Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль проапоптических полиморфизмов p53(C72G), p21 (C31A) и TNF(G308A) в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы у резидентов Забайкальского края

004608250

На правах рукописи

Белоусова Анастасия Ивановна

РОЛЬ ПРОАПОПТОТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ р53(С72С), р21(С31А)иТЩС308А)В ПАТОГЕНЕЗЕ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ У РЕЗИДЕНТОВ ЗАБАЙКАЛЬСКОГО КРАЯ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 1-, ИЮН 2310

Чита-2010

004608250

Работа выполнена в ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Витковский Юрий Антонович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Цыбиков Намжил Намзатович

кандидат медицинских наук Гармаева Александра Алексеевна

Ведущая организация: Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится "29" июня 2010 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава (672090, г. Чита, ул. Горького, 39-А).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия Росздрава.

Автореферат разослан пЛ$п Об 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема глаукомы в настоящее время остается одной го наиболее актуальных в современной офтальмологии. Число больных глаукомой наземном шаре составляет 105 млн., из них слепых на оба глаза - 9,1 млн. (Quigley Н., 2006). По расчетным данным J .Goldberg (2000) к 2030 году число больных глаукомой может увеличиться в два раза. 80% этих больных живут в развивающихся странах. С возрастом число больных увеличивается от 0,1-1,5% в 40-45 лет до 10-14% в 75 лет и выше (Куроедов A.B., 2004).

Такое положение обусловлено многообразием клинических проявлений, сложностью патогенеза, трудностью ранней диагностики и лечения, а также серьезностью прогноза и медико-социальной значимостью заболевания (Кириленко Ю.А., Березников А.И., 2003).

Несмотря на серьезный прорыв в понимании проблем глаукомы до настоящего времени не предложено достаточно эффективных методов предупреждения заболевания и его раннего выявления.

На сегодняшний день, практически половина людей, приходящих с серьезными жалобами к офтальмологу, страдают глаукомой либо имею т подозрения на это заболевание. При этом в 90% случаев, глаукома обнаруживается на поздних стадиях (Егоров Е.А., 2007). Учитывая тот факт, что в ранней фазе глаукома протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями зрительного нерва. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска и разработки новых эффективных молекулярно-генети-ческих методов ранней диагностики глаукомы и внедрения их в повсеместную практику.

В настоящий момент есть все основания относить первичную открытоу-гольную глаукому (ПОУГ) к группе мультифакторных заболеваний, развивающихся на фоне апоптоза, связанного с активацией проапоптических генов и белковой перестройкой содержимого клеток. Следовательно, именно первичные генетические эффекты определяют интенсивность патологических изменений в ганглиозных клетках сетчатки, местную реакцию глаз на возрастные сдвиги и анатомические особенности дренажной системы и диска зрительного нерва (Кириленко Ю.А., Березников А.И., 2003).

За последние годы проводилось энергичное исследование картографии ПОУГ-генов. В результате проводимых комбинированных исследований было обнаружено более 20 генов, непосредственно влияющих на развитие первичной открытоугольной глаукомы. Также было идентифицировано множество генов, потенциально связанных с ПОУГ (Bao J.F., 2005). Таким образом, исследования в этом направлении в дальнейшем смогут обеспечить хорошие

ресурсы для анализа мутации в ассоциированных исследованиях, углубить представления о патогенезе и разработать новые эффективные методы прогнозирования и ранней диагностики данного заболевания (Dimasi D.P., 2006).

Цель я задачи исследования. Основной целью исследования явилось изучение роли проапоптотических полиморфизмов генов p53(C72G), р21(СЗ 1 А) и TNFa(G308A) в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы и оценка их прогностического значения для развития заболевания у резидентов Забайкальского края в этническом аспекте.

Решались следующие задачи:

1. Выявить и оценить частоту встречаемости, экспрессивность и пенетрант-ность проапоптотических аллельных вариантов генов TNFa, р53, р21 у больных первичной открытоугольной глаукомой и здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах.

2. Оценить прогностическое значение проапоптотических аллелей p53(C72G), р21(С31А) и TNFa (G308A) для развития ПОУГ у представителей этнических групп Забайкальского края.

3. Сравнить степень риска возникновения первичной открытоугольной глаукомы у лиц-носителей различных аллельных вариантов генов TNFa, р53, р21.

4. Изучить влияние проапоптотических вариантов p53(C72G), р21(С31А) и TNFa (G308A) на особенности течения первичной открытоугольной глаукомы в русской и бурятской этнических группах.

5. Сравнить содержание провоспалительных цитокинов IL-1 и.TNFa в слезной жидкости больных-носителей различных аллельных вариантов генов TNFa, р53, р21 и здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что проапоптотические аллель-ные варианты p53(C72G), р21 (СЗ1 А) и TNFa(G308A) предрасполагают к развитию первичной открытоугольной глаукомы, влияют на скорость прогресси-рования и тяжесть течения заболевания в русской и бурятской этнических группах.

Обнаружено, что экспрессивность изучаемых полиморфизмов выявляется в максимальной степени в сочетании с проапоптотическим вариантом гена р53.

Впервые установлено, что проапоптотические полиморфизмы p53(C72G), р21(С31А) и TNFa(G308A) повышают риск развития первичной открытоугольной глаукомы среди русских в более значительной степени, по сравнению с представителями бурятской этнической группы.

Впервые предложен механизм формирования толерантного внутриглаз-

ного давления у лиц-носителей различных вариантов гена р53.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные о патогенезе первичной открытоугольной глаукомы, демонстрирующие роль проапоптотических полиморфизмов р53(С720), р21 (СЗ1 А) и Т№га (0308А) в механизме развития заболевания. Носительство проапоптотических аллелей оказывает влияние на тяжесть течения ПОУГ среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края.

Выявленные факты позволяют оценить риск заболевания ПОУГ в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики глаукомы среди резидентов русской и бурятской популяции. Получешше сведения о наличии р53(С72(!), р21(СЗ 1 А) и ТЫ Ра (С308А) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития глаукомы.

Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной и патологической физиологии ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия, а также в перечень диагностических мероприятий по выявлению наследственной предрасположенности к глаукоме в офтальмологическом отделении Диагностической поликлиники при ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия и Краевой детской клинической больницы Забайкальского края.

Публикации. По теме диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе одна - в издании, определенном ВАК Министерства образования и науки РФ.

Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на Всероссийской конференции, посвященной 55-летию Читинской медицинской академии (Чита, 2008), на Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию офтальмологической службы Забайкальского края (Чита, 2009), конференции, посвященной 80-летию Дорожной клинической больницы на ст. Чита-II (Чита, 2007), на заседании Читинского отделения Физиологического общества им. И.П. Павлова.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 279 работ, из них - 48 отечественных и 131 зарубежных авторов, иллюстрирована 21 таблицей, 14 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Распределения полиморфизмов генов р53(С72С), р21(СЗ 1 А) и "ШРог.^ЗОЗА)

у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Частота встречаемости проапоптотических аллельных вариантов генов р53, р21 и TNFa относительно выше среди лиц бурятской национальности, как среди больных ПОУГ, так и среди здоровых резидентов.

2. Экспрессивность и пенетрантность проапоптотических полиморфизмов р53 и TNFa выше среди представителей русской этнической группы. Наиболее высокая экспрессивность проапоптотических аллельных вариантов выявляется у носителей сочетанных полиморфизмов гена р53.

3. Полиморфизм проапоптотических генов p53(C72G), р21(С31А) и TNFa (G308A) влияет на риск развития первичной открытоугольной глаукомы и определяет тяжесть течения заболевания у представителей русской и бурятской этнических групп. Носительство проапоптотических аллельных вариантов p53(C72G), р21(С31А) и TNFa(G308A) влияет на скорость про-грессирования гааукоматознош процесса и предрасполагает к развитию двустороннего поражения глаз.

4. Полиморфизм гена р53 детерминирует резистентность ганглиозных клеток сетчатки к воздействию повышенного офтальмотонуса и определяет уровень толерантного внутриглазного давления. Здоровые резиденты русской и бурятской национальности с цроапоптотическим полиморфизмом р53 имеют более низкий уровень толерантного внутриглазного давления, чем лица с антиапоптотическими аллельиыми вариантами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая характеристика обследованных больных первичной открытоугольной глаукомой и здоровых резидентов

В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki 1964, 2000 ред.).

Методом сплошной выборки в процесс исследования были включены 178 (90 женщин, 88 мужчин) больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) русской национальности, а также 78 (39 женщин и 39 мужчин) больных бурятской национальности, проживающих на территория Забайкальского края.

В качестве контрольной группы обследовано 190 русских (99 женщин, 91 мужчина) и 80 резидентов бурятской национальности (42 женщины, 38 мужчин); не имеющих острых и хронических заболеваний глаз и соматической патологии, приводящей к вторичному поражению глаз.

Все больны е ПОУГ имели характерные изменения диска зрительного нерва, открытый иридокорнеальный угол и типичные дефекты нолей зрения. Па-

циенты с вторичной глаукомой любой этиологии, а также пациенты с закрытым иридокорнеальным углом были исключены из группы обследуемых.

Средние показатели внутриглазного давления (ВГД) среди русских больных ПОУГ составили 22,8 ± 0,9 мм, среди пациентов бурятской национальности - 21,6 ± 0,6 мм, в группе контроля -18,7 ± 0,9 мм и 17,9 ± 0,8 мм соответственно. Среднее значение экскавации диска зрительного нерва для группы больных ПОУГ - 0,8, для группы контроля - 0,3.

В группе русских болышх ПОУГ двусторонний процесс (поражены оба глаза) выявлен у 85 человек (47,8%), односторонний процесс - у 93 человек (52,2%). Среди резидентов бурятской национальности - у 41 человека (52,6%) и 37 человек (47,4%) соответственно.

Методы исследования

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для молекулярно-генетичес-кого исследования были выбраны 3 точечные мутации: p53(C72G), р21 (СЗ1 А) и TNFa (G308A). Для получения образцов ДНК использовался буккальный эпителий. Выделение ДНК проводилось с помощью набора "Минипреп", версия с магнитными частицами, "Силекс" (Москва), реактивы "Евроген" (Москва), "Литех" (Москва).

Амплификацию проводили на термоциклере модель 110 (ООО "Биоком", Москва). Анализ продуктов амплификации произведен методом электрофореза. Для проведения электрофореза использовался 2% агарозный гель с добавлением бромистого этидия.

Иммуноферментный анализ. В слезной жидкости больных глаукомой и здоровых резидентов определяли концентрацию TNFa и IL-1 р методом иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск).

Клинические методы исследования. Больные первичной огкрытоу-гольной глаукомой и здоровые резиденты прошли офтальмологическое обследование: рефрактометрию, биомикроскопшо, периметрию, тонометрию, визометршо, гониоскопию.

Статистическая обработка материала. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с применением пакета прикладной программы "BIOSTAT" и про1раммы статистического анализа Microsoft Excel, версия ХР, с определением достоверности различий при достигнутом уровне значимости р<0,05. Параметры цитокинов приведены в виде средних величии со стандартным отклонением (M±SD), достоверность различий оценивалась по парному t-критершо Стьюдента для нормально распределенных переменных. Для сравнения частот и групп по качественному бинарному признаку

применялся критерий х2 (Пирсона). Для измерения силы и направления связи между изучаемыми явлениями использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Вычислялся абсолютный риск развития глаукомы в группе носителей проалонтотических и антиапоптотических вариантов исследуемых генов, атакже относительный риск (ОР) и отношение шансов. Для определения частот аллельных вариантов генов применялся закон Харди-Вейнберга.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Полиморфизм 72 кодона р53 среди представителей русской и бурятской этнической группы

Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено: 160 Arg гомозигот (84,2 %), 25 Pro/Arg гетерозигот (13,2 %), пять Pro гомозигот (2,6 %). Из 30 обследуемых, у которых выявлены аномальные гены, мужчины составили 19 человек (63,3%), женщины -11 человек (36,7%).

В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ', распределение генотипов имело следующий вид: 82 Arg гомозиготы (46,1%), 72 Pro/Arg гетерозигот (40,4%), 24 Pro гомозиготы (13,5%) (рис.1). Частота аллели Pro среди больных ПОУГ составила q=0,32, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q=0,08 (р<0,01). В то же время аллель Arg оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (р = 0,68), по сравнению с контрольной группой, р 0,92 (р<0,05) (табл. 1).

100%

84.20%

46,10%*

50% -

40,40%**

13,50%**

Группа контроля Больные ПОУГ

й Нормальные гомозиготы И Гетерозиготы ■ Аномальные гомозиготы

Рис. 1. Полиморфизм кодона72 р53 среди русских резидентов.

Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных- (х2-тест) **-р<0,01, *-р<0,05.

Таким образом, 53,9% больных первичной открытоугольной глаукомой имели проапоптотический аллельный вариант гена р53, в то время как среди здоровых резидентов данный полиморфизм встречался только в 15,8% случаев (р<0,05). Следовательно, носительство пролиновой аллели в русской этнической группе предрасполагает к апоптозу ганглиозных клеток сетчатки и развитию первичной открытоугольной глаукомы.

Значительный процент гетерозиготного состояния проапоптотического варианта р53 в группе больных ПОУГ, можно объяснить тем, что мутации в одной из аллелей гена р53 вызывают инактивацию продукта второй, неповрежденной аллели. Коэкслрессирующиеся нормальный и мутантный белок р53 образуют неактивные гегеромсрные комплексы, что приводит к подавлению функции нормального белка р53 по доминантно-негативном)' механизму (Reed J., 1995).

Среди обследуемых бурятской национальности, распространенность про-апоптотической С-аллели (Pro) оказалась выше как среди больных ПОУГ, так и среди здоровых резидентов по сравнению с русской этнической группой (р<0,05). Б группе здоровых бурят выявлено 24 Arg гомозиготы (30%), 40 Pro/ Arg гетерозигот (50%) и 16 Pro гомозигот (20%). В группе больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности гомозиготное носительство Arg выявлено у 16 человек (20,7%), гетерозиготы Pro/Arg составили 22 человека (28 %), гомозиготное носительство Pro обнаружено у 40 человек (51,3%) (рис. 2).

60% 1

Группа контроля Больные ПОУГ

22 Нормальные гомозиготы Ш Гетерозиготы М Аномальные гомозиготы Рис. 2. Полиморфизм кодона72 р53 среди лиц бурятской национальности.

Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных - (х2-тест) *-р<0,05, **-р<0,01.

Установлено, что частота Pro-аллели среди больных ПОУГ составила q=0,55, что незначительно выше, чем среди здоровых резидентов, q=0,45 (р<0,05), частота Arg аллели - р=0,45 ир=0,55 соответственно (табл. 1).

В группе русских больных ПОУГ корреляционная связь между наличием проапоптотичесой С-аллели p53(C72G) и заболевания сильно выражена (г ~ 0,85; 0,7<г<0,9, коэффициент ранговой корреляции Спирмена). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе носителей проаноптотической аллели р53 в 3,4 раза выше (ОР>1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 6,32.

В группе больных ПОУГ бурятской национальности корреляционная связь между наличием проапоптотической аллели C72G р53 и наличием заболевания значительна (г = 0,55; 0,5<г<0,7). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе носителей проаноптотической аллели р53 в 1,25 раз выше (ОР>1), чем среди лиц с С-аллельным вариантом. Отношение шансов равно 1,66 (табл.2).

Таким образом, наряду с более высокой распространенностью проапоп-тотической аллели р53 в бурятской этнической группе, пенетрантность С-ва-рианта (Pro) выше у лиц русской национальности.

Среди больных с поражением обоих глаз частота проапоптотической аллели выше как среди бурят, так и среди русских резидентов (р<0,05). Из 85 русских пациентов, имеющих поражение обоих глаз, 68 человек (80%) явились носителями проапоптотического полиморфизма р53, из них 20 обследуемых (23,5%) - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составила q=0,55, что выше, чем в общей группе больных ПОУГ, q=0,32 (р<0,05).

Из 41 пациента бурятской национальности, имеющего поражение обоих глаз, 33 человека (80,5%) оказались носителями проапоптотического варианта р53, из них 20 обследуемых (48,9%) - в гомозиготном состоянии. В то же время частота встречаемости Pro-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз составляет q=0,56, что незначительно превышает показатель в общей группе больных ПОУГ, q=0,55 (р>0,05).

Принимая во внимание более высокую распространенность проапоптотической аллели у больных с двусторонним глаукоматозным процессом, можно предположить, что пролиновый вариант р53 влияет на скорость прогресси-рования и тяжесть течения заболевания. Вместе с тем, экспрессивность проапоптотического полиморфизма р53 выше в русской этнической группе.

В группе здоровых носителей пролиновой аллели р53 (С-вариант) русской национальности отмечался более низкий уровень внутриглазного давления по сравнению остальными резидентами. Среди представителей группы

контроля с нроапоптотическими полиморфизмами р53 средний уровень ВГД составил 16,2±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых -18,7±0,9 мм (р<0,05). Аналогичная тенденция, наблюдается и у здоровых лиц бурятской национальности. Среди бурятских резидентов с С-аллельным вариантом, средний уровень ВГД составил 16,7±0,9 мм, в то время как в общей группе здоровых индивидуумов - 17,9±0,8 мм (р<0,05).

Известно, что повышение внутриглазного давления опосредованно запускает процесс апоптоза ганглиозных клеток сетчатки и приводит к поражению зрительного нерва (Kaiser Н. et al., 1996).

Проапоптотическая активность гена р53 варьирует у разных индивидуумов в связи с генетическим полиморфизмом. Из полученных данных видно, что здоровые резиденты с проапоптотическим полиморфизмом р53 имели более низкий уровень внутриглазного давления, чем индивидуумы с антиапоп-тотическим полиморфизмом. Таким образом, можно предположить, что именно имеющийся низкий уровень ВГД позволял данным индивидуумам избежать развития глаукоматозного процесса, в то время как лица с антиапоптоти-ческим полиморфизмом р53 оставались здоровыми при более высоком уровне внутриглазного давления. Следовательно, полиморфизм р53, обуславливая проапоптотическую предрасположенность клетки, детерминирует резистентность ганглиозных клеток сетчатки к воздействию повышенного внутриглазного давления и определяет уровень толерантного внутриглазного давления.

Полиморфизм TNFa G308A среди представителей русской и бурятской этнической групп

Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 168 нормальных гомозигот (88,4%), 19 гетерозигот (10%), 3 патологические гомозиготы (1,6 %). Частота встречаемости проапоптотической А-алле-ли среди здоровых резидентов составила q^O.04, распространенность нормальной G-аллели - р = 0,96.

В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, распределение генотипов имело следующий вид: 5 патологических гомозигот (2,8%), 63 гетерози-готы (35,4%), 110 нормальных гомозигот (61,8%). Частота проапоптотической А-аллели среди больных ПОУГ составила q = 0,18, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q = 0,04 (р<0,01), в то же время нормальная G-аллель оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (р = 0,82) по сравнению с контрольной группой, р = 0,96 (р<0,01) (табл. 1).

В бурятской этнической группе наблюдалась аналогичная тенденция. В контрольной группе выявлено 67 нормальных гомозигот TNFa (84,2%) и 13 гетерозигот (15,8%).

Среди пациентов, страдающих первичной открытоугольной глаукомой, распределение генотипов оказалось следующим: 43 нормальные гомозиготы (55,2%), 27 гетерозигот(35,4%), 8 патологических гомозигот (9,4%). Частота аномальной А-аллели TNFa среди больных ПОУГ составила q = 0,26, что значительно выше, чем среди здоровых резидентов, q = 0,08 (р<0,01 ), в то же время нормальная аллель менее распространена в группе больных глаукомой (р = 0,74), по сравнению с контрольной группой, р = 0,92 (р<0,05) (табл. 1 ).

В целом, доля генотипов с проапоптотическим вариантом TNFa в бурятской этнической группе выше, чем среди представителей русской национальности (р<0,05).

Корреляционная связь между наличием аномальной аллели TNFa и глаукомой сильно выражена в обеих этнических группах (г = 0,80 и г = 0,85: 0,7<г<0,9). Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы в группе русских носителей проапоптотической аллели в 3,29 раз выше (ОР> 1), чем среди лиц с нормальным аллельным вариантом ( р<0,05). Отношение шансов (ОШ) равно 4,72. В бурятской этнической группе относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы среди носителей патологической аллели TNFa в 2,75 раз выше (ОР>1), чем среди резидентов с нормальными аллельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 4,19 (табл.2).

Распространенность проапоптотической аллели в группе русских пациентов с двусторонним поражением глаз составила 0,38, что больше, чем в общей группе пациентов русской национальности - q=0,18 ( р<0,01 ). Частота встречаемости аномальной аллели в группе бурят с двусторонним поражением глаз оказалась q = 0,31, что также несколько выше, чем в общей ipynne бурят, страдающих ПОУГ, q-0,26 (р<0,05).

Таким образом, полиморфизм TNFa влияет на риск развития и на тяжесть течения глаукомы в обеих этнических группах. В то же время, сравнивая частоту встречаемости проапоптотических полиморфизмов и степень риска развития заболевания среди русского и бурятского населения Забайкальского края, можно отметить, что пенетрантность гена TNFa выше в русской этнической группе.

Экспрессивность аномального полиморфизма высока в обеих этнических группах, с незначительным преобладанием среди русских резидентов.

Полиморфизм С31А р21 среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края

Нами был проведен анализ частоты мутаций 31 кодона гена р21 среди 270 здоровых резидентов, 178 русских больных и 78 больных бурятской национальности.

Среди здоровых представителей русской этнической группы выявлено 144 Ser гомозиготы (75,8 %), 32 Ser/Arg гетерозиготы (16,8 %) и 14 Arg гомозигот (7,4%).

В группе русских пациентов, страдающих ПОУГ, генотипы распределились следующим образом: 123 Ser гомозиготы (69,1%), 41 Ser/Arg гетеро-зигота (23%), 14 Arg гомозигот (7,9%).

Частота проапоптотической аллели Arg среди больных ПОУГ' составила q =0,28, что выше, чем среди здоровых резидентов - q = 0,13 (р<0,01),вто же время аллель Ser оказалась менее распространенной в группе больных глаукомой (р = 0,72), по сравнению с контрольной группой, р = 0,87 (р<0,05) (табл. 1).

Доля генотипов с проапоптотическим вариантом р21 в бурятской этнической группе в целом незначительно выше, чем среди представителей русской национальности.

Частота аллели Arg среди бурят, страдающих ПОУГ составила q = 0,29, что больше, чем среди здоровых резидентов - q = 0,19 (р<0,05). Частоты Ser аллели для лиц с ПОУГ и здоровых людей: р = 0,71 и р = 0,81 соответственно (р<0,05) (табл. 1).

Корреляционная связь между наличием аномальной аллели р21 и глаукомой сильно выражена в русской этнической группе (г = 0,8; 0,7<г<0,9), в то время как среди резидентов бурятской национальности менее значительна (г = 0,5; 0,3<г<0,5). Относительный риск развития первичной открытоуголыюй глаукомы среди русских носителей проапоптотической аллели р21 в 1,4 раза выше (ОР> 1), чем среди лиц с нормальными аллельными вариантами.

Риск развития заболевания у носителей аргининовой аллели в бурятской

Таблица 1

Частоты аллельных вариантов р53, р21 и TNFa среди больных ПОУГ и здоровых индивидуумов в различных этнических группах

Русские Буряты

Больные ПОУГ Группа контроля Больные ПОУГ Труппа контроля

р53 G (Arg) 0,68* 0,92 0,45* 0,55

С (Pro) 0,32** 0,08 0,55* 0,45

TNFa G-вариант 0,82* 0,96 0,74* 0,92

А-вариант 0,18** 0,04 0,26** 0,08

Р21 A (Ser) 0,72* 0,87 0,71* 0,81

С (Arg) 0,28* 0.13 0,29* 0.19

Примечание: достоверность различий между группами носителей мутаций условно здоровых и больных (х2-тсст) - * - р<0,05, ** - р<0,01.

этнической группе в 1,1 раза выше (ОР> 1 ), чем среди лиц с нормальными ал-лельными вариантами. Отношение шансов (ОШ) равно 1,1 (табл.2).

Полученные результаты демонстрируют роль полиморфизма р21 (СЗ1 А) в развитии первичной открытоугольной глаукомы в обеих этнических группах. Частота проапошотической С-аллели (Arg) выше среди больных ПОУГ русской и бурятской национальности, чем среди здоровых резидентов ( р<0,01).

В группе больных распространенность С-варианта среди русских и бурят практически одинакова (р>0,05), но принимая во внимание частоту проапоп-тотической аллели в этнической группах в целом (р<0,05), а также показатели относительного риска, можно утверждать, что пенегрантность проапоптоти-ческого полиморфизма р21 ниже у лиц бурятской национальности.

Из 85 русских пациентов, имеющих поражение обоих глаз, 43 человека (50,6%) явились носителями патологического варианта СЗ 1А р21, из них 11 обследуемых (12,9%) - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg-аллели в группе больных с двусторонним поражением глаз - q = 0,36, что выше, чем в общей группе, страдающих ПОУГ (q~0,28) (р<0,05). В бурятской этнической группе 29,3% пациентов - носители проапоптотического варианта р21, из них 14,6% обследуемых - в гомозиготном состоянии. Частота встречаемости Arg аллели в группе бурят с двусторонним поражением глаз составила q-0,38, что также выше, чем в общей группе больных ПОУГ, q - 0,29 (Р<0,05).

Таким образом, наряду с влиянием полиморфизма р21 на риск развития глаукомы, проапоптотические варианты данного гена также могут определять скорость прогрессировання и тяжесть течения шаукоматозного процесса как у русских больных ПОУГ, так и у бурят, причем на экспрессивность проапопто-тических полиморфизмов р21 этнический фактор не оказывает значительного влияния.

Таблица2

Относительный риск и отношение шансов возникновения ПОУГ у носителей нормальных и аномальных аллелей р53, TNFa и р21 в различных этнических

группах

р53 TNFa р21

Русские Буряты Русские Буряты Русские Буряты

Относительный риск 3,4* 1,25 3,29* 2,75 1,4 и

Отношение шансов 6,32** 1,66 4,72* 4,19 1,5 1,1

Примечание: достоверность различий между русской и бурятской этнической группой -*- р<0,05, **- р<0,01.

Сочетание проапоптотических полиморфизмов p53(C72G), p21 (С31 А) и TNFa (G308А) в русской и бурятской этнических группах

Сочетание нроаиоптотических аллелей в гомозиготном состоянии имели шесть русских больных ПОУГ, из них: пять человек - сочетание двух аллелей, один пациент - гомозиготные варианты по трем генам. Из трех резидентов, имеющих сочетание прапоптотических аллелей р53 и р21, один обследуемый наблюдался с развитой стадией глаукомы, два пациента - с терминальной стадией глаукомы, причем у всех пациентов выявлено поражение обоих глаз. Из двух резидентов с сочетанием С-аллелыюго варианта р53 и А-аллельного варианта TNFa один имел терминальную, а другой - далекозашедшую стадию глаукомы. Больной мужского пола с аномальным полиморфизмом трех генов страдал поражением обоих глаз, с развитой стадией глаукомы на одном и далекозашед-шей стадией - на другом глазу.

Таким образом, в русской этнической группе наиболее прогностически неблагоприятным является гомозиготное сочетание проапоптотических полиморфизмов генов р53и р21, на втором месте находится сочеташшй полиморфизм p53(C72G) и TNFa(G308A).

Из 178 русских больных первичной открытоугольной глаукомой 44 обследуемых имели сочетание двух полиморфизмов и два пациента - сочетание трех полиморфизмов в гетерозиготном состоянии. Также были обследованы два пациента с сочетанием аномальных аллелей р21 и TNFa в гетерозиготном состоянии и проапоптотической гомозигота р53.25 пациентов (56,8%) с нро-апоптотическим вариантом двух генов в гетерозиготном состоянии имели двустороннее поражение глаз, причем у 20 из них - на одном отмечалась да-лекозашедшая стадия. Из двух пациентов с сочетанием гетерозигот с про-апоптотическими гомозиготами р53, один резидент также имел двустороннее поражение глаз в далекозашедшей стадии. Один из пациентов с сочетанием трех полиморфизмов имел двустороннее поражение глаз с развитой и далекозашедшей стадией глаукомы, другой - развитую стадию на обоих глазах.

Сочетание двух аномальных аллелей в гомозиготном состоянии выявлено у семи пациентов бурятской национальности, страдающих первичной открытоугольной глаукомой, из них четыре резидента (57%) имели сочетание р53 и TNFa, два обследуемых-р21 и р53, один пациент-TNFa и р21. У всех носителей сочетанного полиморфизма TNFa и р53 наблюдалось поражение обоих глаз. Пациенты с проапоптотическими полиморфизмами р21 и р53 имели двустороннее поражение глаз с далекозашедшей стадией на одном глазу. Носитель сочетанных вариантов TNFa и р21 имел терминальную стадию на одном глазу и начальную - на другом.

Необходимо отметить, что три из четырех случаев терминальной глауко-

мы в бурятской популяции представлены сочетанными вариантами проапоп-тотических полиморфизмов р53 и TNFa, и TNFa и р21 в гомозиготном состоянии.

Сочетание полиморфизмов в гетерозиготном состоянии наблюдалось у 18 пациентов, у восьми из них: р53 и TNFa, р21 и р53 - в двух случаях, TNF и р21 - у восьми резидентов. Сочетание гетерозиготного варианта р21 с аномальной гомозиготой р53 выявлено в шести случаях. У десяти пациентов (55,6%) с сочетанными гетерозиготами отмечалось поражение обоих глаз, у 11 резидентов (61,1%) выявлена далекозашедшая стадия глаукомы, семь из них имели сочетанный вариант полиморфизма р53 и TNFa. У больных с сочетанием гетерозиготного варианта р21 с аномальной гомозиготой р53 отмечалась развитая стадия глаукомы, у четырех (67,7%) пациентов заболевание протекало с поражением обоих глаз.

Полученные результаты демонстрируют усухубляющее влияние сочетан-ных вариантов проапоптотических полиморфизмов на тяжесть течения глаукомы среди русских и бурят. Наиболее неблагоприятное влияние на риск развития и тяжесть течения глаукомы в обеих этнических группах оказывали со-четанные варианты полиморфизма р53.

Таким образом, проапоптотические полиморфизмы p53(C72G), р21(СЗ 1 А) и TNFa (G308A) предопределяют поражение ганглиозных клеток сетчатки при воздействии пусковых факторов и повышают риск развития первичной открытоугольной глаукомы, скорость прогрессирования глаукоматоз-ного процесса и тяжесть течения заболевания у представителей русской и бурятской этнических групп (рис. 3).

Содержание провоспалительных цитокинов TNFa и IL-lß в слезной жидкости русских больных ПОУГ и здоровых резидентов

В слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой содержание провоспалительных цитокинов оказалось повышенным по сравнению с группой контроля. Концентрация IL-lß в группе обследуемых в 1,52 раза больше по сравнению с группой здоровых, а TNFa в слезной жидкости превышает нормальные уровни от 3 до 6 раз (р<0,05). Содержание цитокинов среди пациентов-носителей различных аллельных вариантов р21, р53 и TNFa, страдающих ПОУГ различается (р<0,05).

Среди русских больных ПОУГ содержание TNFa максимально повышено у носителей проапоптотических вариантов TNFa и р53, и составляет 381,7±58,7 пкг/мл и 384,8±52,7пкг/мл соответственно. Наиболее высокий уровень IL-lß выявлен у резидентов с А-аллельным вариантом TNFa, 59,6±S, 1 пкг/мл. Необходимо отметить, что высокие концентрации данного цитокина наблюдались у

вгутоцпя в 308 кодоне ТИТ».

апопто! г англиозных клеток сетчатки нет апоптол» ганглмохных клеток сетчатки

Рис. 3. Концептуальная схема роли полиморфизмов Р53, р2 1 и ТХКс'х в патогенезе первично» огкрытоугшьнон глаукомы.

больных с сочетанием аномальных полиморфизмов р53 и ТЬ'Ра. В футте больных с полиморфизмами Т№а и р53 в гетерозиготном и гомозиготном состоянии уровни цитокинов различались незначительно (р>0,05), из чего можно предположить, что экспрессия проапоптотических полиморфизмов в гомо- и гетерозиготном состоянии одинаково влияет на содержание 1Ь-1Р и ТИРа.

Концентрации ировоспалительных цитокинов в слезе русских пациентов с антиапоптотическими вариантами генов р21, р53 и ТТ\тГа отличаются от здоровых резидентов в меньшей степени (р<0,05).

В группе контроля показатели 1Ь-1Р и ТИР а отличались от больных ПОУГ, но внутри группы здоровых резидентов, в зависимости от генотипа варьировали менее значительно. Максимальное их содержание наблюдалось у резидентов с проапоптотическим А-аллельным вариантом ТЖсс 1Ь-1Р - 37,5±9,1 пкг/ мл, ТКРа - 71 ,б±8,3 пкг/мл. Минимальная концентрация 1Ь-1Р выявлена у носителей в-аллельного варианта гена ШРа, содержание TNFa - у обследуемых с нормальным вариантом гена р21, 18,4±7,8 пкг/мл и 48,9±9,7 пкг/мл соответственно (р<0,05).

В группе больных-носителей проапоптотических полиморфизмов русской национальности уровтш провоспалительных цитокинов в слезной жидкости повышены более значительно по сравнению с носителями аналогичных вариантов в бурятской этнической группе.

Следовательно, экспрессия проапоптотических аллелей более выражена среди русских больных ПОУГ по сравнению с представителями бурятской этнической группы.

Содержание провосполительных цитокинов ТОТа и 1Ь-1Р в слезной жидкости больных ПОУГ и здоровых резидентов бурятской национальности

В слезной жидкости больных первичной открытоугольной глаукомой бурятской национальности содержание 1Ь-1[3 и ТКТа повышено но сравнению с группой контроля, но различия концентрации прововосполительных цитокинов среди здоровых и больных менее значительны по сравнению с русской этнической группой (р<0,05). В то же время в группе здоровых бурят уровень IЬ-1 р и ТЫРа ниже по сравнению с аналогичной группой русских обследуемых (р<0,05). Концентрация ТКРа максимально увеличена у носителей проапоптотических вариантов генов ТЫРа и р53, и составила 378,7±68,3пкг/мл и 374,8+45,9 пкг/мл соответственно (р<0,01). Наиболее высокий уровень 1Г-1Р отмечался у резидентов с А-аллельным вариантом ЮТа и составил 54,4±8,7пкг/мл. Минимальное содержание 1Ь-1Р выявлено в группе больных с в-аллельным вариантом Т№а, а ТЫРа - у носителей О-вари-

антар53 (36,3±8,8пкг/мл и 151,4±59,2пкг/мл соответственно).

Необходимо отметить, что наиболее высокие концентрации как 1Ь-1Р, гак и ТЬТс. наблюдались у больных-носителей сочетаний проапоптотичес-ких полиморфизмов р53 и 'Гора (р<0,01), что повторяет аналогичную тенденцию в русской этнической группе.

В группе контроля отмечались более низкие концентрации провоспали-тельных цитокинов в слезной жидкости, как по сравнению с больными ПОУГ, так и со здоровыми резидентами русской национальности (р<0,05). В то же время максимальные уровни ТОТа и 11.-1 [3, 70,7±10,4 пкг/мл и 32,7±8,3, наблюдались у представителей группы контроля с аномальным полиморфизмом Юта С308А (р<0,01).

Таким образом, в слезной жидкости больных первичной открытоуголь-ной глаукомой бурятской национальности содержание 1Ь-1 (3 и ТМРсх ниже, чем в группе русских пациентов, что может свидетельствовать о менее интенсивном течении апоптотического процесса и меньшей экспрессивности проапоп-тотических полиморфизмов у представителей данной этнической группы.

Концентрации провоспалительных цитокинов в слезной жидкости здоровых людей с проапоптотическим полиморфизмом р53 были выше, чем с анти-апоптотическими вариантами (р<0,05). Данное явление можно расценивать как дополнительный аргумент в пользу генетической детерминированности проапоптотической предрасположенности ганглиозных клеток сетчатки и уровня толерантного внутриглазного давления, обусловленного этой предрасполо-жеиностью.

ВЫВОДЫ

1. Распределение частотпроапоптотических аллельных вариантов р53(С720), р21 (СЗ1 А) и Т№7а (С308А) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности. Частота встречаемости р53(С720), р21(С31А) и Т№а (0308А) относительно выше среди лиц бурятской национальности, как в группе больных ПОУГ, так и здоровых лиц.

2. Больные первичной открытоугольной глаукомой в обеих этнических группах являются носителями исследуемых проапоптотических полиморфизмов р53, р21 и "ШЕа чаще, чем здоровые резиденты. Частота встречаемости неблагоприятных аллельных вариантов выше в группе больных ПОУГ бурятской национальности, что связано с высокой распространенностью проапоптотических аллелей среди бурятского населения в целом. Экспрессивность и пенетрантность проапопто тических полиморфизмов р53 и Т№а выше среди русского населения.

3. Риск развития первичной открытозтольной глаукомы выше у лиц-носителей

проапоптотических аллельных вариантов генов TNFa, р53, р21 в обеих этнических группах. Относительный риск развития первичной открытоугольной глаукомы выше у носителей проапоптотических аллельных вариантов р53, р21 и TNFa среди русских резидентов в сравнении с лицами бурятской национальности. Максимальная вероятность возникновения первичной открытоугольной глаукомы наблюдается в группе русских носителей проапоптотических полиморфизмов гена р53.

4. Сочетанные формы проапоптотических полимоморфизмов генов р53, р21 и TNFa являются более прогностически неблагоприятными для риска развития глаукомы среди русского и бурятского населения Забайкальского края.

5. Частота встречаемости проапоптотических полиморфизмов р53, р21 и TNFa выше в группе больных с поражением обоих глаз русской и бурятской национальности. Наиболее неблагоприятное влияние на прогрессирование глаукоматозного процесса и развитие двухстороннего поражения глаз оказывает сочетанньш полиморфизм р53 в обеих этнических группах.

6. В обеих этнических группах содержание провоспалительных цитокинов в слезной жидкости больных ГТОУГ повышено по сравнению со здоровыми резидентами. Концентрации IL-1Р и TNFa у лиц-носителей проапоптотических полиморфизмов значительно больше, чем у носителей ангиапоптоти-ческих вариантов. В слезной жидкости русских больных концентрации провоспалительных цитокинов выше, чем у пациентов бурятской национальности. Содержание IL-1 (3 и TNFa максимально у носителей проапоптотических аллельных вариантов генов TNFa и р53.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью повышения эффективности ранней диагностики ПОУГ следует включить определение проапоптотических полиморфизмов генов p53(C72G), р21(СЗ 1А) и TNF(G308A) в алгоритм обследования больных с подозрением на глаукому, а также осуществлять медико-генетическое консультирование лиц с отягощенной наследственностью по данному заболеванию.

2. С целью прогнозирования скорости прогрессировать глаукоматозного процесса и тяжести течения заболевания следует проводить исследование полиморфизмов p53(C72G), р21(С31А) и TNF(G308A) при обследовании больных с первичной открытоугольной глаукомой.

СПИСОКРАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоусова А. И. Генетические механизмы апоптоза в патогенезе первичной открытоуголыюй глаукомы /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский// Дальневосточный медицинский журнал. -2008. - №4. -С. 113-115.

2. Белоусова А. И. Генетические маркеры первичной открытоугольной глаукомы в различных этнических группах /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский / / Забайкальский медицинский вестник. - 2008. - №2. - С. 38-43.

3. Белоусова А. И. Полиморфизм гена р21 как фактор риска первичной открытоугольной гдакомы среди населения Забайкальского края /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский, H.A. Логунов, В.В. Комаров //Забайкальский медицинский вестник. - 2009. - №3. - С. 19-21.

4. Белоусова А. И. Генетические механизмы апоптоза в патогенезе первичной открытоуголыюй глаукомы в различных этнических группах/ А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский// Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Тез. докл. Всероссийской научно- практической конференции. - Чита, 2008. - С. 168 -169.

5. Белоусова А. И. Генетические механизмы первичной открытоугольной глаукомы в различных этнических группах /А.И. Белоусова, Ю.А. Витковский // Сборник научно-практических статей третьей межрегиональной конференции, посвященной 100-летию офтальмологии Забайкальского края. - Чита, 2009. - С.75 - 76.

СЛИСОКСОКРАЩЕНИЙ

ВГД - внутриглазное давление

гке - ганглиоз!гые клетки сетчатки

дзн - диск зрительного нерва

ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

ОР - относительный риск

ош - отношение шансов

Cdk - ци клин-зависимая киназа

IL -интерлейкин

TNF - фактор некроза опухолей

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 19.05.10. Бумага офсетная. Формат 60x84 '/|6. Усл.печ.л-1,0 Тираж 100. Заказ№ 832010.

Отпечатано в информационно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39а.