Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль оксида азота и альфа-токоферола в системе мать - плод и постнатальном эритроцитарном системогенезе при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у белых крыс
- Ученая степень
- доктора медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.03.03
Автореферат диссертации по медицине на тему Роль оксида азота и альфа-токоферола в системе мать - плод и постнатальном эритроцитарном системогенезе при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у белых крыс
На правах рукописи
Иванова Анастасия Сергеевна
РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА И АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА В СИСТЕМЕ МАТЬ - ПЛОД И ПОСТНАТАЛЬНОМ ЭРИТРОЦИТ АРНОМ СИСТЕМОГЕНЕЗЕ ПРИ НАРУШЕНИИ МАТОЧНО-ПЛАЦЕНТАРНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ У БЕЛЫХ КРЫС
14.03.03 - Патологическая физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
4 Дп{ 2014
Москва-2015
005556184
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Назаров Сергей Борисович
Официальные оппоненты:
академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Захаров Юрий Михайлович заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВГ10 ««Южно-Уральский государственный медицинский университет»» Министерства здравоохранения Российской Федерации
доктор медицинских наук, профессор Демуров Евгений Аркадьевич профессор кафедры общей патологии и патологической физиологии ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов
доктор медицинских наук, профессор Каюмова Алия Фаритовна заведующий кафедрой нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита диссертации состоится «/9 у> 2015 года в «_» часов на заседа-
нии диссертационного совета Д 208.072.05 на базе ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. Г).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте http://rsmu.ru ГБОУ ВПО «Российский национатьный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
Автореферат разослан 2014 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук,
доцент
Кузнецова Татьяна Евгеньевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Функциональная система мать - плод обеспечивает сложные интегративные взаимоотношения между матерью и плодом (Гармашева Н. Л., Константинова Н. Н.,1978; Колесников С. И., Морозова Л. М.,1985; Савченков Ю. И., Лобынцев К. С., 1980; Назаров С. Б., 1995). Неотъемлемым ее компонентом является плацента. Этот орган напрямую определяет антенатальное развитие организма. При изменении размеров, функциональной активности плаценты, нарушении кровообращения, транспорта питательных веществ и кислорода через фетоплацентарный барьер возникает комплекс изменений, называемых «задержка внутриутробного развития» (ЗВУР), что оказывает негативное влияние на рост и развитие организма в постнатальном онтогенезе (Денисова Т. Г., 2013; Джобава Э. М., 2012; Камилова Н. М., 2010; Крымшокалова 3. С., 2009; Fu W. et al, 2005; Jobgen W. S. et al.,2006; Wu G. et al., 2004). По данным литературы, в настоящее время частота возникновения плацентарной недостаточности колеблется от 30 до 77% (Клементе А. X. М., 2012; Савельева Г. М. и др., 1991; Радзинский В. Б., Ордиянц И. М., 1999; Тютюн-ник В. Л. и др., 2003).
Для решения указанной проблемы необходимо изучение клинических, патофизиологических и патоморфологических основ плацентарной недостаточности. Ведущим механизмом развития фетоплацентарной недостаточности является нарушение маточно-плацентарного кровообращения (НМПК) (Закурина А. Н. и др., 2010; Протопопова Н. В. и др., 2012; Стрижаков А. П. и др., 1988; Сидорова И. С., Макаров И. О., 2000). Возникающая на фоне данной патологии внутриутробная гипоксия, изменяет газовый состав крови, трофику и метаболизм тканей, оказывает повреждающее действие на органы и системы плода, что является важной причиной перинатальной заболеваемости и смертности (Луканская Е. Н., 2013; Полячи-кова О. Л. и др., 2009; Nusken K.-D. et al., 2008). Кроме того, хронический дефицит кислорода приводит к нарушению механизмов адаптации плода к родам (Пересада О. А., Котова Г. С., 2009; Сидорова И. С., Макаров И. О., 2000).
Проблема НМПК и его влияние на плод в настоящее время активно изучается, однако проведение исследований в условиях клиники представляет собой достаточно трудную задачу с точки зрения сложности изучения на уровне органов и тканей, в связи с чем более удобными являются экспериментальные исследования (Гужвина Е. Н. и др., 2011; ХайбуллинаЗ. Р., 2011; Wu G. etal., 2006). Для моделирования плацентарной недостаточности создавали гипокснчсскую гипоксию (По-годаев К. И. и др., 1983), перевязывали сосуды пуповины (Студеникин М. Я. и др., 1984), использовали кровопотерю (Константинова Н. Н. и др.,1983; Шевелева Г. А. и др., 2001), лигировали каудальную полую вену (Бородин Ю. И. и др.,1987, 1992), дозировано вводили гипертонический раствор хлорида натрия в область расположения преплацентарных сосудов плодовместилища (Кравцова Н. В. и др., 2010), тромбировали венозные сосуды с использованием тромбопластина (Клименко Т. А. и др., 1982). Однако, по мнению большинства авторов, наиболее адекватным
способом воспроизведения фетоплацентарной недостаточности является лигирова-ние преплацентарных сосудов (Лысая Т. Н. и др., 1990; Клименко Т. А. и др., 1982; Кучерявенко А. Н., Карымшакова К. К., 1985; Lane R. Н. et al., 1996; 1998; Ozanne S. E., 2001; Pan S. L., Yu Y. H., 2002; Simmons R. A. et al., 2001).
В последние годы значительно возрос интерес к оксиду азота (NO), который является соединением с широким функциональным спектром действия (Барбараш Н. А. и др., 2011; Новицкий В. В. и др., 2011; Реутов В. П. и др., 1993; Рязанцева Н. В. и др., 2012; Hanafy К. A. et al., 2001). Известно, что изменение уровня NO в организме при беременности приводит к появлению классических симптомов эклампсии, нарушению развития плаценты, изменению ее кровообращения, эм-брио- и фетопатиям, внутриутробной задержке роста и смерти плода (Иванова О. Ю. и др., 2010; Линде В. А. и др., 2011; Мурашко Л. Е., 2009; Purcell Т. L. et al., 1997; Rosseli М. et al., 1998). Оксид азота может выступать фактором как пато-, так и саногенеза при фетоплацентарной недостаточности (Новиков А. А., 2005; Шесто-палов А. В., 2007; Wu G. et al., 2006). В условиях гипоксии с одной стороны повышается продукция NO, а с другой - снижается синтез необходимых факторов для образования этого соединения, что приводит к дефициту оксида азота в первую очередь в сосудах (Shi W. et al., 2004). Поэтому, в стандартную терапию хронической фетоплацентарной недостаточности в последние годы включаются препараты L-аргинина (источника синтеза NO) и донаторы оксида азота (Буштырева И. О. и др., 2006; Малаховская Е. А., Зайнулина М. С., 2004).
При повышении концентрации оксида азота, в условиях хронической гипоксии активируются свободнорадикальные процессы, образуется высокотоксичное соединение пероксинитрит, который вызывает повреждение клеток и тканей (Дже-риева И. С., Волкова Н. И., 2011; Линде В. А. и др., 2011; Стародубцева М. Н., 2011). Окислительный стресс является важной проблемой акушерства, так как на ранних этапах онтогенеза способности антиоксидантной системы очень ограничены, и развивающийся эмбрион и плод очень чувствительны к высокой концентрации сво-боднорадикальных продуктов, особенно в периоды органогенеза (Castillo С. et al., 2005; Fuji i J. et al., 2005). Поэтому, представляется важным изучить влияние альфа-токоферола как фактора коррекции НМПК. Этот витамин тормозит процессы пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) и взаимодействует со свободными радикалами, он быстрее других антиоксидантов используется в окислительных реакциях (Нач-кина Э. И., 2003).
Оксид азота синтезируют большое количество клеток, среди которых инду-цибельная NO-синтаза (iNOS) макрофагов, существенно влияющая на активность фагоцитов. Макрофаги в женской репродуктивной системе участвуют во множестве функций: регулируют образование сосудов и апоптоз в плаценте, осуществляют взаимодействие в системе мать - плод, синтез стероидных гормонов, образование фолликулов и желтого тела (Павлов О. В., Сельков С. А., 2011; Румянцева В. П. и др., 2012; Сельков С. А., Павлов О. В., 2010; Степанова О. И. и др., 2013; Талаев В. Ю. и др., 2012; Шестопалов А. В., 2007; Ietta F. et al., 2007; Kaufmann P. et al., 2003; Zicari M. D., Tícconí M. D. С., 2006).
Несмотря на большое количество работ, посвященных вопросам патогенеза нарушения фетоплацентарного кровотока и его коррекции, данные об изменениях функциональной активности макрофагов в этих условиях малочисленны. Также отсутствует сравнительная характеристика влияний биологически активных веществ на перитонеалыше и плацентарные макрофаги. Изучение in vitro роли метилового эфира L-аргинина (L-NAME) и липополисахарида Е. cotí (ЛПС) обусловлено тем, что первый является ингибитором NO-синтазы (NOS) и позволит оценить функцию макрофагов при блокаде этого фермента (Rosseli M. et al., 1998), а второй является активатором индуцибельной NO-синтазы и играет важную роль в патогенезе внутриутробных инфекций (Милош Т. С., 2010; Zhao L. et al., 2008). Кроме того, оба вещества используют для экспериментального моделирования эклампсии (Sakawi Y. et al., 2000). Оценка влияния женских половых гормонов позволит изучить состояние мембранных рецепторов макрофагов к ним, активность которых может меняться при различной патологии беременности (Ширшев С. В., Некрасова И. В., 2011; Andronowska A., Chrusciel M., 2008). Аномальная беременность нарушает соотношение прооксидантной и антиоксидантной систем (Клементе А. X. М., 2011; Тюренков И. Н. и др., 2013; Занько С. Н., 2010; Fujii J. et al., 2005). Водорастворимый аналог токоферола и супероксиддисмутаза (SOD) позволят изучить in vitro влияние антиоксидантов на активность макрофагов.
В литературе, посвященной вопросам перинатальной гипоксии, большое внимание уделяется проблемам патогенеза нарушений у детей, развивавшихся в условиях дефицита кислорода (Логинова И. Г. и др., 2013; Пересада О. А., Котова Г. С., 2009). Известно, что при дефиците кислорода активация эритроцигарной системы происходит уже внутриутробно (Huch R., Huch А., 1993; MaierR. et al., 1994). Поэтому, с нашей точки зрения является актуальным исследование влияния антенатальной гипоксии на процессы становления этого звена кислородтранспортной системы. Как уже говорилось выше, при НМПК происходит изменение образования оксида азота, нарушается регуляция свободнорадикальных процессов. Поэтому, помимо влияний дефицита кислорода, представляется важным сравнить саногенетический эффект донатора NO и альфа-токоферола на постнатальное развитие эритроцитарной системы.
СТЕПЕНЬ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Известно, что течение беременности, в том числе и физиологической, сопровождается увеличением продукции оксида азота и активацией ПОЛ, развивающейся в результате регуляторного дисбаланса между процессами свободноради-кального окисления и антиоксидантной защиты. Однако, в литературе отсутствуют данные о воздействии избытка и недостатка NO и свободных радикалов на все компоненты системы мать - плод.
Проблема плацентарной недостаточности и ее влияние на плод в настоящее время активно изучается, но, несмотря на это, частота встречаемости этой патологии беременности остается высокой. Существует большое количество работ, посвященных плацентарной недостаточности, но комплексная оценка изменений в
системе мать - плод, а также влияние избытка и недостатка N0 и свободных радикалов не описано. Также малочисленны данные об изменениях функциональной активности макрофагов в этих условиях. Отсутствует сравнительная характеристика влияний биологически активных веществ на перитонеальные и плацентарные макрофаги при физиологической беременности и при беременности с НМПК.
В условиях внутриутробной гипоксии у плода происходит изменение работы эритроцитарной системы. Практически отсутствуют данные об особенностях ее постнатального развития и путях внутриутробной фармакологической коррекции возможных нарушений.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Установить значение оксида азота и свободнорадикальных процессов в системе мать - плод и постнаталыюм эритроцитарном системогенезе у белых крыс при нарушении маточно-плацентарного кровообращения.
ЗАДАЧИ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Установить состояние продукции оксида азота и свободнорадикальных механизмов при физиологической беременности и при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у белых крыс.
2. Оценить влияние экзогенного донатора, ингибитора синтеза оксида азота и альфа-токоферола на эритроцитарный состав периферической крови, продукцию N0, сво-боднорадикальные процессы и функциональную активность макрофагов у беременных крыс в норме и при нарушении маточно-плацентарного кровообращения.
3. Изучить особенности воздействия ряда биологически активных веществ (Ь-ЫАМЕ, ЛПС, водорастворимые формы эстрадиола и прогестерона, водорастворимый аналог токоферола 1го1ох, супероксиддисмутаза) на функции перитонеальных и плацентарных макрофагов в норме и при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у крыс.
4. Исследовать воздействие экзогенного донатора, ингибитора синтеза оксида азота и альфа-токоферола на морфологические и метаболические характеристики плаценты, эритроцитарный состав периферической крови и продукцию N0 у плодов крыс при физиологической беременности и в условиях нарушения маточно-пла-центарного кровообращения.
5. Оценить особенности влияния антенатальной гипоксии на развигие потомства белых крыс по показателям, характеризующим образование оксида азота, эритроцитарный системогенез и активность эритрофагоцитоза.
6. Изучить воздействие донатора оксида азота и альфа-токоферола, используемых в условиях антенатальной гипоксии, на продукцию N0 и развитие эритроцитарной системы у крысят.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые установлено, что ведение нитрита натрия, Ь-ИАМЕ и альфа-токоферола в организм беременных крыс при физиологической беременности и в сочетании с нарушением маточно-плацентарного кровообращения меняет не только
уровень N0 и содержание свободных радикалов, но и концентрацию эндотелиаль-ного фактора роста (УЕОР-С), кальция в материнской крови.
Установлено, что уровень оксида азота и состояние прооксидантной и анти-оксидантной систем организма существенно изменяют активность перитонеальных и плацентарных макрофагов.
При изучении влияния Ь^АМЕ, ЛПС, эстрадиола и прогестерона, аналога токоферола 1то1ох, супероксиддисмутазы на активность макрофагов, установлено, что действие этих веществ зависит от места локализации макрофагов и наличия или отсутствия экспериментальной патологии беременности.
Установлено, что в плацентах крыс, получавших нитрит натрия, Ь-ИАМЕ, альфа-токоферол при физиологической беременности, а также при НМПК, наблюдаются изменения, приводящие к возникновению задержки внутриутробного развития и гипоксии плода.
Установлены закономерности изменения образования N0 и эритроцитарного системогенеза у плодов и крысят, развивавшихся в условиях антенатальной гипоксии.
Установлено влияние донатора N0 и альфа-токоферола, применяемых в условиях экспериментальной патологии беременности, на постнатальное развитие эритроцитарной системы.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ
Работа имеет значение для углубленного понимания механизмов, лежащих в основе регуляции работы системы мать - плод. Полученные результаты дают возможность расширить представления о роли оксида азота и альфа-токоферола в организме млекопитающих.
Особое внимание уделяется биологическим факторам воздействия на плацентарные макрофаги и макрофаги, образующие перитонеальное микроокружение органов репродуктивной системы. Полученные данные совершенствуют представление о роли N0, женских половых гормонов, антиоксидантов в регуляции функции макрофагов при физиологической и патологической беременности. Оценка влияния N0, женских половых гормонов, антиоксидантов на функции фагоцитов как значимых продуцентов биологически активных веществ при патологической беременности открывает возможности разработки селективных методов коррекции функции макрофагов. Это обеспечит новые подходы к целенаправленной, патогенетически обоснованной терапии фетоплацентарной недостаточности, улучшит перинатальные исходы у новорожденных.
Неблагоприятное влияние альфа-токоферола, используемого во время беременности, на кровообращение в плаценте и состояние плода, ограничивает возможности использования антиоксидантов для рациональной патогенетической терапии фетоплацентарной недостаточности.
Имеется возможность в динамике проследить особенности эритроцитарного системогенеза в ранний период постнатального развития при физиологической беременности и беременности с НМПК. Проведена сравнительная оценка эффективности патогенетической терапии НМПК экзогенным N0 и витамином Е с точки
зрения влияния этих веществ на развитие эритроцитарной системы у плодов и в ранний постнатальный период. Дано теоретическое обоснование целесообразности применения препаратов - донаторов оксида азота и антиоксидантов для лечения хронической фетоплацентарной недостаточности.
РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты работы внедрены в учебный процесс (лекционный курс) ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре нормальной физиологии (Акт о внедрении предложения «Особенности функционирования системы мать - плод при воздействии донатора оксида азота и ингибитора его синтеза»), на кафедре патофизиологии, клинической патофизиологии и иммунологии (Акт о внедрении предложения «Особенности эритроцитарного системогенеза плодов и крысят, развивавшихся при нарушении маточно-плацентарного кровообращения»), на кафедре фармакологии и клинической фармакологии (Акт о внедрении предложения «Особенности влияния альфа-токоферола на функциональную систему мать - плод при неосложненной беременности»), в практику работы лаборатории клинической биохимии и генетики ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В. Н. Городкова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Акт о внедрении предложения «Оценка влияния биологически активных веществ на функциональную активность макрофагов»).
МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование экспериментальной патологии беременности. Уменьшение количества сосудов, кровоснабжающих плод, позволяет получить нарушение работы системы мать - плод в виде экспериментальной модели фетоплацентарной недостаточности у здоровых животных.
Метод хронического эксперимента позволяет исследовать физиологические и биохимические показатели жизнедеятельности организма при физиологической беременности и беременности с НМПК.
Фармакологические воздействие непосредственно на животных. Различные вещества по-разному влияют на состояние системы мать - плод. Это позволяет изучать зависимость ее функционирования от изменений уровня различных факторов в организме.
Прямое воздействие на макрофаги биологически активными веществами. Этот метод позволяет вмешиваться в естественную регуляцию работы фагоцитов и сравнить их функцию при физиологической беременности и беременности с НМПК.
Метод сравнения позволяет выявить сходства и различия в работе системы крови и показателях внутренней среды при физиологической беременности и беременности с НМПК.
Онтогенетическое изучение. Изучая развитие эритроцитарной системы у интактных крысят и у крысят, развивавшихся в условиях гипоксии, можно установить, какие изменения в ней являются физиологическими, а какие - патогенетического характера.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1. Нитрит натрия и метиловый эфир Ь-аргинина при физиологической беременности противоположным образом меняют концентрацию оксида азота в крови беременных крыс, однонаправленно влияют на уровень свободнорадикальных процессов и активность перитонеальных макрофагов и разнонаправлено - на активность плацентарных фагоцитов. Вводимый при беременности альфа-токоферол не влияет на фагоцитарную активность макрофагов, но существенно снижает ПОЛ.
2. Введение беременным крысам нитрита натрия, метилового эфира 1_-аргинина. альфа-токоферола вызывает задержку внутриутробного развития плодов и возникновение внутриутробной гипоксии.
3. Экспериментальная патология беременности уменьшает образование оксида азота, стимулирует свободнорадикальные процессы в крови у беременных крыс, снижает активность перитонеальных макрофагов, но активирует плацентарные макрофаги. Эти изменения в материнском организме сопровождаются нарушениями кровообращения в плаценте и задержкой развития плода.
4. Нарушение маточно-плацентарного кровообращения на фоне поступления донатора N0 усугубляет морфологические изменения плаценты при сохраняющейся гипоксии плода в условиях увеличения оксида азота и нитротирозина как в крови матери, так и плода. Введение метилового эфира Ь-аргинина при НМГЖ приводит к компенсаторному повышению уровня N0 в крови у матери и плода, и уменьшает выраженность ЗВУР плода. Положительного эффекта от длительного введения альфа-токоферола во время беременности при экспериментальном нарушении кровообращения не отмечается.
5. Хроническая гипоксия плода в первые дни постнатального периода жизни крысят приводит к повышению содержания оксида азота в крови, способствует стимуляции эритропоэза в красном костном мозге и печени. Активация эритроцитарной системы приводит впоследствии к нарушению ее функционирования.
6. Поступление оксида азота в организм беременных крыс с НМПК предотвращает нарушение функционирования эритроцитарной системы у их потомства в постнатальном онтогенезе. Альфа-токоферол, вводимый в условиях экспериментальной патологии беременности, не предотвращает отдаленные постгипо-ксические нарушения эритрона у крысят.
СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ Исследования проведены на здоровых животных, содержащихся в условиях специализированного вивария. Число животных в экспериментальных группах было достаточным для достижения достоверных результатов.
Полученные результаты обработаны с использованием различных статистических методов: вариационный анализ, проверка вида распределения, использование параметрических и непараметрических статистических критериев.
По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 15 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ Материалы диссертации доложены и обсуждены на Республиканской научно-практической конференции «Кардиологические проблемы в акушерстве, гинекологии и перинатологии» (Иваново, 2006), XX Съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), ежегодных научно-практических конференциях студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки» (Иваново, 2006, 2010,2011), III Конференции молодых ученых и студентов ФГБУ НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН (Москва, 2012), VII, VIII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012, 2013).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 270 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов. Библиографический список использованной литературы включает 198 работ отечественных авторов и 230 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 39 рисунками и 30 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на белых беспородных крысах-самках, содержащихся в условиях вивария на стандартном рационе питания, имеющих свободный доступ к воде (Западнюк И. П. и др., 1983). Использование крыс в качестве объекта исследований обусловлено с одной стороны тем, что при экспериментальной фето-плацентарной недостаточности гетерохронность отставания в роете и развитии тканей и органов подобна таковой при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у плода человека (Гармашева Н. Л., Константинова Н. Н., 1985). С другой стороны, у крыс, как и у человека, тип плаценты гемохориальный, что имеет важное значение для интерпретации данных при использовании этого вида животных в эксперименте (Карлсон Б., 1983).
Экспериментальное нарушение маточно-плацентарного кровообращения моделировалось с помощью методики М. М. Вартановой (1984) перевязкой 1/3 части преплацентарного сосудистого пучка на 16-й день беременности, т.е. в тот период, когда уже завершена плацентация и происходит полный переход плода на плацентарное кровообращение. Нарушение кровотока через 1/3 всех приводящих и отво-
дящих сосудов вызывает нарушение маточно-плацентарного кровообращения, которое вызывает внутриутробную гипоксию и гипотрофию плода (Томилова И. К 2012).
Для оценки эффектов экзогенного донатора, ингибитора синтеза оксида азота и альфа-токоферола взрослые животные были разделены на 13 групп:
1) интактные небеременные крысы-самки (п = 15);
2) животные с физиологической беременностью (п = 30);
3) небеременные крысы-самки, получавшие вместо питьевой воды донатор оксида азота 0,2% раствор нитрита натрия в течение 20 дней (группа сравнения) (Roth А. С. etal, 1987) (п= 15);
4) беременные крысы-самки, получавшие вместо питьевой воды 0,2% раствор нитрита натрия с 1-го дня беременности (п = 30);
5) небеременные крысы-самки, получавшие неселективный ингибитор синтеза оксида азота L-NAME в дозе 10 мг/кг внутримышечно ежедневно (Huang H.-S. et al., 2008) в течение 20 дней (группа сравнения) (п = 15);
6) беременные крысы-самки, получавшие L-NAME внутримышечно в дозе 10 мг/кг с 1-го дня беременности (п = 30);
7) небеременные крысы-самки, получавшие фармакопейный альфа-токоферол внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю в течение 20 дней (группа сравнения) (Kilic F.S., Erol К., 2003; Bosland М. С. et al., 2006) (n = 15);
8) беременные крысы-самки, получавшие альфа-токоферол в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 1 дня беременности (п = 30);
9) ложнооперированные беременные крысы (группа сравнения) (п = 10);
10) беременные крысы с экспериментальным НМПК (п = 30);
11) беременные крысы с НМГГК на фоне поступления с питьевой водой 0,2% раствора нитрита натрия с 1-го дня беременности (п = 30);
12) беременные крысы с НМПК на фоне введения L-NAME внутримышечно в дозе 10 мг/кг с 1-го дня беременности (п = 30);
13) беременные крысы с НМПК на фоне введения альфа-токоферола внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 1-го дня беременности (п = 30).
Для изучения влияния НМПК, эффектов экзогенного донатора оксида азота и альфа-токоферола на развитие потомства у белых крыс животные были разделены на следующие группы:
14) животные с физиологической беременностью (взрослых крыс - 10, плодов 22-х дн. - 25, крысят на 2-й день жизни - 36, крысят на 15-й день жизни - 30, крысят на 30-й день жизни - 15);
15) крысы с НМПК на 16 день беременности (взрослых крыс - 10, плодов 22-х дн. - 26, крысят на 2-й день жизни - 32, крысят на 15-й день жизни - 26, крысят на 30-й день жизни - 15);
16) животные с физиологической беременностью, получающие экзогенный донатор оксида азота «Депонит-10» с 16 дня беременности до окончания срока гестации (взрослых крыс - 10, плодов 22-х дн. - 16, крысят на 2-й день жизни - 28, крысят на 15-й день жизни -15, крысят на 30-й день жизни - 15). На внутреннюю поверхность
ушной раковины им наклеивали пластырь площадью 5 мм2 содержащий нитроглицерин - «Депонит-10». Препарат для исследования предоставлен фирмой «Schwarz Pharma», Германия. Пластырь такой площади обеспечивал выделение нитроглицерина со скоростью 0,001мг/кг/ч. Пластырь меняли ежедневно до окончания срока гестации.
17) животные после НМПК, получающие экзогенный донатор оксида азота «Депо-нит-10» с момента операции до окончания срока гестации (взрослых крыс - 10, плодов 22-х дн. -16, крысят на 2-й день жизни - 34, крысят на 15-й день жизни -15, крысят на 30-й день жизни - 15).
18) животные с физиологической беременностью на фоне введения альфа-токоферола внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с 16 дня беременности до окончания срока гестации (взрослых крыс - 10, плодов 22-х дн. - 15, крысят на 2-й день жизни - 15, крысят на 15-й день жизни - 15, крысят на 30-й день жизни - 15);
19) крысы с НМПК на фоне введения альфа-токоферола внутримышечно в дозе 150 мг/кг 2 раза в неделю с момента операции до окончания срока гестации (взрослых крыс - 10, плодов 22-х да. - 15, крысят на 2-й день жизни - 15, крысят на 15-й день жизни - 15, крысят на 30-й день жизни - 15).
Оценка показателей взрослых крыс 1-13 групп:
- показатели красной крови: концентрация эритроцитов, гемоглобина, показатель гематокрита, содержание ретикулоцитов;
- биохимические показатели сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов (NOx), концентрация нитротирозина; концентрация кальция; концентрация эндотелиального фактора роста сосудов VEGF-C; концентрация цитрул-липа; состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантная активность;
- исследование фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов в краткосрочных культурах у взрослых крыс по следующим критериям:
- оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных всех групп;
- оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных 2-й и 10-й групп при введении в среду для инкубации клеток разных концентраций следующих веществ: L-NAME, липополисахарид Е. coli, водорастворимая форма эстрадиола, водорастворимая форма прогестерона, водорастворимый аналог токоферола trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-диметлхроман-2-кар-боксильная кислота 97%), супероксиддисмутаза;
~ оценка in vitro фагоцитарной активности перитонеальных и плацентарных макрофагов у животных 8 и 13 групп при введении в среду для инкубации клеток разных концентраций следующих веществ: L-NAME, липополисахарид Е. coli, водорастворимая форма эстрадиола, водорастворимая форма прогестерона.
Изучение морфологических и метаболических характеристик плаценты у крыс 2,4,6, 8, 9,10,11,12,13 групп по следующим критериям:
- масса;
- патоморфологическое исследование: оценка материнского и плодового кровообращения, состояния трофобласта;
- биохимическое исследование: концентрация суммарных нитратов и нитритов, нитротирозина; состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантная активность.
Оценка состояния плодов на 20 день беременности у крыс 2-й, 4-й, 6-й, 8-й, 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й групп по следующим критериям:
- масса;
- состояние эритроцитарной системы: концентрация эритроцитов, гемоглобина, содержание оксифильных проэритроцитов; процент эритроидных клеток в кроветворных органах;
- биохимические показатели сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов, нитротирозина, кальция; состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантная активность.
Оценка состояния 22-дневных плодов и крысят на 2-й, 15-й и 30-й день жизни, полученных от животных 14 - 19 групп:
- масса;
- показатели эритроцитарной системы: содержание эритроцитов, гемоглобина, показатель гематокрита, концентрация ретикулоцитов, содержание оксифильных проэритроцитов; процент эритроидных клеток в кроветворных органах;
- исследование перитонеальных макрофагов на 15-й и 30-й день жизни: фагоцитарная активность в краткосрочных культурах;
- биохимический показатель сыворотки крови: концентрация суммарных нитратов и нитритов.
Использование в эксперименте плодов перед родами (в возрасте 22 дней) и крысят на 2-й, 15-й и 30-й день после рождения связано с важностью этого периода онтогенеза для становления эритроцитарной системы. По данным литературы, в этот период развития изменяется интенсивность, место и тип кроветворения (Ды-гай А. М. и др., 1981; Назаров С. Б., 1996), а также заканчивается процесс постна-тального преобразования эритрона у крыс (Карташов А. Г. и др., 1987; Назаров С. Б., 1995). Поданным Махинько В. И., Никитина В. Н. (1975), в исследуемый период физиологические особенности организма крысят соответствуют особенностям у детей от рождения до 4 - 7 лет.
Эвтаназия животных производилась путем дислокации шейных позвонков (взрослые животные) и декапитации (крысята).
Состояние эритроцитарной системы оценивалось с использованием следующих групп методов:
1) Исследование эритроцитарного состава периферической крови проводилось унифицированными методами.
2) Исследование морфофункциональных характеристик эритроцитов: проводился расчет морфометрических индексов эритроцитов (средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците).
3) Оценка состояния эритропоэза: определение относительной и абсолютной концентрации ретикулоцитов в периферической крови; определение концентрации ок-сифильных проэритроцитов в периферической крови; определение содержания эритроидных клеток в печени, селезенке, красном костном мозге.
Фагоцитарная активность макрофагов: использовали методику краткосрочного культивирования перитонеальных (Mantovani В., 1987) и плацентарных макрофагов с аутологичными эритроцитами. У животных производили забор крови из подъязычного венозного сплетения для приготовления суспензии эритроцитов в среде 199 (1:100). Для получения перитонеальных макрофагов в брюшную полость вводили 10 мл среды 199, после массажа живота через разрез передней брюшной стенки получали суспензию клеток. Ее наносили на покровные стекла и инкубировали в течение 15 минут при 37°С в планшетах для культур клеток. Далее стекла промывали и в лунки планшета вносили по 2 мл суспензии эритроцитов.
Для оценки активности плацентарных макрофагов ткань 3-4 целых плацент разрезали на несколько более мелких частей и тщательно отмывали от крови, гомогенизировали, смешивали с физиологическим раствором, и пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм. Затем клеткам давали осесть. Осадок смешивали со средой 199. Клеточную суспензию подвергали центрифугированию в ступенчатом градиенте плотности В отмытые клетки добавляли среду 199, после чего суспензию макрофагов инкубировали в б-ти луночных планшетах на покровных стеклах 24 х 24 в течение одного часа при 37°С, далее стекла аккуратно промывали средой 199, удаляя не прикрепившиеся клетки, и заливали суспензией эритроцитов.
Суспензии эритроцитов содержали следующие вещества: водорастворимый аналог токоферола trolox 6-гидрокси-2,5,7,8-диметилхроман-2-карбоксильная кислота 97% (производитель Aldrich) в концентрации 1 и 25 мкмоль/л (Reed К. L. et al., 2006); супероксиддисмутаза (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100 Единиц/мл (Hemanz R. et al. 2001); липополисахарид Е. coli (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100 нг/мл (Filipov N. М. et al., 2005); L-NAME (производитель SIGMA) в концентрации 0,1 и 1 ммоль/л (Wu R. et al., 2004); водорастворимая форма (5-эстрадиола (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100 нмоль/л (Okada М. et al., 1997); водорастворимая форма прогестерона (производитель SIGMA) в концентрации 10 и 100 нмоль/л (Program of Plenary Sessions and Advance Abstracts of Short Communications, 1991).
Для получения контрольных значений к макрофагам добавляли суспензию эритроцитов без каких-либо веществ.
Планшеты инкубировали в течение 60 минут при 37° С. Стекла фиксировали в 1% растворе глутарового альдегида, затем окрашивали по Романовскому.
Макрофаги крыс взаимодействуют с аутологичными эритроцитами in vitro с образованием розеткоподобных структур. Производился дифференциальный подсчет этих структур с выделением 4 типов: макрофаги без эритроцитов (МФо), макрофаги, несущие на своей поверхности 1-2(1 тип; МФО, 3 - 5 (2 тип; МФ?), 6-8 (3 тип; МФз), более 9 эритроцитов (4 тип; МФ4). Для шггегральной оценки рассчитывался индекс адгезионно-фагоцитарной активности (ИАФА):
ИАФА = (МФ, + 2 * МФ2 + 3 * МФз + 4 * МФ4) / МФ0.
Биохимические показатели.
Содержание суммарных нитратов и нитритов определяли путем восстановления нитратов в нитриты в присутствии хлорида ванадия (Miranda К. M. et al., 2001). Содержание кальция определяли с использованием набора для биохимических исследований фирмы Human. Концентрацию цитруллииа измеряли колориметрическим методом (Sugawara К. et al., 1998). Определение количества свободных радикалов и антиоксидантной активности проводилось методом индуцированной хемилюминесценции. Хемилюминесценцию (XJI) измеряли на биохеми-люминометре БХЛ-06М. Оценивали содержание свободных радикалов по све-тосумме свечения (S) и максимальной интенсивности сигнала (Imax), а также состояние антиоксидантной системы по коэффициенту k (Imax / S). Определение концентрации ннтротирозина проводили набором фирмы «НВТ» (Нидерланды) иммуноферментным методом на автоматическом ридере EL-808 (BIO-TEK INSTRUMENTS INC., USA). Определение концентрации васкулоэндотелиаль-ного фактора (VEGF-C) в крови проводилось иммуноферментным методом с применением набора Bio Vendor (Чехия) на автоматическом ридере EL-808 (ВЮ-ТЕК INSTRUMENTS INC., USA).
Патоморфологическое исследование плаценты.
Для гистологического исследования плацент по наибольшему периметру, из центральной части органа, иссекали биологический материал. Маркированные кусочки фиксировали в нейтральном забуференном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Готовые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась стандартным пакетом статистических программ STATISTIKA-6,0 (StatSoft, Inc.) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка W для оценки нормальности распределения. Достоверность отличий данных, подчиняющихся нормальному распределению, определяли с помощью t-критерия Стью-дента. Если характер распределения отличался от нормального, то сравнение средних величин проводили с помощью Т-критерия Уилкоксона и U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования выявлено, что у интактных беременных крыс на 20-й день показатели периферической крови (эритроциты, гемоглобин, гематокрит) достоверно снижаются по сравнению с результатами первого дня беременности. Причиной может являться физиологическая гемодилюция, а также уменьшение продолжительность жизни красных клеток крови по сравнению с небеременными животными. Количество ретикулоцитов увеличивается в связи с повышением уровня эритропоэтина и прогестерона, стимулирующих эритропоэз (De Rijk Е. Р. С. T. et al., 2002). При физиологической беременности на 20-й день концентрации NOx и цитруллина в крови повышаются по сравнению с небеременными крысами. Оксид азота активно синтезируется из L-аргинина, с образованием цитруллина, в сосудах матки и плаценте за счет интенсивного образование эндоте-лиалыюй NO-синтазы и повышения кальций-зависимой активности NO-синтаз
(Nelson S. H. et al., 2000). При физиологической беременности наблюдается уменьшение поступление L-аргинина в эндотелий сосудов матери. NO-синтаза при дефиците этой аминокислоты образует свободнорадикальные соединения (Goodrum L. A. et al., 2003). Плацента также продуцирует липидные перекиси в большом количестве (Walsh S. V., Wang Y., 1993). Эти результаты подтверждаются в наших исследованиях - антиоксидантный потенциал крови на 20-й день беременности достоверно меньше по сравнению с 1-м днем. Таким образом, физиологическое течение беременности сопровождается относительным дисбалансом работы систем регуляции процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты (Флоренсов В. В. и др., 2005), что мы и наблюдаем в нашем случае.
У беременных крыс происходит снижение концентрация кальция в крови по сравнению с 1 -й группой, что может быть результатом использования этого катиона плодами, а также следствием физиологической гемодилюции и повышенной фильтрации в почках (Ritchie L. D. et al., 1998).
Уровень VEGF-C в крови достоверно повышается, что связано с активным процессом ангиогенеза в плаценте и у плода на момент исследования.
При физиологической беременности у животных активность перитонеаль-ных макрофагов повышается по сравнению с интактными небеременными крысами. Активацию процесса фагоцитоза можно объяснить изменением гормонального фона, работы иммунной системы, напряженным эритропоэзом (Carvalho-Frcitas M. I. et al.. 2007; Wan H. et al., 2007). Активность плацентарных макрофагов гораздо меньше, чем перитонеальных.
Поступление донатора оксида азота нитрита натрия с 1-го дня беременности вызывает развитие метгемоглобинемии и гемической гипоксии (Гоженко А. И. и др., 1996). У животных этой группы отмечается повышение концентрации ретику-лоцитов, что является естественным ответом на хроническую гипоксию (рис. 1). Повышение уровня нитритов при поступлении их в организм закономерно. Воздействие нитрита натрия повышает интенсивность свободнорадикальных процессов (Реутов В. П. и др., 1997; Степуро И. И. и др., 1997), о чем свидетельствуют результаты определения концентрации нитротирозина и индуцированной ХЛ крови. Концентрация кальция в крови у этих животных достоверно повышается по сравнению со 2-й группой. Это может быть связано с неблагоприятным влиянием избытка оксида азота и свободных радикмов на процесс транспорта катиона через фетоплацентарный барьер, нарушением работы почечного фильтра матери, так как нарушаются все основные почечные функции (Gozhenko А. I. et al., 2003).
При введении донатора оксида азота повышается концентрация VEGF-C в крови (см. рис. I). Ведущим механизмом, объясняющим увеличение эндотелиаль-ного фактора роста, может быть возникновение гемической гипоксии, как в организме матери, так и плода. Происходит активация метаболических путей, регулируемых такими белками, как индуцируемый гипоксией фактор 1-альфа, и снижается образование антиангиогенных веществ (Fujita D. et al., 2010). Второй механизм стимуляции образования VEGF - снижение уровня глюкозы в тканях, что имеет место при дефиците кислорода (Спринджук М. В., 2010). Третьим путем активации является увеличение свободнорадикальных процессов при избытке оксида азота,
которые также стимулируют продукцию эндотелиального фактора роста (\¥и 3. е1 а1„ 2011).
%
60 40 20
Л
X '— о x
гг
мать
Ш ц- 1/1 х
и и га > ^
а»—«»=«««0,
1га Н
I 5
£
плацента
■\
1 * I §
* * *
•V
-О С х И П] 1/1 X
|8яЮ01и |
плед
Рис. 1. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у беременных животных, получавших нитрит натрия по сравнению с интактными беременными (* - р < 0,05).
При поступлении нитрита натрия у беременных крыс повышается активность перитонеальных макрофагов по сравнению с интактными беременными крысами, что связано с влиянием N0 и нитритов на макрофаги и фагоцитируемые объекты. (Покровский А. А., Тутельян В. А., 1976; ВюпсЦ С. е( а1., 2002; Ке X. е1 а!., 2001). Активность плацентарных макрофагов достоверно не меняется, вероятно, вследствие активации процессов апоптоза в плаценте к данному сроку наблюдения, либо в результате прямого цитотоксического действия избытка N0 и других свободно-радикальных продуктов на эти клетки. Эту особенность можно рассматривать как механизм, предотвращающий активацию ¡N08 и еще большее повышение оксида азота в организме.
В тканях плаценты у крыс с нитритной интоксикацией содержание ЫОхи нит-ротирозина достоверно не меняется по сравнению с интактными беременным крысами, что можно объяснить снижением его эндогенного синтеза (см. рис. I). В лабиринтном отделе плаценты при патоморфологическом исследовании обнаружены очаговые кровоизлияния, полнокровие материнских лакун во всех отделах, анеми-зация плодовых капилляров. Зоны с нарушенным кровоснабжением сочетаются с некротическими изменениями в трофобласте. Активация процессов клеточной и соединительнотканной пролиферации приводит к нарушению цито- и гистоархи-тектоники плаценты. Последний фактор наряду с некротическими изменения тро-фобласта существенно замедляет обменные процессы между двумя кровотоками материнским и плодовым.
У плодов крыс при нитритной интоксикации отмечается снижение массы тела вследствие длительного окислительного стресса (по результатам XJI в крови увеличивается количество свободных радикалов) на фоне дефицита кислорода (см. рис. 1). Содержание эритроцитов, гемоглобина и оксифильных проэритроцитов возрастает в ответ на гемическую гипоксию, а также существенные нарушения кровообращения в плаценте. В сыворотке значительно повышается концентрация NOx. Концентрация кальция в крови у плодов увеличивается, что можно объяснить нарушением его использования тканями в ответ на хронический дефицит кислорода вследствие изменения транспорта ионов через клеточные мембраны (Балина Ю. Д. и др., 1988). Одновременно при гипоксии изменяются молекулярные механизмы регуляции кальциевого гомеостаза (Huang S.-T. J. et al., 2004), а также нарушается работа гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы плода (Федорова М. В., 1982).
Введение L-NAME в течение 20-ти дней беременности не меняет показатели периферической крови матери, но вызывает снижение суммарных нитратов и нитритов в сыворотке (рис. 2).
90
%
П
П
о
п
-10
-so
h- га LU IS) X -V Г: ГО X н
z X s и CD LU го £ :: и и ■ го с Z X
= > :: S
* - * *
S m x о
>
с I
Z
* *
У
и
* плацента
плод
Рис. 2. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у беременных животных, получавших метиловый эфир Ь-аргинина по сравнению с интактными беременными (* - р < 0,05).
Это вещество приводит к снижению уровня NO, что связано с конкурентным ингибированием NOS (Гуреев В. В., 2012). Количество свободных радикалов в крови возрастает, вследствие уменьшения антиоксидантного влияния оксида азота
(Wink D. et al., 1993). Кроме того, вещества, препятствующие синтезу оксида азота посредством конкурентного ингибирования NO-сшггазы, способствуют разрыву ферментативной активности этого фермента и преобразовывают NO-синтазу в генератор супероксида (Boger R. H., 2009). В то же время антиоксидантная активность крови уменьшается. Уровень кальция в сыворотке выше нормы. Увеличение концентрации кальция также можно объяснить снижением его поступления к плоду вследствие нарушения фетоплацентарного кровотока, который прямо пропорционален уровню оксида азота (Sladek S. M. et al., 1997). Неселективный антагонист NO-синтаз значительно активирует перитонеальные и плацентарные макрофаги. Усиление фагоцитоза можно объяснить увеличением образования в них ин-терлейкина-6, monocyte chemoattractant protein-1 и ядерного фактора-kB, так как длительное введение L-NAME стимулирует работу воспалительных генов в организме (Gonzalez W. et al., 2000).
При введении L-NAME масса плацент увеличивается (см. рис. 2). Вероятно, дефицит оксида азота нарушает физиологический процесс роста, инвазии и васку-логенеза плаценты (Crocker I. P. et al., 2003; Nath А. К. et al., 2004). С другой стороны, происходящие перестройки можно расценить как компенсаторные, обеспечивающие улучшение гемодинамики (Хоменко Ю. Б., 2006). Торможение синтеза оксида азота в плаценте достоверно снижает концентрацию NO, в тканях плаценты. Одновременно в этом органе активируются свободнорадикальные процессы.
При патоморфологическом исследовании в лабиринтном отделе плацент кровенаполнения материнских лакун возрастает по направлению к базальному отделу с образованием резко дилатированных сосудов. Параллельно увеличивается кровенаполнение и расширение плодовых капилляров. Морфологические изменения в плацентах исследуемой группы частично повторяют таковые при воздействии нитрита натрия. Однако, этой группе существенно изменено как кровенаполнение материнских лакун, так и плодовых капилляров. Значительное расширение материнских сосудов, с деструкцией межсосудистых перегородок можно объяснить избытком в ткани плацент свободнорадикальных соединений, относящихся к стимуляторам индуцированной кровотоком дилатации (Микашинович 3. И., Олемпиева Е. В., 2008).
У плодов масса тела уменьшается (см. рис. 2). L-NAME приводит к длительному окислительному стрессу (по данным XJ1 в крови плодов возрастает количество свободных радикалов), изменяет транспорт аминокислот, в том числе L-аргинина, через фетоплацентарный барьер плоду (Greenberg S. S. et al., 1997), снижается влияние NO на рост мышечной ткани (Wu G. et al., 2006). В периферической крови достоверно повышено содержание оксифильных проэритроцигов, свидетельствующее о достаточно выраженной внутриутробной гипоксии. В сыворотке крови у плодов закономерно снижена концентрация NO* и нитротирозина.
Альфа-токоферол у интактных беременных животных повышает активность конститутивной NO-синтазы (Dayuan L. et al., 2001; Heller R. et al., 2004), что проявляется в достоверном повышении концентрации цитруллина в крови беременных крыс (рис. 3). На этом фоне снижается концентрации NOx, так как токоферол снижает активность индуцибелыюй NO-синтазы макрофагов (Jiang Q. et al., 2000). В
крови у животных значительно уменьшается количество свободных радикалов, ан-тиоксидантная активность возрастает за счет антиоксидантного эффекта альфа-токоферола. Концентрация эндотелиального фактора роста в крови у этой группы животных достоверно возрастает. Механизмом может быть повышение продукции эн-дотелиальной >ТО-синтазы и индуцируемых гипоксией факторов 1 и 2 под влиянием альфа-токоферола фауиап Ь. е1 а1., 2001; Каз1ташскат Я. К. а!., 2010).
Альфа-токоферол существенного влияния на активность макрофагов к 20-му дню беременности не оказывает, что отличает эту группу животных от небеременных крыс, получавших витамин Е в течение такого же промежутка времени (Иванова А. С., 2008).
70
%
50
30
10
....... ,П
а У £
-10
п
-30
-50
У- и и
5 >
и
П
X ь- Ы х ОХ ¡5 2 Е
плацента
о 2
Л
та Ь/"
г *
плод
Рис. 3. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, океифияьные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у беременных животных, получавших альфа-токоферол по сравнению с интактными беременными (* - р < 0,05).
Известно, что альфа-токоферол, с одной стороны, стимулируя выработку УЕСИ, с другой стороны, может изменять процессы роста и развития сосудов (Кса-олинг Я. и др., 2004). Это влияние на васкулогенез в нашем эксперименте предположительно проявляется в уменьшении массы плаценты (см. рис. 3). Кроме того, в лабиринтном отделе плаценты выявлена анемизация капилляров, за счет стенози-рования просвета и прекращения кровотока в субхориальных и суббазальных зонах плацент. Вместе с дистрофическими изменениями клеток, встречается очаговая ин-терваскулярная пролиферация трофобласта. Учитывая соотношение нарушенного
20
кровенаполнения плодовых капилляров и компенсаторных перестроек, складывается впечатление о негативном влиянии альфа-токоферола на плацентарное кровообращение.
Согласно данным литературы (Микашинович 3. И., Олимпиева Е. В., 2008), при физиологической течении беременности продуцируются перекись водорода, органические пероксиды и пероксинитрит, что сопровождается активацией глута-тионпероксидазы и миелопероксидазы. Альфа-токоферол, разлагая перекиси (Goodhue С. T., Risley H. H., 1965), вносит корррективы в механизм дилятации сосудов за счет нарушения ее высвобождения из мононуклеаров (Leb L. et al., 1985). Кроме этого витамин Е ингибирует активность индуцибельной NOS макрофагов (Jiang Q. et al., 2000), в том числе плацентарных, ухудшая тем самым нарушенный фетоплаценгарный кровоток.
У плодов отмечается снижение массы тела по сравнению с плодами интакт-ных крыс, вероятно, в связи с нарушением плацентарного кровообращения (см. рис. 3). Содержание эритроцитов у плода возрастает, что свидетельствует в пользу гипоксического компонента изменений. В крови у плодов снижается активность свободнорадикальных процессов и повышается антиоксидантная активность.
При НМПК у беременных крыс из описываемых показателей периферической крови (содержание эритроцитов, гемоглобин, гематокрит) достоверно уменьшена только концентрация гемоглобина в небольшой степени, что может быть связано, в первую очередь, с оперативным вмешательством (рис. 4).
В крови экспериментальных животных отмечается уменьшение концентрации NOx по сравнению с интактными и ложнооперированными крысами, повышается количество свободных радикалов. Изменения биохимических показателей крови можно объяснить возникновением эндотелиальной дисфункции при перевязке преплацентарнтарного сосудистого пучка, связанной с облитерацией части сосудов и существенным перераспределением кровотока в плаценте на фоне гипоксии плода. В условиях сниженного синтеза оксида азота происходит оксидантное повреждение эндотелиальных клеток, увеличивается адгезия и агрегация тромбоцитов и лейкоцитов, повышается активность ангиотензина, что в совокупности приводит к нарушению микроциркуляции, возникновению многоочаговой тканевой гипоксии, которая еще более усугубляет степень повреждения сосудов и сопряженных с этим осложнений (Белокриницкая Т. Е. и др., 2005). Содержание кальция в сыворотке увеличивается, вероятно, в связи с формированием плацентарной недостаточности, нарушающей транспорт Са2+ к плоду, со сниженным его потреблением плодом на фоне возникающей гипотрофии, а также нарушением кальций-зависимых механизмов синтеза оксида азота в поврежденных сосудах (Nelson S. H. et al., 2000). В литературе описаны противоположные влияния гипоксии на образование VEGF (Крукиер И. И., Погорелова Т. Н„ 2006; Bartha J. L. et al., 2003). В нашем случае достоверные изменения отсутствуют.
%
40
20
и
Q
-20
га и-) х
(j U ™ > —
U
гг
X 1— 1Л X
ОХ !Н г с
плацента
(— го <л х х и га
-40 ..................
Рис. 4. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотел. фактор роста, индуцированная хе-милюминесценция) у беременных животных после НМПК по сравнению с ин-тактными беременными (* - р < 0,05).
Активность перитонеапьных макрофагов в условиях НМПК достоверно меньше, чем у интактных животных и, тем более, чем у беременных крыс с L-NAME. Такую особенность можно объяснить более выраженными и менее продолжительными нарушениями образования оксида азота, снижением выработки мак-рофагального колониестимулирующего фактора (Fried G. et al., 2003), увеличением выработки глкжокортикоидов (Imperatore A. et al., 2010), изменением двигательной активности макрофагов вследствие гипоксии, индукцией в них процессов апоптоза (Burke М. R. et al., 2001). Активность плацентарных макрофагов достоверно повышается, но, по данным литературы, продукция NO этими клетками в условиях плацентарной недостаточности низкая (Шестопалов А. В., 2007). В тоже время адаптация макрофагов фетоплацентарной системы приводит к усиленному «респираторному взрыву», интенсификации свободнорадикальных процессов в плаценте (Хоменко Ю. Б., 2006), что и наблюдается в нашем исследовании. Таким образом, активация плацентарных макрофагов в условиях хронической гипоксии носит патологический характер, поддерживая несостоятельность фетоплацентарного комплекса.
Патоморфологическое исследование плацент крыс после НМПК выявляет ряд адаптационных перестроек как со стороны внеплацентарных оболочек, в виде глубокой их нидации в лабиринтный отдел, так и плодового кровотока - активация ангиогенеза в строме ветвистого хориона. Во всех отделах лабиринтной части плаценты резко снижено кровенаполнение как материнских, так и плодовых сосудов, особенно в субхориальных и центральных отделах. Подобные изменения в системе кровообращения относятся к явным проявлениям ишемии. Выявлены некротические изменения трофобластических клеток. Как видно из патоморфологического исследования, адаптационные процессы в плаценте при НМПК слабо выражены, что приводит к задержке внутриутробного развития и снижению массы плодов в связи с дефицитом нутриентов и кислорода.
В периферической крови плодов уменьшается концентрация гемоглобина, свидетельствующая о достаточно тяжелой гипоксии и связанной с ней ацидотиче-ской альтерацией красных клеток крови (Аршавский И. А., 1982) (см. рис. 4). В сыворотке у плодов увеличивается концентрация нитротирозина, что может быть связано с одновременным повышением в условиях гипоксии процессов перекис-ного окисления и синтеза оксида азота, приводящее к образованию пероксинитрита (Ма С. et al., 1999). Это соединение оказывает токсическое действие на органы и ткани плода, но в то же время является вазодилататором (Villa L. М. et al., 1994).
Поступление донатора N0 на фоне НМПК у беременных животных повышает кислородную емкость крови и активирует эритропоэз по сравнению с изолированным НМПК (рис. 5). Концентрация оксида азота и нитротирозина в крови закономерно выше по сравнению с изолированным НМПК. Одновременно возрастает концентрация VEGF-C по сравнению с изолированной патологией беременности. Активность макрофагов в этих условиях увеличивается по сравнению с изолированным НМПК и практически достигает уровня интактных крыс, что связано с экзогенным поступлением N0 в организм.
Масса плацент при патологии беременности на фоне введения нитрита натрия не меняется (см. рис. 5). В плацентах крыс с НМПК, получавших во время беременности нитрит натрия, при патоморфологическом исследовании, выявлен очаговый отек со склерозом внеплацентарных оболочек, что является исходом альтерации клеток и структур плодовых оболочек при хронической гипоксии. Толщина плаценты в лабиринтном отделе уменьшена. Локальные зоны гиперемии чередуются с зонами анемизации, за счёт снижения кровенаполнения материнских лакун с последующим некрозом первого слоя грофобласта. Базальный отдел плаценты уменьшен по толщине. Выражены некротические изменения со стороны клеток, формирующих базальный отдел. На основе полученного морфологического субстрата следует сделать вывод о недостаточности материнского и плодового кровоснабжения в данной группе, что можно объяснить прямым цитотоксическим действием избытка N0 на клетки и ткани плаценты (Жирова Н. В., 2004).
У плодов крыс, получавших донатор N0 на фоне НМПК, содержание эритроцитов, гемоглобина, оксифильных проэритроцитов выше по сравнению с изолированным НМПК (см. рис. 5). О тяжести гипоксии свидетельствует повышение оксифильных проэритроцитов и по сравнению с изолированным введением нитрита
натрия. В крови значительно повышается концентрация ЫОх, что имеет негативное значение, так как образующийся в результате реакции дополнительный оксид азота усиливает цитотоксическое действие.
140 % 120
100 80 60
40
20
-20
-40
п
-О • X
п
■ и 1Д
У
П пП
мать
плацента
¿ДПй
(Т) ^
со
плод
Рис.5. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у животных после нарушения маточно-плацентарного кровообращения и введения нитрита натрия по сравнению с изолированным нарушением маточно-плацентарного кровообращения (* - р < 0,05). # - достоверные отличия от воздействия нитрита натрия (р < 0,05).
Таким образом, саногенетические процессы у животных при НМПК на фоне поступления донатора N0 практически отсутствуют. Патогенез изменений в системе мать - плод представлен на рисунке 6.
^^ув сличение
Рис. 6. Взаимодействие в системе мать - плод при НМПК на фоне воздействия нитрита натрия. Прямоугольник - влияние нитрита, овал - особенности при моделировании НМПК.
Введение антагониста N0 на фоне НМПК у беременных крыс приводит к достоверному повышению уровня гемоглобина, что увеличивает кислородную емкость крови и тем самым улучшает оксигенацию плода (рис. 7). Известно, что оксид азота снижает продукцию эритропоэтина (ЗсЬоЬегеЬе^ег е1 а1., 1996). Поэтому, дефицит N0 может стимулировать образование эритропоэтина и эритропоэз в красном костном мозге, что в нашем эксперименте проявляется ретикулоцито-зом. Эритропоэтин может вызывать возникновение феномена дистантного ишеми-ческого прекондиционирования, что способствует васкулогенезу и оказывает ци-топротекторный эффект (Колесник И. М., 2010). Кроме того, эритропоэтин улучшает параметры кислородтранспортной функции крови, усиливает антиоксидант-ную защиту (2гас1шк V. V. й а!., 2010).
60
40 40
%
*#
п
-10 ■20
-40
=Г
ма
оп X
О) £
а
г-,
ги«пП
... ...
X К и У У ПЗ • X! Г X
ох »
г
плацента
пло^
1Л х ш
Е
Рис. 7. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у животных после НМПК и введения метилового эфира Ь-аргинина по сравнению с изолированным нарушением маточно-плацен-тарного кровообращения (* - р < 0,05). # - достоверные отличия от воздействия Ь-ЫАМЕ (р < 0,05).
НМПК на фоне введения Ы^АМЕ вызывает достоверное повышение в крови суммарных нитратов и нитритов, нитротирозина, а также показателей свободнора-дикальных процессов ХЛ по сравнению с изолированным введением антагониста N0. Повышение уровня N0 при сочетанном нарушении связано, вероятно, с акги-
вацией гена индуцибельной NO-синтазы (Miller M. G. et al., 1996), что может корректировать возникающие в результате ишемии морфофункциональные нарушения в плаценте (Гуреев В. В., 2012).
Повышение уровня нитротирозина свидетельствует о высокой активности свободнорадикальных процессов и образовании пероксинитрита, который играет относительную саногенетическую роль, являясь вазодилататором (Liu S. et al., 1994; Villa L. M. et al., 1994).
Антиоксидантная активность значительно уменьшается, что свидетельствует об истощении резервов антиоксидантной системы на фоне двух воздействий (L-NAME и НМПК), каждый их которых существенно влияет на процессы ПОЛ в организме. При этом концентрация Са2+ достоверно ниже, чем у изолированного НМПК, не отличается от интактных беременных крыс. Вероятно, оксид азота способствует улучшению циркуляции в фетоплацентарной области и обеспечивает переход кальция к плоду. Однако, концентрация эндотелиалыюго фактора роста достоверно ниже, чем при изолированном НМПК. Структурные изменения в плацентах крыс с НМПК, получавших во время беременности L-NAME, имеют особенности. В отличие от изолированного НМПК, в лабиринтном отделе таких плацент материнские лакуны с хорошим кровенаполнением, особенно в центральном и субба-залыюм отделах. Обнаружены незначительные изменения со стороны ядер клеток в виде их гипертрофии и гиперхромии. Кроме этого выявлена так называемая «ложная» пролиферация трофобласта первого слоя, вызванная спазмом плодовых капилляров. Согласно структурным изменениям в плаценте, при созданной экспериментально сочетанной патологии, повреждений неожиданно меньше, чем при изолированном НМПК. Выявленный феномен может быть связан с одновременным увеличением содержания NOx и нитротирозина как в тканях плаценты, так и в крови плодов.
Введение антагониста NO-синтаз на фоне НМПК значительно увеличивает активность перитонеальных и плацентарных макрофагов по сравнению с изолированным НМПК, что связано с усилением работы воспалительных генов в организме (Gonzalez W. et al., 2000). Повышение активности макрофагов через активацию iNOS вносит свой вклад в регуляцию фетоплацентарного кровотока. Увеличение нитротирозина свидетельствует о синтезе большого количества пероксинитрита, способного вызывать дилатацию сосудов (Villa L. M. et al., 1994). Расширение материнских сосудов также можно связать с избытком накопленных в ткани плацент свободно радикальных соединений, относящихся к стимуляторам индуцированной дилатации сосудов с усилением кровотока (Микашинович 3. И., Олемпиева Е. В., 2008). О менее выраженной внутриутробной гипоксии свидетельствует и достоверное повышение массы плодов по сравнению с НМПК, но количество оксифильных проэритроцитов увеличивается (см. рис. 7).
Таким образом, при НМПК на фоне введения L-NAME в материнском организме и плаценте включается ряд саногенетических механизмов: увеличение кислородной емкости крови, усиление синтеза эритропоэтина, ишемическое прекон-диционирование, активация iNOS макрофагов. Механизм изменений в системе мать - плод у этой группы животных представлен на рисунке 8.
Рис. 8. Взаимодействие в системе мать-плод при НМПК на фоне воздействия Ь-ЫАМЕ. Прямоугольник - влияние Ь-ЫАМЕ, овал - особенности при моделировании НМПК.
Введение альфа-токоферола на фоне НМПК не вызывает существенных изменений концентрации эритроцитов и гемоглобина, но повышает содержание цит-руллинав крови по сравнению с изолированной патологией беременности (рис. 9). Количество свободных радикалов становится меньше, в то же время антиоксидант-ная активность возрастает. Увеличение синтеза оксида азота может быть связано с повышением биодоступности эссенциального фактора для работы NOS - тетрагид-робиоптерина, который в условиях активации ПОЛ окисляется и не может использоваться ферментом, а также повышением активности эндотелиальной NO-синтазы (Castillo С. et al., 2005; Daynan L. et al., 2001; Shi W. et al., 2004). Однако, концентрация суммарных нитратов и нитритов не меняется, что согласуется с данными литературы и связано, вероятно, с ускорением метаболизма оксида азота (Hirneth H., Classen H. G., 1982), либо торможением индуцибельной NOS макрофагов (Jiang Q. et al., 2000). Концентрация эндотелиального фактора роста в этих условиях достоверно снижается, что можно объяснить гибелью эндотелия в перевязанных сосудах на фоне уменьшения интенсивности стимулятора его образования - свобод-норадикальных процессов.
70
50
30
%
#*
*и
-10 'm
-30
п
п
П п
О X
i S
*
плацента
*# плс№
-50
Рис.9. Отклонение показателей крови и плацент (масса, эритроциты, гемоглобин, ретикулоциты, оксифильные проэритроциты, суммарные нитраты и нитриты, нитротирозин, цитруллин, кальций, эндотелиальный фактор роста, индуцированная хемилюминесценция) у животных после нарушения маточно-плацентарного кровообращения и введения альфа-токоферола по сравнению с изолированным нарушением маточно-плацентарного кровообращения (* - р < 0,05). # - достоверные отличия от воздействия альфа-токоферола (р < 0,05).
Активность макрофагов у животных этой группы увеличивается по сравнению с изолированным НМПК и практически достигает уровня ин гактных крыс, что
можно объяснить снижением свободнорадикального повреждения клеток плаценты в условиях перераспределения кровотока.
Исследование плацент крыс при НМПК, получавших во время беременности альфа-токоферол, показало значительное ухудшение кровоснабжения лабиринтного отдела. Большая часть материнских лакун пуста, лишь в суббазальных отделах сосуды, содержащие материнскую кровь полнокровны.
Одной из причин нарушенного фетоплацентарного кровообращения в плаценте, у данной группы животных, может быть значительное снижение продукции оксида азота за счет противовоспалительного действия альфа-токоферола (tog W. J. et al., 2004; Kim S. et al., 2012). Другой причиной, кроме указанной, является снижение активности индуцибельной NOS, синтезируемой плацентарными макрофагами (Jiang Q. et al, 2000).
Снижение активности индуцибельной NOS плацентарных макрофагов (Jiang Q. et al., 2000) у этой группы животных проявляется в виде снижения концентрации суммарных нитратов и нитритов в сыворотке плодов (см. рис. 9). Отсутствие повышения оксифильных проэритроцитов в этих условиях может быть следствием тяжести гипоксии.
Таким образом, альфа-токоферол при сочетанной патологии вместо саноге-нетического является фактором, вызывающим изменения патогенетического характера, что представлено на рисунке 10.
Для поиска возможных фармакологических путей коррекции работы пери-тонеальных и плацентарных макрофагов у животных оценивали функциональную активность клеток при введении в инкубационную среду ряда биологически активных веществ.
При введении в среду для инкубации клеток брюшной полости trolox у беременных животных это вещество в обеих концентрациях оказывает тормозное влияние на активность макрофагов. Известно, что окислительные механизмы принимают участие в работе скавенджер-рецепторов и лектиноподобных рецепторов макрофагов, следовательно, для активации этих рецепторов необходимы окислительные процессы (Aleksieieva I. M. et al., 2005). Кроме того, под действием анти-оксиданта возможно изменение поверхностной мембраны фагоцитируемого объекта. Также эффект может быть связан с непосредственным воздействием тролокса на внутриклеточный тетрагидробиоптерин (Heller R. et al, 2004), в чем заключается отличие механизма действия тролокса от альфа-токоферола. SOD при инкубации с перитонеальными макрофагами оказывает дозозависимый тормозной эффект, действуя подобно аналогу токоферола.
В отношении плацентарных макрофагов trolox и супероксиддисмутаза достоверно не влияют. Это может быть связано с повышением концентрации апьфа-то-коферола и супероксиддисмутазы к концу физиологической беременности (Фло-ренсов В. В. и др., 2005; Шестопалов А. В., 2007).
У беременных крыс ЛПС вызывает лишь незначительное увеличение активности перитонеальных макрофагов в большей концентрации. Эти отличие можно объяснить снижением чувствительности клеток к стимулирующему влиянию
Рис. 10. Взаимодействие в системе мать-плод при НМПК на фоне воздействия альфа-токоферола. Прямоугольник -влияние альфа-токоферола, овал - особенности при моделировании НМПК.
оксида азота. В то же время при физиологической беременности наблюдается перераспределение пула аргинина в пользу плода, уменьшается его содержание в материнской крови (Goodmrn L. Л. et al., 2003). NO-синтаза при дефиците этой аминокислоты образует свободнорадикальные соединения, что может вызвать повреждение мембран макрофагов.
При инкубации плацентарных макрофагов с ЛПС в обеих концентрациях их активность значительно возрастает. Такая особенность может иметь физиологическое значение, обеспечивая адекватный ответ на проникновение инфекции в плаценту.
У беременных крыс L-NAME достоверно снижает активность перитонеаль-ных макрофагов только в высокой концентрации. Активность плацентарных макрофагов антагонист оксида азота не изменяет.
У интактных беременных крыс эстрадиол и прогестерон достоверных влияний на активность перитонеальных макрофагов не оказывают. При инкубации плацентарных макрофагов с эстрадиолом и прогестероном они оказывают стимулирующее влияние в обеих концентрациях, что можно объяснить особенностями гормонального фона в плаценте при беременности.
При НМПК trolox тормозит активность перитонеальных макрофагов только в высокой концентрации (рис. 11). Активность плацентарных макрофагов уменьшается только под воздействием trolox в низкой концентрации (рис. 12). Выраженность ингибирующего влияния SOD на перитонеальные макрофаги не зависит от ее концентрации в инкубационной среде. В отношении плацентарных макрофагов супероксиддисмутаза оказывает сходное действие.
Вероятно, в условиях моделирования плацентарной недостаточности, происходит гиперактивация свободнорадикальных процессов, истощаются резервы этого фермента в плацентарных фагоцитах, и они становятся к нему чувствительны.
При НМПК, как и при физиологической беременности, активность перитонеальных макрофагов увеличивается только при высокой концентрации ЛПС. На плацентарные макрофаги ЛПС достоверного влияния не оказывает. Такая особенность может играть неблагоприятную роль, нарушая нормальный ответ клеток при проникновении чужеродных агентов. L-NAME при НМПК на перитонеальные макрофаги крыс в обеих концентрациях не влияет. На плацентарные макрофаги антагонист оксида азота оказывает тормозное влияние только в высокой концентрации. У животных с НМПК эстрадиол достоверно не влияет на активность перитонеальных фагоцитов. Активность плацентарных макрофагов эстрадиол повышает в обеих концентрациях, как и у интактных беременных крыс.
Чувствительность перитонеальных макрофагов к прогестерону повышена в обеих концентрациях, их активность возрастает до уровня интактных беременных крыс. При плацентарной недостаточности продукция этого гормона в плаценте значительно снижается (Анастасьева В. Г., 1997), что может вызывать повышение чувствительности клеток и имеет физиологическое значение.
150
100
50
-50
-100
Рис. 11. Изменение активности фагоцитоза при воздействии на перитонеаль-ные макрофаги крыс с НМПК различными веществами: 1,2- разные концентрации ЛПС; 4, 5 - разные концентрации L-NAME; 7, 8 - разные концентрации Trolox; 10, 11 - разные концентрации SOD; 13, 14 - разные концентрации прогестерона; 16, 17 - разные концентрации эстрадиола (* - р < 0,05).
зоо
250 200 150 100
50
о
-50 100
%
12 3 4 I ...... 1 Г 1 171 ! 14 15 16 17
3 * * *
Рис. 12. Изменение активности фагоцитоза при воздействии на плацентарные макрофаги крыс с НМПК различными веществами: 1,2- разные концентрации ЛПС; 4, 5 - разные концентрации L-NAME; 7, 8 - разные концентрации Trolox; 10, 11 - разные концентрации SOD; 13,14- разные концентрации прогестерона; 16, 17 - разные концентрации эстрадиола (* - р < 0,05).
Под действием прогестерона секреция простогландина Ег усиливается, что рассматривается как иммуносупрессорный эффект, направленный на сохранение беременности (Yagel S. et al., 1987). Также этот гормон, связываясь с глю-кокортикоидными рецепторами, снижает продукцию провоспалительных ци-токинов, образование которых увеличивается при хронической гипоксии (Das С. et al., 2002). На плацентарные макрофаги прогестерон достоверно не влияет. Эта особенность, вероятно, защищает макрофаги от переактивации и стимуляции апоптоза, что может привести к еще большему изменению структуры плаценты.
При беременности на фоне введения альфа-токоферола активность пе-ритонеальных макрофагов под влиянием ЛПС, L-NAME, эстрадиола, прогестерона не отличается от значений интактных макрофагов крыс этой группы. Активность плацентарных макрофагов при введении альфа-токоферола меняется - они становятся чувствительны к ЛПС и прогестерону в высокой концентрации и эстрадиолу. Это позволяет предположить, что значение свободнора-дикальных процессов в регуляции работы перитонеаяьных макрофагов гораздо выше, чем плацентарных.
При введении альфа-токоферола и НМПК на процесс фагоцитоза пери-тонеальными макрофагами положительно влияют только женские половые гормоны. Активность плацентарных макрофагов на фоне НМПК и введения альфа-токоферола увеличивают высокие концентрации ЛПС и прогестерона.
Таким образом, на первом этапе работы были изучены особенности влияния N0 и свободнорадикальных процессов на функционирование системы мать - плод в норме и при НМПК.
Нарушение маточно-плацентарного кровообращения вызывает гипоксию плода, возникают серьезные системные, клеточные и метаболические изменения во всех тканях, адаптирующихся к повреждающему эффекту дефицита кислорода (Boutilier R. G., 2001). С нашей точки зрения изучение развития эритрона является важным, так как при дефиците кислорода активация этого звена кислородтранспортной системы происходит уже внутриутробно.
На этапе исследования беременных животных с НМПК обнаружены, как уже говорилось выше, снижение синтеза оксида азота, и активация свободно-радикальных процессов. Кроме того, при плацентарной недостаточности в сыворотке крови снижается концентрация альфа-токоферола (Флоренсов В.В. и др., 2005). Поэтому, помимо исследования эритроцитарного системогенеза после НМПК, было решено дополнительно сравнить влияние донатора оксида азота «Депонит-10» и антиоксиданта альфа-токоферола, вводимых с момента моделирования НМПК и до окончания гестации, на постнатальное развитие эритроцитарной системы.
При анализе продукции оксида азота в постнатальном онтогенезе на фоне НМПК выявлено повышение его образования у 2-х дневных крысят (рис. 13). Однако в дальнейшем в крови животных содержание NO* постепенно снижается и к 15-му дню достоверно не отличается от крысят контрольной
группы. На 30-й день концентрация N0* в крови крысят после НМПК снижается и становится достоверно меньше значений контроля, что можно объяснить истощением функциональных резервов регуляции метаболизма оксида
150 ■ 130 1 10
90 70 50 30 10 -10 -30 -50 150 130 110 90 70 50 30 10 -10 -ЗО -50
%
Ж-Ц—
пл. 22 д.
тг . I.
2 д.
15 Д.
1од:
г к+д
| нмпк+д
о НМПК+ГФ
2 д.
I
Рис. 13. Отклонение концентрации суммарных нитратов и нитритов у 22-х дневных плодов и 2-х, 15-ти, 30-ти дневных крысят 15-й (НМПК), 16-й (К+Д), 17-й (НМПК+Д), 18-й (К+ТФ), 19-й(НМПК+ТФ) групп по сравнению с 14-й группой (интактные) (* - р < 0,05).
При НМПК наблюдаются преобразования в эритроцитарной системе у плодов и крысят (рис. 14). Согласно данным литературы, при хронической внутриутробной гипоксии плода, как правило, происходит усиление процессов эритропоэза (Гармашева Н. Л.,"Константинова Н. Н., 1985; Румянцев А. Г. и др., 2002; Ма1ег Я. Р'. й а!., 1994). Изучение полученных нами результатов показывает, что у плодов и крысят в возрасте 2-х и 15-ти дней концентрация эритроцитов, гемоглобина и показатель гематокрита имеют значения сходные с таковыми у животных группы контроля. Реакция крови на гипоксию не всегда обнаруживает заметные изменения показателей периферической крови, что может быть связано с повреждением мембран эритроцитов при ацидозе у
35
крысят после НМПК (Торубарова Н. А., 1993). Кроме того, возникновение ацидоза в условиях дефицита кислорода стимулирует взаимодействие макрофагов с эритроцитами, активируя их фагоцитоз (ВюпсИ С. е( а1., 2002), что и выявляется на 15-й день жизни в нашем эксперименте. Эритропения, снижение концентрации гемоглобина и гематокрита, наблюдаемые на 30-й день у крысят, развивавшихся в условиях нарушения маточно-плацентарного кровообращения, скорее всего, связаны с гиперфункцией в пренатальный и ранний постнатальный периоды жизни эритроцитарной системы, что привело к истощению ее функциональных резервов в конечном итоге. Активность эритро-диереза также снижается и становится меньше, чем в контроле, что может являться защитой от еще большего уменьшения уровня эритроцитов.
I1
40 •!-%........
-ВО ■'-■■•■--------------------------------------------------------------------------------------
Рис. 14. Отклонение концентрации эритроцитов у 22-х дневных плодов и 2-х, 15-ти, 30-ти дневных крысят 15-й (НМПК), 16-й (К+Д), 17-й (НМПК+Д), 18-й (К+ТФ), 19-й (НМПК+ТФ) групп по сравнению с 14-й группой (интакт-ные) (* - р < 0,05).
Исследование состояния кроветворения показывает, что НМПК вызывает повышение концентрации ретикулоцитов и оксифильных проэриггроци-тов у плодов и 15-ти дневных крысят. Значительное возрастание этих индикаторов интенсификации эритропоэза в крови плодов данной экспериментальной группы, по всей видимости, свидетельствует об интенсивном процессе эритропоэза.
Известно, что печень является основным местом, где происходит процесс образования эритроцитов в пренатальный период развития (Назаров С. Б., 1995,1996; Румянцев А. Г. и др., 2002). Активизации процесса инволюции печеночного гемопоэза и перехода на медуллярное кроветворение способствует внутриутробная гипоксия (Аршавский И. А., 1982). Имеющиеся в литературе сведения подтверждают полученные нами результаты, которые указывают на то, что уровень кроветворения в печени у плодов и 2-х дневных крысят после НМПК находится на достаточно высоком уровне и превышает его в контрольной группе животных. 15-й день жизни крысят после гипоксии сопровождается значительным снижением темпов кроветворения в печени. Содержание эритроидных клеток в этом органе на 30-й день постнаталыюго онтогенеза находится на одинаково низком уровне у контрольных животных и крысят после НМПК, что указывает на прекращение в печени процесса эритропоэза.
У плодов и 2-х дневных крысят НМПК способствует активации кроветворения в красном костном мозге (рис. 15). При патологической беременности в мазках красного костного мозга количество клеток эритроидного ряда достоверно выше, чем в контрольной группе. Интенсивность эритропоэза в красном костном мозге к 15-му дню жизни у крысят этой группы уменьшается и становится достоверно ниже значений контроля. На 30-е сутки постнаталь-ного онтогенеза темпы медуллярного кроветворения в контроле и после НМПК имеют сходные значения и практически не отличаются между собой.
Использование экзогенного донатора оксида азота способствует поддержанию уровня N0 в организме плодов и крысят практически на одном уровне на протяжении всего срока наблюдения как при НМПК, так и в контроле (см. рис. 13). Также следует отметить, что у животных после НМПК на 30-е сутки их развития под влиянием экзогенного N0 интенсивность синтеза эндогенного оксида азота находится в пределах контрольных значений.
В крови плодов применение донатора N0 на фоне НМПК повышает концентрацию эритроцитов, гемоглобина и показатель гематокрита (см. рис. 14). Это можно объяснить защитным действием оксида азота на мембраны эритроцитов, связанным с предохранением их от повреждения. По данным И. Ю. Малышева и Е. Б. Манухиной (1998), оксид азота может активизировать синтез протекторных стресс-белков, которые принимают участие в процессе ренату-рацин белков, поврежденных в результате стресса, вызванного в данном случае дефицитом кислорода. Экзогенный оксид азота способствует развитию эритропении на второй день жизни крысят после НМПК, тогда как концентра-
ция эритроцитов в крови у крысят после НМПК была достоверно выше контрольных значений. С точки зрения Ф. 3. Меерсона и др. (1994), оксид азота в клетках может депонироваться в виде биоактивного пула нитрозилированных протеинов. Вероятно, оксид азота при переходе к внеутробным условиям существования, высвобождается из депо и модулирует процессы эритродиереза (Мясоедова Е. Е., 2005). В группе интактных крысят под воздействием N0 на 15-й день наблюдается увеличение содержания гемоглобина по сравнению с нормой. Вполне вероятно, что происходит задержка смены популяций эритроцитов под влиянием экзогенного оксида азота и еще большое число фетальных эритроцитов, содержащих большую концентрацию гемоглобина, находится в крови. К 30-му дню жизни животных, получавших внутриутробно N0, концентрация эритроцитов сходна с контрольными значениями. У крысят, развитие которых происходило при нарушении маточно-плацентарного кровообращения, N0 вызывает достоверное увеличение концентрации гемоглобина и ге-матокрита, тогда как их уровень у потомства, развивавшегося в условиях внутриутробной гипоксии, значительно ниже.
У 2-х дневных крысят использование экзогенного донатора оксида азота вызывает значительное увеличение содержания ретикулоцитов, как в группе интактных животных, так и развивавшихся в условиях НМПК. По всей видимости, в первые дни после рождения некоторому замедлению процесса становления эритроцитарной системы способствует экзогенный N0. Однако в дальнейшем активность развития эритроцитарной системы значительно ускоряется, о чем говорит более низкая концентрация ретикулоцитов в крови 15-ти дневных крысят по сравнению с другими группами. Значительное понижение уровня ретикулоцитов в крови на 30-й день жизни наблюдается у крысят только после изолированного воздействия N0.
При оценке состояния кроветворения в печени выявлено, что у плодов и 2-х дневных крысят под влиянием экзогенного N0 на фоне НМПК отсутствуют достоверные отличия в содержании эритроидных клеток. Также в печени интактных крысят 2-го дня жизни, испытавших на себе влияние экзогенного N0, наблюдается более высокое содержание эритроидных клеток. На 15-й день жизни крысят после НМПК и применения N0 отмечаются более интенсивные темпы инволюции гемопоэза в печени по сравнению с контрольными.
К интенсификации процесса эритропоэза в красном костном мозге у плодов также приводит использование экзогенного оксида азота на фоне НМПК (см. рис. 15). Однако активность медуллярного кроветворения уже у 2-х дневных крысят практически не отличается от уровня контрольных животных. На 15-й день жизни темпы медуллярного кроветворения у животных, развивавшихся при НМПК и подвергавшихся влиянию экзогенного N0, также не отличаются от нормы. В группе интактных крысят к существенному повышению содержания эритроидных клеток в красном костном мозге по сравнению с контролем приводит использование донатора оксида азота. В селезенке во всех группах уровень кроветворения не отличается от контроля на протяжении всего эксперимента.
По данным литературы, оксид азота играет важную роль в модуляции роста и дифференцировки эритроидных клеток (Oria R. et al., 1995; Raffery S. P. et al., 1996; Richardson D. R. et al., 1995; Suhasini M. et al., 1995). В нашем исследовании экзогенный NO в первые дни после рождения вызывает некоторое замедление процесса становления эритроцитарной системы. Оксид азота снижает скорость перехода от гепатолиенального типа кроветворения к медуллярному в соответствующий возрастной период.
70 60 so до зо 20 ю о -10 -20 -30
бо
50 40 ЗО 20 Ю О -10 -20
%
Ш
I
inn. 22 д..
%
2Д.Г
.....Jsa...
I к+д
; НМПК+Д
. 30 А.
пл. 22 д.
2 А,
|
А }•.......
□ "' : НМПК4-ТФ
..ЗОа.
Рис. 15. Отклонение содержания эритроидных клеток в красном костном мозге у 22-х дневных плодов и 2-х, 15-ти, 30-ти дневных крысят 15-й (НМПК), 16-й (К+Д), 17-й (НМГ1К+Д), 18-й (К+ТФ), 19-й (НМПК+ТФ) групп по сравнению с 14-й группой (интактные) (* - р < 0,05).
Введение альфа-токоферола как на фоне НМПК, так и в контроле обеспечивает поддержание уровня N0 в организме крысят практически на одном уровне на протяжении всего срока исследования (см. рис. 13).
Применение альфа-токоферола у новорожденных крысят в группе с НМПК приводит к достоверному снижению концентрации эритроцитов по сравнению с изолированной гипоксией, но от контрольных значений показа-
тель не отличается (см. рис. 14). Это свидетельствует, вероятно, об уменьшении выраженности гипоксии. Отсутствие отличий в концентрации ретикуло-цитов с НМПК может быть связано с замедлетгем скорости созревания молодых эритроцитов (March В. Е., 1969). Уменьшение количества эритроидных клеток в красном костном мозге у крысят после аномальной беременности на фоне введения альфа-токоферола это подтверждает (см. рис. 15).
На 15-е сутки жизни у крысят после НМПК и поступления витамина Е достоверно с НМПК снижается концентрация ретикулоцитов, но в тоже время эритропоэтическая активность красного костного мозга уменьшается, как в группе с изолированным НМПК. Это позволяет сделать вывод о том, что альфа-токоферол в этот период жизни не предотвращает снижение эритропо-эза. Активность эритрофагоцитоза у крысят после воздействия гипоксии и альфа-токоферола достоверно ниже, чем при изолированном НМПК, что препятствует развитию эритропении.
У 30-ти дневных крысят введение альфа-токоферола на фоне патологии беременности достоверно не меняет содержание эритроцитов и показатель ге-матокрита по сравнению с изолированным НМПК. Из полученных результатов видно, что наметившаяся тенденция к снижению показателей усугубляется на 30-й день жизни, чему дополнительно способствует возрастание активности клеточного эригродиереза по сравнению с изолированным НМПК.
Таким образом, результаты проведенного исследования выявляют неоднозначное влияние оксида азота на функционирование системы мать - плод при физиологической и патологической беременности. В то же время использование фармакологического донатора N0 как фактора коррекции антенатальной гипоксии положительно влияет на процесс постнатального эритроцитар-ного системогенеза. Альфа-токоферол оказывает неблагоприятное воздействие на систему мать-плод, вызывая внутриутробную гипоксию и задержку развития плода.
выводы
1. При физиологической беременности в материнском организме возникает комплекс изменений, обеспечивающий развитие плода (активируется эритропоэз, увеличивается образование оксида азота и синтез эндо-телиального фактора роста, усиливаются свободнорадикальные процессы). При нарушении маточно-плацентарного кровообращения снижается продукция оксида азота, что вместе с морфологическими изменениями в плаценте вызывает задержку внутриутробного развития и гипоксию плода.
2. Избыток оксида азота и свободных радикалов в организме беременных крыс ухудшает функционирование системы мать - плод, оказывает прямое цитотоксическое действие на ткань плаценты, приводит к задержке внутриутробного развития и возникновению гипоксии плода. При сочетании избытка оксида азота с нарушением маточно-плацентарного кровообращения усиливаются изменения плацентарного кровообращения, усугубляется внутриутробная гипоксия.
3. При снижении образования оксида азота на фоне активации свободно-радикальных процессов в системе мать - плод возникают изменения, сходные с воздействием донатора оксида азота. Однако, введение ингибитора синтаз оксида азота в сочетании с нарушением маточно-плацентарного кровообращения вызывает возникновение комплекса приспособительных изменений (активация эритропоэза в материнском организме, усиление образования оксида азота как у матери, так и у плода, снижение кальция в крови). Взаимодействие сосудорасширяющих и сосудосуживающих веществ обеспечивает повышение компенсаторных возможностей плацентарной циркуляции, что проявляется в увеличении массы плода.
4. Торможение свободнорадикальных процессов на фоне снижения уровня оксида азота вызывает появление признаков нарушения плацентарного кровообращения, сопровождающееся у плода гипоксией и гипотрофией. При сочетании антиоксидантной терапии с нарушением маточно-пла-центарного кровообращения возникает дефицит эпдотелиального фактора релаксации сосудов, что в комбинации с нехваткой свободнорадикальных продуктов приводит к еще большему ухудшению плацентарного кровообращения и гипоксии плода.
5. При физиологической беременности и нарушении маточно-плацентарного кровообращения активность перитонеальных макрофагов снижают антиоксиданты trolox, супероксиддисмутаза, активирует липополисаха-рид Е. coli. При нарушении маточно-плацентарного кровообращения также стимулирующее влияние на макрофаги оказывает прогестерон.
6. Активность плацентарных макрофагов, в отличие от перитонеальных, при физиологической беременности не подвержена действию антиокси-дантов, но они более чувствительны к липополисахариду Е. coli и женским половым гормонам. При нарушении маточно-плацентарного кровообращения появляется чувствительность к влиянию антиоксидантов, но исчезает реакция на эндотоксин Е. coli и прогестерон.
7. В пос гнатальном онтогенезе у крысят, развивавшихся в условиях нарушения маточно-плацентарного кровообращения повышается продукция оксида азота. В пренатальный и первые дни постнатального периода жизни потомства белых крыс происходит мобилизация функциональных резервов эритроцитарной системы, которая проявляется в виде усиления процессов эритропоэза в красном костном мозге и печени. Избыточное образование оксида азота и эритроцитов приводит впоследствии к истощению функциональных резервов и торможению клеточных механизмов эритродиереза.
8. Применение экзогенного донатора оксида азота на фоне нарушения маточно-плацентарного кровообращения в постнатальном периоде развития предотвращает изменение эритроцитарного системогенеза и синтеза оксида азота. Альфа-токоферол, несмотря на положительное влияние в отношении продукции оксида азота, не препятствует отдаленным пост-гипоксическим изменениям эритроцитарной системы.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Са - кальций НЬ - гемоглобин
Imax - максимальная интенсивность сигнала iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота
к - коэффициент, оценивающий состояние антиоксидантной системы
L-NAME - метиловый эфир L-аргинина
ЛПС - липополисахарид
N0 - оксид азота
NOS — синтаза оксида азота
N0X — суммарные нитраты и нитриты
Rt - ретикулоциты
S - светосумма свечения
SOD - супероксидцисмутаза
VEGF - эндотелиальный фактор роста сосудов
Д- депонит-10
ЗВУР - задержка внутриутробного развития
ИАФА- индекс адгезионно-фагоцитарной активности макрофагов ИФА— иммуноферментный анализ К - контрольная группа МФ - макрофаги
НМПК - нарушение маточно-ллацентарного кровообращения
HT - нитротирозин
ОП - оксифильные проэритроциты
ПОЛ - перекисное окисление липидов
СРП - свободнорадикальные процессы
ТФ — токоферол
ХЛ — хемилюминесценция
Цитр. — цитруллин
Эр - эритроциты
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Иванова, А. С. Влияние хронической нитритной интоксикации на эритрон беременных крыс, плодов, крысят / А. С. Иванова // Материалы научной конференции «Неделя науки». - Иваново, 2006. - С. 38.
2. Иванова, А. С. Состояние эритрона и интенсивность индуцированной хемилюминесценции у беременных крыс и их плодов при хронической нитритной интоксикации / А. С. Иванова, О. Г. Ситникова, С. Б. Назаров // Материалы республиканской научно-практич. конференции «Кардиологические проблемы в акушерстве, гинекологии и пе-ринатологии». - Иваново, 2006. - С. 104- 105.
3. Иванова, А. С. Влияние длительной нитритной интоксикации на эритроцитарную систему беременных крыс и их потомства / А. С. Иванова, О. А. Пахрова, С. Б. Назаров // Гигиена и санитария. -
2007. - № 2. - С. 63 - 66.
4. Иванова, А. С. Влияние длительной нитритной интоксикации на эритроцитарную систему беременных крыс и их потомства / А. С. Иванова, О. Г. Ситникова, С. Б. Назаров // Гигиена и санитария. -
2008. - № 4. - С. 72 - 75.
5. Иванова, А. С. NO-зависимые механизмы у беременных крыс, в плацентах и у плодов при нормальной беременности и на фоне нарушения маточно-плацентарного кровообращения/ А. С. Иванова// Материалы 90-й юбилейной ежегодной научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2010» посвященной 80-летию академии. - Иваново, 2010. - С. 168.
6. Иванова, А. С. Состояние NO-зависимых механизмов в плаценте и у плодов белых крыс при нормальной беременности и на фоне нарушения маточно-плацентарного кровообращения / А. С. Иванова, И. Г. Попова, С. Б. Назаров // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 2. - С. 32 -35.
7. Иванова, А. С. Изменение показателей эритроцитарной системы и активности свободнорадикальных процессов у крыс при хронической нитритной интоксикации и введении альфа-токоферола / А. С. Иванова, О. Г. Ситникова, С. Б. Назаров // Гигиена и санитария. - 2011. - № 3. - С. 78 - 80.
8. Иванова, А. С. Активность свободнорадикальных процессов и состояние эритрона у плодов крыс при хронической нитритной интоксикации и введении альфа-токоферола / А. С. Иванова, И. Г. Попова, С. Б. Назаров // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2011.- №2.-С. 23-25.
9. Иванова, А. С. Функциональная активность перитонеальных макрофагов в фазу проэструса у белых крыс / А. С. Иванова, С. Б. Назаров // Проблемы репродукции. -2011.-№ 1. - С. 19-21.
Ю.Иванова, А. С. Активность перитонеальных макрофагов у крыс при экспериментальном нарушении маточно-плацентарного кровообращения / А. С. Иванова // Материалы итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки». - Иваново, 2011.-С. 136.
П.Иванова, А. С. Роль антиоксидантов в регуляции активности перитонеальных макрофагов при нормальной беременности у белых крыс / Е. А. Попова, А. С. Иванова II Вестник молодых ученых ИвГУ. -
2011.-вып. 11.-С. 38-40.
12.Иванова, А. С. Влияние нарушения маточно-плацентарного кровообращения на продукцию оксида азота и эндотелиального фактора роста у белых крыс / А. С. Иванова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2012. - № 1. - С. 256.
1 З.Иванова, А. С. Роль оксида азота в регуляции состояния эритроци-тарной системы у потомства крыс при хроническом нарушении маточно-плацентарного кровообращения / С. Б. Назаров, А. С. Иванова, А. А. Новиков // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. -№ 5. - С. 21 - 23.
14.Иванова, А. С. Роль NO-зависимых механизмов при нормальной беременности и на фоне нарушения маточно-плацентарного кровообращения у белых крыс / А. С. Иванова, О. Г. Ситникова, С. Б. Назаров И Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -
2012,-№2.-С. 31-34.
15.Иванова, А. С. Влияние оксида азота на активность перитонеальных макрофагов при нормальной беременности у белых крыс / А. С. Иванова, О. Г. Ситникова, С. Б. Назаров // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова. - 2012. - № 3. - С. 388 - 395.
16.Иванова, А. С. Морфометрические показатели плаценты и состояние NO-зависимых механизмов у плодов при нормальной беременности и нарушениях маточно-плацентарного кровообращения в эксперименте / С. Б. Назаров, А. С. Иванова, А. А. Новиков // Архив патологии. - 2012.-Т. 74, № 1.-С. 48-50.
17.Иванова, А. С. Роль оксида азота в регуляции функции перитонеальных макрофагов у крыс при экспериментальном нарушении маточно-плацентарного кровообращения / А. С. Иванова, И. Г. Попова, С. Б. Назаров // Биомедицина. - 2012. 2. - С. 61 - 67.
18.Иванова, А. С. Влияние различных факторов на активность плацентарных макрофагов при нормальной беременности у белых крыс / А. С. Иванова // Материалы III конференции молодых ученых и студентов. ФГБУ НИИ НФ им. П. К. Анохина РАМН, 2012.
[Ищк//ги scribd.com/doc/]14067824/Conference-yIU]
19.Иванова, А. С. Влияние оксида азота на физическое развитие и активность эритропоэза у потомства крыс при нарушении маточно-плацен-
тарного кровообращения / С. Б. Назаров, А. С. Иванова, А. А. Новиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2012. -№ 12.-С. 701-704.
20.Иванова, А. С. Влияние антиоксидантов и оксида азота на активность перитонеальных макрофагов при нормальной беременности у белых крыс / А. С. Иванова, И. Г. Попова, С. Б. Назаров // Бюллетень экспериментальной биологин и медицины. - 2012. - N° 11. - С 532534.
21.Иванова, А. С. Влияние бета-эстрадиола и прогестерона на активность макрофагов при нарушении маточно-плацентарного кровообращения у белых крыс / А. С. Иванова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2013. - №1. - С. 154 -155.
22. Иванова, А. С. Продукция оксида азота у беременных крыс и особенности постнатального системогенеза у их потомства, развивавшегося при нарушении маточно-плацентарного кровообращения / С. Б. Назаров, А. С. Иванова, А. А. Новиков // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2013. -№ 4. - С. 59-63.