глутатионредукгазы) и концентрацию восстановленного глутатиона в лимфоцитах периферической измеряли спектрофотометрическим методом [Брусов A.C. и соавт., 1976; Королюк М.А., Иванова Л.И., 1988; А.И. Карпищенко и соавт., 1999]. Определение уровня перекиси водорода проводили на основе ее способности взаимодействовать с красителем феноловым красным [Арутюнян Л.В. и соавт., 2000]. Содержание нитритов определяли по их способности диазотировать сульфаниловую кислоту [Green L.C. et al., 1982]. Интенсивность перекисного

окисления липидов оценивали по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты - ТБК-а), и диеновых конъюгатов [Владимиров Ю.А., Арчаков А.К., 1972]. Концентрацию диеновых конъюгатов определяли с помощью метода, в основе которого лежит способность коныогированных диеновых структур гидроперекисей липидов поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 233 нм [Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983]. Идентификацию CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD56+, CD95+ лимфоцитов осуществляли с помощью лимфоцитотоксического теста; иммунорегуляторный индекс (ИРИ) вычисляли по соотношению CD4+ и CD8+ клеток [Петров Р.В. и соавт., 1992]. Уровень апоптоза лимфоцитов устанавливали по экспрессии на наружном монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина методом флуоресцентной микроскопии с использованием FITC-меченного annexin V [Beckman Coulter, Франция].

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы «Statsoft Inc.». Проверку гипотезы нормальности распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали Mann-Whitney U test (несвязанные выборки). Различия считали достоверными при р-уровне < 0,05. Зависимость параметров в группах оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Корреляцию считали значимой при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ структуры болезней щитовидной железы за последние десятилетия свидетельствует об устойчивой тенденции к увеличению доли АИТ и ДТЗ среди тиреопатий, ведущим патогенетическим звеном которых является дисбаланс иммунной системы, связанный с нарушением структуры, метаболизма и функций ее основного клеточного звена - лимфоцитов. В свою очередь доказано, что функциональные свойства лимфоцитарных клеток зависят (главным образом) от интенсивности их внутриклеточного метаболизма. Именно на уровне метаболической системы формируются ответные реакции клетки на различного рода воздействия [Савченко A.A. и соавт., 2003].

В настоящее время состоянию процессов свободнорадикального окисления (СРО) отводится основополагающая роль в развитии цитодеструктивных процессов в патогенезе огромного числа заболеваний, в том числе и аутоиммунной патологии щитовидной железы. Повышение концентрации АФК становится причиной повреждения белков, нуклеиновых кислот, запуска процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что, в

свою очередь, может служить фактором повреждения клеток, аллергизации и развития аутоиммунных состояний [Нагоев Б.С. и соавт., 2002]. Болезнетворным является не только повышение уровня СРО, но и нарушение баланса между его интенсивностью и функциональной активностью антиоксидантной системы организма [Арутюнян A.B. и соавт., 2000].

При изучении содержания активных метаболитов кислорода (супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, оксида азота - по содержанию конечных стабильных метаболитов - нитритов) в первой возрастной группе больных АИТ и ДТЗ было выявлено накопление супероксид-аниона и перекиси водорода при одновременном снижении концентрации нитритов в лимфоцитах периферической крови.

При нормальном течении метаболизма супероксид-анион в клетках, как известно, не накапливается. Опасность может представлять то обстоятельство, что он плохо проникает через клеточную мембрану и содержание его в клетке нарастает в условиях, когда повышенная скорость образования свободных радикалов или редуцированная способность антиоксидантной системы клетки приводит к увеличению стационарного уровня радикальных соединений [Коршун М. М. и соавт., 2001].

Липиды клеток (в том числе мембранные липиды) также подвергаются атаке со стороны АФК. Наиболее уязвимыми оказываются жирнокислотные цепи фосфолипидов, которые содержат сопряженные двойные связи. Окисление носит характер самопроизвольно ускоряющейся реакции и приводит к нарушению регулярной упаковки мембранного бислоя и его разрыхлению [Aglarz М. et al., 2004]. Повышение у больных первой возрастной группы с аутоиммунными тиреопатиями содержания в лимфоцитах одного из конечных продуктов ПОЛ - ТБК-а, свидетельствует об активации образования АФК и нарушении нормального окислительного метаболизма клеток. Вместе с тем, у подростков с АИТ и ДТЗ накопления продуктов пероксидации липидов в лимфоцитах периферической крови зарегистрировано не было (табл. 1).

Снижение концентрации нитритов в условиях накопления супероксидного анион-радикала в лимфоцитах периферической крови у больных первой возрастной группы с АИТ и ДТЗ можно считать неблагоприятным признаком. Известно, что оксид азота выступает в роли ингибитора радикалов и таким образом оказывает протективное действие на клетки и ткани в условиях окислительного стресса. В этом аспекте в отношении контроля реакций СРО низкое содержание нитритов в лимфоцитах, обусловленное, возможно, истощением NO-продукции на фоне длительно текущего патологического процесса (в среднем 6,4±2,7 лет), является отрицательным фактором.

Клеточная защита от свободных радикалов представляет собой многоуровневую систему биоантиоксидантов. Супероксидцисмутаза (СОД), катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода [Дубинина Е.Е., 1995] и тем самым предотвращает патогенное действие АФК [Макаренко Е.В., 1988]. Образующуюся в процессе пероксидации перекись водорода разлагает каталаза [Королюк М.А. и соавт., 1988]. Глутатионпероксидаза (ГП) катализирует восстановление перекиси водорода и органических перекисей с использованием восстановленного глутатиона (ВГ) [Моин В.М., 1986]. Регенерация В Г, необходимого для детоксикации перекисей, происходит с участием глутатионредуктазы (ГР) [Макаренко Е.В., 1988]. Еще одним ферментом, использующим глутатион для осуществления антиоксидантной защиты, является глутатионтрансфераза (ГТ). Восстановление с помощью ГП и ГТ гидропероксидов предупреждает прогрессирование пероксидации и появление ее вторичных метаболитов [Шанин Ю.Н. и соавт., 2003].

Таблица 1

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидаптаой защиты в лимфоцитах крови у здоровых доноров и больных аутоиммуииыми тиреопатиями (Х±ш) ___

Группы обследованных лиц ТБК-а, мкмоль/мг белка ДК, у.е. / мг белка сод, у.е. / мг белка Каталаза, мкат / мг белка

Здоровые доноры 25,6014,30 11,33±2,35 0,5310,07 0,7510,11

АИТ в фазе субклшшческго гипотиреоза 41,08±3,12 р<0,01 8,0612,61 0,25±0,08 р<0,01 0,63±0,15

Взрослые АИТ в фазе эутирсоза 57,8017,21. р<0,05 р2<0,001 8,20-tl,21 р2<0,001 0,3610,11 р<0,01 0,3810,04 р<0,01 р,<0,01 р2<0,05

дтз 45,60±5,51 р<0,01 Р2<0,001 9,71±1,98 р2<0,001 0,1910,03 р<0,01 р2<0,001 0,3910,04 р<0,05 pi<0,01 рг<0,05

1 О & Здоровые доноры б,14±1,51 3,02±0,56 0,44±0,10 1,64=0,29

АИТ в фазе эутирсоза 3,841.0,85 1,8910,31 0,3510,09 0,7910,20 р<0,05

ё ДТЗ 7,66±1,75 2,36±0,74 0,62±0,05 1,04±0,22

Примечание: Здесь и в табл. 2: АИТ - аутоиммунный тиреоидит, ДТЗ - диффузный токсический зоб, ТБК-а - ТБК-активные продукты, ДК - диеновые коньюгаты, СОД -супероксвддисмутаза; р - уровень статистической значимости различий по сравнению с группой здоровых доноров аналогичного возраста; р1 - по сравнению с группой больных аутоиммунным тиреоидитом аналогичного возраста в фазе субклиничсского гипотиреоза; Р2 - по сравнению с группой подростков аналогичной группы исследования.

У больных первой возрастной группы с АИТ в фазе эутиреоза и ДТЗ отмечались схожие изменения в работе антиоксидантной системы, а именно снижение активности СОД, каталазы, ГП и ГТ в лимфоцитах при нормальном содержании ВГ, вероятно, обусловленном нормальным функционированием ГР (табл. 1, 2). Сопряженные изменения активности каталазы и ГП у взрослых больных АИТ с эутиреоидным состоянием щитовидной железы подтверждались наличием их прямой корреляционной зависимости (г=0,40; р=0,02). Снижение активности СОД, каталазы, ГП и ГТ в лимфоцитах крови у взрослых больных АИТ в фазе эутиреоза и ДТЗ может свидетельствовать либо об истощении системы антиоксидантиых ферментов лимфоцитов либо об ингибировании последней. Такое состояние антиоксидантной системы (АОС) неизбежно ведет к накоплению АФК (даже если они образуются в физиологических концентрациях) и развитию окислительного стресса.

Таблица 2

Содержание восстановленного глутатиона и ферментов системы глутатиона в лимфоцитах периферической крови у здоровых доноров и больных аутоиммуниыми тиреопатиями (Х±т) __ ._

Группы обследованных лиц ВГ, ныоль/мг белка ГП, мкмоль/(мип ГТ, мкмоль/(мин ГР, МКМ0ЛЬ/(НШ1

X мг белка X мг белка) X мг белка)

Здоровые доноры 27,94±4,03 1,6610,35 11,58±1,97 3,30±0,Э5

АИТвфазс субкллшпескго 26,34±7,67 1,75±0,27 10,71±3,10 2,90±0,50

о пшотареоза

Й о о & я АИТ в фазе эутареоза 26,14±3,48 0,83±0,16 р<0,001 р,<0,01 7,93*1,46 р<0,05 2Д4±0,22

дгз 21,40±2,2б 0,63±0,23 р<0,05 р,<0,01 5,70-Ы,32 р<0,05 2,58±0,25

Здоровые доноры 86,99±19,26 50,45±20,95 0,21±0,44 1,01±0,45

| АИТ в фазе эутиреоза 69,28*14,0 91,74±15,71 р<0,05 0,15±0,04 р<0,05 1,95±0,97

& ДТЗ 61,03±7,15 63,42±7,40 0,21±0,10 1,88±0,53

й р<0,01 р<0,05

Примечание: ВГ - восстановленный глутатион, ГП - глутатионпсроксидаза, ГТ -глуталкш-З-трансфераза, ГР - глутатионредуктаза

Наряду с описанными выше изменениями, снижение активности СОД обнаруживалось в лимфоцитах у большое первой возрастной группы.с АИТ в фазе субклинического гипотиреоза, однако остальные показатели АОС в данной подгруппе оставались на уровне контрольных значений, что, возможно, объясняется действием экзогенного гормона - тироксина, в виду того, что больные в данной группе получали заместительную терапию Ь-тироксином. Высказано предположение [Фадеев В.В. и соавт., 2001] о том, что падение уровня ТТГ, которое происходит при назначении Ь-тироксина,

уменьшает презентацию антигенов щитовидной железы и, таким образом, замедляет аутоиммунный процесс. Известно, что Т4 способен в физиологических концентрациях изменять уровень антиоксидантных ферментов, влияя на транскрипцию кодирующих их генов [Антипенко E.H. и соавт., 1994], а также работать как стимулятор репарации ДНК [Арутюнян A.B. и соавт., 2000]. Эти данные позволяют полагать, что экзогенные гормоны способны активировать изначально «плохо функционирующие» гены, ответственные за работу ферментов АОС в лимфоцитах. Снижение же активности СОД у взрослых больных во всех исследуемых подгруппах (с АИТ в фазе эу- и гипотиреоза, ДТЗ) может свидетельствовать о наличии некоего генетического дефекта, на который не могут воздействовать тиреоидные гормоны.

Несмотря на то, что у подростков с АИТП в лимфоцитах периферической крови не были обнаружены признаки активации ПОЛ, при АИТ в фазе зутиреоза регистрировалось уменьшение содержания каталазы в лимфоцитах и тенденция к снижению активности СОД, т.е. ферментов, которые, как уже указывалось выше, являются ключевыми в защите организма от продуктов ПОЛ [Зенков Н. К., 2001] (табл. 1). Вместе с тем, у подростков с ДТЗ отмечалось повышение активности ГР, а у подростков с АИТ она, наряду с увеличением активности ГП, была на уровне контрольных значений (табл. 2), что, вероятно и обеспечивало поддержание ПОЛ в лимфоцитах крови в пределах нормы.

Активация ГР может свидетельствовать о повышенном уровне образования окисленного глутатиона (ОГ) либо в результате взаимодействия ВГ и АФК, либо в результате реакций, катализируемых глутатион-зависимыми ферментами. Также у подростков с АИТ в фазе эутиреоза устанавливалась тенденция к снижению, а у больных ДТЗ - достоверное снижение концентрации ВГ в лимфоцитах (табл. 2), что может свидетельствовать об активном его взаимодействии с АФК, либо о повышенном расходовании ферментами [Марри Р., 2004].

При изучении зависимости активности системы антиокевдантной защиты и ПОЛ от возраста обследованных больных были выявлены существенные их различия. Так, концентрация ТБК-а и диеновых конъюгатов (ДК) в первой возрастной группе у больных АИТ в фазе эутиреоза и ДТЗ была значительно выше, а активность ферментов антаоксидантной системы (АОС) - СОД и каталазы, напротив, значительно ниже, чем во второй возрастной группе. Тот факт, что у подростков с АИТ и ДТЗ, у которых стаж заболевания был меньше (1,2±0,3 года при АИТ и впервые выявленном ДТЗ), чем у взрослых, уровень ПОЛ в среднем оставался на уровне показателей здоровых доноров позволяет предположить, что активность процессов ПОЛ при АИТП определяется возрастными

особенностями организма и усугубляется с течением заболевания. Об этом же может свидетельствовать и снижение активности СОД и катал азы у взрослых больных с ДТЗ, в то время как активность данных ферментов у подростков с ДТЗ оставалась в норме. Снижение активности каталазы у больных АИТ как в первой, так и во второй возрастных группах, возможно, объяснятся неким генетическим дефектом (как уже указывалось выше) или нарушением передачи сигналов, запускающих синтез белковых антиоксидантов на уровне транскрипции и трансляции генов в лимфоцитах, что и приводит к выраженной недостаточности АОС. Это либо одна из первопричин, либо следствие развития аутоиммунного процесса.

В настоящее время патогенез большинства аутоиммунных расстройств интерпретируется в контексте нарушений апоптотической регуляции иммунокомпетентных клеток. Показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции апоптоза и развитием заболеваний, сопровождающихся снижением эффективности иммунологического надзора, а именно развитием аутоиммунной патологии [Krammer Р., 2000].

По результатам оценки уровня экспрессии Fas-рецептора лимфоцитарными клетками периферической крови было обнаружено достоверное увеличение содержания С095+-лимфоцитов у больных АИТ первой возрастной группы независимо от функционального состояния щитовидной железы и у взрослых и подростков с ДТЗ (более чем в 2 раза и сравнительно с нормой). Однако у больных второй возрастной группы с АИТ данный показатель оставался в пределах нормы, что может указывать на более серьезные отклонения в системе иммунного контроля при данном варианте патологии (рис. 1).

%

Рис. 1. Относительное количество СБ95+-лимфоцитов в периферической крови у здоровых доноров и больных аутоиммунными тиреопатиями

0 Здоровые доноры

Ш Пациенты с аутоиммунным тиреоидигом в фазе субклиническою гипотиреоза

@ Пациеоты с аутоиммунным тирсоидт'ом в фазе эутареоза

Р Пациент с диффузным токсическим зобом

* Статистически значимые различия по сравнению со здоровыми донорами

Повышение числа лимфоцитов, зкспрессирующих CD95, является закономерным проявлением активации иммунной системы, характерным в том числе, как показали результаты, и для аутоиммунных расстройств. Об этом свидетельствует установленная взаимосвязь между содержанием С095+-лимфоцитов и уровнем антител к тиреопероксидазе (АТ-ТПО) в крови (г=0,79; р=0,01) при АИТ в фазе эутиреоза у взрослых больных.

Наряду с этим, увеличение уровня экспрессии CD95 при АИТ и ДТЗ у больных зрелого возраста может быть фактором CD-субпопуляционных нарушений [Бойчук C.B., Мустафин И.Г., 2001; Жукова О.Б. и соавт., 2006], поскольку чрезмерное накопление апоптотических клеток вследствие нарушения их утилизации фагоцитами ведет к тому, что собственные антигены клеток распознаются как чужеродные, изменяется спектр доминирующих гуморальных факторов с увеличением доли противовоспалительных цитокипов, обладающих способностью к длительному поддержанию иммунного ответа по Th2-nyrn [Giordano С. et ai., 2001; BarashJ., 2003].

Так, при анализе CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных АИТ (у взрослых и подростков) было выявлено повышение относительного количества B-лимфоцитов (CD20'-клеток) в периферической крови. Это указывает на усиление гуморальной реакции иммунной системы, что, как правило, сопровождается избыточной продукцией антител к антигенам щитовидной железы и способствует прогрессированию болезни. Это подтверждается прямой корреляцией между уровнем АТ-ТПО и количеством С020+-лимфоцитов в крови (г=0,72; р=0,01) у больных первой возрастной группы с АИТ в фазе эутиреоза.

Снижение содержания СИЗ-клеток в крови у больных ДТЗ, установленное в настоящей работе, могло быть обусловлено уменьшением количества Т-супрессоров, так как СОЗ-антиген является маркером общей фракции Т-лимфоцитов. Выраженное повышение ИРИ определялось снижением числа CD8+ и возрастанием относительной доли CD4+ лимфоцитов/хелперов. В целом, такой дисбаланс свидетельствует о преобладании ТЬ2-типа иммунного реагирования [Weetman А.Р., 2003].

Однако наличие на поверхности Fas-рецептора вовсе не означает обязательную реализацию клеткой заложенной программы гибели. Для этого необходимо связывание рецептора со специфическим лигандом, в качестве которого могут выступать FasL цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток [Фильченков A.A. и соавт., 2002], но которое может быть нарушено при различного рода дизрегуляторных влияниях. Вероятно, именно поэтому, несмотря на количественное увеличение содержания С095+-лимфоцитов в

крови, при АИТ и ДТЗ у больных первой возрастной группы усиления апоптоза лимфоцитов обнаружено не было. Напротив, при оценке реализации программируемой клеточной смерти с помощью аннексинового теста у больных первой возрастной группы при АИТ и ДТЗ было зарегистрировано достоверное снижение содержания annexin V-презснтирующих клеток в крови, отрицательно коррелирующее с количеством CD20+-лимфоцитов как у взрослых больных АИТ в фазе субклинического гипотиреоза (г=-0,85; р-0,03), так и при ДТЗ (г=-0,77; р=0,04). Сопоставляя полученные данные аннексинового теста с результатами оценки содержания CD95+- и С020+-лимфоцитов становится ясно, что реализация Fas-индуцированной апоптотической гибели В-лимфоцитов при аутоиммунной патологии щитовидной железы оказывается заблокированной, что подтверждается также положительной корреляционной зависимостью при ДТЗ между количеством апоптотических и предуготовленных к апоптозу клеток (г=0,62; р=0,04).

Снижение уровня annexin V-презентирующих клеток (схема 1), т.е. отсутствие ожидаемой активации апоптоза у пациентов первой возрастной группы с аутоиммунными тиреопатиями в отношении лимфоцитов на фоне повышенной экспрессии ими CD95, активации СРО и угнетения активности ферментативных антиоксидантов может быть обусловлено характерной для аутоиммунных заболеваний мутацией гена FAS с образованием неактивного белкового продукта (дефектного CD95), а также циркуляцией в крови растворимых форм апоптогенных рецепторов - sFas, sFasL и, возможно, sTNFR. Ведущая роль в этом может принадлежать интенсификации ПОЛ, происходящей при аутоиммунной патологии щитовидной железы, и изменению вследствие этого упорядоченности и микровязкости липидного бислоя мембраны, ведущему к модификации ее структурных свойств. Как известно, в липидном слое плазматической мембраны имеются липидные микродомены - рафты, с которыми ассоциированы многие трансмембранные рецепторы. Встраивание специфических мембранных белков в липидный микродомен приводит к его стабилизации, а последующее' связывание лигандов с рецепторами, локализующимся в области таких рафтов, обусловливает их слияние и запускает передачу внутриклеточного сигнала. Разрушение вследствие ПОЛ существующих мембранных микродоменов лишает апоптогенные рецепторы способности к возбуждению [Блохин Д.Ю. и соавт., 2007].

Кроме того, передача сигнала через рецепторы смерти может быть заблокирована на уровне взаимодействия рецептора с лигандом посредством связывания лиганда с «рецептором-приманкой» (decoy receptor), лишённым полноценного домена смерти [Haberkom О., Bellemann М.Е., Brix G. et al., 2001]. С другой стороны, снижение численности annexin V-презентирующих

Схема 1. Факторы иммунопатогенеза аутоиммунных тиреопатий (серым выделены результаты собственных иссл<

клеток при АИТ и ДТЗ может быть связано также с нарушением процесса экстернализации фосфатидилсерина (маркера обратимой стадии апоптоза) при нарастающем повышении в клетке уровня реактивных соединений кислорода, вызывающих ПОЛ [Скулачев В. П., 2001].

В условиях дефицита цитотоксических С08+-клеток (который был установлен у подростков и взрослых больных с ДТЗ) вполне вероятным при аутоиммунной тиреоидной патологии может быть и нарушение перфорин-гранзимового пути апоптоза, реализуемого посредством секреции Т-киллерами перфорина - белка, образующего трансмембранные каналы в клетке-мишени, по которым внутрь последней поступают одновременно секретируемые Т-киллером гранзимы, активирующие фрагментацию ДНК [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2003].

При оценке взаимосвязи активности ПОЛ и ферментов АОС с уровнем апоптоза лимфоцитов были выявлены значимые отрицательные корреляции между уровнем апоптотической предуготовленное™ лимфоцитов (по количеству С095-презентирующих клеток), активностью СОД у больных ДТЗ (г=-0,88; р=0,001) и активностью ГП у больных АИТ в фазе эутиреоза (г=-0,57; р=0,02), что укладывается в концепцию об апоптозмодулнрующей функции антиокислителей в условиях АФК-опосредованной агрессии. Общеизвестно, что недостаточность антиосидантных ферментов приводит к дополнительной генерации активных метаболитов кислорода и является одним из проявлений окислительного стресса, который, как показали результаты проведенного исследования, является не только индуктором апоптоза, но и, наряду с этим, фактором, препятствующим реализации Fas-зависимого пути клеточной гибели.

В целом, установленные изменения могут способствовать угнетению Т-клеточного звена иммунитета и активации его гуморального звена, что составляет основу иммунопатогенеза аутоиммунных тиреопатий.

ВЫВОДЫ

1. Течение аутоиммунных тиреопатий у лиц подросткового (13-17 лет) и зрелого (18-50 лет) возраста при эу-, гипо- и гипертиреозе сопровождается сходными нарушениями прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, которые менее выражены у подростков, чем у взрослых больных.

2. У больных зрелого возраста при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза и диффузном токсическом зобе уровень свободнорадикального окисления (накопление супероксид-аниона, перекиси водорода и ТБК-активных продуктов), дефицита оксида азота и активности антиоксидантных ферментов (супероксидидисмутазы, каталазы,

глутатионпероксидазы, глутатион-трансферазы) в лимфоцитах периферической крови выше, чем при аутоиммунном тиреоидите в фазе гипотиреоза.

3. У подростков отсутствие активации перекисного окисления липидов в лимфоцитах периферической крови обусловливается при аутоиммунном тиреоидите увеличением активности глутатионпероксидазы (наряду с дефицитом активности катал азы и глутатионтрансферазы), при диффузном токсическом зобе — повышением активности глутатионредуктазы (в сочетании с дефицитом восстановленного глутатиона).

4. Высокий уровень антител к тиреопероксидазе в сыворотке крови при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза сопряжен с повышением количества CD20+ и CD95+ (предуготовленных к апоптозу) лимфоцитов в крови.

5. Угнетение активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах периферической крови при аутоиммунных тиреопатиях определяет предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу, о нарушении реализации которого у пациентов зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом свидетельствует уменьшение числа annexin У+-клеток в крови.

6. Повышение числа С020+-лимфоцитов в периферической крови у подростков и взрослых больных с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом, наряду с CD3+- и СБ8+-дефицитом при гипертиреозе, свидетельствует о субпопуляционном (Т- и В-кпеточном) дисбалансе, формирование которого обусловливается нарушением Fas-зависимого апоптоза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Популяционный состав лимфоцитов и уровень инфицированности вирусами группы герпеса у больных аутоиммунным тиреоидитом / Е.Б. Кравец, О.И. Уразова, В.В. Новицкий, A.B. Рогалева и др. // Клиническая и экспериментальная тиреоидология. - 2006. - Т. 2, №4. - С. 43-46.

2. Особенности окислительного метаболизма лимфоцитов крови у больных аутоиммунными тиреопатиями / О.И. Уразова, Е.Б. Кравец, В.В. Новицкий, A.B. Рогалева и др. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - №6. - С. 35-38.

3. Особенности фенотипического профиля лимфоцитов при аутоиммунном тиреоидите / A.B. Рогалева, О. А. Старикова, Е.А. Мифтофутдинова, Ю.В. Недосекова // Материалы межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 19-20 апреля 2006). -СПб., 2006.-С. 108-109.

4. Степень инфицированное™ вирусами группы герпеса больных с уатоиммунным тиреоидитом / Ю.В. Недосекова, A.B. Рогалева, О.И. Уразова, O.A. Старикова // Материалы межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 19-20 апреля 2006). -СПб., 2006. - С. 80-82.

5. Рогалева, A.B. Оценка активности процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты лимфоцитов у больных аутоиммунным тиреоидитом / A.B. Рогалева, O.A. Старикова // Материалы VII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 18-19 мая 2006 г.). - Томск: СибГМУ, 2006. - С. 122 - 123.

6. Особенности фенотипического профиля и факторы индукции апоптоза лимфоцитов крови у больных диффузным токсическим зобом / О.И. Уразова, Е.Б. Кравец, В.В. Новицкий, A.B. Рогалева и др. // Бюллетень сибирской медицины. -

2007. - Т. 6, №1. - С. 57-61.

7. Рогалева, A.B. Активность антиоксидантной системы в лимфоцитах периферической крови у подростков с аутоиммунным тиреоидитом / A.B. Рогалева, O.A. Сишокова, Т.Е. Будкина // Материалы межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007). - СПб., 2007. - С. 107-108.

8. Оценка уровня ИЛ-2 у пациентов с разлиными формами аутоиммунного тиреоидита / Ю.В. Недосекова, A.B. Рогалева, В.Н. Кузнецова и др. // Материалы межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007). - СПб., 2007. - С. 102-103.

9. Будкина, Т.Е. Уровень апоптоза лимфоцитов крови при аутоиммунных тиреопатиях / Т.Е. Будкина, A.B. Рогалева, O.A. Сишокова // Материалы межвузовской конференции молодых ушных «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 24-25 апреля 2007). - СПб., 2007. - С. 23-24.

10. Апоптоз лимфоцитов крови у больных аутоиммунными тирсопатиями / О.И. Уразова, Е.Б. Кравец, В.В. Новицкий, A.B. Рогалева и др. // Медицинская иммунология. -2008. - Т. 10, №2-3. - С. 187-192.

11. Активность перекисного окисления липидов и системы глутатиона в лимфоцитах крови у больных диффузным токсическим зобом / О.И. Уразова, Е.Б. Кравец, В.В. Новицкий, A.B. Рогалева и др. // Бюллетень сибирской медицины. -

2008.-Т. 7,№4.-С. 47-51.

12. Рогалева, A.B. Активность перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при аутоиммунных тиреопаггиях / A.B. Рогалева, O.A. Васильева // Материалы научно-практического симпозиума с международным участием (Волгоград, 23-25 апреля 2008). - Волгоград: ВОЛГМУ, 2008. - С. 25.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АИТ - аутоиммунный тиреоидит АИТП - аутоиммунные тиреопатии АТ-ТПО - антитела к тиреопероксидазе АФК- активные формы кислорода

ВГ - восстановленный глутатион ГП - глутатионпероксидаза ГР - глутатионрсдуктаза ГТ - глутатион-8-трансфераза ДТЗ - диффузный токсический зоб ИРИ - иммунорегуляторный индекс ПОЛ - перекисное окисление липидов СОД - супероксиддисмутаза СРО - свободнорадикальное окисление Т4 - тироксин, тстрайодтироиин ТБК -тиобарбитуровая кислота ТБК-а- ТБК-активные продукт!,! ТТГ - тиреотропный гормон РаяЬ - Рая-лиганд

яРая - растворимая форма РаБ-рецсптора вРазЬ - растворимая форма Раэ-лиганда ТЬ (Т-Ье1рег) - Т-хелпер

в! №11 - растворимая форма рецептора к фактору некроза опухолей

Отпечатано в ООО «НИП» г. Томск, ул. Советская 47, тел.: 53-14-70 заказ № 5432, тираж 105 экз.

Актуальность проблемы. В настоящее время аутоиммунные тиреопатии (АИТП) остаются одной из наиболее актуальных проблем современной эндокринологии, что во многом объясняется не только достаточно высоким уровнем заболеваемости лиц разного возраста, но и многочисленностью органов и систем, реагирующих на воздействие тиреоидных гормонов и вовлекаемых в патологический процесс при нарушении их продукции. Однако остаются нерешенными вопросы, касающиеся патогенетических механизмов, объективных и надежных методов диагностики, прогноза и профилактики заболеваний щитовидной железы [Аппельганс Т.В., Маклакова Т.П., 2006; Кияев А.В. и соавт., 2006; Фадеев В.В. и соавт., 2007].

Диффузный токсический зоб (болезнь Грейвса) и аутоиммунный тиреоидит являются наиболее распространенными аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, имеющими сходную этиологию, но различный патогенез, специфичность которого на уровне организма проявляется, в том числе, различающимся уровнем продукции тиреоидных гормонов [Петунина Н.А., 2002; Петунина Н.А., 2003; Кияев А.В. и соавт., 2007; Кандрор В.И., 2008].

Исследованиями последних лет определен ряд специфических структурно-функциональных особенностей клеток щитовидной железы. Тиреоциты относятся к немногочисленным клеткам, метаболизм которых предполагает постоянное образование высоких концентраций активных форм кислорода (АФК) в ответ на физиологическое стимулирующее действие тиреотропного гомона. В этой связи поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза представляется чрезвычайно важным условием сохранения структурной - целостности и жизнедеятельности тиреоцитов [Martiner-Cayuela М., 1995]. Существенную опасность в аспекте

АИТП представляют также опосредованные свободными радикалами деструкция и преждевременная гибель иммунокомпетентных клеток, регулирующих силу иммунного ответа, что ведет к срыву процессов иммунологической толерантности с формированием антитиреоидного аутоиммунитета [Нагоев Б.С. и соавт., 2002; Петунина Н.А., 2003].

В условиях окислительного стресса судьба клетки определяется совокупностью различных адаптационных метаболических процессов, индуцированных как воздействием АФК, так и конституциональными, генетическими особенностями ее защитных биохимических систем. К числу механизмов активации прооксидантных реакций в организме относится функциональная недостаточность системы антиоксидантной защиты клеток, одного из первостепенных «охранных» эшелонов, обеспечивающих поддержание свободнорадикального окисления на стационарном уровне. Механизмы антиоксидантной защиты универсальны и одинаковы для всех типов клеток независимо от их структурно-тканевой организации [Меныцикова Е.Б. и соавт., 2006]. Это объясняет возросший интерес к поиску способов поддержки и стимуляции этих процессов с целью повышения жизнеспособности клеток при угрозе их повреждения. В последние годы в литературе появились сообщения об антиокислительных свойствах тиреоидных гормонов, их способности предотвращать свободно-радикальное окисление ДНК, белков хроматина и ферментов ДНК-репарации, препятствовать гибели клеток [Арутюнян А.В. и соавт., 2000].

Общеизвестно, что одной из форм ответной реакции клетки на стрессирующее воздействие, причиной которого могут быть повреждение ДНК и других структурных элементов клетки, отсутствие необходимых факторов роста, гормонов, цитокинов и др., является активация программированной суицидальной программы клетки — апоптоза [Москалева Е.Ю., Северин С.Е., 2006]. Актуальность проблемы апоптоза определяется сопряженностью нарушений его регуляции с широким спектром заболеваний, в том числе АИТП. Накопление в клетке АФК предшествует апоптозу, что свидетельствует о существенной значимости окислительных процессов в реализации этого феномена [Зенков Н.А. и соавт., 2001].

Вместе с тем сведения, касающиеся механизмов гиперактивации реакций окисления и их роли в развитии иммунного дисбаланса при АИТП и в патогенезе заболеваний щитовидной железы в целом, являются немногочисленными и фрагментарными. Нет четких указаний на связь между активностью про- и антиоксидантной систем с апоптозом иммунокомпетентных клеток при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе. Вскрытие же механизмов окислительного дисбаланса при АИТП,.их взаимосвязи с активностью процессов апоптоза и дизрегуляцией продукции тиреоидных гормонов не только позволит получить новые фундаментальные знания о патогенезе аутоиммунного повреждения щитовидной железы, но и может оказаться основой для разработки новых подходов как к диагностике, прогнозированию течения и исходов, так и к терапии АИТП, направленной на медикаментозный контроль аутодеструктивных процессов.

Цель исследования: установить типовые проявления прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в лимфоцитах периферической крови и его роль в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в подростковом и зрелом возрасте.

Задачи исследования: 1. Установить общие закономерности и особенности нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у подростков 13-17 лет и взрослых пациентов 18-50 лет с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.

2. Определить взаимосвязь показателей свободнорадикального окисления, антиоксидантной защиты, апоптоза и CD-фракционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите с активностью аутоиммунного процесса.

3. Дать комплексную оценку значимости прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в модуляции апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов крови у пациентов подросткового и зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом.

Научная новизна. По итогам сравнительной оценки показателей прооксидантно-антиоксидантного состояния и апоптоза лимфоцитов периферической крови у лиц зрелого и подросткового возраста при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе установлено, что их изменения являются однонаправленными, но более выраженными при эутиреозе и гипертиреозе у взрослых больных, чем у подростков. При этом у взрослых больных при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза и диффузном токсическом зобе активация свободнорадикального окисления (увеличение концентрации супероксидного анион-радикала, Н2О2) и липопероксидации в условиях дефицита оксида азота и активности антиоксидантных ферментов (оксида азота, супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) в лимфоцитах крови имеет более выраженный характер, чем при субклиническом гипотиреозе на фоне заместительной терапии. У подростков течение аутоиммунных тиреопатий не сопровождается активацией перекисного окисления липидов в связи с компенсаторным увеличением в лимфоцитарных клетках активности глутатионпероксидазы при эутиреозе (в сочетании с дефицитом каталазы и глутатионтрансферазы) и глутатионредуктазы при гипертиреозе (при снижении концентрации восстановленного глутатиона).

Продемонстрировано, что недостаточность активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах при тиреопатиях определяет сопряженную с активностью аутоиммунного процесса предрасположенность клеток к Fasзависимому апоптозу (сопряженную с уровнем антитиреоидных антител при эутиреозе), о нарушении реализации которого у пациентов зрелого возраста свидетельствует уменьшение числа annexin У+-клеток в крови. При этом дефицит активности антиоксидантов в сочетании с профицитом активных метаболитов кислорода в лимфоцитах крови рассматривается в качестве одного из факторов апоптоза и CD-субпопуляционного (Т- и В-клеточного) дисбаланса, более выраженного при гипертиреозе, чем при аутоиммунном тиреоидите как у подростков, так и у взрослых больных.

Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые фундаментальные знания о роли прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса в иммунопатогенезе аутоиммунных тиреопатий в зависимости от функционального состояния щитовидной железы, активности гуморального антитиреоидного аутоиммунитета и возраста больных (подростки, взрослые). Установленные данные могут служить основой для коррекции программы лечебно-реабилитационных мероприятий у больных с аутоиммунной патологией щитовидной железы, а также обосновывают необходимость применения при эутиреозе антиоксидантной терапии для профилактики дальнейшего прогрессирования аутоиммунного процесса и развития гипотиреоза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови при аутоиммунном тиреоидите и диффузном токсическом зобе носят однонаправленный характер, но более выраженный у взрослых больных с эу- и гипертиреозом, чем у подростков. •

2. У больных зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом в фазе эутиреоза и диффузным токсическим зобом уровень прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса, проявляющийся увеличением концентрации 02", Н2Ог, ТБК-активных продуктов на фоне дефицита оксида азота, активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы в лимфоцитах периферической крови, выше, чем при аутоиммунном тиреоидите в фазе гипотиреоза.

3. У подростков с диффузным токсическом зобом дефицит антиоксидантов в лимфоцитах крови менее выражен, чем при аутоиммунном тиреоидите, что в совокупности с повышением активности глутатионпероксидазы при эутиреозе и глутатионредуктазы при гипертиреозе обусловливает нормальный уровень перекисного окисления липидов в клетках.

4. Снижение активности антиоксидантных ферментов и накопление продуктов свободнорадикального окисления в лимфоцитах периферической крови при аутоиммунных тиреопатиях определяют сопряженную с активностью антитиреоидного аутоиммунитета предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу, нарушение реализации которого опосредует повышение количества CD20+ В-лимфоцитов в крови.

Реализация и апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2006,

2007), VII Конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград,

2008), а также на научно-образовательных семинарах «Патофизиология системы крови и иммунитета» при Центре компетенции по проблеме инфекционных болезней им. И.И. Мечникова и Р. Коха ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (Томск, 2008). Основные положения и выводы диссертации используются в учебном процессе в Сибирском государственном медицинском университете на кафедре патофизиологии в тематических разделах «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови» и на кафедре эндокринологии и диабетологии в лекционных и практических курсах по теме «Аутоиммунные тиреопатии».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 160 источников, из них 102 отечественных и 58 зарубежных авторов.

126 ВЫВОДЫ

1. Течение аутоиммунных тиреопатий у лиц подросткового (13-17 лет) и зрелого (18-50 лет) возраста при эу-, гипо- и гипертиреозе сопровождается сходными нарушениями прооксидантно-антиоксидантного равновесия, апоптоза и CD-субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, которые менее выражены у подростков, чем у взрослых больных.

2. У больных зрелого возраста при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза и диффузном токсическом зобе уровень свободнорадикального окисления (накопление супероксид-аниона, перекиси водорода и ТБК-активных продуктов), дефицита оксида азота и активности антиоксидантных ферментов (супероксидидисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатион-трансферазы) в лимфоцитах периферической крови выше, чем при аутоиммунном тиреоидите в фазе гипотиреоза.

3. У подростков отсутствие активации перекисного окисления липидов в лимфоцитах периферической крови обусловливается при аутоиммунном тиреоидите увеличением активности глутатионпероксидазы (наряду с дефицитом активности каталазы и глутатионтрансферазы), при диффузном токсическом зобе — повышением активности глутатионредуктазы (в сочетании с дефицитом восстановленного глутатиона).

4. Высокий уровень антител к тиреопероксидазе в сыворотке крови при аутоиммунном тиреоидите в фазе эутиреоза сопряжен с повышением количества CD20+ и CD95+ (предуготовленных к апоптозу) лимфоцитов в крови.

5. Угнетение активности антиоксидантных ферментов в лимфоцитах периферической крови при аутоиммунных тиреопатиях определяет предрасположенность клеток к Fas-зависимому апоптозу, о нарушении реализации которого у пациентов зрелого возраста с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом свидетельствует уменьшение числа annexin У+-клеток в крови.

6. Повышение числа С020+-лимфоцитов в периферической крови у подростков и взрослых больных с аутоиммунным тиреоидитом и диффузным токсическим зобом, наряду с CD3+- и С08+-дефицитом при гипертиреозе, свидетельствует о субпопуляционном (Т- и В-клеточном) дисбалансе, формирование которого обусловливается нарушением Fas-зависимого апоптоза.

128

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты позволяют судить о наличии существенного сдвига в балансе между процессами СРО и активностью АОЗ в лимфоцитах крови и состоянии адаптивного иммунитета при аутоиммунных тиреопатиях. Однако установленные данные позволяют предполагать наличие зависимости изменений, происходящих в клетках, от возраста больных и стажа заболевания, а именно увеличение степени их выраженности по мере взросления организма и с увеличением сроков течения патологического процесса.

Повышение экспрессии Fas-рецептора на фоне активации СРО и снижения активности АОЗ в лимфоцитарных клетках позволяет предположить, что нарушение баланса «прооксиданты/антиоксиданты» является одним из факторов предрасположенности клеток к апоптозу. В свою очередь снижение числа annexin V-презентирующих клеток может свидетельствовать о нарушении целостности фосфолипидного спектра цитоплазматической мембраны и Fas-зависимого апоптоза.

В целом, установленные изменения могут обусловливать угнетение Т-клеточного звена иммунитета и активацию его гуморального звена, что составляет основу иммунопатогенеза аутоиммунных тиреопатий.

Однако в настоящей работе рассмотрен лишь частный аспект метаболических сдвигов в лимфоцитах в аспекте возможного их вклада в реакции антитиреоидного иммунитета за счет модуляции апоптоза, субпопуляционного состава иммунореактивных клеток и Thl/Th2-поляризации иммунного ответа. Вклад апоптоза в реализацию аутоиммунного процесса в щитовидной железе находится еще в стадии осмысления. Вместе с тем, исследование апоптоза иммунокомпетентных клеток способствует более глубокому и полному пониманию молекулярных механизмов формирования АИТ и ДТЗ, что, в свою очередь, необходимо для разработки новых подходов к лечению этих состояний и профилактике их неблагоприятного течения.