Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Исследование возможности индукции экстратимической дифференцировки αβТ-лимфоцитов при беременности

На правах рукописи

005053878

ГЛЕБЕЗДИНА Наталья Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИНДУКЦИИ ЭКСТРАТИМИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ арТ-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ОПТ 2012

Екатеринбург - 2012

005053878

Работа выполнена в лаборатории иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научный руководитель:

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент, руководитель отделения иммунологии и микробиологии Екатеринбургского НИИ охраны материнства и младенчества

Доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии, с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Пермской государственной фармацевтической академии

Ведущая организация: ФГБУ "Главный научный центр Институт иммунологии" ФМБА России, г. Москва

Защита состоится «09» ноября 2012 г. в 11-30 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 004.027.01 при ФГБУН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, Российская Федерация,

г. Екатеринбург, ул. Первомайская, 106.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул. С.Ковалевской, д. 22/20).

Автореферат разослан « ¿¿Г» с/сю.с^,2012 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертации при ФГБУН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН,

д.м.н., проф. И.А. Тузанкина

Куклина Елена Михайловна

Чистякова Гузель Нуховна

Юшков Владимир Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно традиционным представлениям, основные этапы созревания и дифференцировки сфТ-лимфоцитов осуществляются в тимусе. В процессе тимического развития Т-клеточные предшественники формируют антигенспецифичный рецептор (Т Cell Receptor, TCR) и проходят процессы клональной селекции, обеспечивающие элиминацию аутореактивных клонов (Ярилин А.А. и др., 1991; Fehling Н. J., von Boehmer Н., 1997). В результате зрелые Т-лимфоциты, выходящие на периферию, способны эффективно выполнять функции иммунного надзора, а именно - распознавать и обеспечивать уничтожение чужеродных антигенов, не повреждая при этом собственных тканей.

Известно, что при некоторых физиологических и патологических состояниях, сопровождаемых атрофией тимуса, в организме активируется альтернативный путь дифференцировки - экстратимический, который затрагивает не только у5Т-лимфоциты, традиционно созревающие вне тимуса (Robey Е.А., Fowlkes B.J., 1998; Mincheva-Nilsson L. et al., 1997), но и сфТ-клетки (Rocha В. et al., 1995; Ibraghimov et al., 1995). Такой компенсаторный механизм имеет место при стрессе (Shimizu Т. et al., 2000), аутоиммунных (Seki S. et al., 1991; Abo Т., 2001) и некоторых инфекционных заболеваниях (Kadena Т. et al., 1997; Lamontagne L. et al., 1997), а также в случае возрастных изменений (Ohteki Т. et al., 1992). Логично предположить, что аналогичный механизм включается и при беременности, которая сопровождается существенной атрофией тимуса, выраженной в снижении его массы (Rijhsinghani A.G. et al., 1996) и клеточности (Rijhsinghani A.G., 1996; Shinomiya N. et al., 1991), главным образом за счет атрофии коркового слоя и истощения популяции кортикальных тимоцитов (Shinomiya N. et al., 1991). На возможность активации экстратимического развития сфТ-клеток в этот период указывает и тот факт, что отдельные факторы, ассоциированные с беременностью, в частности, онкостатин М (Boileau С. et al., 2000) или эстрогены в высокой дозе (Okuyama R., 1992), при экзогенном введении вызывают появление на периферии aPT-клеток с незрелым фенотипом (CD^CDe^ (Boileau С. et al., 2000) или с промежуточным уровнем экспрессии TCR, указывающим на их экстратимическое происхождение (Okuyama R., 1992).

Поскольку беременность, будучи феноменом естественной аллотрансплантации, требует наличия эффективных регуляторных механизмов для предупреждения возможных антифетальных иммунных реакций, и основная роль в

этом процессе отводится локальному иммунитету, при исследовании экстратимического развития Т-лимфоцитов особый интерес представляла дифференцированная оценка этих процессов в зависимости от Т-клеточной локализации: в селезенке, периферической крови, лимфатических узлах, причем отдельно - в дренирующих матку и не дренирующих.

Цель работы: исследовать наличие процессов экстратимической дифференцировки aßT-лимфоцитов при беременности у мышей, а также возможные механизмы их активации.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи:

1. Оценить возможность активации процессов дифференцировки aßT-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах и тканях при беременности у мышей.

2. Определить роль молекулы CD40 в индукции экспрессии ключевого маркера дифференцировки Т-лимфоцитов, рекомбиназы RAG-1.

3. Сопоставить реактивность периферических aßT-лимфоцитов различной локализации беременных мышей в отношении антигенов самца.

Научная новизна. Вопрос об активации экстратимического пути дифференцировки aßT-лимфоцитов при беременности до сих пор никем не рассматривался, поэтому все полученные результаты являются новыми. В частности, впервые на основе экспрессии ключевого фактора реаранжировки, рекомбиназы RAG-1, а также маркера незрелых Т-клеточных предшественников, суррогатной a-цепи TCR, показана возможность активации процессов дифференцировки в периферических aßT-клетках беременных мышей, причем, данный процесс прослежен в динамике беременности и при разных вариантах скрещивания. Впервые выявлено появление при беременности у мышей нетипичной популяции С040+Т-лимфоцитов. Впервые свойства и функции периферических Т-лимфоцитов беременных самок, в том числе их реактивность в отношении аллоантигенов самца, исследованы дифференцированно для Т-клеток различной локализации - спленоцитов, лейкоцитов, клеток разных типов лимфатических узлов.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе выявлен принципиально новый механизм регуляции иммунной системы при беременности у мышей, связанный с возможной индукцией альтернативного, экстратимического, пути дифференцировки aßT-лимфоцитов. С одной стороны, данный феномен может вносить вклад в формирование толерантности материнского организма к

чужеродному для нее (полуаллогенному) плоду - в том случае, если речь идет о развитии регуляторных Т-клеток. С другой стороны, учитывая отсутствие на периферии условий для эффективной клональной селекции, экстратимическая дифференцировка может быть причиной развития аутоиммунных патологий, которые часто провоцируются беременностью. Кроме того, согласно полученным данным, Т-лимфоциты лимфатических узлов, дренирующих матку, существенно отличаются по своим свойствам и функциям от Т-клеток других лимфатических узлов или селезенки, что указывает на необходимость новых, дифференцированных подходов к исследованию Т-клеточного звена при беременности.

Результаты работы изменяют существующие представления как о тимической дифференцировке, так и о механизмах формирования толерантности, в том числе при беременности, и найдут применение в биологии, а также в экспериментальной и практической медицине.

Положения, выносимые на защиту:

1. Физиологическая беременность сопровождается активацией экстратимической реаранжировки генов антигенного рецептора Т-лимфоцитов -ключевого события Т-клеточной дифференцировки, а также появлением на периферии незрелых Т-лимфоцитов, несущих суррогатную а-цепь TCR. Данный процесс характерен, главным образом, для лимфатических узлов, дренирующих матку. Он выявляется, начиная с середины беременности, причем, как у нелинейных животных, так и у мышей линии CBA/J при разных вариантах скрещивания, моделирующих нормальную аллогенную и нормальную сингенную беременности, а также в склонной к аборту комбинации.

2. Беременность у мышей ассоциирована с появлением в периферических лимфоидных органах Т-лимфоцитов, несущих на мембране нетипичную для них молекулу CD40. Локализация С040-позитивной Т-клеточной субпопуляции аналогична локализации ключевого фактора и маркера реаранжировки генов TCR, рекомбиназы RAG-1, т.е. ограничена в основном лимфатическими узлами, дренирующими матку, однако непосредственного участия CD40 в активации экспрессии рекомбиназы не выявлено.

3. Реактивность периферических aßT-лимфоцитов беременных самок мышей в отношении аллоантигенов самца также зависит от их локализации: Т-лимфоциты лимфатических узлов, дренирующих матку, отвечают на спленоциты самца достоверно эффективнее Т-клеток лимфоузлов других типов.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены, обсуждены на Региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2006, 2007); 16 Европейском конгрессе по иммунологии (Париж, Франция, 2006); 2 Европейском конгрессе по иммунологии (Берлин, Германия, 2009); 12 Европейском конгрессе по иммунологии (Кобе, Япония, 2010); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010); I Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011).

Основные результаты проведенных исследований представлены в 14 печатных работах, включая 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 13 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 207 наименований, среди которых 12 отечественных и 195 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на нелинейных и линейных мышах. Первый этап исследования проводился на самках мышей породы Swiss в разных стадиях беременности: на 4-5, 10-12 и 17-18 сутки (50 животных). Второй этап - на самках мышей линии CBA/J, которых скрещивали с самцами линий BALB/c, моделируя нормальную аллогенную беременность, с CBA/J - нормальную сингенную беременность, с DBA/2 - комбинацию с повышенной частотой спонтанных абортов (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004) (70 животных). Срок беременности y линейных животных составлял 9-10 суток. Первый гестационный день фиксировали по появлению вагинальной пробки. Из эксперимента животных выводили методом цервикапьной дислокации.

Наряду с этим, исследовалась периферическая кровь (лейкоциты) женщин, имеющих разные сроки беременности - I, II или III триместр (35 женщин, средний

возраст - 25,2 года). Контрольную группу составляли небеременные женщины репродуктивного возраста (10 женщин).

Объекты исследования. В работе использовали лимфоциты периферической крови, селезенки, тимуса и лимфатических узлов (отдельно дренирующих матку -парааортальных, и не дренирующих - подмышечных, мезентериальных и паховых (Chaouat et al., 1983; Lin et al., 2004)). Клетки лимфоидных органов выделяли гомогенизацией с последующим фильтрованием гомогената через капроновые сетки, лейкоциты - из гепаринизированной периферической крови (25 ед/мл) центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина («Биолот») (плотность - 1,077 г/смЗ). Для цитометрического анализа использовали нефракционированную клеточную суспензию, для оценки экспрессии мРНК -фракционированную: а именно, суспензию клеток, из которой удаляли В-лимфоциты, способные в норме реаранжировать цепи антигенного рецептора на периферии (Hikida М. et al., 1996). При этом клетки разделяли на поверхности пластика, нагруженной антителами к иммуноглобулинам мыши («Медгамал») или к В-клеточному маркеру CD 19 («Caltag»). Далее в работе такая суспензия обозначена как «Т-лимфоциты». В дополнительной серии экспериментов проводилось непосредственное выделение арТ-лимфоцитов из исходной (нефракционированной) суспензии с помощью иммуномагнитных бус («Invitrogen») в комплексе с биотинилированными моноклонапьными антителами хомяка НМ3600 или Н57-597 («Caltag») к (3-цепи офТСЛ мыши, 62,5 мкг/мл, (далее - «офТ-лимфоциты»). В этом случае из исследования наряду с В-клетками исключалась минорная популяция у5Т-лимфоцитов, традиционно дифференцирующихся вне тимуса и также способных экспрессировать маркеры реаранжировки на периферии (Mincheva-Nilsson L. etal., 1997; Robey E.A., Fowlkes B.J., 1998).

Оценка наличия процессов экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов. Процессы дифференцировки в периферических лимфоидных органах выявляли по экспрессии в Т-клетках двух факторов - рекомбиназы RAG-1 (Recombination Activating Gene 1) и суррогатной а-цепи TCR (а-цепи пре-Т-клеточного рецептора, pre-TCRa).

Первый фактор, RAG-1, - маркер реаранжировки генов TCR, ключевого события Т-клеточной дифференцировки. Он участвует во всех основных этапах реаранжировки и регистрируется только в лимфоцитах и только в момент реаранжировки генов каждой из цепей антигенного рецептора (Turka L. et al., 1991).

Второй фактор, суррогатная a-цепь TCR, - маркер незрелых aßT-клеток. В норме pre-TCRa экспрессируется субпопуляцией ранних тимических предшественников до реаранжировки a-цепи и появления на мембране полноценного TCR (Bruno L. et al., 1995). Экспрессия обоих факторов оценивалась на уровне мРНК, а для RAG-1 - и на уровне белка.

Определение экспрессии мРНК. Анализ проводили методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. В клетке оценивали наличие трех продуктов - мРНК RAG-1, pre-TCRa и ß-актина (положительный контроль на наличие мРНК в пробе). Для анализа использовали фракционированные T-ZaßT-лимфоциты периферических лимфоидных органов, а также тимоциты (положительный контроль на наличие мРНК для RAG-1 и pre-TCRa).

Выделение РНК, обратную транскрипцию и амплификацию проводили с помощью соответствующих наборов («Лаборатория Изоген»): для выделения тотальной РНК (Trizol RNA Prep 100), для обратной транскрипции (GenePak RT Core) и для амплификации (GenePak PCR Core).

В работе использовались следующие специфические праймеры и соответствующие режимы амплификации: для RAG-1 (431 bp) -5'-CATCGAGACAGTCCCTTCC-3' и 5'-CGATAGAGCCATCCCTTTC-3' (Vaitatis G.M. et al., 2003; уточнение праймеров с помощью базы данных нуклеотидных последовательностей GENBANK и программы Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi), 92°С><30 с, 60°С><30 с, 72°Сх60 с, 35 циклов; для pre-TCRa (750 bp) - 5 ' - AC ACTGCTGGTAG ATGG AAGG-3 ' и 5'-CGAGCAGAAGCAGTTTGAAGAG-3' (Corcoran L. et al., 2003), 92°Cx30 с, 52°CX30 с, 72°C*60 с, 38 циклов; для ß-актина (415 bp) 5 '-TGTTACC AACTGGG ACGAC А-3 ' и 5 '-TTTGATGTC ACGCACGATTT-3 ' (GENBANK и программа Primer3), 92оСх30 с, 60°Сх30 с, 72°Сх60 с, 30 циклов.

Электрофорез мРНК проводили стандартным методом в 1,5% геле агарозы («Serva») при напряжении 80 В. Для электрофореза использовался стандартный ТВЕ-буфер (буфер Трис (0,089 М), борная кислота (0,089 M), EDTA (0,0025 М)). Гель окрашивали бромистым этидием (концентрация - 10 мкг/мл). Документирование электрофореза осуществляли с помощью соответствующего пакета программ.

Определение экспрессии рекомбнназы RAG-1 на уровне белка.

Экспрессию белка RAG-1 в aßT-лимфоцитах оценивали проточной цитометрией по

коэкспрессии RAG-1 и aPTCR в нефракционированной клеточной суспензии с помощью соответствующих моноклональных антител к aPTCR (aPTCR-FITC («Invitrogen»)) и RAG-1 (anti-RAG-1 (H 300) («Santa Cruz Biotechnology»)) + anti-rabbit IgGPE-Cy5.5 («Invitrogen»). Внутриклеточное окрашивание RAG-1 проводили с использованием набора фиксирующего/пермеабилизирующего буферов («Biolegend») в соответствии с рекомендациями производителя. Пробы анализировали на цитометре Becton Dickinson FACS-calibur, для обработки результатов использовали программу CellQuest («Becton Dickinson»).

Оценка роли молекулы CD40 в индукции экспрессии RAG-1 в периферических ар Т-лимфоцитах. Экспрессия мембранной молекулы CD40 на периферических арт-лимфоцитах оценивалась в нефракционированной клеточной суспензии проточной цитометрией с использованием моноклональных антител: анти-aPTCR-FITC («Invitrogen») и анти-С040РЕ («Caltag»). Одновременно оценивалась экспрессия внутриклеточного белка RAG-1 - с использованием указанных выше моноклональных антител. В ряде экспериментов для разделения клеточных конгломератов выделенные клетки перед проведением цитометрического анализа инкубировали в 0,5 мМ EDTA.

Наряду с этим, в ряде экспериментов фракционированные офТ-лимфоциты инкубировали in vitro в течение 18 часов в присутствии моноклональных антител к CD40, меченых биотином («Caltag»), обеспечивая перекрестное связывание CD40 на мембране внесением в культуру стрептавидина («Caltag»). По окончании культивирования оценивали экспрессию RAG-1 в клетках.

Определение реактивности периферических арт-лимфоцитов беременных мышей в отношении антигенов самца. Оценка реактивности проводилась по пролиферативному ответу фракционированных офТ-лимфоцитов лимфатических узлов беременных самок CBA/J (2x105 на пробу) на антигены самцов соответствующих линий - CBA/J, BALB/c, DBA/2, а также небеременных самок CBA/J, в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов. При этом стимулирующие клетки (2 х 104 на пробу) предварительно обрабатывали митомицином С (25 мкг/мл). Культивирование длилось 72 часа. Результаты оценивали в тесте с МТТ (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5)-diphenyltetrazolium bromide («Sigma»)), основанном на определении количества жизнеспособных клеток в пробе (Xi et al., 2005). Индекс стимуляции определялся как отношение

соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной (Т-клетками самца) и не стимулированной проб.

Статистическая обработка. Анализ результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statistica 5.0. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализ наличия процессов дифференцировки Т-клеток в центральных и периферических лимфоидных органах нелинейных животных. Показано, что у небеременных самок мышей породы Swiss экспрессия мРНК RAG-1 выявляется в тимоцитах, но отсутствует в Т-лимфоцитах, выделенных из лимфатических узлов как дренирующих матку, так и не дренирующих (рисунок 1).

небеременные самки

RAO-1

pre-TCRo. -*■

ß-актин ►

Рисунок 1 - Экспрессия мРНК RAG-1 и pre-TCRa Т-клетками тимуса и лимфатических узлов небеременных самок мышей Swiss

Примечание: ПА - парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ - подмышечные, М - мезентериальные, П - паховые; ß-актин - положительный контроль на наличие мРНК в пробе.

Эти данные закономерны и свидетельствуют о том, что в отсутствие беременности дифференцировка aßT-лимфоцитов осуществляется только в центральных (тимус), но не в периферических лимфоидных органах.

Исследования, проведенные на мышах на ранней стадии беременности (5-е сутки), показали, что у самок экспрессия мРНК RAG-1 выявляется в тимоцитах, но отсутствует в Т-клетках лимфатических узлов (рисунок 2). В середине беременности, на 11-е сутки, экспрессия мРНК RAG-1, наряду с тимусом, регистрировалась в парааортальных лимфатических узлах (в 70% случаев), а на 17-е сутки она выявлялась уже не только в дренирующих матку (в 60% случаев), но и в

не дренирующих лимфатических узлах, в основном, подмышечных (в 60% случаев) (рисунок 2). Анализ экспрессии мРНК pre-TCRa выявил сходные закономерности (рисунок 3): отсутствие данного транскрипта в периферических Т-лимфоцитах на ранних этапах беременности и его появление, хотя и менее выраженное по сравнению с RAG-1, начиная с середины беременности - на 11-е сутки только в парааортальных лимфатических узлах (в 40% случаев), а на 17-е сутки - как в парааортальных (в 40% случаев), так и в подмышечных (в 20% случаев).

Беременные самки

Рисунок 2 - Экспрессия мРНК RAG-1 Т-клетками тимуса и лимфатических узлов мышей Swiss на разных стадиях беременности

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

pre-TCRa Р-актин _^

Рисунок 3 - Экспрессия мРНК pre-TCRa Т-клетками тимуса и лимфатических узлов мышей Swiss на разных стадиях беременности

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

Согласно приведенным выше данным, начиная с середины беременности в периферических лимфоидных органах мышей могут активироваться процессы реаранжировки генов TCR, ключевого этапа Т-клеточной дифференцировки, а

Ьеременные самкн

появление на периферии мРНК суррогатной ot-цепи TCR свидетельствует о том, что данный процесс, по крайней мере частично, связан с миграцией в лимфатические узлы тимоцитов, поскольку ни в зрелых Т-клетках, ни в костномозговых предшественниках этот маркер не экспрессируется (Bruno L. et al., 1995).

Экспрессия маркера реаранжировки генов TCR в сфТ-клетках центральных и периферических лимфоидных органов линейных животных.

Установлено, что в отличие от небеременных самок CBA/J, у которых экспрессия мРНК RAG-1 выявляется только в тимусе (рисунок 4), у беременных мышей уже на 9-е сутки гестации данный транскрипт определяется и в периферических Т-лимфоцитах - причем это характерно как для нормальной беременности (CBA/J х BALB/c, CBA/J х CBA/J), так и для склонной к аборту комбинации (CBA/J х DBA/2). Принципиальных различий между группами не выявлено: при всех вариантах скрещивания наиболее устойчиво экспрессия мРНК RAG-1 выявлялась в парааортальных лимфатических узлах (в 60-100% случаев) и, в гораздо меньшей степени, в подмышечных (-40%) и мезентериальных (-10%) (рисунок 5).

Аналогичные данные были получены и для популяции офТ-лимфоцитов, выделенных из соответствующих лимфоузлов (рисунки 4, 5), так что возможность влияния на конечный результат В-лимфоцитов или yôT-лимфоцитов, присутствующих в лимфатических узлах и в норме экспрессирующих белки RAG (Mincheva-Nilsson L. et al., 1997; Hikida M. et al., 1996), исключена.

неберемен ны e самкн CBA/J

3

RAG-1

Т-тшфоцкгы (общий п>*л)

Ê-актин Т-тшмфощтгы (общий пул)

RAG-1 -арТ-пимфоцкгы

Рисунок 4 - Экспрессия мРНК Т-/арТ-клетками тимуса и лимфатических

узлов небеременных самок СВА/Л

Примечание: ПА - парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ - подмышечные, М - мезентериальные.

Возвращаясь к результатам, полученные на мышах породы Swiss, можно сказать, что выявленные закономерности подтвердились и на линейных животных, причем, характер экспрессии мРНК RAG-1 не зависел от вариантов скрещивания. Последнее обстоятельство позволяет говорить о том, что данный процесс, несмотря на свою ограниченность, по-видимому, универсален, а также о том, что высокая частота спонтанных абортов в комбинации CBA/J х DBA/2 никак с ним не связана и имеет другие причины.

беременные самкн С В А/J

(9-е сутки беременности)

ÇCBA/J X ¿ВАШс нормальная ашгогеккая беременность

gCBA/J >с ¿СВАЯ нормальная сингенная беременность

к а

i ПА s С 1 ПА 2 с ш ПА S пм

ÇCBA/J к ÎDEAI2

склонная к аборту комбинация

RAG-1

Т-лимфоциты ~ (общий пул)

ß-актин

Т - литлф опиты (общий П/л)

RAG-1 ар Т-лимфоциты

Рисунок 5 - Экспрессия мРНК RAG-1 Т-/офТ-клетками тимуса и лимфатических узлов беременных мышей CBA/J

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 4.

Роль молекулы CD40 в активации экспрессии рекомбиназы RAG-1 периферическими арТ-лимфоцитами беременных мышей. Данные об активации экстратимической реаранжировки генов TCR при беременности подняли вопрос о том, какие факторы и механизмы участвуют в ее индукции. Наиболее вероятный кандидат на эту роль - мембранная молекула CD40: во-первых, в периферических B-лимфоцитах именно сигнал с молекулы CD40 запускает экспрессию рекомбиназ (Grewal I.S., Flavell R.A., 1998); во-вторых, у мышей линии NOD (Non Obese Diabetic), для которых характерно наличие процессов реаранжировки генов в периферических Т-лимфоцитах, до 60% периферических Т-клеток несут на мембране эту нетипичную для них молекулу (Waid D.M. et al., 2004). Поэтому следующим этапом работы было изучение экспрессии молекулы CD40 на

офТ-лимфоцитах периферических лимфоидных органов беременных мышей, а также возможного вклада данной молекулы в индукцию реаранжировки генов TCR.

Установлено, что у мышей Swiss, начиная со второй половины беременности в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку, а также, в меньшей степени, в подмышечных лимфоузлах, регистрируется нетипичная популяция сфТ-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD40 (таблица 1). Размер данной популяции небольшой, однако, отличие принципиальное: у небеременных мышей она практически не выявляется.

Таблица 1 - Экспрессия молекулы CD40 сфТ-лимфоцитами периферических лимфоидных органов и тканей беременных мышей

Периферические органы/ ткани Процент С040+-клеток в популяции сфТ-лимфоцитов

Небеременные мыши (п - 16) Беременные мыши (п = 13)

Периферическая кровь 0,42 ± 0,08 0,47 ±0,15

Селезенка 1,51 ±0,23 3,05 ± 0,42

ПА 0,87 ±0,15 5,33 ± 0,59*

ПМ 0,87 ± 0,08 3,55 ±0,46*

П 0,51 ±0,06 0,76 ± 0,08

Примечание: обозначения те же, что и на рисунке 1.

* - р < 0,05 (в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей).

Приведенные в таблице 1 данные получены для классического пула лимфоцитов (рисунок 6А, гейт Я1). Однако, для парааортальных и подмышечных лимфатических узлов, а также для селезенки беременных мышей справа от классической популяции лимфоцитов регистрировалось дополнительное клеточное облако (рисунок 6А, гейт Я2), размер которого составлял в среднем 16,4 ± 2,09 % от общего количества лимфоцитов для селезенки и 11,2 ± 1,60 % для лимфатических узлов. Анализ коэкспрессии СБ40 и сфТСЯ в этом неклассическом лимфоцитарном пуле (гейт И2) показал, что значительная часть Т-клеток несет молекулу СБ40 (рисунок 6С).

Наиболее выражен данный показатель был в парааортальных лимфатических узлах - 35,80 ± 3,31 % арТСК+С040+-клеток от общего числа офТ-лимфоцитов, и несколько ниже - в селезенке (11,90 ± 2,23%) и подмышечных лимфатических узлах (23,60 ± 3,30%).

Учитывая, что наличие арТСЯ+СЭ40+-объектов вне классического лимфоцитарного пула может быть связано с образованием конгломератов Т- и В-лимфоцитов, ряд экспериментов по оценке коэкспрессии на клетках СБ40 и

офТСЯ проводили в хелатирующих условиях (ЕЮТА) и показали, что неклассическое лимфоцитарное облако при этом существенно не изменяется и процент С040-позитивных Т-клеток в нем сохраняется на том же уровне: для парааортальных лимфоузлов размер популяции офТСЯ СГМО -клеток составлял 29,00 ± 3,92%, для подмышечных - 21,90 ± 4,64%.

Ломфатнческне узлы

Селезенка Плрааортальные

R1 И

Rl М

L.

0.78% оРтаПЛМО*

о 3,86%

aßTCR*CD40*

І

8 л

100 101 102 "103

* 2.58% ußTCR'CiMO' M to4

Л

" « L.

10,67% s 37.4% s 26.4%

nßTCR'CD40 P (L. Wo apTCR'CD40' p 8s apTCR"CD40'

tC 8 s

Рисунок 6 - Коэкспрессия aßTCR и CD40 различными субпопуляциями Т-клеток лимфатических узлов беременных мышей

Примечание: А — диаграмма распределения клеток лимфатических узлов по параметрам переднего и бокового светорассеяния, гейтом R1 выделен классический пул лимфоцитов, гейтом R2 -неклассическое облако лимфоцитов;

В - двухпараметрический график распределения клеток из классического лимфоцитарного пула (гейт R1) по уровню экспрессии aßTCR и CD40;

С - двухпараметрический график распределения клеток из неклассического облака лимфоцитов (гейт R2) по уровню экспрессии aßTCR и CD40.

Важно отметить, что экспрессия молекулы CD40 Т-лимфоцитами беременных мышей имела те же закономерности распределения, что и экспрессия рекомбиназы RAG-1 в этих клетках, как на уровне мРНК, показанное ранее, так и на уровне белка (рисунок 7): наиболее четко и воспроизводимо она выявлялась в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку.

Периферическая Селезенка Парааортальные Подмышечные Паховые

кровь лимфатические лимфатические лимфатические

узлы узлы узлы

Рисунок 7 - Экспрессия белка RAG-1 aßT-лимфоцитами периферических лимфоидиых органов и тканей мышей при беременности

Примечание: незаштрихованные столбцы - небеременные животные, заштрихованные столбцы -беременные (10-11 сутки);

* - р < 0,05 (в сопоставлении с соответствующим показателем для небеременных мышей).

Анализ экспрессии рекомбиназы RAG-1 в периферических сфТ-лимфоцитах парааортальных лимфатических узлов в зависимости от наличия или отсутствия на мембране CD40 не выявил четких закономерностей: рекомбиназа выявлялась как в арТСЯ+С040+-клетках (5,40 ± 0,81 % RAG-Г-лимфоцитов от общего числа aßTCR+CD40+-wieTOK), так и в классической, С040-негативной популяции Т-лимфоцитов (3,90 ± 0,76 % RAG-^-лимфоцитов от общего числа aßTCR+CD40"-MieTOK). Кроме того, перекрестное связывание CD40 на мембране офТ-клеток парааортальных лимфатических узлов in vitro не изменяло уровня RAG-1 -позитивных клеток в культуре (таблица 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что CD40, по-видимому, не играет ключевой роли в индукции экспрессии рекомбиназы в периферических Т-лимфоцитах.

Таблица 2 - Экспрессия белка RAG-1 фракционированными aßT-лимфоцитами парааортальных лимфатических узлов беременных самок CBA/J (CBA/J х BALB/c) в 18-часовой культуре в ответ на перекрестное связывание CD40 на мембране

Экспериментальные условия Процент RAG-1+- клеток (М ± гп)

До культивирования (п = 8) После культивирования

Без С040-зависимой активации (п = 5) На фоне С040-зависимой активации (п = 5)

Интактная культура aßT-лимфоцитов 4,11 ±0,68 3,63 ± 0,523 3,75 ±0,538

В целом, мы показали присутствие при беременности в периферических лимфоидных органах мышей необычной популяции С040-позитивных Т-лимфоцитов, которая по своей преимущественной локализации (в парааортальных лимфатических узлах, дренирующих матку) совпадает с экспрессией рекомбиназы 11АС-1. Тем не менее, отсутствие прямой связи между экспрессией белка ЯАС-1 и наличием на мембране СБ40 при их оценке на уровне одной клеточной системы свидетельствует о том, что С040-зависимый сигнал, по-видимому, не играет ключевой роли в индукции рекомбиназы.

Экспрессия ЯАС-1 и С040 офТ-лимфоцитами периферической крови человека при беременности. Проведен анализ экспрессии ЯАС-1 и СБ40 в отношении Т-клеток периферической крови беременных женщин, находящихся на разных сроках гестации. Исследования не выявили значимой экспрессии молекулы С040 арТ-лимфоцитами женщин, независимо от срока беременности (I, II или III триместры) - во всех случаях популяция С040-позитивных клеток не превышала 1% от общего количества арТ-лимфоцитов, как и у небеременных (таблица 3).

Таблица 3 - Экспрессия С040 и ЯАв-1 арТ-лимфоцитами периферической крови беременных женщин

Показатели Небеременные женщины Беременные женщины, срок беременности

I триместр II триместр III триместр

Процент aßTCR+ CD40+-клеток от общего количества сфТ-лимфоцитов, М±т 0,47 ±0,061 («=10) 0,48 ± 0,036 (и = 8) 0,33 ± 0,048 (и = 5) 0,19 ±0,011 ("=12)

Процент aßTCR+ RAG-1+-клеток от общего количества aßT-лимфоцитов, М ± m 0,65 ±0,13 («=10) - 0,56 ±0,17 (и = 4) 1,42 ±0,358 (и = 9)

Одновременная оценка экспрессии Т-лимфоцитами рекомбиназы ЯАС-1 показала аналогичные результаты: размер арТСЯ+ЯАО-1+-популяции даже в III триместре не превышал 1,5% (таблица 3).

Эти результаты согласуются с приведенными выше данными для мышей, у которых, несмотря на появление С040+Т-лимфоцитов в лимфатических узлах и селезенке на поздних сроках беременности, в периферической крови заметных изменений не регистрировалось, что свидетельствует о локальном характере данного процесса.

Оценка реактивности периферических сфТ-лимфоцитов беременных самок в отношении антигенов самца. Процесс реаранжировки генов ТСЛ на периферии теоретически должен сопровождаться формированием нового антигенного рецептора или изменением специфичности уже существующего (Куклина Е.М., 2006). В связи с этим, следующим этапом работы было сопоставление антигенраспознающей активности офТ-лимфоцитов беременных мышей с таковой для небеременных при разных вариантах скрещивания -нормальном аллогенном, нормальном сингенном и в склонной к аборту комбинации.

Анализ пролиферативного ответа сфТ-лимфоцитов беременных самок СВАЛ на антигены самцов соответствующих линий показал, что при нормальной беременности (и сингенной, и аллогенной) индекс пролиферации Т-клеток, определяемый как отношение показателей пролиферативной активности в стимулированной и нестимулированной пробах, выше, чем у небеременных животных (таблица 4), но зависит от происхождения Т-клеток - конкретно, от типа лимфоузлов, из которых они получены. Наиболее выраженным этот эффект был при нормальной аллогенной беременности (СВАЛ х ВАЬВ/с) для Т-лимфоцитов парааортальных лимфатических узлов (дренирующих матку), существенно меньшим, но статистически значимым - для подмышечных, тогда как для Т-клеток мезентериальных лимфоузлов ответ на антигены самца не отличался от такового для небеременных самок СВАЛ. Более того, достоверные различия в индексах пролиферации были выявлены и в пределах одной группы животных: ответ Т-клеток у беременных самок СВАЛ х ВАЬВ/с был выше в парааортальных лимфоузлах по сравнению с мезентериальными (таблица 4). В отличие от нормальной беременности, в комбинации СВАЛ х ОВА/2, характеризующейся высоким уровнем спонтанных абортов, ответа периферических Т-клеток на антигены самцов ОВА/2 не выявлено (таблица 4).

В комбинации СВА х ЭВА/2, характеризующейся высоким уровнем спонтанных абортов, ответа периферических Т-клеток на антигены самцов ОВА/2 не выявлено. Возможно, отсутствие ответа в данной модели и является одной из причин предрасположенности к абортам, поскольку, согласно современным представлениям, для успешной имплантации и плацентации необходим достаточный уровень иммунореактивности материнского организма в отношении

отцовских и фетальных антигенов - цитокины, секретируемые в ходе иммунного ответа, оказывают трофическое действие на плаценту и плод (\Vegmann е/ аі., 1993).

Возвращаясь к данным, полученным на модели нормальной аллогенной беременности, важно отметить, что более активный ответ Т-лимфоцитов парааортальных лимфоузлов, дренирующих матку, может быть связан не только с изменением специфичности Т-лимфоцитов, но и с примированием этих клеток антигенами плода в ходе беременности.

Таблица 4 - Пролиферативный ответ периферических арТ-лимфоцитов самок СВА/Л на антигены самца в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов

Отвечающие клетки (сфТ-лимфоциты самки) Индекс стимуляции (М ± т)

Стимулирующие клетки (спленоциты самца)

ВАЬВ/с СВАЛ ОВА/2

Небеременные самки СВАЛ ПА 1,47 ±0,081 1,39 ±0,089 1,37 ±0,109 н.д. 1,19 ±0,074 1,18 ±0,062 1,21 ±0,048

М

ПМ

Беременные самки СВАЛ х ВАЬВ/с ПА 2,09 ± 0,222* 1,49 ±0,124 1,69 ±0,196*

М

ПМ

Беременные самки СВАЛ х СВАЛ ПА 1,72 ±0,183 1,66 ±0,178 1,46 ±0,138

М

ПМ

Беременные самки СВАЛ х ЭВА/2 ПА 1,083 ± 0,042" 4 1,11 ±0,045* 1,01 ± 0,035* аЬ

м

ПМ

Примечания: в каждой группе 8-10 животных; ПА - парааортальные лимфатические узлы (дренирующие матку), ПМ - подмышечные, М - мезентериальные; н.д. - нет данных; индекс пролиферации определялся как отношение соответствующих показателей оптической плотности для стимулированной (спленоцитами самца) и не стимулированной проб. * - р < 0,05 (сопоставление с ответом Т-клеток соответствующих лимфатических узлов небеременных самок),

а -р< 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем для беременности СВАЛ х ВАЬВ/с), Ь-р< 0,05 (сопоставление с соответствующим показателем для беременности СВАЛ х СВАЛ).

Чтобы нивелировать эффект примирования, был определен ответ Т-лимфоцитов беременных самок СВА х ВАЬВ/с на спленоциты небеременных самок СВА. В результате выявлены следующие закономерности: индекс стимуляции Т-клеток парааортальных лимфатических узлов у этих животных был достоверно

выше такового для Т-лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов, а также Т-лимфоцитов парааортальных лимфоузлов небеременных самок. Поскольку в данной модели возможность предварительного примирования Т-клеток существенно снижена, появление реактивности Т-лимфоцитов парааортальных лимфатических узлов в отношении собственных клеток связано, вероятнее всего, именно с изменением антигенраспознающего репертуара, в частности, с появлением новых аутореактивных Т-клеточных клонов.

В целом, на основе экспрессии маркера незрелых Т-клеточных предшественников, а также фактора реаранжировки генов TCR, мы показали наличие при беременности процессов экстратимической дифференцировки сфТ-лимфоцитов. Выявление этих процессов в лимфатических узлах имеет как минимум два логичных объяснения. Первое заключается в том, что незрелые тимоциты под действием тех или иных факторов, ассоциированных с беременностью, мигрируют в периферические лимфоидные органы и там завершают свое развитие. В пользу этого механизма говорит экспрессия в периферических Т-клетках pre-TCRa, которая в норме выявляется только в ранних тимических предшественниках (Bruno et al., 1995). Второй механизм предполагает активацию недавно открытого процесса, известного как «ревизия антигенного рецептора», при котором в зрелых периферических Т-лимфоцитах повторно индуцируются процессы реаранжировки цепей антигенного рецептора, сопровождающиеся формированием TCR с новой специфичностью (Куклина, 2006). Не исключено, что оба механизма вносят вклад в этот процесс. Что касается факторов, индуцирующих его, то эту роль могут играть уже упоминавшиеся ранее члены семейства интерлейкина 6 - ОМ (Boileau et al., 2000) и/или фактор, ингибирующий лейкемию (Leukemia Inhibitory Factor, LIF) (Shen et al., 1994), а также эстрогены (Okuyama et al., 1992), способные при экзогенном введении (Boileau et al., 2000; Okuyama et al., 1992) или в случае трансгенной экспрессии (Shen et al., 1994) активировать процессы экстратимической дифференцировки сфТ-клеток у мышей.

Обсуждая биологическое значение выявленного феномена, важно учитывать, что речь идет о беременности, которая, в силу экспрессии плодом чужеродных (отцовских) антигенов, предполагает включение сложных механизмов регуляции иммунной системы матери, предупреждающих реакции отторжения. Расшифровка этих механизмов на сегодняшний день не завершена. В этой связи особый интерес представляет выявленная в работе преимущественная активация процессов

реаранжировки именно в лимфоузлах, дренирующих матку. Вероятнее всего, смысл такой активации заключается не просто в компенсации атрофических процессов, происходящих в этот период в тимусе, а в локальной коррекции антигенраспознающего репертуара Т-лимфоцитов, с учетом появления в организме новых антигенов - фетальных и плацентарных. Это предположение отчасти подтверждается данными по реактивности периферических Т-лимфоцитов беременных самок в отношении антигенов самца: пролиферативный ответ Т-клеток парааортальных лимфатических узлов, в которых как раз и регистрируется преимущественно экспрессия RAG-1 и pre-TCRa, в наших экспериментах был заметно выше, чем у Т-лимфоцитов лимфатических узлов других типов.

С одной стороны, активация процессов экстратимической дифференцировки сфТ-лимфоцитов при беременности может представлять собой новый, ранее неизвестный механизм формирования иммунной толерантности матери к плоду - в том случае, если такой реаранжировке подвергаются регуляторные клетки, реализующие в дальнейшем иммуносупрессивную активность, или же эффекторные Т-лимфоциты, которые под действием репродуктивных гормонов дифференцируются преимущественно в Th2 и продуцируют цитокины, оказывающие трофическое действие на плаценту.

С другой стороны, учитывая отсутствие на периферии условий для эффективной клональной селекции, дифференцировка aßT-клеток вне тимуса может быть причиной развития аутоиммунных процессов в организме, которые часто провоцируются беременностью (Куклина, 2010).

ВЫВОДЫ

1. У беременных самок мышей Swiss, начиная со второй половины беременности, в Т-лимфоцитах лимфатических узлов выявляется маркер незрелых тимических предшественников, а также ключевой фактор реаранжировки генов TCR, что свидетельствует об активации экстратимической дифференцировки Т-лимфоцитов; эти процессы идут преимущественно в дренирующих матку (парааортальных) лимфоузлах, но, в меньшей степени, и в не дренирующих (главным образом, в подмышечных).

2. Беременность у самок линии CBA/J сопровождается активацией экспрессии маркера реаранжировки генов TCR, основного события тимической дифференцировки, в aßT-лимфоцитах периферических лимфоидных органов,

главным образом парааортальных лимфатических узлов; этот феномен регистрируется при разных вариантах скрещивания: CBA/J х BALB/c (нормальная аллогенная беременность), CBA/J х CBA/J (нормальная сингенная беременность) и CBA/J х DBA/2 (склонная к аборту комбинация).

3. У беременных самок мышей Swiss регистрируется необычная популяция С040-позитивных aßT-лимфоцитов, появление ее совпадает по времени (вторая половина беременности) и по локализации (лимфатические узлы, дренирующие матку) с активацией процессов реаранжировки в aßT-клетках.

4. Анализ наличия процессов реаранжировки в aßT-лимфоцитах в зависимости от экспрессии на мембране CD40, а также их индукции при ответе на С040-зависимую активацию, указывает на отсутствие причинно-следственной связи между этими явлениями.

5. Пролиферативный ответ aßT-лимфоцитов беременных самок CBA/J на спленоциты самца наиболее выражен при нормальной аллогенной беременности (CBA/J х BALB/c), в меньшей степени при сингенной беременности (CBA/J х CBA/J), и не выявляется в склонной к аборту комбинации (CBA/J х DBA/2); при этом клетки лимфатических узлов, дренирующих матку, отвечают на антигены самца достоверно эффективнее, чем лимфоциты других типов лимфатических узлов, что совпадает с локализацией процессов реаранжировки в aßT-лимфоцитах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Ширшев C.B. Экстратимическая реаранжировка генов антигенного рецептора aßT-лимфоцитов при беременности / C.B. Ширшев, А.Ю. Максимов, O.A. Крапивина, Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Биохимия. - 2007. -Т.72, № 9. - С. 1207-1213.

2. Глебездина Н.С. Роль С040-зависимого сигнала в индукции рекомбиназной активности в периферических aßT-лимфоцитах при беременности / Н.С. Глебездина, Е.М. Куклина, C.B. Ширшев // Российский иммунологический журнал. - 2011. - Т.5 (14),№2.-С. 133-137.

3. Куклина Е.М. Анализ реактивности периферических aßT- лимфоцитов беременных самок на антигены самца / Е.М. Куклина, C.B. Ширшев, Н.С. Глебездина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№4/1 (38).-С. 127-128.

Публикации в других изданиях

4. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки арТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, О.А. Крапивина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Региональный конкурс РФФИ-Урал: результаты науч. исслед., получ. за 2005 г.: аннотац. отчеты. - 2006. - С. 203-204.

5. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки арТ-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, А.Ю. Максимов, О.А. Крапивина, Н.С. Глебездина (Паршакова) // Региональный конкурс РФФИ-Урал: Результаты науч. исслед., получ. за 2004 г.: аннотац. отчеты. - 2007. -С. 224-226.

6. Shirshev S.V. Studying the extrathymic differentiation of alpha/beta T lymphocytes during pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology. 16TH European Congress of Immunology. - 2006. - Abstr. - P. 223.

7. Ширшев С.В. Исследование экстратимической дифференцировки aPT-лимфоцитов при беременности / С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина (Паршакова)// Медицинская иммунология. - 2006. - Т.8, № 2. - С.151-152.

8. Глебездина (Паршакова) Н.С. Исследование экспрессии рекомбиназ в периферических Т-лимфоцитах при беременности // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: материалы регион, науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых 2006 и 2007 гг. - Пермь, 2007. - С. 228.

9. Глебездина (Паршакова) Н.С. Экстратимическая дифференцировка аР Т-клеток при беременности у мышей. Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: Материалы регион, науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых 2006 и 2007 гг. - Пермь, 2007. - С. 230.

10. Shirshev S.V. Rearrangement of antigen receptor Genes in Peripheral aPT Lumphocytes during Pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology: 2nd European Congress of Immunology. - 2009. - Abstr. - PC19/1.

11. Shirshev S.V. The Unusual CD40+ офТ Lumphocyte Population as a Potential Target of extrathymic Differentiation in Pregnancy / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // European Journal of Immunology: 2nd European Congress of Immunology. - 2009. - Abstr. - WS C19/10.

12. Shirshev S.V. Pregnancy is associated with the activation of extrathymic аР T cell development / S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, N.S. Glebezdina (Parshakova) // International Immunology: 12ndEuropean Congress of Immunology. - 2010. - Abstr. -WS/PP-110-05.

13. Куклина Е.М. Беременность у мышей ассоциирована с появлением необычной популяции С040+арТ-лимфоцитов в периферических органах иммунной системы / Е.М. Куклина, Н.С. Глебездина // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Вып.4 (13), № 4. - С. 382-383.

14. Глебездина Н.С. Роль С040-зависимого сигнала в экспрессии рекомбиназ в периферических аВТ-лимфоцитах при беременности / Н.С. Глебездина, Е.М. Куклина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -Т. 1, № 2/1 (35).-С. 26.

ГЛЕБЕЗДИНА Наталья Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИНДУКЦИИ ЭКСТРАТИМИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ сфТ-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ

Специальность 14.03.09- Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 02.10.2012. Формат 60x90/16.Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1,0 Набор компьютерный.

Отпечатано в ФГБУН ИЭГМ УрО РАН 614081, Пермь, ул. Голева, 13