Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль полиморфизма генов цитокинов в нарушении консолидации переломов длинных костей конечностей

Гусев Кирилл Аркадьевич

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В НАРУШЕНИИ КОНСОЛИДАЦИИ ПЕРЕЛОМОВ ДЛИННЫХ КОСТЕЙ КОНЕЧНОСТЕЙ

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

' | чАР 2015

005560517

Чита - 2015

005560517

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент Мироманов Александр Михайлович Научный консультант:

Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Витковский Юрий Антонович

Официальные оппоненты:

Ефремов Анатолий Васильевич - Заслуженный деятель науки РФ, Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии

Сашенков Сергей Львович - доктор медицинских наук, профессор. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры нормальной физиологии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Иркутск.

Защита диссертации состоится "¿<Х" 2015 г. в

_часов на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при

ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Минздрава России, 672090, г. Чита, ул. Горького, 39а.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации (672090, г. Чита, ул. Горького, 39а) и на caйтe:http://chitgma.ru/nauka/zashchita-dissertatsij?task=item.view&id=20

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208. 118.01 доктор медицинских наук, профессор _

И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительное количество исследований, посвященных изучению нарушений консолидации, данная проблема не решена до настоящего времени (Мироманов, A.M., Намоконов Е.В., 2014; Мироманов, A.M., 2013; Берченко, Г.Н., 2011; Камека, A.JL, Леонова С.Н., 2008). По разным данным, нарушение консолидации переломов длинных костей конечностей составляет от 15 до 50% от всех травм опорно-двигательного аппарата, а частота развития ложных суставов даже при применении современных медицинских технологий варьирует от 4,7 до 33,2 %. В структуре последствий травм длинных костей псевдоартрозы бедра составляют по частоте 10,7 - 30,8%, голени - 15 -50,6%, плеча - 0,4 - 30% (Кузьминова Е.П. и соавг., 2013; Барабаш Ю.А. и соавт., 2012; Миниахметова P.P. и соавт., 2009; С.П. Миронов и соавт., 2007; Амирханов, И.М., 2006; Дедов, И.И. и соавт., 2002), а образующиеся при этом анатомо-функцио-нальные нарушения конечности являются причиной стойкой инвалидности у 11,6-44,9% больных (Раскина Т.А., Летаева М.В., 2012; McClean Е. ei al., 2003). Высокая частота неудовлетворительных результатов лечения закономерно повышает теоретический и практический интерес к дальнейшему изучению и уточнению патогенетических механизмов развития нарушений консолидации при переломах (Мироманов, A.M. и соавт., 2013; Берченко, Г.Н., 2011; Камека, А.Л., Леонова С.Н., 2008).

Степень разработанности темы. В развитии, течении и исходе нарушения консолидации играют роль многочисленные факторы различных систем макроорганизма (иммунная, "ПОЛ-антиоксиданты", эндокринная, состояние местного и общего кровообращения и прочие) (Мироманов A.M., Намоконов Е.В., 2014; Мироманов A.M., и соавт., 2013; Котельников Г.П., 2009; Камека А.Л., Леонова С.Н., 2008). Одними из ведущих звеньев в патогенезе нарушений консолидации являются: механический фактор, нарушение процессов микроциркуляции и воспаление в травмированном сегменте (Попсуйшапка А.К. и соавт., 2013; Елдзаров П.Е. и соавт., 2012; Гурин Н.Н., 2004). Тем не менее, даже не смотря на применение современных медицинских технологий, предотвращающих возникновение вышеуказанных причин, нарушения консолидации не имеют тенденции к снижению, что свидетельствует о превалировании других механизмов развития данного осложнения (Осипенко А.В., Трифонова Е.Б., 2012; Мамаев В.И., 2010; Бердюгина О.В. и соавт., 2009; Марков Д.А., 2008). Новый виток развития изучения заболеваний и осложнений, связанных с нарушением

процессов ремоделирования костной ткани связан с развитием остео-иммунологии и генетики (Мироманов A.M., 2013; Крылов М.Ю. и со-авт., 2010; Цыган В.Н. и соавт., 2010; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Громова А.Ю., Симбирцев A.C., 2005).

Известно, что практически любая травма, в том числе и операционная, оказывает неблагоприятный эффект на иммунную систему и вызывает развитие иммунодефицита, главным проявлением которого являются различные осложнения, в том числе и нарушение консолидации (Мироманов A.M., Намоконоз Е.В., 2014; Котельников Г.П., Тру-ханова И.Г., 2009; Кузник Б.И. и соавт., 2005, 2008). Иммунные клетки секретируют многочисленные растворимые медиаторы (цитокины) играющие важнейшую роль в различных физиологических и патологических процессах организма (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Кузник Б.И. и соавт., 2008).

Согласно данным последних лет, полиморфизм генов цитокинов оказывает существенное влияние на предрасположенность к ряду заболеваний и осложнений. Различия в генах, контролирующих защитные реакции организма, могут влиять на уровень продукции кодируемых белков и, тем самым, на характер протекания иммунного ответа (Ефремов A.B. и соавт., 2011 ; Цыган В.Н. и соавт., 2010; Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Симбирцев A.C., Громова А.Ю., 2005; Montes А.Н. et al., 2010; Emonts M., 2007; Bidwell J. et al., 2001 ; Collins RS., McKusick V.A., 2001).

Поскольку в нашей стране и за рубежом молекулярно-генетичес-ким исследованиям больных с нарушением консолидации переломов не уделено должного внимания, изучение генетического полиморфизма цитокинов, их рецепторов и эффекторных молекул, принимающих участие в миграции клеток, репарации поврежденной ткани, механизмах регуляции межклеточных взаимодействий у больных при травме, а также поиск генетических и иммунологических маркеров развития осложнений представляется перспективным как в теоретическом, так и в практическом отношениях (Мироманов A.M. и соавт., 2013,2014).

В рамках рассматриваемой проблемы идентификация генов, вовлеченных в патогенез нарушения консолидации, является важной задачей, решение которой способствует формированию фундаментальных представлений о патогенезе данного социально значимого осложнения, что в конечном итоге позволит сделать долгосрочный индивидуальный прогноз для конкретного лица и провести необходимые профилактические мероприятия для его предотвращения.

Цель исследования: определить роль полиморфизма генов TNFa-308G>A, IL4-5890T, IL10-5920A, IL10-8190T, IL10-1082G>A TGFßr25Arg>Pi "о, EG FR-2 0 73А >Т в нарушении консолидации переломов длинных костей конечностей.

Задачи исследования:

1. Определить частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма генов TNFa-308G>A, IL4-5890T, IL10-5920A, ILW-8190T, IL10-1082G>A, TGFßI-25Arg>Pro и EG FR-2 0 73A> Ту пациентов с нео-сложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием замедленной консолидации в Забайкальском крае.

2. Оценить содержание цитокинов (TNFa, IL-4, IL-10, TGFß] и EGF) у больных с неосложнённым течением переломов и развитием замедленной консолидации переломов длинных костей конечностей с учетом носительства различных генотипов и аллелей полиморфизма генов TNFa-308G>A, IL4-589C>T, IL10-5920A, IL10-8190T, IL10-1082G>A, TGFß-25Arg>Pro иEGFR-2073A>T.

3. Выявить прогностическую роль изучаемых показателей в нарушении консолидации переломов длинных костей конечностей.

Научная новизна исследования.

Впервые установлено, что при замедленной консолидации переломов длинных костей конечностей выявлена более высокая частота носительства генотипа -25Рго/Рго гена TGFßf25Arg>Pro и генотипа -2073Т/Т гена EGFR-20 73A>Tв сравнении с группой контроля и клинического сравнения.

Доказано, что аллель -25Рго- и генотип -25Рго/Рго гена TGFßr 25Arg>Pro, а также аллель -2073Т- и генотип -2073Т/Т гена EGFR-20 73А>Тповышают вероятность развития замедленной консолидации при переломах длинных костей. Носительство генотипа -25Рго/Рго гена TGFß-25Arg>Pro и генотипа -2073Т/Т генаEGFR-2073A>Тявляются факторами риска развития замедленной консолидации переломов в позднем периоде травмы.

Установлено, что нарушение консолидации переломов длинных костей конечностей сопровождается низкими значениями ростовых факторов (TGFß,, EGF) на десятые сутки после операции.

Обнаружено, что у больных с переломами длинных костей конечностей наличие генотипа -25Рго/Рго гена TGFß-25Arg>Pro и генотипа -2073Т/Т гена EGFR-207ЗА>Тсопровождается уменьшением продукции TGFß, и EGF, соответственно, а носительство генотипов -25Arg/ Arg гена TGFß,-25Arg>Pro и генотипа -2073А/А генаEGFR-2073A>T,

напротив, сопровождается увеличением продукции кодируемых ростовых факторов (TGFfS,, EGF).

Теоретическая и практическая ценность работы.

Результаты исследований могут бьггь полезными для расширения сведений о патогенезе нарушения консолидации у больных с переломами длинных костей конечностей. Носительство аллеля -25Рго- и генотипа -25Рго/Рго гена TGFp~25Arg>Pro, а также аллеля -2073Т- и генотипа -2073Т/Т гена EGFR-2О73А>Тявляется фактором риска нарушения консолидации в позднем периоде травмы, что может позволить своевременно проводить превентивные лечебно-профилактические мероприятия пациентам, тем самым предотвращать развитие данного осложнения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наличие аллели -25Рго- и генотипа -25Рго/Рго гена TGF/3-25Arg>Pro, а также аллели -2073Т- и генотипа -2073Т/Т гена EGFR-2073А>Т ассоциировано с нарушением консолидации переломов длинных костей конечностей.

2. У больных с переломами длинных костей конечностей наличие генотипа -25Рго/Рго гена TGFp~25Arg>Pro и генотипа-2073Т/Т гена EGFR-20 73A>Тсопровождается уменьшением продукции TGFp, и EGF. Прогностическими факторами развития замедленной консолидации является носительство генотипа-25Рго/Рго гена TGFp-25Arg>Pro и генотипа -2073Т/Т гена EGFR-2073A>T, а также низкие значения содержания ростовых факторов (TGFPp EGF) на 10 сутки посттравматического периода.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в травматологическом отделении и клинико-диагностической лаборатории ГУЗ "Городская клиническая больница №1", г. Чита. Материалы диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедры патологической физиологии, травматологии и ортопедии ГБОУ ВПО "Читинской государственной медицинской академии".

Апробация работы. Материалы исследований доложены на II Китайско-Российском конгрессе "Травматология, ортопедия и восстановительная медицина третьего тысячелетия" (Маньчжурия (КНР), 2011), I конгрессе стран Шанхайской организации сотрудничества "Травматология, ортопедия и восстановительная медицина третьего тысячелетия" (Маньчжурия (КНР), 2013), Межрегиональной научно-практической конференции "Реабилитация хирургических больных в условиях

модернизации отечественного и регионального здравоохранения (Да-расун, 2013), III Съезде травматологов-ортопедов Сибирского федерального округа (Горно-Алтайск, 20И), заседании научно-практического общества травматологов-ортопедов Забайкалья (Чита, 2013,2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ: из них 4 статьи в ведущих рецензируемых журналах, определённых ВАК; 1 учебное пособие для последипломного образования.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит 117 страниц машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы (115 отечественных и 101 зарубежных источников). Работа иллюстрирована 30 таблицами и 4 рисунками.

Диссертационная работа выполнена по плану НИР ГБОУ ВПО "ЧГМА" Минздрава России (номер государственной регистрации 01201152870).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki 1964, 2011 - поправки) и "Правилами клинической практики в Российской Федерации", утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003г. № 266. Данное диссертационное исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО "ЧГМА" от 09.11.2012г. протокол № 44.

Нами обследовано 108 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с переломами длинных костей конечностей, лечившихся в травматологических стационарах г. Читы. Пациенты распределены на следующие группы: I группа представлена 62 больными с неосложнённым течением переломов длинных костей конечностей (группа клинического сравнения). II группа - больные с нарушением консолидации (п=46) (в данной группе отмечалось заживление ран первичным натяжением, однако в позднем послеоперационном периоде зарегистрировано нарушение консолидации переломов по типу замедленной консолидации). Контрольную группу составили 100 практически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 20 до 40 лет. Критерием исключения из групп являлось наличие острых или хронических сопугствующих заболеваний.

В процессе исследования, нами не выявлена статистическая значимость различий исследуемых параметров в группах не только в за-

висимости от уровня повреждения, характера травмы (открытый, закрытый перелом), но и вида остеосинтеза. Вследствие вышесказанного, больные с закрытыми и открытыми переломами длинных костей нижних конечностей, а также с различным уровнем повреждения и видом остеосинтеза объединялись в одну группу (в зависимости от развившегося осложнения).

Лечение пациентов осуществлялось в соответствии стандартам оказания медицинской помощи при переломах длинных костей конечностей и национальным руководствам по травматологии и ортопедии (2008,2011).

Клиническое исследование. Важным моментом в лечении переломов длинных костей конечностей являлось прогнозирование осложнений. С этой целью в послеоперационном периоде учитывали динамику клинических симптомов - боли в ране, общее состояние больного, повышение температуры тела, местные критерии заживления (гиперемия кожи, отёчность и инфильтрация тканей в области раны, характер раневого отделяемого). Сроки наблюдения за больными составили: при поступлении в стационар (1 сутки после травмы), 2, 10 сутки после оперативного лечения, в дальнейшем через 3 месяца.

Лабораторные методы исследования. 1. Микробиологические методы: а) Определение микробной обсеменённости экспресс-методом. Техника экстренного определения численности бактерий в 1 г ткани определялась по методу Ю.К. Абаева (2006). 2. Иммунологические исследования: а) Определение цитокинов. Для выявления концентрации цитокинов (TNF-a, 1L-4, IL-10, TGFß,, EGF) использовали наборы реагентов ЗАО "Вектор-Бест" (г. Новосибирск), методом твердофазного иммуноферментного анализа. 3. Генетические исследования. Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической крови поступивших больных. Для исследования выбраны точечные мутации TNF-a в позиции 308 (G>A), IL-4 в позиции 589 (С>Т), IL-10 в позиции 1082 (G>A), 592 (ОА) и 819 (С>Т), TGFß, в позиции 25 (Arg>Pro) и EGFR в позиции 2073 (А>Т). Амплификацию фрагментов генов TNF-a, IL -4, ILIO, TGFßt и EGFR проводили в термоцикле (модель Ре "Бис" - М111 (ООО "Бис-Н", Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров НПФ "Литех''-''SNP" (Москва).

Инструментальные методы исследования. 1. Рентгенологический. Рентгенологическое исследование повреждённого сегмента конечности пациентам выполняли в двух стандартных проекциях с зах-

ватом смежных суставов до операции, после оперативного лечения, через 1 и 3 месяца.

Способы статистической обработки полученных результатов. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ "STATISTICA 6.1®" (StatSoft, USA), "MicrosoftOfficeExell 2010 for Windows 7©", "БИОСТЛТ". Для описания характера распределения количественных признаков определялись средние величины (М), стандартные отклонения (SD). Для сравнения показателей пациентов с осложнённым и неосложнённым течением переломов длинных косгей конечностей использовали критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Для анализа групп по качественному бинарному признаку применялся критерий х2 (Пирсона). Для оценки ассоциаций аллелей генотипов с развитием замедленной консолидации рассчитывали относительный риск (OR). Предсказание значений ряда зависимых переменных по известным значениям других переменных осуществлялось с помощью множественного регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма генов цитокинов у больных с переломами

длинных костей конечностей в Забайкальском крае Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов генов TNFa-308G>A, IL4-589C>T, IL10-5920A, IL10-8190Т. 1L10-I082G>A TGFß,-25Arg>Pro и EGFR-20 73A>Tпри переломах длинных костей конечностей представлено в таблицах 1 и 2.

Изучая частоту носительства различных генотипов и гллелей полиморфизма генов TNFa-308G>A, IL4-5890T, IL10-5'92C>A, 1L10-819С>Т, IL10-1082G>A, нами не отмечено достоверных различий в исследуемых группах, что может свидетельствовать об отсутствии их роли в развитии нарушения консолидации (Мироманов A.M. и соавт., 2013,2014).

Определяя частоту встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма генов TGFß-25Arg>Pro и EGFR-2073A>Tу пациентов с нео-сложненным течением переломов длинных костей конечностей н нарушением консолидации в Забайкальском крае выявлены достоверные отличия. В частности, в группе с неосложненным течением зафиксировано преобладание генотипа -25Arg/Arg гена TGFßr тогда как в груп-

пе с нарушением консолидации -25 Arg/Pro гена TGFßr Частота алле-ля -27Рго- гена TGFß1 более чем в 2 раза чаще обнаруживалась у пациентов с замедленной консолидацией. Данный факт говорит о высоком риске развития нарушения консолидации у носителей аллеля -27Рго-гена TGFßI и генотипа -25Pro/Pro гена TGFßl (Мироманов A.M. и со-авт., 2014).

Таблица 1

Распределение генотипов генов TNFa-308G>A, IL4-589C>T, IL10-5920A, IL10-819C>T,IL10-1082G>A, TGFßr25Arg>Pro и EGFR-2073A>Tсреди резидентов Забайкальского края

Генотип Группа кштроля (н=100) Группа I (n=62) Группа П (n=46) OR [95% CI] I и II группы

-308G/G гена TNFa 0,71 0,742 0,739 0,99 [0,41-2,35]

-308САгена TNFa 0,23 0,258 0,239 0,9 [0,37-2,19]

-308А/Агена TNFa 0,06 - 0,022 4,12 [0,16-103,5]

-589С/С гена ZW 0,73 0,758 0,717 0,81 [0,34-1,93]

-589С/Т гена IIA 0,25 0,226 0,261 1,21 [0,5-2,94]

-589Т/Г гена IIA 0,02 0,016 0,022 1,36 [0,08-22,26]

-592С/С гена IU0 0,81 0,661* 0,761 1,63 [0,69-3,84]

-592С/А гена IU0 0,19 0,339* 0,217 0,54 [0,23-1,3]

-592А/А гена ILIO - - 0,022 4,12 [0,16-103,5]

-819С/С гена ILIO 0,73 0,597 0,674 1,4 [0,63-3,1]

-819С/Т гена 7L/0 0,27 0,403 0,304 0,65 [0,29-1,45]

-819T/Treua IIАО - - 0,022 4,12 [0,16-103,5]

- 1082G/G гена ILIO 0,75 0,710 0,739 1,16 [0,49-2,73]

-I082G/A гена ILIO 0,25 0,274 0,239 0,83 [0,35-2,0]

-1082A/Arena/L70 - 0,016 0,022 1,36 [0,08-22,26]

-25Arg>Arg гена TGFß, 0,6 0,58 0,28*/** 0,28 [0,13-0,64]

-25Aig>Pro гена TGFß, 0,28 0,37 0,2*/** 0,41 [0,17-1,01]

-25Рго>Рш гена 'TGFß, 0,12 0,05 0,52*/** 21,45 [5,87-78,43]

-2073A>A гена F.GFR 0,29 0,306 0,13*/** 0,34 [0,12-0,94]

-2073A>T гена EGFR 0,63 0,597 0,37*/** 0,4 [0,18-0,87]

-20731>T гена EGFR 0,08 0,097 0,5*/** 9,33 [3,36-25,92]

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с группой неосложнёшюго течения переломов.

Таблица 2

Частота аллельных вариантов генов ТМРа-308С>А, 1Ь4-589С>Т, 1Ы0-592С>А, 1Ы0-819ОТ, 1Ы0-Ю82О>А, ТСРрг25АгЯ>Рго и ЕОРЯ-2()73А>Тсреди резидентов Забайкальского края

Генотип Группа контроля (n=100) Группа I (n=62) Группа II (n=46) OR [95% CI] I и II группы

-308G- гена TNFa 0,825 0,871 0,859 0,9 [0,41-1,98]

-308А- гена TNFa 0,175 0,129 0,141 1,11 [0,51-2,44]

-589С- гена ПА 0,855 0,871 0,848 0,83 [0,38-1,79]

-589Т- гена1L4 0,145 0,129 0,152 1,21 [0,56-2,63]

-592С- гена ILIO 0,905 0,831 0,87 1,36 [0,63-2,93]

-592А- гена ILIO 0,095 0,169* 0,13 0,74 [0,56-2,63]

-8I9C- гена ILIO 0,865 0,798 0,826 1,2 [0,6-2,4]

-819Т- кил ILIO 0,135 0,202 0,174 0,83 [0,42-1,67]

-1082G- rem ILIO 0,875 0,847 0,859 1,1 [0,51-2,36]

-10S2A- гена ILIO 0,125 0,153 0,141 0,91 [0,42-1,95]

-25Arg- гена TGFß, 0,74 0,77 0,38*/** 0,19 [0,1-0,34]

-25Pro- гена TGFß, 0,26 0,23 0,62*/** 5,33 [2,95-9,64]

-2073A- гена EGFR 0,605 0,605 0,315*/** 0,3 [0,17-0,53]

-2073T- гена EGFR 0,395 0,395 0,685*/** 3,33 [1,88-5,87]

Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с группой неосложнённого течения переломов.

Анализируя частоты распределения генотипа полиморфизма гена EGFR-207ЗА>Ту пациентов в исследуемых группах выявлено значительное преобладание гетерозиготного варианта в группе с замедленной консолидацией (генотип -2073А/Т гена EGFR регистрировался более чем в 59% случаев, в то время как в группе клинического сравнения менее чем в 10%). Рассматривая частоту встречаемости аллелей гена EGFR-2073A>Т, отмечено,'что аллель -2073Т- достоверно (р=0,0001) чаще встречалась у пациентов с замедленной консолидацией, что, также позволяет нам говорить о положительной ассоциации (высоком риске) носительства аллеля -2073Т- гена EGFR и генотипа -2 0 73 Т/Т гена EGFR с нарушением регенерации костной ткани (Миро-манов A.M. и соавт., 2014).

Содержание цитокиное у пациентов с переломами длинных костей конечностей

Прежде чем определить влияние генотипов исследуемых полиморфизмов генов цитокинов на экспрессию кодируемых белков, нами проведено изучение общего содержания цитокиное в рассматриваемых группах на 10-е сутки после травмы (рис. 1). Выявлено, что количественные показатели про- и противовоспалительных цитокинов у пациентов с нео-сложненным течением и у пациентов с нарушением консолидации, а именно TNF-a, IL-4 и 1L-10 превышали аналогичные значения в контрольной группе в 1,3 - 1,9 раза, что является закономерным и говорит о сохранении воспалительного ответа в зоне повреждения вследствие продолжающихся регенераторных процессов в костной ткани. Однако показатели ростовых факторов -TGF-Pj и EGF у пациентов с нарушением консолидации регистрировались в 1,4 раза ниже по сопоставлению с группой клинического сравнения, что подтверждает ведущую роль исследуемых белков в процессах регенерации тканей и свидетельствует о нарушении консолидации перелома (Мироманов A.M. исоавт., 2013,2014).

TNFa IL-4 IL-10 TGFP1 EGF

□ контроль 14,6 38 35,5 74,4 69,4

Е01 группа 24,18 49,1 67,6 121,2 113,9

91! группа 24,7 50,5 66,4 92,1 82,2 i

Рис. 1. Содержание некоторых цитокинов у больных с переломами длинных костей конечностей на 10-е сутки после травмы, пг/мл (М±8В). Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** - статистическая значимость различий с группой клинического сравнения.

Влияние генотипов исследуемых полиморфизмов генов цитокинов на экспрессию кодируемых белков

Нами определено влияние полиморфизмов генов ТМРа-308С>А, И4-589С>Т, Л10-5920А, И10-819С>Т, 1110-10820А, ТС,рр г25Аг&>Рго и ЕСРЯ.-20 7ЗА> Тна уровень продукции кодируемых цитокинов.

Анализируя влияние полиморфизма гена Т№а-308Ст>А на уровень продукции ТОТ-сх выявлено, что наличие генотипа -308С/А и генотипа -308 А/А полиморфизма гена ШРа-3080>А способствует более высокой экспрессии цитокинаТМР-а при переломах длинных костей конечностей (рис. 2).

О контроль ПН группа Л I! группа

Рис. 2. Содержание Т№-а на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена ТМРа-3080>А. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; **-статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Напротив, наличие генотипа -589С/Т и генотипа -589Т/Т полиморфизма гена 1Ь4-589С>Ту пациентов с переломами трубчатых костей значимо снижает экспрессию 1Ь-4 (рис. 3).

пг/м л

80

□ контроль ВI группа К II группа

Рис. 3. Содержание 1Ь-4 на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена И-4-589С>Т. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Изучая влияние полиморфизма гена IL10-592С>А на уровень продукции кодируемого цитокина выяштено, что в группе контроля у людей с носительством генотипа -592С/А гена ILIO отмечается снижение концентрации IL-1 0 в 1,8 раза, чем у носителей генотипа -592С/С. В группе с неосложненным течением переломов, у обладателей генотипа -592С/С гена ILIO, на 10 сутки после полученной травмы, регистрируется повышение концентрации IL-10 до 74,34±14,29 пг/мл, что в 2,5 раза выше, относительно группы контроля (р<0,001). У носителей гетерозиготного варианта -592С/А содержание 1L-10 в крови составило 50,32±13,63 пг/мл, что в 1,7 раза выше, чем в группе контроля. Носи-тельство мутантных гомозиготных вариантов генотипа -592А/А в группе контроля и клинического сравнения не выявлено (рис. 4).

□ контроль ЮI группа ■ I! группа

Рис. 4. Содержание IL-10 на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена ILI0-592C>A. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Определяя воздействие полиморфизма гена IL10-819C>Tна синтез IL-10, обнаружено, что у пациентов с неосложненным течением переломов и с развитием замедленной консолидацией переломов, у обладателей генотипа-819С/С гена ILIO на 10 сутки посттравматического периода отмечается повышение концентрации IL-10 до 79,42± 17,58 пг/мл и 76,86±13,14 пг/мл, соответственно, что в 1,9 разавьтше, чем в группе контроля (р<0,0001) и в 1,7 и 1,6 раза, соответственно, выше по сопоставлению с аналогичными значениями носителей генотипа -819С/Т. Генотип -819Т/Т гена ILIO выявлен в одном случае только в группе с осложненным течением (рис. 5).

80

пг/мл

60

40

20

С/С

С/А

А/А

с/с с/т тд

Рис. 5. Содержание IL-10 на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена IL10-819C>T. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Изучая влияние полиморфизма гена IL10-10820A наэкспрессию противовоспалительного IL-10, выявлено, что у пациентов с неослож-нённым течением переломов и нарушением консолидации переломов длинных костей конечностей, отмечается значимое повышение концентрации IL-10 при носительстве генотипа-1082G/G гена ILIO по сравнению с группой контроля (р<0,0001). Приданном генотипе, концентрация 1L-10 превышала аналогичные значения группы контроля в 1,9 раза, и в 1,7 раза по сопоставлению с генотипом -1082G/A. Уровень цитокинов, выявленный у пациентов с замедленной консолидацией переломов в зависимости от генагипа исследуемого полиморфизма не отличался от аналогичных значений группы клинического сравнения (рис. 6).

_____________б/а а/а

Рис. 6. Содержание ^-10 на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена К10-Ю82С>А. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Таким образом, генотипы -592С/С, -819С/С и -1082G/G полиморфизма гена IL10 способствует значимому повышению экспрессии противовоспалительного IL-10 в крови больных с переломами костей конечностей (Мироманов A.M. и соавт., 2013).

Анализируя влияние полиморфизма гена TGFfi-25Arg>Pro на уровень продукции TGF-p, выявлено, что наличие генотипа -25Рго/Рго полиморфизма гена TGFpr25Arg>Pro способствует значимому снижению экспрессии цитокина TGF-B, при переломах длинных костей конечностей (рис. 7), (Мироманов A.M. и соавт., 2014).

Arg/Arg Arg/Pro Pro/Pro

Рис. 7. Содержание TGF-pS, на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена TGFp,-25Arg>Pro. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Аналогичные данные получены при определении влияния полиморфизма гена EGFR-20 73A>Tна содержание цитокина EGF, т.е. наличие генотипа -2073Т/Т полиморфизма гена EGFR-20 73A>Tу пациентов с переломами костей конечностей значимо снижает экспрессию EGF (рис. 8), (Мироманов A.M. и соавт., 2014).

Таким образом, наличие генотипа-25Рго/Рго полиморфизма гена TGFp-25Arg>Pro и генотипа -2073Т/Т полиморфизма гена EGFR-2073А>Т способствует значимому снижению экспрессии цитокина TGFP, и EGF, соответственно, что в свою очередь приводит к дисбалансу процессов ремоделирования костной ткани и нарушению консолидации переломов (Мироманов A.M. и соавт., 2014).

пг/мл

□ контроль ВI группа ■ II группа

Рис. 8. Содержание EGF на 10-е сутки в крови у травмированных больных в зависимости от генотипа полиморфизма гена EGFR-2073A>T. Примечание: * - статистическая значимость различий с контролем; ** -статистическая значимость различий с нормальной гомозиготой; # - статистическая значимость различий с гетерозиготой (достоверно при р<0,05).

Регрессионная многофакторная модель нарушения консолидации при переломах длинных костей конечностей

В настоящее время общепринятыми критериями определения нарушения консолидации переломов являются данные рентгенологических методов исследования. Как правило, существующие классификации нарушений консолидации содержат исключительно клинические и рентгенологические критерии, часть из которых носит субъективный характер, тем самым затрудняя объективную оценку течения регенераторных процессов костной ткани (Мироманов A.M., 2013). В связи с вышесказанным, определенный интерес представляет поиск персонализированных критериев для объективной оценки развития замедленной консолидации переломов (Мироманов A.M. и соавт., 2014).

Мы изучили связь данных анамнеза, клинических показателей, результатов лабораторного и инструментального обследования с помощью регрессионной модели, включающей показатели, выявленные у больных с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и нарушением консолидации.

Результаты данного многофакторного пошагового регрессионного анализа показали, что наиболее близко связанным с нарушением консолидации переломов длинных костей конечностей у пациентов оказалось выявление ростового фактора EGF (шаг 1). Точность предсказания увеличивалась при добавлении данных о гомозиготной мутации гена EGFR-2073А>Т(шаг 2), генотипа -819С/Т гена ILIO (шаг 3), генотипа -25Рго/ Pro гена TGFßf (шаг 4) и содержания ростового фактора TGF-ß] (шаг 5).

При добавлении других показателей в дополнение к уже отобранным, нарастания значимой прогностической мощности не огмечалось (табл. 3).

Таблица 3

Прогностическое значение показателей в многофакторной модели нарушения консолидации переломов

N=108 *БЬТА Ст. Ош. БЕЛА В Ст. Ош В **р-уров.

Св. член 1,773661 0,160379 0,000000

EGF -0,72073 0,141376 -0,012546 0,002461 0,000002

-2073Т/Т гена EGFR 0,26659 0,119671 0,186686 0,083801 0,028095

-819СЛ' гена ILI0 -0,36038 0,087372 -0,353562 0,085720 0,000076

-25Рго/Рго гена TGFp. 0,44181 0,132626 0,268468 0,080590 0,001205

TGFp, 0,33897 0,138417 0,004937 0,002016 0,016035

Примечание: beta - регрессионный коэффициент; **р - уровень статистической значимости (достоверен при р<0,05).

При анализе прогностической модели, полученной в результате проведенного многофакторного регрессионного анализа, значение множественного коэффициента корреляции составило 0,767, что говорит о значительной линейной зависимости между факторами влияния и откликом (нарушением консолидации). Коэффициент детерминации (R-квад-рат) - 0,6, данный факт свидетельствует о высокой степени соответствия регрессионной модели эмпирическим данным. Уровень значимости регрессионной модели р<0,0000001, что еще раз подтверждает ее высокую чувствительность и достоверность (Михалевич И.М., 2012).

Концеотрация EGF явилась наиболее значимым критерием в диагностике развития замедленной консолидации при переломах длинных костей конечностей, (вероятность положительного результата прогноза - чувствительность, составила 86,96%, вероятность отрицательного прогноза - специфичность - 90,32%, относительная частота принятия безошибочных решений - безошибочность - 88,89%, а ложноотрицательный и ложнополо-жительный ответ составили 13,04 и 9,68% соответственно).

Однако и при выявлении генотипа -2073Т/Т гена EGFR отмечается повышение риска развития замедленной консолидации в 27 раз (чувствительность - 87%, специфичность - 90,3%, безошибочность - 88,9%); генотипа -25Рго/Рго гена TGFPl - в 44 раза (чувствительность - 71,4%, специфичность - 95,2%, безошибочность - 85,2%); а при сниженном

содержании ростового фактора TGFß,, риск развития осложнения увеличивается в 34 раза (чувствительность - 71,4%, специфичность -95,16%, безошибочность - 85,19%). Напротив, более редкое выявление генотипа -819С/Т гена ILIO в группе с нарушением консолидации переломов и более частое в группе клинического сравнения указывает на возможный вклад данного генотипа в индивидуальные различия больных по характеру течения данной патологии и эффективности механизмов про-тективного иммунитета (чувствительность - 69,6%, специфичность - 90,3%, безошибочность - 81,5%), (Мироманов A.M. и соавт., 2013).

Таким образом, высокую прогностическую ценность имеет определение ростового фактора EGF, полиморфизма геновEGFR-20 73A>T, IL 10-819С>Т, TGFß-25Arg>Pro и содержание ростового фактора TGF-ß .

Вследствие вышесказанного, определение ростового фактора EGF и TGF-ß! на 10 сутки посттравматического периода, а также выявление полиморфизма геновEGFR-207ЗА>Т, IL10-819C>T, TGFß-25Arg>Pro при переломах длинных трубчатых костей может использоваться в диагностическом процессе с целью прогнозирования нарушения консолидации.

Учитывая полученные результаты, мы предлагаем модифицированную схему некоторых патогенетических механизмов нарушения консолидации переломов длинных костей (рис. 1).

Рис. 9. Схема некоторых патогенетических механизмов нарушения консолидации переломов длинных костей конечностей.

Исследование полиморфных молекул цитокинов дает возможность осуществить долгосрочный индивидуальный прогноз для конкретного

лица и позволит при необходимости выполнить профилактические мероприятия для предотвращения развития данного осложнения.

Полученные результаты могут широко использоваться не только в работе научно-исследовательских институтов, занимающихся проблемой персонализированной медицины, но и в практике врачей травматологов-ортопедов для прогнозирования и предупреждения развития данной патологии. Предлагаемый методический подход также может быть применён в качестве дополнительного критерия ранней диагностики нарушений консолидации при переломах.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей распределение частот аллелей и генотипов генов ТЫЕа-3080А, 1Ь4-589С>Т, 1110-5920А, 1Ы0-819С>Т, И10-10820А не отличалось от группы с развитием замедленной консолидации переломов.

2. У больных с нарушением консолидации переломов частота аллели -25Рго-гена ТСГР, и аллели -2073Т- гена ЕвЕЯ повышена в 2,7 и 1,7 раза, соответственно, по сравнению с группой неосложнённого течения, одновременно с этим регистрируется более высокое носительство генотипа -25Рго/Рго гена ТОЕр1 и генотипа-2073Т/Т тыглЕОЕН Напротив, носительство генотипов -25А^/Аг& -25Аг^Рго гена ТОТ/?, и генотипов -2073А/А, -2073А/Т гена ЕОЕЯ встречается чаще в группе с неосложненным течением переломов в 2,1,1,9 и 2,4,1,6 раза, соответственно.

3. Наличие генотипа -25Рго/Рго гена ТОЕр1 сопровождается уменьшением продукции ТвРр,, а носительство генотипа -2073Т/Т рецептора гена ЕОЕК- уменьшением продукции ЕОР.

4. Предрасполагающими факторами нарушения консолидации переломов длинных костей конечностей являются генотипы -25Рго/Рго гена ТСЕр1 и -2073Т/Т рецептора гена а также низкий уровень ростовых факторов (ТвРр,, ЕСР) на 10 сутки посттравматического периода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для доклинической диагностики нарушений консолидации переломов длинных костей конечностей необходимо определять содержание ростовых факторов (ЕСР/ГО!^) в сыворотке крови на 10-е сутки после травмы (операции) и при значении ЕОР=82,22±18,4 пг/мл и ТОРр =92,07±31,2 прогнозируется возможность развития замедленной консолидации.

2. С целью прогнозирования нарушений консолидации у больных с переломами необходимо выявлять распределение генотипов полиморфизма генов TGFß-25Arg>Pro и EGFR-20 73 С> Т и при выявлении генотипа -25Рго/Рго и генотипа -2073Т/Т проводить превентивные профилактические мероприятия, направленные на предупреждение нарушения консолидации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах, определенных ВАК Мннобрнауки России (4 статьи):

1. Полиморфизм гена интерлейкина-4 у больных с осложненным течением переломов длинных костей конечностей / A.M. Ми-романов, О.Б. Миронова, С.А. Усков, М.В. Трубицын, К.А. Гусев // Врач-аспирант. - 2013. - № 5.3 (60). - С. 434-440.

2. Полиморфизм гена интерленкина-10 (G-1082A, С-592А, С-819Т) у пациентов с неосложненным н осложненным течением переломов длинных костей конечностей [Электронный ресурс] / A.M. Мироманов, М.В. Трубицын, К.А. Гусев |и др.] // Забайкальский мед. вестн. - 2013. - № 2. - С. 59-65. - Режим доступа: http://chitgma.ru/zmv2 (3 июля 2014).

3. Полиморфизм гена ИЛ-4 (С 589Т) у больных с нарушением консолидации переломов в Забайкальском крае [Электронный ресурс] /К.А. Гусев [и др.]//Забайкальский мед. вестн. -2014. -JY» 1.-С. 64-68. - Режим доступа: http://chitgma.ru/zmv2 (5 сентября 2014).

4. Мироманов, A.M. Полиморфизм гена TGFß! (Arg25Pro) и гена EGF (А2073Т) у больных с нарушением консолидации переломов в Забайкальском крае / A.M. Мироманов, К.А. Гусев, С.А. Усков// Фундаментальные исследования. - 2014. - № 10. - 4.7. - С. 1360-1364.

Публикации в прочих изданиях:

5. Мироманов, A.M. Способ прогнозирования нарушения регенерации костной ткани при переломах длинных трубчатых костей нижних конечностей /' A.M. Мироманов, С.А. Усков, К.А. Гусев // Травматология, ортопедия и восстановительная медицина третьего тысячелетия : материалы второго Китайско-Российского конгр., Чита-Маньчжурия, 22-26 мая 2011 г. - Чита, 2011. - С. 55-56.

6. Гусев, К.А. Некоторые эпидемиологические особенности нарушений консолидации переломов длинных костей конечностей у больных со стой-

кой утратой трудоспособности / К.А. Гусев, A.M. Мироманов // Реабилитация хирургических больных в условиях модернизации отечественного и регионального здравоохранения: тр. межрег. иауч.-практ. конф., Чита, 6 сентября 2013 г. - Чита : Экспресс-издательство, 2013. - С. 73 -74.

7. Трубицын, М.В. Полиморфизм гена ИЛ-10 (G-1082A, С-592А, С-819Т) у больных при переломах костей конечностей / М.В. Трубицын, К.А. Гусев, A.M. Мироманов // III съезд травматологов-ортопедов Сибирского федерального округа : материалы съезда, Горно-Алтайск, 22 августа 2014 г./ под ред. В.А. Пелеганчука, М.А. Садового. - Горно-Алтайск : Новосибирский академический центр человека, 2014.-С. 338-343.

Учебное пособие:

8. Мироманов, A.M. Нарушение консолидации переломов длинных костей конечностей : учебное пособие / A.M. Мироманов, С.А. Ус-ков, К.А. Гусев // Чита: РИЦ ЧГМА, 2012. - 71 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БИМОС - блокируемый интрамедуллярный остеосинтез

мое - металлоостеосинтез

мпк - минеральная плотность кости

ОДА - опорно-двигательный аппарат

ПХО - первичная хирургическая обработка

CD - кластер дифференцировочных антигенов

Ig - иммуноглобулины

IL - интерлейкин

ММР - металлопротеиназа

OR - относительный риск

Pg - простогландин

SD - стандартное отклонение

TGF - трансформирующий фактор роста

TNF - фактор некроза опухолей

EGF - эпидермальный фактор роста

EGFR - рецептор энидермального фактора роста

RANK - рецептор нуклеотидного фактора каппа

RANKL - белок из семейства TNF, повышающий резорбирующую

активность остеокластов

SARS - тяжелый острый респираторный синдром

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 20.02.2015. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 Чк. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 27/2015.

Отпечатано в редакционно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.