Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Роль оценки полиморфизма генов цитокинов в оптимизации лечения хронических неспецифических цервицитов

На правах рукописи

Лемякина Елена Викторовна

РОЛЬ ОЦЕНКИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В ОПТИМИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦЕРВИЦИТОВ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ОКТ 2014

Волгоград - 2014

005553041

005553041

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Жаркин Николай Александрович Научный консультант:

доктор медицинских наук, Гумилевский Борис Юрьевич Официальные оппоненты:

Озолиня Людмила Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения РФ, профессор кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета

Трубникова Лариса Игнатьевна, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки РФ, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии медицинского факультета

Ведущая организация: ФГБУ «Ростовский научно - исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «31» октября 2014 года в ¡Q часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.05 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета, на caiiTe:wwvv.volgmed.ru. на сайте ВАК Министерства науки и образования РФ: \v\vw.vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан ССиТЛ^ 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Селихова Марина Сергеевна

Общая характеристика работы Актуальность работы

Хронические неспецифические цервициты (ХНЦ) относятся к таким заболеваниям, которые сами по себе прямой угрозы здоровью женщины не представляют. Однако в нижних отделах полового тракта сохраняются и постоянно накапливаются в высоких концентрациях условно патогенные микроорганизмы, вызывая вагиниты и вагинозы, что в последствие может стать причиной развития гнойно-септических заболеваний органов малого таза, послеоперационных воспалительных осложнений, хориоамнионита, преждевременных родов, послеродового метроэндометрита, а также невынашивания и бесплодия, различных форм дисплазий (В.Н. Прилепская, 2005; 3. Ш. Азамова, 2006; О.В. Макарова, 2007; C.B. Сердюков, 2009; Э.А. Казачкова , 2009; Е.И. Новиков, 2012; А.Л.Уланян, 2012; P. Nyirjesi, 2001; J. Cuzick, 2006;N.M. Jones, 2010). Несмотря на существующий прогресс и применение различных новых методов и технологий в практической гинекологии, частота ХНЦ остается на высоком уровне и составляет 30 -40%, а у нерожавших женщин до 30 лет - от 50% до 90% случаев (Н.И. Кондриков, 2005; В.М. Гольцфарб, 2005; В.Н. Прилепская, 2005; Е.А. Соколова, 2006;С.Н. Грибова, 2010). Симптоматика ХНЦ, как правило, бывает маловыраженной и очень часто это заболевание протекает бессимптомно, длительно с частыми рецидивами (И. Г. Ваганова, 2000; И.Ю. Угай, 2006; А.Л. Тихомиров, 2007; Н.В. Дуб, 2007; Т.А. Щетинина, 2008;С.Н. Грибова, 2010;W.MendIing, 2006).

Важное значение в возникновении, прогрессировании и рецидивировании воспалительных заболеваний шейки матки отводят состоянию иммунной системы (И.Ю. Угай, 2006; Т.А. Щетинина, 2008; С.А. Плескановская, 2009; С.Н. Грибова, 2010; C.B. Мураков, 2010; H.Yasui, 2003; W.J.Ledger, 2007).

Накоплены данные о влиянии полиморфизма генов цитокинов на состояние иммунной системы. В ряде исследований предполагается роль полиморфизма отдельных генов цитокинов в развитии и характере течения воспалительного процесса и влиянии на развитие про - и противовоспалительного ответа, наряду с патогенностью микроорганизма (B.C. Баранов, 2000; О.П. Гумилевская, 2008; Б.Ю. Гумилевский, 2010;Bidzhieva В., 2006;2007;2008;N.M. Jones, 2010; W. Wul, 2013). Вопрос о влиянии генетических факторов, в частности полиморфизма генов цитокинов, на частоту возникновения и течение ХНЦ, а также их связь с состоянием иммунной системы пациенток остается открытым, что определяет актуальность научного исследования.

Современное лечение воспалительного процесса в области шейки матки состоит из трех основных компонентов: антибиотикотерапия с обязательной местной санацией влагалища и восстановлением нормального микробиоценоза, а также иммунокоррекция (М.Н. Костава, 2006; Е.Б.

Рудакова, 2007; B.C. Майборода, 2008; Т.А. Щетинина, 2008; Э.А. Казачкова, 2009; С.Н. Грибова, 2010; W. Mendling, 2006).-

Некоторыми авторами предложено использование преформированных факторов таких как, электрофорез с солями меди, бальнеотерапия, магнитотерапия, озонотерапия, иглорефлексотерапия, лазеротерапия (И.Б. Манухин, 2000; О.В. Голубкова, 2001; H.A. Жаркин, 2003;2007; В.М. Зуев, 2005; А.Е Сашкина, 2007; B.C. Улащик, 2007; В.В. Ежов, 2010; Е.В. Никитина, 2010; H.Dalgik, 2001; J.Chen, 2008).

Однако большинство из перечисленных методов сложны, дорогостоящи и не проявляют ожидаемой эффективности. Возможно, это связано с недостаточным влиянием на патогенетические механизмы ХНЦ, что отражается на отсутствии тенденции к снижению частоты ХНЦ в настоящее время. Цель исследования

Повышение эффективности лечения хронических неспецифических цервицитов на основе оценкигенетических полиморфизмов. Задачи исследования

1. Изучить генетические особенности пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом.

2. Уточнить эффективность современных методов лечения хронических неспецифических цервицитов.

3. Оценить влияние иммуногенетических особенностей пациенток на цитокиновый профиль в процессе лечения.

4. Разработать комплексный метод лечения хронических неспецифических цервицитов с использованием вагинального лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон».

5. Оценить клиническую эффективность разработанного метода лечения.

Научная новизна

Впервые подтверждена взаимосвязь характера клинического течения воспалительного процесса в шейке матки, длительности заболевания с иммуногенетическим профилем пациентки.

Впервые определены изменения системного иммунитета в виде количественного содержания сывороточного уровня про - и противовоспалительных цитокинов (MJI-lß, ИЛ-6, ИЛ-17а, ИЛ-4, ИЛ-10, IFNy, TNFa) на фоне различных вариантов лечения у пациенток с ХНЦ.

Впервые в лечении пациенток с ХНЦ применено сочетание вагинальной лазеротерапии и бальнеологического средства «Эльтон» в виде «короткой» и «удлиненной» схемы лечения в зависимости от выявленных иммуногенетических особенностей пациентки. Доказано повышение эффективности терапии с применением лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон», их положительное влияние на биоценоз влагалища, регенеративную активность шейки матки и цитокиновый профиль.

Практическая значимость работы

Определение мутации ТЬЯб (полиморфизм - 8ег249Рго) позволило выявить предрасположенность к нарушению иммунного реагирования, прогнозировать течение заболевания и его исход, а также подобрать индивидуальную схему лечения каждой пациентке в зависимости от ее генотипа. Определение цитокинового профиля пациенток позволяет оценить эффективность терапии и полноту излеченности ХНЦ.

Разработан «Способ лечения подострых и хронических неспецифических цервицитов нерожавшим женщинам, включающий курс лазерного фотофореза с применением бальнеологического средства "Эльтон" - гель» (патент РФ № 2495689 от 20 октября 2013 г.).

Разработанная схема лечения с комбинацией преформированных факторов на основе оценки иммуногенетических критериев позволила нормализовать иммунологический статус пациенток и достичь полноценной эпителизации шейки матки, что повысило эффективность терапии ХНЦ в 2 раза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Клинико-лабораторные проявления воспалительного процесса при ХНЦ у нерожавших женщин, связаны с глубиной подавления механизмов врожденного и адаптивного иммунитета и детерминируются иммуногенетическими особенностями, выражающимися в индивидуальном наборе аллельных вариантов гена ТЬЯб.

2. Изменения параметров цитокинового профиля и особенности полиморфных вариантов 8М> мутаций ТЬИ.6 позволяют осуществить оценку риска развития хронизации воспалительного процесса в шейке матки и прогнозировать течение заболевания.

3. Предложенный метод комплексного лечения ХНЦ с сочетанным использованием вагинальной лазеротерапии и бальнеологического средства «Эльтон», основанный на оценке иммуногенетических особенностей пациентки, способствует купированию клинических симптомов, приводит к элиминации инфекционного агента и восстановлению микробиоценоза влагалища, цитокинового равновесия и полноценной эпителизации шейки матки.

Апробация работы и публикации

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на 71-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); I Научно-практической конференции с международным участием «Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья девочек» (Москва, 2013); IV международной научной конференции молодых ученых «Новейшие технологии медицинской реабилитации в санаторно-курортных условиях» (Украина, Одесса, 2013); 72-й открытой научно-практической

конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2014); 16-ой Поволжской научно - практической конференции акушеров-гинекологов, неонатологов и педиатров «Проблемы сохранения здоровья матери и ребенка» (Волгоград, 2014).

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, включенных в действующий перечень ВАК для работ по медицинским наукам, а также получен патент РФ № 2495689 «Способ лечения подострых и хронических неспецифических цервицитов нерожавшим женщинам, включающий курс лазерного фотофореза с применением бальнеологического средства "Эльтон"- гель». Внедрение результатов исследования в практику

Полученные результаты исследования внедрены и применяются в работе женских консультаций ГУЗ «Клинический родильный дом №2», ГУЗ «Родильный дом №4», г. Волгограда. Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия кафедр акушерства и гинекологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 24 фотографии, иллюстрирована 15 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, главы результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы содержит 199 источников: 161 - на русском и 38 - на иностранных языках.

Содержание работы Материалы, объем и методы исследования

Для достижения намеченной цели и решения поставленных задач нами обследовано 240 нерожавших женщин. У всех пациенток было получено информированное согласие на использование данных обследования в научных целях и согласие этического комитета на проведение исследования. Пациентки с ХНЦ были распределены на две клинические группы: группу сравнения (п=64) и основную (п=128). Контрольную группу (п=48) составили женщины без патологии шейки матки. Группы были идентичны по возрастному, соматическому и психологическому исходному состоянию. При формировании больных в группы использовались критерии включения и исключения.

Критерии включения: нерожавшие женщины от 23 до 30 лет с ХНЦ, имеющие рецидивы данного заболевания в анамнезе.

Критерии исключения: беременность, наличие заболеваний

передающихся половым путем, экстрагенитальная патология

инфекционного генеза, наличие острого цервицита, наличие вирус-ассоциированного заболевания шейки матки, ЦИН, РШМ, доброкачественные и злокачественные новообразования, участие пациента в любом другом исследовании, нежелание самой женщины, пациентки социальной группы, в соответствии с требованиями ICN-GCP (студентки медицинских, фармакологических учебных заведений, младший персонал больниц и лабораторий, военнослужащие, заключенные, неизлечимые или психические больные и т д).

Всем пациенткам основной группы и группы сравнения была назначена терапия, включающая местную санацию влагалища и восстановление нормобиоценоза влагалища, согласно приказу МЗ №765 от 20.11.2006 г. и национальному руководству по гинекологии (В.И. Кулаков и др., 2011). Пациенткам, у которых при бактерологическом культуральном методе исследования были идентифицированы микроорганизмы в концентрациях более 10 на первом этапе лечения была проведена этиотропная терапия, в строгой зависимости от выявленного патогена. Назначались препараты группы цефалоспоринов (цефиксим 400 мг в сутки на 7 дней), линкозаминов (клиндамицин 450 мг в сутки на 7 дней), макролидов (азитромицин 1000 мг в сутки на 3 дня), фторхинолонов (левофлоксацин 500 мг в сутки на 7 дней) в сочетании с метронидазолом (750 мг в сутки на 10 дней). С целью лечения и профилактики вульвовагинального кандидоза назначали флуконазол в дозе 150 мг. Для местной ликвидации условно-патогенных микроорганизмов, грибов и анаэробов был включен комбинированный препарат нео-пенотран форте в виде вагинальных свечей (по 1 свече на ночь в течение 7 дней). С целью восстановления влагалищного микробиоценоза после антибиотикотерапии был назначен Ацилакт по 1 свече интравагинально в течение 10 дней. На втором этапе лечения больным группы сравнения (п=64) с целью коррекции иммунологических нарушений был назначен «Генферон» 500 тыс. ME вагинально по 1 свече 2 раза в день в течение 10 дней.

На втором этапе лечения больные основной группы были разделены на 3 подгруппы. В подгруппе №1 (п=32) проводилась вагинальная лазеротерапия (время воздействия - 3 минуты, длина волны - 0,9 нм, импульсная мощность - 5 Вт, частота следования импульса - 600 Гц, курс - 10 дней). В подгруппе №2 (п=32) использовались тампоны с бальнеологическим средством «Эльтон» в гелевой форме в течение 10 дней, время воздействия 2 часа. В подгруппе №3 (п=64) применялось сочетание вагинальной лазеротерапии и бальнеотерапии, при котором шейка матки обрабатывалась бальнеологическим средством «Эльтон» с последующим воздействием на нее лазерного излучения, идентичного по характеристикам с подгруппой №1.

На каждую пациентку заполнялся протокол исследования, который позволял учитывать данные анамнеза, объективного клинического обследования, дополнительных методов исследования, данные о

проводившихся лечебных мероприятиях. Все исследования в группах больных проводились дважды - до и после проведенного курса лечения через 2 месяца, в контрольной группе - однократно, ввиду отсутствия заболевания. Оценку отдаленных результатов через 6 месяцев проводили в основной группе и группе сравнения.

Обследование женщин выполнялось по единому протоколу и состояло: из общеклинического обследования, согласно национальному руководству по гинекологии (В.И. Кулаков и др., 2011), включавшего в себя оценку жалоб, сбор анамнеза, общий и гинекологический осмотр; из комплекса лабораторных методов исследования (бактериоскопического исследования содержимого влагалища, цервикального канала методом простой микроскопии, бактериологического исследования содержимого цервикального канала, ДНК-диагностики урогенитальных инфекций, цитологического метода исследования мазков с шейки матки); из инструментального метода исследования (простой и расширенной кольпоскопии). Кроме общепринятыхметодов были проведены специальные исследования. Для изучения иммуногенетических особенностей пациенток анализу подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» методом ПЦР производства НПФ «Литех» (табл. 1,2).

Таблица 1.

Генетические полиморфизмы провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, определяемые в исследовании

Мутация интерлейкина 1Р ген - IL-1 ß, полиморфизм - ТЗ1С

Мутация интерлейкина 12(5 ген - IL 12ß, полиморфизм -Al 188С

Мутация TNF-alpa ген - TNF, полиморфизм - G308A

Мутация интерлейкина 6 ген - IL-6, полиморфизм - C174G

Мутация интерлейкина 17 А ген - I117A. полиморфизм - G197A

Мутация интерлейкина 17F ген - IL17F, полиморфизм - Н161А

Мутация-1 интерлейкина 10 ген - IL-10, полиморфизм - G1082A

Мутация-2 интерлейкина 10 ген - IL-10, полиморфизм - С592А

Мутация-З интерлейкина 10 ген - ILIO, полиморфизм - С819Т

Мутация интерлейкина 4 ген- IL4, полиморфизм -С-589Т

Таблица 2. Генетические полиморфизмы ТЬЯ, системы свертывания крови и фибринолиза, определяемые в исследовании

Мутация ТЬЯ 2 полиморфизм- Агя75301п

Мутация ИЛ13 полиморфизм - РЬе4^еи

Мутация Ш14 полиморфизм - Азр29901у

Мутация ТЬК 6 полиморфизм - 5ег249Рго

Мутация ТЬЯ 9 полиморфизм - Т-1237С

Мутация 1 метилентетрагидофолатредуктазы полиморфизм - А1а222Уа1 (С677Т)

Лейденская мутация полиморфизм - Аг£50601п

Для изучения системных механизмов противоинфекционной защиты определялись цитокины в периферической крови обследованных с помощью наборов реактивов для иммуноферментного анализа производства фирмы ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург): «ИФА-1Ь-4», «ИФА-IL-ö», «ИФА-IL-17А», «ИФА-IL-IO», «ИФА-IL-lß», «ИФА-IFN-gamma», «ИФА-TNF-alpa».

Вариационно-статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами с помощью программного пакета EXCEL 2010 (Microsoft, USA), StatPlus 2009, ППП Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Значимость различий при сравнении групп оценивалась непараметрическим U-критерием Манна-Уитни, достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в группах определяли по двустороннему варианту точного критерия Фишера. Для статистического анализа уровней цитокинов вычисляли медиану и 25% - 75% квартили {Me (25%-75%)}. Статистический анализ результатов молекулярно-генетических исследований включал оценку частоты встречаемости аллелей генов, генотипов и их комбинаций, анализ таблиц сопряженности. Частоту аллелей генов и генотипов вычисляли методом прямого подсчета. Статистическую оценку ассоциации генов и генотипов проводили по показателю OR (odds ratio — отношение шансов) с вычислением 95% доверительного интервала для OR (95%С1). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95 % (р< 0,05).

Автором лично проводилось: отбор, наблюдение и лечение пациенток, динамическое клиническое обследование, сеансы лазеротерапии, бальнеотерапии, лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон», статистическая обработка и оформление результатов исследования.

Результаты исследования и их обсуждение

Роль нммуногенетнческих нарушений в патогенезе ХНЦ

До разделения на группы у больных ХНЦ (п=192) и женщин, не имеющих патологию шейки матки (п=48), были определены и изучены взаимосвязи точечных нуклеотидных мутаций промоторных участков генов цитокинов и TLR.

В ходе молекулярно-генетического исследования при сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов противовоспалительного Ил-10 (мутация I, G-1082A; мутация 2, С-592А; мутация 3, С-819Т) и гена противовоспалительного Ил-4 (С-589-Т), а также генов системы свертывания крови и фибринолиза (Лейденовский фактор F5, MTHFR) исследуемых групп статистически значимых отличий выявлено не было. Изучая точечные нуклеотидные мутации промоторных участков генов провоспалительных цитокинов (TNFa, Ил-lß, Ил-2,Ил-6, Ил-12р, Ил-17а, Ил-17f) у пациенток, страдающих ХНЦ и женщин, не имеющих данного заболевания, обнаружены значимые отличия лишь в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера TNFa (G-308A). Выявлено

увеличение в 5 раз частоты встречаемости гетерозиготного генотипа GA в группе больных ХНЦ. В свою очередь у пациенток с генотипом GA полиморфного маркера TNFa наблюдалась более активная продукция TNFa относительно пациенток с другими генотипами. Однако уровень TNFa после лечения нормализовался и ни у одной пациентки увеличенной его выработки не наблюдалось. Значимых различий в продолжительности и течении ХНЦ у больных с гетерозиготным генотипом GA в гене TNFa выявлено не было. При изучении полиморфизма генов системы врожденного иммунитета между группой больных ХНЦ и контрольной группой были определены значимые увеличения частот встречаемости: мутантных гомозигот Gln/Gln гена (Arg753Gln) TLR2, гетерозиготного генотипа Phe/Leu TLR3 (Phe412Leu), гетерозиготного генотипа ТС гена TLR9 (Т-1237С), гетерозиготного генотипа Ser/Pro и мутантных гомозигот Pro/Pro гена TLR 6 (Ser249Pro). Так, гетерозиготный генотип Phe/Leu TLR3 (Phe412Leu) в группе больных ХНЦ встречался чаще на 17,7% относительно контрольной группы (42,7% против 25%), а генотип ТС гена TLR9 (Т-1237С) чаще в 2,1 раза (53,2% против 25%).

Наибольшие различия при изучении точечных нуклеотидных мутаций промоторных участков генов цитокинов, системы свертывания крови hTLR были выявлены при анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR6 (табл.3).

Таблица 3.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера гена TLR

Показатель Больные ХНЦ Контрольная группа Критерий Фишера OR 95%С1

Ser 196 (51,1%) 68 (69,8%) р<0,01 0,42 0,26-0,69

Pro 188 (48,9%) 28 (30,2%) р<0,01 2,32 1,43-3,77

Всего 384 96 - - -

SerSer 76 (39,6%) 24 (50,0%) р > 0,05 0,65 0,34-1,23

SerPro 44 (22,9%) 22 (44,8%) р<0,05 0,35 0,18-0,68

ProPro 72 (37,5%) 2(4,1%) р<0,01 13,8 3,25-58,57

Всего 192 48 - - -

Среди пациенток с ХНЦ мутантные гомозиготы Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) встречались в 9,2 раза чаще, чем среди женщин, не имеющих данного заболевания - 37% против 4% (р< 0,01). Гетерозигота Ser/Pro гена TLR6 (Ser249Pro) выявлялась у больных ХНЦ реже в 1,9 раза, чем у женщин контрольной группы - 22,9% против 44,8% (р< 0,05). В 3,6 раза чаще течение ХНЦ длительностью менее 2 лет наблюдалось у пациенток без мутации в гене TLR6. Кроме того, у таких больных в 3 раза реже данное заболевание длилось более 5 лет. Следовательно, у больных, имеющих в своем генотипе мутантную гомозиготу Pro/Pro TLR6, имелась тенденция к более длительному, затяжному течению заболевания.

Клиническая характеристика пациенток до лечения

Средний возраст пациенток составил в группе сравнения - 26,2±2,4 лет, в основной группе - 26,6±2,2 лет, в контрольной группе - 26,7 ±2,1 лет (р>0,05). Средний возраст менархе в группе сравнения составил 13,2±0,14 лет, в основной группе - 13,0±0,12 лет, а в контрольной - 13,1±0,23 лет (р>0,05).Нарушение менструального цикла в виде олигоменореи отмечалось у 10 (15,6%) пациенток группы сравнения, у 16 (12,5%) основной группы (р>0,05). Альгодисменорея выявлена у 20 (31,2%) и у 38 (29,7%) пациенток соответственно (р>0,05). Во всех группах преобладали женщины, не состоявшие в зарегистрированном браке - 36 в группе сравнения (56,2%), 70 (54,6%) в основной группе и 26 (54,1%) в контрольной группе (р>0,05). Возраст сексуального дебюта, отражающий особенности сексуального поведения у обследованных женщин, составил во всех группах -17,2±0,9лет.

Основными жалобами у пациенток с ХНЦ были постоянные или периодические выделения из половых путей, чувство дискомфорта или жжения во влагалище. При обращении жалобы предъявляли 56 (87,5%) больных в группе сравнения и 112 (87,5%) - в основной группе (р>0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что 8 (12,5%) пациенток группы сравнения и 16 (12,5%) - в основной группе жалоб не предъявляли. Все больные проходили ранее лечение по поводу цервицита. Во время предыдущих курсов лечения назначалась антибактериальная терапия и местная санация влагалища. Длительность заболевания к моменту обследования пациенток представлена в таблице 4.

Таблица 4.

Длительность заболевания к моменту обследования

Длительность заболевания Группа сравнения, п=64 Основная группа, п=128

N % п %

1-2 года 24 37,5 46 35,9

3-4 года 28 43,7 54 42,3

5 лет и более 12 18,8 28 21,8

Средняя длительность заболевания составила в группе сравнения - 3,0 ±1,1 лет, в основной группе - 3,1±1Д лет. Частота рецидива заболевания варьировала от 1 до 4 эпизодов в течение жизни.

При осмотре шейки матки в 100% случаев обнаружены гиперемия шейки матки и патологические выделения из цервикального канала. У большинства пациенток групп наблюдения в мазках отмечался умеренный лейкоцитоз в сочетании с воспалительными или дисбиотическими изменениями влагалищного биоценоза. При культуральном микробиологическом исследовании цервикального канала чаще других у больных основной группы выявлялись Escherichia coli (78,1%), Candida spp (62,5%) и Streptococcus spp (59,4%). В группе сравнения результаты были

аналогичны. У подавляющего большинства женщин контрольной группы, а именно у 42 (87,5%) пациенток посев роста патогенной флоры не дал. По результатам скрининга на вирус папилломы человека методом ПЦР у 38 (59,4%) больных группы сравнения и у 82 (64,0%) больных основной группы получены отрицательные результаты. При дальнейшем генотипировании и определении количественной нагрузки были выявлены вирусы папилломы человека низкого онкогенного риска 6, 42, 43, 44, 53, 54 типов с клинически малозначимой вирусной концентрацией (менее 10 копий геномов). Нормальная цитологическая картина (I класс мазка) обнаружена в 43,7% случаях в группе сравнения, в 40,6% случаях в основной группе и у всех пациенток (100%) контрольной группы. Воспалительная цитологическая картина (II класс мазка) обнаружена у 56,3% пациенток группы сравнения, у 59,4% больных основной группы (р>0,05).

Кольпоскопическая оценка шейки матки проводилась согласно международной классификации кольпоскопических терминов в отношении шейки матки, принятой в Рио де Жанейро, 2011 г. В контрольной группе у всех пациенток определялся многослойный плоский эпителий, а расширенная кольпоскопия в 100% случаев подтвердила нормальную кольпоскопическую картину. Воспалительная кольпоскопическая картина была определена у всех пациенток с ХНЦ.

При анализе цитокинового профиля больных в группах наблюдения обращало на себя внимание нарушение баланса всех исследуемых провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов, что свидетельствует о реактивности иммунной системы при хроническом течении цервицита. Однако, выявленные различия в количественном содержании Ил-6, Ил-10, Ил-1р, Ил-4 у больных ХНЦ и у женщин контрольной группы, не превышали показателей нормы (табл.5).

Таблица 5.

Уровни интерлейкинов в периферической крови пациенток до лечения {Ме (25%-75%)) ___

Интерлейкин пг/мл Группа сравнения, п=64 Основная группа,п=128 Контрольная группа,п=48

Ил-6 8(5-9,5) * 8(5-10)* 2,5 (2-6)

Ил-10 8(5-10,5)* 9(7-14)* 3 (1-6,5)

Ил-1р 2(1-3)* 1(1-2)* 3,5 (2-9,5)

Ил-4 2 (1-8) * 1 (1-2,5) * 4,5 (2-7)

Ил-17а 442 (215,5-665) * 353(285-900)* 117(75-143,5)

3,5 (1,-6,5) * 3(1-6)* 12,5 (5-15)

ТМ^а 55 (24,5-77) * 68 (46-101,5)* 2 (0-7,5)

*- значимые различия по сравнению с контрольной группой, р<0,05

Анализ анамнеза, жалоб, данных объективного и специальных методов исследования больных в группе сравнения и основной группе показал однородность пациенток с ХНЦ по всем вышеперечисленным показателям.

Таким образом, для больных ХНЦ характерны стертые клинические формы, длительное рецидивирующее течение с развитием устойчивого патологического состояния в шейке матки и с изменением иммунологической реактивности, поддерживаемое на системном уровне.

Эффективность современных методов лечения пациенток с ХНЦ

Проанализировав данные о динамике клинических симптомов в процессе лечения, отмечено значительное улучшение самочувствия у 54 (84,4%) пациенток группы сравнения. Положительная динамика выражалась в отсутствии жалоб у большинства пролеченных пациенток. Лишь у 15,6% больных сохранялись жалобы на умеренные выделения, которые уменьшились, но не исчезли полностью. Жалобы на неприятный запах влагалищного секрета отмечены только у 9,4% пациенток, что достоверно ниже, чем до проводимой терапии.

Изменения слизистой шейки матки воспалительного характера сохранились у 20 (31,2%) больных группы сравнения, в виде локальной или диффузной гиперемии экзоцервикса, отека, слизисто - гнойных выделений из цервикального канала, несмотря на то, что половина из них жалоб не предъявляла. Снижение количества лейкоцитов и слизи в мазках отмечено у всех пролеченных, явления неспецифического вагинита были полностью устранены, однако у 14 (21,9%) пациенток сохранялись патологические изменения, характерные для дисбиоза влагалища.

Повторный бактериальный посев подтвердил устранение инфекционного агента у 48 больных (75,0%) группы сравнения. Восстановление нормальной микрофлоры влагалища отмечено у трети пациенток. Так, уровень лактобактерий после лечения повысился до уровня более 108 КОЕ/мл у 4 (6,2%) пациенток, до 106 - 108 КОЕ/мл - у 16 (25,0%) пролеченныхдо 104 -10б КОЕ/мл - у 30 (46,9%) больных, в 14 (21,8%) случаях пул лактобактерий был угнетен и составил менее 104 КОЕ/мл.

В результате цитологического скрининга нормальная цитологическая картина (I класс мазка) была определена в 22 (68,8%) случаях, в то время как воспалительная цитологическая картина сохранилась у 10 (31,2%) пациенток.

Нормальная кольпоскопическая картина в группе сравнения констатирована лишь у 24 (37,5%) пациенток. Кольпоскопическая картина воспаления (незначительная гиперемия вокруг наружного зева, очаговая крапчатость при пробе Шиллера) отмечена у 20 (31,2%) пациенток. В остальных случаях (31,2%) наблюдалась аномальная кольпоскопическая картина I степени (слабовыраженные поражения).

Несмотря на положительную динамику клинико-лабораторных показателей полной ликвидации воспалительного процесса не произошло. У трети пациенток сохранилось дисбиотическое состояние микробиоценоза влагалища, что является условием для прогрессирования условно -патогенной флоры и поддержания вялотекущего воспалительного процесса

в шейке матки. У больных этой группы клиническое улучшение в течение заболевания носило временный характер, о чем свидетельствует возникший рецидив в течение 6 месяцев наблюдения у трети пациенток.

Влияние иммуногенетических особенностей пациенток на цитокиновый профиль в процессе лечения

Изучая иммунологический ответ на проведенную терапию у пациенток в группе сравнения, была отмечена нормализация уровней только четырех цитокинов (Ил-1Р, Ил-6, Ил-10, ЮТа) из изучаемых семи.

Была отмечена усиленная активность противовоспалительного Ил-4. Его продукция резко возросла с 2 (1-8) пг/мл до 19,5 (9-32,5) пг/мл, более чем в 9,7 раза (р<0,05). Повышенное содержание Ил-4 было отмечено больше чем у' половины пациенток (59,4%). Вероятно, это свидетельствует об активации Т-хелперов второго типа с последующей стимуляцией гуморального звена иммунитета и носит компенсаторный характер, угнетая продукцию провоспалительного цитокина ТОТа. Действительно, продукция ТЫБа после лечения нормализовалась и ни у одной пациентки увеличенной его выработки не наблюдалось. Полученные данные и выявленные иммуногенетические особенности, в виде увеличения гетерозиготного генотипа вА в гене ЮТа, можно считать независимыми друг от друга наблюдениями.

Изучая динамику Ил-17а в ходе исследования, установлено снижение продукции данного цитокина на 10,8% после проведенной терапии с 442 (215,5-665) пг/мл до 394 (124-560) пг/мл. Однако показатель сохранялся высоким, в 3,4 раза. Повышение уровня Ил-17а было констатировано у 19 (59,4%) пролеченных. После проведенной традиционной терапии выявлено значимое увеличение количества 1РЫу по сравнению с исходным более чем в 16 раз (3,5 (1,-6,5) пг/мл против 59 (19-110) пг/мл, р<0,05). Повышенная концентрация 1Шу наблюдалась у 19 (59,4%) больных. Увеличение продукции И^Ыу указывает на подавление клеток Т-хелперов второго типа и увеличение активности Т-лимфоцитов. В то же время продукция Ил-6 и ТЫРа снизилась, что является следствием нормализации повышенной активности макрофагов.

Полученные данные говорят о том, что общепринятая терапия, примененная в группе сравнения не достаточно эффективна для восстановления цитокинового равновесия. Можно предположить, что сохраняющаяся иммунологическая дисфункция является патогенетически значимым механизмом в поддержании хронического вялотекущего воспалительного процесса в шейке матки и является основой для периодических обострений заболевания. Вероятно, недостаточно высокая эффективность терапии ХНЦ в группе сравнения (68,8%) обусловлена нарушением иммунного реагирования в результате дисфункции цитокинового каскада.

На основании мнения ряда авторов о важной роли генов цитокинов и TLR в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения заболеваний (B.C. Баранов, 2000; A.A. Берлин, 2006; Б.А. Биджиева, 2007; JI.B. Ганковская, 2009; О.П. Гумилевская; Б.Ю. Гумилевский, 2010; О.Г. Кабурнеева, 2012; Л.П. Малежик, 2012), а также изучив результаты цитокинового профиля, было решено проанализировать влияние иммуногенетических особенностей пациенток на эффективность лечения. Оказалось, что в группу сравнения вошли 28 пациенток из 72 женщин с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro). Именно у них проведенная терапия была менее эффективна по сравнению с 36 пациентками с гомозиготным Ser/Ser или гетерозиготным Ser/Pro генотипами в гене TLR6 (Ser249Pro) (табл. 6).

Таблица 6.

Сравнение эффективности проведенной терапии в группе сравнения между пациентками с различными генотипами в гене Т1Л16_

Вид исследования Полученные результаты Группа сравнения, п=64

Пациентки носители мутации в TLR6, п=28 Пациентки без мутации в TLR6, п=36

Сбор жалоб Умеренные выделения 6 (21,4%) 4(11,1%)

Неприятный запах 6 (21,4%) 0

Отсутствие жалоб 22 (78,5%) 32 (88,8%)

Осмотр шейки матки в зеркалах Гиперемия, отечность 16(57,1%)* 4(11,1%)

Норма 10 (39,2%)* 34 (94,4%)

Бактериоскопия влагалищного секрета Нормоценоз 6 (21,4%)* 20 (55,5%)

Промежуточный тип 8 (28,5%)* 16 (44,4%)

Дисбиоз 14 (50%)* 0

Вагинит 0 0

Бактериологическое исследование Gardnerellavagmalis>105 14 (50%)* 0

Candida spp. > 105 2(7,1%) 0

Роста нет 12 (42,8%)* 36 (100%)

Количественное определение лактобактерий более 10s КОЕ/мл 0* 4(11,1%)

10й- 108 КОЕ/мл 0* 16 (44,4%)

10* - 10й КОЕ/мл 20 (71,4%)* 10 (27,7%)

Менее 104 КОЕ/мл 8 (28,5%) 4(11,1%)

Цитологическое исследование I класс мазка 11 (39,2%)* 33 (91,6%)

II класс мазка 16 (57,1%) 4(11,1%)

Кольпоскопия Норма 4 (14,2%)* 20 (55,5%)

Воспаление 16 (57,1%)* 4(11,1%)

Аномальная кольпоскопия I степени 6 (21,4%) 14 (38,8%)

Цигокиновый профиль Повышение уровня Ил-4 28 (100%)* 6(16,6%)

Повышение уровня Ил-17а 28 (100%)* 10 (27,7%)

Повышение ypOBiwIFNy 28(100%)* 10 (27,7%)

Наблюдение в течение 6 месяцев Возникший рецидив заболевания 16(57,1%)* 4(11,1%)

*- значимые различия в пределах одной группы, р<0,05

Назначение этиотропной терапии, восстановление биоценоза влагалища и местная иммунокоррекция человеческим интерфероном альфа-2 с таурином не привело к нормализации уровней трех из исследованных цитокинов: уровни противовоспалительного Ил-4 и провоспалительных Ил-Па, IFNy остались повышенными больше чем у половины пациенток. Причем у носительниц генотипа Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) усиленная продукция как про -, так и противовоспалительных цитокинов констатирована в 100% случаев. В тоже время у пациенток с генотипами Ser/Ser и Ser/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) повышенная активность данных цитокинов наблюдалась лишь у трети пролеченных группы сравнения. Принципиально важно отметить, что у пациенток с мутацией в гене TLR6 частота рецидива заболевания была в 5 раз выше, чем у пациенток этой группы с другими генотипами (57,1% против 11,1%), а эффективность лечения была в 2 раза ниже, соответственно (42,9% против 88,9%).

Принципы врачебной тактики у больных с ХНЦ на основе иммуногенетических критериев с применением вагинальной лазеротерапии и бальнеологического средства «Эльтон»

Многочисленными научными исследованиями доказаны

противовоспалительный, анальгезирующий, репаративный,

иммуномодулирующий и другие эффекты лазеротерапии (Г.Е. Бриль, 2001; A.B. Гапеев, 2006; B.C. Улащик, 2007; C.B. Москвин, 2008; H. Dalgik, 2001; Т.Кага, 2008). В подгруппе Xsl схема была идентичной как для пациенток с генотипом Pro/Pro в генеТЬЯб (Ser249Pro) (п=10), так и для пациенток с генотипами Ser/Ser и Ser/Pro (п=22). Основанием для выбора в подгруппе №2 бальнеологического средства «Эльтон» явились его особенности воздействия на ткань, поврежденную воспалительным процессом (C.B. Толмачева, 2006; H.A. Жаркин, 2007; Т. А. Щетинина, 2008). Схема была также одинаковой как для пациенток с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) (п=6), так и для пациенток с генотипами Ser/Ser и Ser/Pro (п=26). Комплексное воздействие бальнеологического средства «Эльтон» и лазерного излучения может способствовать возникновению синергетического эффекта за счет существенного усиления микроциркуляции, повышения проницаемости эпителия и ускорения диффузии лекарственного средства в месте воздействия (C.B. Москвин, 2010). В ходе нашего исследования было выявлено, что гомозиготы Pro/Pro аллельного варианта SNP мутации в гене TLR6 (Ser249Pro) встречаются в 9,2 раза чаще среди пациенток с ХНЦ, чем среди женщин, не имеющих данного заболевания. В связи с этим мы предположили, что технология лазерного фотофореза должна быть индивидуальной и зависеть от наличия или отсутствия иммуногенетических нарушений, что может также способствовать повышению эффективности комплексного лечения. Иммуногенетическое обследование профиля гена TLR6 в позиции - 249 у

женщин с ХНЦ послужило основой для индивидуализации лечебных мероприятий. Подгруппа №3 была разделена на 2 подгруппы. В подгруппу № За (п=18) вошли пациентки с гомозиготным (Ser/Ser) и гетерозиготным (Ser/Pro) вариантами SNP полиморфизма в гене TLR6 (Ser249Pro), которым применялась «короткая» схема лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон». Зона поражения обрабатывалась бальнеологическим средством «Эльтон», после чего, использовалось инфракрасное лазерное облучение шейки матки. Время воздействия составило 3 минуты, длина волны 0,9 нм, импульсная мощность 5 Вт, частота следования импульса 600 Гц. Сеансы проводились в течение 10 дней, ежедневно, начиная в первую фазу менструального цикла.

В подгруппе №36 (п=14) пациенткам с гомозиготным вариантом SNP мутации Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) была проведена «удлиненная» схема разработанного метода. Поскольку наличие точеных нуклеотидных мутаций промоторных участков генов цитокинов и TLR может предполагать затяжное течение заболевания и наличие рецидивов, вследствие нарушенного иммунного ответа, что было также подтверждено в ходе нашего исследования. Было решено увеличить время лазерного воздействия и количество процедур для достижения стойкого клинического эффекта у пациенток, несмотря на наличие у них мутантной гомозиготы.

Лазерное излучение осуществлялось по вышеописанной методике, однако было увеличено время воздействия до 10 мин, и курс составил 20 процедур, в течение 2 менструальных циклов по 10 сеансов в каждом.

Оценка клинической эффективности разработанного метода лечения

Эффективность проводимой терапии оценивалась по тем же критериям, что и в группе сравнения. Положительная динамика отмечена практически у всех пролеченных основной группы.

После окончания курса лечения лишь у 7,8% больных жалобы на умеренные выделения не исчезли полностью, хотя данные пациентки отмечали значительное улучшение. Жалоба на неприятный запах влагалищного секрета сохранилась только у 3,1% пациенток, что достоверно ниже, чем в группе сравнения — 9,4%.

При осмотре шейки матки в зеркалах лишь у 6 (4,7%) пациенток визуально сохранились изменения слизистой шейки матки воспалительного характера, в виде локальной гиперемии экзоцервикса, отека, против 20 (31,2%) больных в группе сравнения (р<0,05).

Количество лейкоцитов при микроскопировании значительно снизилось в основной группе во всех наблюдениях, как и в группе сравнения, что говорит об эффективности проведенной этиотропной терапии. Во всех подгруппах основной группы дисбиоза влагалища и вагинита обнаружено не было. В то время как в группе сравнения в мазках сохранялись патологические изменения, характерные для дисбиоза влагалища у 21,9% пролеченных (р<0,05). Картина нормоценоза в группе сравнения была

выявлена реже на 17,7%, в подгруппе №1 основной группы реже на 8,3%, а в подгруппе №2 - на 14,6% по сравнению с контрольной группой. Однако в подгруппах №3а и 36 основной группы биоценоз 1 типа превосходил показатели контрольной группы на 2,8% и на 6%, соответственно.

Наиболее значимые результаты были прослежены в подгруппах №3а и 36, в связи с чем, акцент сделали на этих подгруппах.

В подгруппах №3а и 36 количество лактобактерий было в пределах нормы и не отличалось от показателей контрольной группы. Между тем количественная нормализация Lactobacillus spp. произошла лишь у четверти пролеченных группы сравнения.

Отчетливо прослеживалась и положительная динамика по результатам цитологического скрининга. Так, нормальная цитологическая картина (I класс мазка) была определена у всех пациенток подгрупп №3а и №36. Воспалительная цитологическая картина (II класс мазка) сохранилась только у 6 (18,7%) пациенток подгруппы №2 основной группы, что в 1,7 раза ниже по сравнению с показателями группы сравнения (р<0,05).

Надо отметить, что при кольпоскопическом исследовании шейки матки явления воспаления, такие как отечность, гиперемия, площадь йоднегативных зон, а также количество закрытых желез значительно снизились. Так, в группе сравнения уменьшение воспалительных явлений произошло в 2,3 раза по сравнению с исходным показателем, в подгруппе №2 - в 5,9 раза, в остальных наблюдениях критерии, характерные для воспалительного процесса после лечения отсутствовали.

У большинства пролеченных в подгруппах №3а и 36 определялся многослойный плоский эпителий. У 19 (29,6%) из 21 (32,8%) пациенток в основной группе с ранее выявленной эктопией шейки матки отмечалась в зоне трансформации плоскоклеточная метаплазия без атипии, что является физиологическим процессом замещения цилиндрического эпителия многослойным плоским, в результате пролиферации (С.Н. Роговская, 2011). Особенно активным этот процесс был в подгруппах №1 и №3, что объясняется стимуляцией репаративных механизмов низкоинтенсивным инфракрасным лазерным воздействием в зоне патологического очага. У всех пациенток подгруппы №3а и №36 отмечалось интенсивное окрашивание эпителия в коричневый цвет, что свидетельствовало об отсутствии изменений в структуре многослойного плоского эпителия после проведенного курса комплексной терапии. В подгруппе №1 йоднегативные зоны сохранились у 12,5% пролеченных, а в подгруппе №2 - у 25,0%, что достоверно значимо при сопоставлении с группой, где была применена стандартная терапия - 31,2% (р<0,05). Стоит отметить, что регенеративная активность шейки матки была снижена и в подгруппе №1 и в подгруппе №2 у пациенток носительниц мутантной гомозиготы Pro/Pro в reneTLRfi. Именно у этих пациенток описаны воспалительная и аномальная кольпоскопические картины. Данное обстоятельство позволяет сделать

заключение о влиянии генетически-обусловленного нарушения иммунного равновесия на регенеративную способность шейки матки.

Было установлено, что в большинстве случаев цитокиновый профиль пролеченных женщин нормализовался. Применение на втором этапе лечения физиотерапевтических методов лечения позволило достичь более эффективного влияния на воспаление и нормализацию уровней исследованных цитокинов (табл. 7).

Таблица 7.

Пациентки с повышенным содержанием исследуемых цитокинов после лечения _ ___

Интерлейкин пг/мл Группа сравнения, п=64 Основная группа (подгруппа № 1), п=32 Основная группа (подгруппа № 2), п=32 Основная группа (подгруппа КаЗа), п=36 Основная группа (подгруппа № 36), п=28

Ил-6 6 (9,4%) 2 (6,2%) 2 (6,2%) 0* 0*

Ил-10 4 (6,2%) 2 (6,2%) 2 (6,2%) 0* 3 (10,7%)

Ил-10 6 (9,4%) 2 (6,2%) 2 (6,2%) 0* 0*

Ил-4 38 (59,4%) 18(56,2%) 4 (12,5%)* 2 (5,5%)* 3 (10,7%)*

Ил-Па 38 (59,4%) 2 (6,2%)* 14 (43,7%) 0* 3 (10,7%)*

38 (59,4%) 4 (12,5%)* 16 (50,0%) 2 (5,5%)* 1 (3,5%)*

Т№а 0 0 0 0 0

Примечание: достоверность различий показателя по отношению к показателю группы сравнения (*) р<0,05

Так, включение в комплекс лечения инфракрасного низкоинтенсивного лазерного облучения шейки матки позволило уменьшить долю пациенток с высоким уровнем Ил-17а с 59,4% до 6,2% и с повышенным уровнем ГИЫу с 59,4% до 12,5%. Однако количество пациенток с измененным уровнем противовоспалительного Ил-4 в подгруппе №1 основной группы осталось неизменно большим.

Применение в комплексном лечении ХНЦ на втором этапе бальнеологического средства «Эльтон» так же позволило достичь восстановления цитокинового профиля. Так, количество женщин с повышенным уровнем Ил-4 снизилось с 59,4% до 12,5%, а количество женщин с другими повышенными цитокинами было ниже, но достоверно не отличалось. Число больных с высокой выработкой Ил-17а в подгруппе №2 было ниже на 15,7%, а с увеличенной концентрацией 1РЫу ниже на 9,4% относительно числа пациенток группы сравнения.

Можно заключить, что применение преформированных факторов в комплексном лечении ХНЦ позволяет ликвидировать воспалительный процесс, что отражается в нормализации цитокинового профиля. Причем примененные дополнительные методы терапии стабилизируют разные цитокины, что позволяет предположить о влиянии этих методов на разные патогенетические механизмы заболевания.

Однако, сохранившаяся усиленная экспрессия IFNy у 4 пролеченных больных подгруппы №1 (12,5%) в дальнейшем наблюдении за пациентками выразилась в возникновении рецидива заболевания. Таким образом, эффективность терапии в подгруппе №1 составила 87,5%, что на 16,9% выше относительно пациенток группы сравнения.

В то же время у пациенток с мутацией в гене TLR6 частота рецидива была выше на 20,9%, чем у пациенток этой группы с другими генотипами, что, как и в группе сравнения, говорит о влиянии генетических особенностей на течение заболевания, а эффективность проведенной терапии составила70,0% и 90,9%, соответственно.

Эффективность терапии в подгруппе №2 составила всего 75,0%, что на 6,2% выше относительно пациенток группы сравнения.

Такую незначительную разницу можно объяснить также генетическими особенностями, поскольку у 3 из 6 пациенток с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro), и лишь у 5 больных с другими генотипами повторно появились клинические симптомы и нарушение эпителиального покрова шейки матки в течение 6 месяцев после лечения. Таким образом, в подгруппе №2 рецидив заболевания возник у каждой второй пациентки с мутацией в гене TLR6 и у каждой пятой с нормальным генотипом, соответственно эффективность проведенной терапии в этой составила 50,0 % и 80,7%.

Сочетанное применение бальнео - и лазеротерапии в комплексном лечении ХНЦ в подгруппах №3а и №36 основной группы, оказало более выраженное положительное влияние на течение патологического процесса, регрессию клинических проявлений болезни. В результате разработанной схемы индивидуального лечения были получены данные о клиническом выздоровлении, элиминации условно-патогенных микроорганизмов, восстановлении нормобиоценоза влагалища, нормализации иммунологического статуса и полноценной эпителизации шейки матки у пациенток подгруппы №3а.

Рецидив заболевания в подгруппе №3а возник лишь в 2 случаях, когда отмечалась повышенная продукция Ил-4 и IFNy, что подтверждает зависимость рецидивирования процесса от иммунологического дисбаланса. Эффективность лечения в подгруппе №3а составила 94,5%, что в 1,4 раза выше, чем у пациенток группы сравнения.

Однако если проанализировать и сравнить полученные результаты только у пациенток, не имеющих в своем генотипе мутантную гомозиготу генаТЬЯб, то разница в эффективности терапии была незначительная. Между группой сравнения и подгруппой №3а - 5,6%, среди таких же пациенток подгруппы №1 и подгруппой №3а - 3,6% и между подгруппой №2 и подгруппой №3а — 13,8%, что достоверно не значимо и подтверждает иммуномодулирующие свойства лазеротерапии и бальнеологического средства «Эльтон».

Анализ эффективности проведенного лечения ХНЦ у пациенток носительниц гомозиготы Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) обнаружил достоверно значимые различия. Лишь у 3 (10,7%) больных подгруппы №36 основной группы были отмечены повышенные уровни IFNy, Ил-10 и Ил-17а, что может быть объяснено измененной реактивностью врожденного иммунитета, за счет генотипа Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro), что в дальнейшем проявилось вновь возникшими симптомами, дисбиозом влагалища и изменением эпителиального покрова шейки матки.

Несмотря на это, в подгруппе №36 эффективность проведенной терапии составила 89,3% и была выше относительно женщин с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 (Ser249Pro) группы сравнения в 2 раза, подгруппы №1 на 19,3% и подгруппы №2 в 1,7 раза.

Таким образом, определение у пациенток с ХНЦ мутации TLR6 (полиморфизм - Ser249Pro) позволяет прогнозировать течение заболевания и его исход. Разработанная схема лечения с комбинацией преформированных факторов на основе иммуногенетических критериев позволила повысить эффективность терапии ХНЦ в 2 раза.

Разработанный метод лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон» прост, неинвазивен, атравматичен, легко переносится пациентками, доступен и может быть осуществлен на уровне амбулаторно-поликлинического звена.

Результаты проведенного нами исследования положены в основу способа лечения подострых и хронических неспецифических цервицитов нерожавшим женщинам, включающий курс лазерного фотофореза с применением бальнеологического средства «Эльтон» - гель (патент на изобретение № 2495689 от 20 октября 2013 года).

Научное значение полученных данных заключается в патогенетическом обосновании комплексной индивидуальной терапии у больных с ХНЦ.

Практическая значимость полученных данных заключается в повышении эффективности лечения больных с ХНЦ, учитывающего иммуногенетические особенности пациентки.

Индивидуальный подход в лечении ХНЦ позволил достичь у пациенток, носительниц мутантной гомозиготы Pro/Pro в гене TLR6, элиминации микробного агента, восстановления влагалищной микрофлоры, нормализации иммунологического статуса и активации регенеративной способности шейки матки в 89,3% случаях, что выше относительно женщин с таким же генотипом группы сравнения в 2 раза, подгруппы №1 - на 19,3% и подгруппы №2 - в 1,7 раза.

Выводы

1. Среди пациенток с ХНЦ мутантные гомозиготы Pro/Pro в гене TLR6 в позиции - 249 встречались у каждой третьей обследованной больной, что в 9,2 раза чаще, чем среди женщин, не имеющих данного заболевания - 37% против 4% (р< 0,01).Предиктором ХНЦ является носительство гомозиготы

Pro/Pro TLR6, которое ассоциировано с рецидивированием и хронизацией воспаления в шейке матки.

2. Для больных ХНЦ на современном этапе характерны стертые клинические формы, длительное рецидивирующее течение, несмотря на проводимую терапию. Эффективность общепринятой терапии ХНЦ в группе сравнения составила 68,8% и была обусловлена сохранением дисфункции цитокинового каскада, в виде повышения сывороточного уровня Ил-4, Ил-17а, IFNy у 59,4% пациенток. У больных с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 эффективность лечения была в 2 раза ниже, чем у пациенток этой группы с другими генотипами (42,9% против 88,9%).

3. Включение в комплекс лечения вагинальной лазеротерапии позволило уменьшить количество пациенток с высоким уровнем Ил-17а в 9,6 раза, а с повышенным уровнем IFNy в 4,7 раза (р<0,05). Сохранившаяся усиленная экспрессия IFNy в 12,5% случаях в дальнейшем сопровождалась возникновением рецидива заболевания. Эффективность терапии составила 87,5%. Однако у пациенток с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 эффективность лечения была ниже на 20,9%, чем у пациенток этой группы с другими генотипами (70,0% против 90,9%).

4. Эффективность комплексной терапии с использованием бальнеологического средства «Эльтон» составила 75,0%, что на 6,2% выше относительно группы сравнения. У больных с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 эффективность лечения была ниже на 29,3%, чем у пациенток этой группы с другими генотипами (50,0 % против 80,7%).

5. В результате применения разработанной «короткой» схемы лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон» клиническое выздоровление имело место в 94,5% случаях, что в 1,4 раза выше, чем у пациенток группы сравнения. У больных, не имеющих в своем генотипе мутантную гомозиготу renaTLR6, разницы в эффективности терапии во всех группах достоверно не отмечалось, что подтверждает иммуномодулирующие свойства лазеротерапии и бальнеологического средства «Эльтон».

6. Включение разработанной «удлиненной» схемы лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон» пациенткам с генотипом Pro/Pro в гене TLR6 в позиции - 249 позволило нормализовать биоценоз влагалища, цитокиновый баланс и усилить репаративную активность шейки матки в 89,3% случаях, что выше относительно женщин с таким же генотипом группы сравнения в 2 раза, подгруппы №1 на 19,3% и подгруппы №2 в 1,7 раза.

Практические рекомендации

1. Для оценки риска развития хронизации воспалительного процесса в шейке матки и затяжного течения заболевания женщинам с ХНЦ рекомендуется проводить иммуногенетическое обследование профиля гена TLR6 в позиции - 249.Для оценки Т- клеточного звена иммунитета больных

ХНЦ рекомендуется определить содержание в периферической крови Ил-4, Ил-17а, IFNy.

2. На первом этапе лечения с учетом этиологического фактора и чувствительности к антибиотикам рекомендуется назначать пациентке с ХНЦ антибактериальные препараты последнего поколения в средне — терапевтической дозировке по стандартной схеме. С целью местной санации целесообразно применять комбинированные препараты, обладающие противопротозойным и противогрибковым действием, после которых использовать свечи, восстанавливающие лактофлору влагалища.

3. В качестве лечебного фактора в комплексной терапии больных с ХНЦ на втором этапе лечения рекомендуется использовать лазерный фотофорез бальнеологического средства «Эльтон» в «короткой» или «удлиненной» схемах, в зависимости от наличия у пациентки мутантной гомозиготы reHaTLRö. Метод заключается в следующем:

Пациенткам с гомозиготным (Ser/Ser) и гетерозиготным (Ser/Pro) генотипами в гене TLR6 (Ser249Pro) применить «короткую» схему, для этого зону поражения обработать бальнеологическим средством «Эльтон», после чего, использовать инфракрасное лазерное облучение шейки матки. Время воздействия - 3 минуты, длина волны - 0,9 нм, импульсная мощность - 5 Вт, частота следования импульса - 600 Гц. Сеансы проводить в течение 10 дней, ежедневно, начиная в первую фазу менструального цикла. • Пациенткам с гомозиготным вариантом SNP мутации Рго/Рго в гене TLR6 (Ser249Pro) применить «удлиненную» схему разработанного метода. Лазерное излучение осуществить по вышеописанной методике, при этом необходимо увеличить время воздействия до 10 мин курсом - 20 процедур, в течение 2 менструальных циклов по 10 сеансов в каждом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лемякина Е.В. Особенности цитокинового статуса пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом после различных вариантов терапии / Е.В. Лемякина, Б.Ю. Гумилевский, H.A. Жаркин // Вестник ВолгГМУ. - 2013. - №2(46). - С. 103-106.

2. Опыт применения лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон» в комплексном лечении неспецифических цервицитов у нерожавших женщин / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, Б.Ю. Гумилевский, H.A. Бурова //Медицинский альманах:рецензируемый медицинский научно-практический журнал. - 2013. - № 6(30). - С. 87-89.

3. Лемякина Е.В. Особенности SNP полиморфизма генов Toll рецепторов при хроническом неспецифическом цервиците / Е.В. Лемякина, Б.Ю. Гумилевский // Врач-аспирант. - 2013. - №6.3(61). - С. 427-431.

4. Медицинская реабилитация пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом, основанная на

нммуногенетнческих критериях [Электронный ресурс] / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, БЛО. Гумилевский, H.A. Бурова // Прикладные информационные аспекты медицины: научно-практический электронный журнал. - 2013. -Т. 16. - № 2. - С. 102107.

5. Лемякина Е.В. Лечение неспецифических цервицитов у нерожавших женщин с применением бальнеологического средства « Эльтон- гель» для лазерного фотофореза // Тезисы III Общероссийского семинара « Репродуктивный потенциал России: казанские чтения. Здоровье женщины - здоровье нации" (27 февраля -1 марта 2013 года, Казань). -М.: Изд-во журнала Status Praesens, 2013. - С. 42-43.

6. Лемякина Е.В. Оценка SNP полиморфизма гена рецептора Toll - 6 (Ser249Pro) у пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом / Е.В. Лемякина, Б.Ю. Гумилевский, H.A. Жаркин // Российский иммунологический журнал. - Т. 7(16). - №2-3. - 2013. - С. - 279.

7. Особенности цитокинового спектра крови пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом / Е.В. Лемякина, Б.Ю. Гумилевский, H.A. Жаркин, H.A. Бурова // Материалы Научно - практической конференции с международным участием "Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья девочек». -М., 2013.-С. 100-101.

8. Лемякина Е.В. Нормализация биоценоза влагалища при хроническом неспецифическом цервиците / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, H.A. Бурова // Материалы IV международной научной конференции молодых ученых «Новейшие технологии медицинской реабилитации в санаторно-курортных условиях». - Одесса, 2013. - С. 38-39.

9. Лемякина Е.В. Индивидуализация восстановительного лечения при хронических неспецифических цервицитах на основе иммуногенетических критериев // Материалы IV международной научной конференции молодых ученых «Новейшие технологии медицинской реабилитации в санаторно-курортных условиях». -Одесса, 2013. - С. 40-41.

10. Лемякина Е.В. Комплексное лечение неспецифических цервицитов у нерожавших женщин / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, H.A. Бурова // Лекарственный вестник. - 2012. - Т.6. - №8 (48). - С. 35-39.

11. Влияние лазерного фотофореза бальнеологического средства «Эльтон» на провоспалительные цитокины пациенток с хроническим неспецифическим цервицитом / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, Б.Ю. Гумилевский, H.A. Бурова // Материалы XIV Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М., 2013. - С. 333-334.

12. Лемякина Е.В. Значение природных преформированных факторов в лечении и реабилитации больных с хроническим неспецифическим цервицитом / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, H.A. Бурова // Лекарственный вестник. - 2013. - Т.7, №4 (52). - С. 37-40.

13. Лемякина E.B. Способ лечения подострых и хронических неспецифических цервицитов нерожавшим женщинам, включающий курс лазерного фотофореза с применением бальнеологического средства "Эльтон"- гель: патент РФ № 2495689 / Е.В. Лемякина, H.A. Жаркин, H.A. Бурова. - Заявлено: 08.08.2011; Опубликовано: 20.10.2013.

14. Шатилова Н.В. Цитокиновый профиль пациенток с бактериальным вагинозом [Электронный ресурс] / Н.В. Шатилова, H.A. Бурова, Е.В. Лемякина // Материалы 16-ой Поволжской научно - практической конференции акушеров-гинекологов, неонатологов и педиатров "Проблемы сохранения здоровья матери и ребенка". Волгоград, 15-16 мая 2014. - Волгоград, 2014. - С. 43-45. - CD - диск.

Список сокращений

ХНЦ - хронический неспецифический цервицит

Ил - интерлейкины

ИФА - иммуноферментный анализ

IFNy - интерферон-гамма

TNFa - фактор некроза опухоли альфа

TLR - толл-подобные рецепторы

SNP - единичный нуклеотидный полиморфизм

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЦИН - цервикальная интраэпителиальная неоплазия

РШМ - рак шейки матки

Подписано в печать 08.09 2014 г. Формат 60 * 84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,6. Тираж 110 экз. Заказ 1332.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Волгоградское научное издательство» 400011, г. Волгоград, ул. Электролесовская, 55.