Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин

На правах рукопи<

Андреева Юлия Сергеевна

РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА ЖЕНЩИН

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск -

2005

Работа выполнена в НИИ иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Южно-Уральском научном центре Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Долгушин Илья Ильич

Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Колесников Олег Леонидович Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация' Институт иммунологии и физиологии УрО РАН (г. Екатеринбург).

Защита состоится и 2005г. в «_/$> часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208.117.03 ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «_»_2005г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Л Ф

Jtoow

ms

Л/</3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нейтрофилы относятся к тканевым фагоцитирующим клеткам (Пи-гаревский В Е , 1982, 1992; Бережная НМ, 1988; Бакуев М.М., 1992; Воробьев А А , Медуницин Н.В., 1995; Маянский Д Н., Цырендоржиев Д.Д. и др, 1996; Ройт А., Бростофф Дж. и др., 2000; Долгушин И И., Бухарин О.В , 2001) В тканях нейтрофилы осуществляют все свои эф-фекторные функции, участвуя в антимикробных и воспалительных реакциях. В последние годы показано, что значительная часть этих клеток покидает ткани и мигрирует на поверхность слизистых оболочек, где они и погибают (Долгушин И И , Бухарин О.В., 2001). Остается не ясным, каков биологический смысл такого "марша смерти" нейтрофилов в слизистый биослой.

Не исключено, что, мигрируя на поверхность эпителия и разрушаясь в результате некробиоза или апоптоза, нейтрофилы выделяют наружу антимикробные продукты своих лизосом, которые, обладая бакгерицид-ностью, влияют на микрофлору, заселяющую слизистые оболочки

Ранее было показано, что в секретах репродуктивной системы женщин содержи гея значительное количество нейтрофилов (Bainton D F, 1995; Телешева J1 Ф , 2000) В этой связи возникло предположение, что одной из функций цервикальных и вагинальных нейтрофилов является участие в регуляции микробиоценоза этих биотопов Данное предположение и определило цель исследования.

Цель исследования

Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в регуляции микробиоценоза влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом

Задачи исследования

1 Оценить функциональную активность нейтрофилов периферической крови после активации различными видами микроорганизмов и латексом in vitro. • "„..ГГГТ™"* "

2 Изучить влияние нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалищной слизи здоровых женщин

3 Исследовать влияние нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалищной слизи женщин с бактериальным вагинозом

4 Определить in vitro бактерицидный эффект супернатанта активированных и неактивированных нейтрофилов на S.aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp

Положения, выносимые на защиту

1 Функциональный ответ нейтрофилов на стимуляцию in vitro бактериями различных видов неодинаков' нейтрофилы активно фагоцитируют Е. coli (штамм М-17), S aureus (штамм 209), Lactobacterium spp и в меньшей степени - Bifidobacterium spp. При этом фагоцитоз кишечных палочек и золотистого стафилококка сопровождается существенным, а лакто- и бифидобактерий - менее значительным усилением лизосомаль-ной и НСТ-редуцирующей активностинейтрофильных гранулоцитов

2 Нейтрофильные гранулоциты и их секреторные продукты участвуют в регуляции микробиоценоза влагалища при нормальном микробиоценозе они существенно не влияют на его видовой состав, при дисбиоце-нозе - обладают селективной бактерицидностью, подавляя рост условно-патогенной флоры и существенно не изменяя содержание в вагинальной слизи резидентных бактерий (лактобактерий)

3 Продукты секреции, полученные из неактивированных нейтрофилов периферической крови (супернатанты), обладают широким спектром антимикробной активности и подавляют рост Е coli (штамм М-17), S aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

4 Предшествующая активация нейтрофилов взвесью бактериальных клеток приводит к изменению бактерицидных свойств медиаторов, секретируемых гранулоцитами, при этом спектр антимикробной активности определяется характером индуктора секреции

Научная новизна

Впервые изучено влияние нейтрофилов, продуктов их секреции, гепаринизированной крови и лейкоцитарной взвеси на состав флоры влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Выявлено, что нейтрофильные гранулоциты и их секреторные продукты участвуют в нормализации микробиоценоза влагалища женщин с бактериальным вагинозом При этом секреторные продукты неактивированных нейтрофилов обладают широким спектром антимикробной активности При активации нейтрофилов эталонными штаммами Е coli (штамм М-17), S aureus (штамм 209), Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp бактерицидные свойства их супернатантов изменяются, при этом спектр их бактерицидное™ неодинаков после активации различными культурами микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные помогают расширить представление об участии нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек гениталий женщины Выявлено, что нейтро-филы и продукты их секреции участвуют в селективной деконтаминации влагалищного биотопа женщин с бактериальным вагинозом. Результаты исследований открывают перспективу для проведения клинических испытаний локального использования аутолог ичных секреторных продуктов нейтрофилов в комплексе с основной терапией с целью оптимизации коррекции дисбиотических состояний репродуктивной системы женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным вагинозом, атакже для дальнейшего более детального изучения механизмов бактерицидное-ти продуктов нейтрофилов.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины" (Чита, 2003), HI конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003), конференции "Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов" (Челябинск, 2004); науч-

ной сессии "Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения"; VIIF всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2004)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы исследования", четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 121 отечественную работу и 86 иностранных публикаций Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 11 рисунками.

Материалы и методы исследований

В ходе работы было проведено иммунологическое и микробиологическое обследование 103 женщин в возрасте 19-35 лет, из которых 32 женщины имели установленный диагноз - бактериальный вагиноз, а остальные были здоровыми Исследования проводились в первой фазе менструального цикла У всех пациенток при обследовании были исключены трихомониаз, гонорея, сифилис, ВИЧ-инфекция, хламидиоз, уреап-лазмоз, микоплазмоз, генитальный герпес и цитомегаловирусная инфекция.

Функциональный ответ нейтрофилов крови оценивался по лизосо-мальной активности (Фрейдлин И.С , 1984); с помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста проводилось определение внутриклеточного кислородзависимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов (Маянский А Н , Виксман М.К., 1979), исследование фагоцитарной активности нейтрофилов проводилось на модели поглощения частиц поли-стерольного латекса (Лебедев К А,ПонякинаИ Д , 1990) и контрольных штаммов микроорганизмов (S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин", ФГПУ "НПО "Микроген" МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "Им-Био", г Нижний Новгород), Bifidobacterium spp (препарат "Бифидум-

бактерии сухой", ЗАО "Экополис", г Ковров) (Иммунологические методы .. , 1981, 1987)

Микробиологическое обследование проводилось с целью выявления этиологически значимого возбудителя генитальной инфекции и оценки состава микрофлоры влагалища (Приказ № 286 МЗ РФ "О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем" от 07.12 93 г) Исследование на гонорею и трихомониаз проводилось по общепринятым методикам и согласно приказу № 936 МЗ СССР "Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза" от 12 июля 1985 года Для определения антигенов хлами-дий, уреаплазм, микоплазм, вируса простого герпеса 1,11 типа, цитомега-ловируса и гарднерелл использовали реакции прямой и непрямой имму-нофлюоресценции (РИФ) Кроме РИФ, индикация уреаплазм проводилась на основании качественной пробы на уреазу с использованием жидкой питательной среды Для оценки микробиоценоза влагалища проводили бактериологическое исследование, с целью количественного определения резидентной и факультативной флоры (Приказ № 535 от 22 04 1985 г МЗ СССР "Об унификации микробиологических/бактериологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ")

Для получения продуктов секреции нейтрофилов использовали ге-паринизированную венозную кровь здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом Нейтрофилы выделяли на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR) Плотное гь верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095 (Wong L , 1975) Секреторные продукты нейтрофилов получали методом, разработанным научным коллективом, возглавляемым профессором Долгушиным И. И и опубликованным в работах 1984-1992г.

Для определения бактерицидной активности гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси, нейтрофилов и их секреторных продуктов использовали классический и упрощенный фотонефелометрический методы (Иммунологические методы .. , 1981).

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6 0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала -Уоллиса и Манна - Уитни В отдельных случаях применяли точный критерий Фишера (Гланц С ,1999, Платонов А Е ,2000, Боровиков В П, 2001) При проведении множественных сравнений использовали поправку Бон-феррони (Гланц С.,1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Прежде чем изучить способность нейтрофилов и их секреторных продуктов влиять на микробиоценоз влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом, нами была исследована способность бактерий, наиболее часто заселяющих влагалище, влиять на функциональный статус нейтрофилов.

Функциональная активность нейгрофилов периферической крови была изучена после активации различными видами микроорганизмов (S. aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobacterium spp, Bifidobacterium spp ) и частицами латекса Проведенные исследования позволили установить, что нейтрофилы способны фагоцитировать частицы латекса, условно-патогенные и непатогенные микроорганизмы, при этом поглотительная функция нейтрофилов была минимальной по отношению к бифидобактериям.

Способность нейтрофилов к внутриклеточному киллиш у оценивалась с помощью НСТ-теста, позволяющего определить активность кис-лородзависимых систем бактерицидное™, являющихся ведущими инт-ралейкоци гарными микробоцидными факторами в процессе фагоцитоза Процент клеток, восстанавливающих HCT после активации микроорганизмами и латексом, был выше исходного уровня. Значимые отличия наблюдались при индукции нейтрофилов частицами латекса, Е coli и S aureus Индексы индуцированного стафилококками и латексом НСТ-теста, выраженные в условных единицах, были достоверно выше базальной реакции, а при индукции лакто- и бифидобактериями - значимо не отличались от исходного уровня.

Лизосомальная активность не изменялась при действии частиц по-листирольного латекса, лакто- и бифидобактерий в сравнении с исходным уровнем свечения лизосом и была выше после взаимодействия ней-трофилов с Е coli, S aureus.

В результате проведенных исследований нами получены данные о том, что внутриклеточные киллинговые системы нейтрофилов активируются в большей степени продуктами Е coli (штамм М-17) и S aureus (штамм 209), чем Lactobacterium spp (препарат "Лактобакгерин сухой", фирма "ИмБио", г Нижний Новгород) и Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г. Ковров).

Учитывая, что нейтрофилы на поверхности слизистых оболочек оказывают антимикробное действие, по-видимому, не столько за счет внутриклеточного, сколько внеклеточного киллинга, важно было оценить бактерицидные свойства их секреторных продуктов

Для решения этой задачи, прежде всего, было изучено исходное состояние влагалищной флоры (опыт 1), а затем определено влияние на ее состав гепаринизированной крови (опыт 2), лейкоцитарной взвеси (опыт 3), чистой взвеси нейтрофилов (опыт 4) и супернатантов неактивированных (опыт 5) и активированных нейтрофилов (опыт 6) (рисунок 1)

Для проведения исследований в день опыта у женщины забирали ОД мл вагинального содержимого в пробирку с 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия и 15 мл крови из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом Цельную гепаринизированную кровь использовали в качссч ве reci ируемого образца в опыте № 2 Лёйкоцитарную взвесь получали из гепаринизированной крови после седиментации эритроцитов и использовали в 3 опыте Выделение чистой взвеси нейтрофилов проводили на двойном градиенте растворов фиколла-верографина Выделенные клетки доводили до концентрации 5x106 кл/мл и использовали для опыта № 4 Для опыта № 5 использовали секреторные продукты неактивированных нейтрофилов, которые получали после инкубации клеток (концентрация 5x106 ют/мл) при температуре + 37°С в течение 30 минут без индукторов секреции После этого клетки центрифугировали 20 мин при 3x101 об/мин, полученный супернатант фильтровали через мембран-

СХЕМА ОПЫТА

Контроль 'Uijhojioi ический раствор (о 1ЫтЛИ)

Вагинальное содержимое

30 Флора

t= 37 С VI ин

Опыт

Гепаринизированная кровь (опьп №2) i а

t= 30

Флора

57 С иин

Лейкоцитарная взвесь (опыт №3)

Вагинальное содержимое

Вагинальное to II'ржиVtОС

t=2 7 С 3011ин

t——^t

Нейтрофилы (опыт №4)

t-3 30

ФлЯра

ГС

ЛИН

Нейтрофилы (ОПЫТ^Г25)

НеЙ1рофилы (опыт №6)

Buiинальное

Сунерна i ан i содержимое

t=3' 30 м

Bai инальное сотержимое

Balинальное со держичое

t=: 30

Флера

7°С чин

С>пернатант

Bai инальное »о держичое

t-37 30»

Флора

Рис 1 Схема опытов по оценке влияния нейтрофилов и их продуктов на вагинальную флору

ные фильтры и сразу использовали для тестирования Секреторные продукты активированных нейтрофилов получали после инкубации клеток (концентрации 5x106 кл/мл) в тех же условиях, но в присутствии вагинального содержимого После центрифугирования при 3x103 об/мин, полученный супернатант пропускали через мембранные фильтры и сразу использовали в опыте № 6.

Для регистрации возможного влияния нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалища, 0,9 мл каждого тестируемого образца соединяли с 0,1 мл вагинального содержимого Для контроля использовали 0,9 мл физиологического раствора (опыт № 1). Смесь инкубировали в течение 30 мин при температуре +37°С (рисунок 1)

После инкубации из контрольной и опытных пробирок производили высев количественным методом на 5% кровяной, желточно-солевой агар, на тиогликолиевую среду, среду MRS и Сабуро Через 48 часов инкуба-

ции в эксикаторе со свечой изучали рост микроорганизмов, определяли степень обсеменения вагинальной слизи, выделяли чистые культуры и проводили их идентификацию

У здоровых женщин из влагалища в основном высевались лакто-бактерии, в 23% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях - дрожжеподобные грибы и Е coli (таблица 1), что совпадало с данными литературы (Валышев А В , Елагина Н Н и др , 2001, Кира Е Ф , 2001, Кафарская Л И , Коршунова OB и др , 2002; Кудрявцева Л В , Ильина Е Н и др , 2003)

Содержание лактобактерий в пробе под действием нейтрофилов, их секреторных продуктов, гепаринизированной крови и лейкоцитарной взвеси существенно не менялось Нейтрофилы значимо снижали лишь содержание коагулазонегативных стафилококков в вагинальной слизи На дрожжеподобные грибы и Е coli все тестируемые образцы оказывали бактерицидное действие, однако значимых отличий по сравнению с контролем выявлено не было Таким образом, супернатанты неактивированных и активированных нейтрофилов, лейкоцитарная взвесь и гепарини-зированная кровь существенно не влияли на состав флоры влагалища здоровых женщин

Учитывая полученные результаты, было продолжено исследование бактерицидной активности нейтрофилов периферической крови, их секреторных продуктов, а также лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови в отношении представителей влагалищной флоры женщин с бактериальным вагинозом Данное заболевание представляло наибольший интерес, так как при бактериальном вагинозе наблюдаются значительные нарушения микробиоценоза влагалища, характеризующиеся снижением удельного веса лактобактерий и повышением уровня условно-патогенных микроорганизмов (Муравьева В В., Анкирская A.C., 1996; Wilks М., Thin R N. et al, 1984; Harnmann R , Krombus A. et al., 1987). Кроме этого, одним из проявлений такого состояния является нормальное содержание лейкоцитов в вагинальной слизи (Кафарская Л И , Коршунова OB и др , 2002) и практически полное отсутствие классической воспалительной реакции

Установлено, что у женщин с бактериальным вагинозом из влагалища выделяется более широкий спектр микроорганизмов, чем у здоровых женщин (таблица 1) Наряду с лактобактериями, которые определялись в более низких титрах, из влагалища в 78% случаев высевали гар-днереллы, в 30% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях - дрожжеподобные грибы, бифидобактерии, Е. coli и протей, что совпадает с данными литературы (Коршунов В М , Володин Н Н и др , 1999; Кира Е Ф., 2001, Кудрявцева J1 В , Ильина Е Н и др., 2003).

Таблица 1

Состав микрофлоры здоровых женщин и женщин с бактериальным

вагинозом, lg

Вид микроорганизма Стат показатель Спектр вагинальной: флоры 34 здоровых женщин Спектр вагинальной флоры 32 женщин с бактериальным вагинозом

Lactobacillus spp M±m 4,75±0,15 2.29±0,42

n 32 28

Staphylococcus M ± m 3,88±0,35 3.80±0,29

spp n 8 10

Candida spp M±m 4,00±0,00 4.33±0,33

n 1 3

E coli M±m 4,33±0,33 3.00±0,00

n 3 1

G \aginahs M±m 0 4.64±0,28

n 0 25

Bifidobactenum M±m Ü 5.00±0,00

spp n 0 1

Proteus spp M±m 0 7.00±0,00

n 0 1

При исследовании влияния нейтрофилов и их медиаторов на флору вагинальной слизи было отмечено снижение содержания в секрете количества стафилококков под действием секреторных продуктов нейтрофилов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови (таблица 2) Инкубация с вагинальным секретом очищенной фракции нейтрофилов не оказывала значимого влияния на содержание стафилококков

Таблица2

Влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на количество коагулазонегатнвных стафилококков, G. vaginalis, бифидобактерий, бактерий рода Proteus, дрожжеподобных грибов рода Candida и E.coli в вагинальной сличи женщин с бактериальным вагинозом, lg

Вид микроорганизма Стат показатель Контроль кровь JIB НФ CHH САН

1 2 3 4 5 6

Stapln lococcus spp М 3,80 1,00 , 1,29 2,00 0,40 1,71

m 0,29 0,68 0,64 0,63 0,40 0,52

P Pl-2 0,007 Pl-3 0,006 Pl-5 0,002 Рм 0,005

G vaginalis M 4,64 2,35 2,50 1,53 2,54 2,38

m 0,28 0,65 0,57 0,53 0,57 0,55

P Pl-2 Pl-1 0,002 0,002 Pl-4 0.001 Pl-5 0,005 Pt-6 0,002

Bifidobacterium spp M 5.00 3,00 3,00 0,00 3,00 4.00

m 0,00 0,00 ( 0,00 0,00 0,00 0,00

Proteus spp M 7,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

m 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

E coli M 3,00 0,00 ' 0,00 1 0,00 0,00 0,00

m 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Candida spp M 4,33 3,00 1 2,67 1 3,00 3,00 3,00

M 0,33 1,53 ( 1,76 1,00 1,00 0,00

Примечание к таблице 2'

р - достоверность различий рассчитана по отношению к исходному уровню содержания микроорганизмов в материале; кровь - гепаринизированная кровь; ЛВ - лейкоцитарная взвесь; НФ - нейтрофилы,

СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов; САН- супернатант активированных нейтрофилов;

Нейтрофилы (НФ), супернатант неактивированных (СНН) и активированных (САН) нейтрофилов, лейкоцитарная взвесь (ЛВ) и гепаринизированная кровь значимо снижали содержание гарднерелл в вагинальной слизи По-видимому, супернатанты активированных и неактивированных

нейтрофилов содержат токсические формы кислорода, губительно действующие на анаэробную флору Кроме того, 1§Сг - антитела, которые в

/I

больших количествах определяются в сыворотке и вагинальной слизи женщин с бактериальным вагинозом (Смольникова Л.А, 1999; Долгушина В Ф , Смольникова Л А и др , 2001) обладают опсоническими свойствами и могут стимулировать адгезию, дегрануляцию нейтрофилов и облегчать киллинг микроорганизмов (Азов Н А , Маянский А Н , 1985, Барсуков А А , Годков М А и др , 2004).

При изучении влияния продуктов нейтрофилов на лактофлору было обнаружено незначительное бактерицидное действие супернатантов на эти бактерии Вместе с тем было установлено, что добавление цельной крови к вагинальному содержимому женщин с бактериальным вагинозом стимулирует рост лактобактерий (таблица 3) Это может быть связано с наличием факторов роста для лактобактерий в гепаринизированной крови Вероятно, циклические менструальные кровотечения имеют биологический смысл, возможно, именно так ежемесячно осуществляется саморегуляция состава флоры генитального тракта.

Таблица 3

Влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на лакгобактерии влагалища женщин с бактериальным вагинозом, ^

Вид микроорганизма Стат показатель Контроль кровь ЛВ 1 НФ снн САН

1 2 3 ! 4 5 6 1

ЬасШЬаас- М 2,29 5,35 3,17 2,30 1,20 1,41

пит врр т 0,42 0,48 0,49 0,67 0,63 0,45 ]

п 28 20 23 I 20 10 П I

Р Р1-2 0,00005 Р2-3 0,001 1 Р25 0,0002 Р2-6 0,00002

Примечание к таблице 3: достоверность различий рассчитана по отношению к уровню содержания лактобактерий в пробе при действии гепариниз ирован-ной крови

В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что нейтрофилы и их секреторные продукты оказывают регулирующее и нормализующее влияние на состав флоры слизистых оболочек, тем са-

мым, участвуя в селективной деконтаминации влагалищного биотопа Бактериальный вагиноз это эпителиальная инфекция, и, по-видимому, дефицит локальной лейкоцитарной реакции может быть одной из причин развития вагинального дисбиоза. В то же время восполнение этих клеток в секрете нормализует влагалищную флору

В представленных опытах кровь, взвесь нейтрофилов, их медиаторы г вносились в вагинальный секрет сразу после их выделения Таким обра-

зом, оценивалась суммарная бактерицидность всех выделенных из нейт-. рофилов факторов и короткоживущих (в основном это метаболиты кисло-

рода) и долгоживущих (бактерицидные пептиды и ферменты лизосом).

Для исключения действия быстроразрушающихся метаболитов кислорода, а также для изучения зависимости спектра бактерицидной активности секреторных продуктов нейтрофилов от характера индукции секреции, был изменен дизайн исследования Для опыта использовались супернатанты неактивированных нейтрофилов и нейтрофилов, активированных в течение 30 минут при температуре +37°С in vitro в присутствии различных индукторов секреции (частиц полистирольного латекса, S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobacterium spp , Bifidobacterium spp ) Бактерицидность секреторных продуктов оценивалась через 30 дней после хранения при температуре -15°С Спектр антимикробной активности супернатантов определялся по отношению к тем же штаммам микроорганизмов Для определения бактерицидности по отношению к Е coli (штамм М-17) применялся упрощенный фотонефе-лометрический метод О. В Смирновой и Т. А Кузьминой (Иммуноло-гич методы ,1981) Для этого в пробирки наливали по 4,5 мл стерильного 5% мясопептонного бульона С целью изучения дозозависимого , эффекта в оньиные пробирки добавляли по 1,0 мл, 0,5 и 0,1 млсекретор-

ных продуктов неактивированных нейтрофилов и нейтрофилов, активированных взвесью контрольных штаммов и частицами латекса, недостающий объем до 1 мл восполняли 0,9% раствором хлорида натрия. Для контроля использовали 1мл физиологического раствора Затем во все пробирки вносили но одной капле 24-часовой культуры кишечной палочки (плотность взвеси 0,46-0,48, которую определяли на ФЭКе с зеле-

ным светофильтром при длине волны 540 нм) Содержимое пробирок тщательно перемешивали и стерильной пипеткой отбирали по 2 мл для измерения на ФЭКе оптической плотности (Д) Смесь, оставшуюся в пробирках, инкубировали в термостате при температуре +37°С 3 часа После этого вновь измеряли оптическую плотность содержимого пробирок Бактерицидную активность (БА) вычисляли следующим образом До через 3 часа - До перед инкубацией

БА, % = 100-----------х 100,

Дк через 3 часа - Дк перед инкубацией где До - оптическая плотность в опыте, Дк - оптическая плотность в контроле

Таким же образом определяли бактерицидную активность секреторных продуктов нейтрофилов по отношению к S aureus

Для определения бактерицидной активности на лактобактерии использовали модифицированную жидкую питательную среду MPC ("НИЦФ", г Санкт - Петербург), а для бифидобактерий использовали ти-огликолиевую среду (ОАО "Биомед" им И.И Мечникова) и исследования проводили по той же схеме.

При определении спектра бактерицидности супернатантов, выделенных из интактных нейтрофилов (очищенные на градиенте фиколла-верог-рафина клетки инкубировали 30 минут в физиологическом растворе при температуре +37°С, затем клеточную взвесь центрифугировали при 3000 оборотах в минуту и получали супернатанты), установили, что секреторные продукты неактивированных нейтрофилов снижали содержание всех видов микроорганизмов в исследуемой пробе (таблица 4) Дозозависи-мого повышения бактерицидных свойств секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов отмечено не было

При изучении спектра антимикробной активности супернатантов нейтрофилов, активированных латексом, определили, что бактерицидность секреторных продуктов была ниже бактерицидного действия суперна-танта неактивированных нейтрофилов (СНН), при действии на все тестируемые куш.туры, но достоверное снижение эффекта было отмечено только при действии на Е coli (таблица 4)

Таблица4

Бактерицидное действие супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов на S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Объекты бактери ци дного действия Вид супернатанта

СНН CAHlat CAHS САНЕ ' CAHL САНВ

S aureus т т Г 1*

Е coli г 1* г 1* Г 1

Lactobacterium spp т 1 т

Bifidobacterium spp т т ?* Т I Т т

Примечание к таблице 4:

* - бактерицидность достоверно ниже, чем бактерицидность СНН ** - бактерииидность достоверно выше, чем бактерицидность СНН "Г - бактерицидное действие | - отсутствует бактерицидный эффект СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов CAHlat - супернатант нейтрофилов, активированных латексом CAHS - супернатант нейтрофилов, активированных S aureus (штамм 209) САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных Е coli (штамм М-17) CAHL - супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobactenum spp.

Секреторные продукты нейтрофилов, активированных бифидобак-териями, обладали бактерицидной активностью и превосходили бактерицидный эффект супернатанта неактивированных нейтрофилов при действии на S aureus и Lactobacterium spp В то же время при действии на Е coli бактерицидность супернатанта нейтрофилов, активированных бифи-добактериями (САНВ), была ниже бактерицидного эффекта СНН

Снижение бактерицидности наблюдалось при действии супернатанта нейтрофилов, активированных стафилококком, на лактобактерии и на стафилококки, при действии на бифидобактерии и Е coli бактерицидный потенциал сохранялся, хотя он был значительно ниже уровня бактерицидности супернатанта неактивированных нейтрофилов

При действии секреторных продуктов нейтрофилов, активированных эшерихиями и лактобактериями, на Е. coli и S aureus была отмечена низкая бактерицидная активность, а при влиянии на лактобактерии - этот показатель имел достоверно более высокие значения (таблица 4)

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что интактные нейгрофилы секретируют длительно сохраняющиеся бактерицидные продукты, обладающие широким спектром антимикробного действия, влияющие на рост S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobactenum spp и Bifidobacterium spp Аналогичным (и даже более сильным) эффектом обладают супернатанты, полученные из нейтрофилов, индуцированных взвесью бифидобактерий. Это, по-видимому, связано с описанным выше отсутствием у бифидобактерий способности активировать нейтрофилы В то же время, предварительная инкубация нейтрофилов с взвесью других, изученных нами, индукторов секреции приводят к уменьшению или полному исчезновению у супернатантов части бактерицидной активности по отношению к некоторым видам микроорганизмов, использованных для индукции клеток. Так, преинкубация нейтрофилов со взвесью S aureus (штамм 209) и Е coli (штамм М-17) сопровождается потерей бактерицидных свойств супернатантов относительно этих микроорганизмов, в то время как их антимикробная активность к лакго- и бифидобактериям - сохраняется Такая избирательная потеря бак-терицидности, по-видимому, связана с тем, что антимикробные пептиды и ферменты лизосом обладают определенной специфичностью своего действия на различные группы микроорганизмов, и предвари гельная инкубация нейтрофилов с этими штаммами сопровождается расходованием (истощением) этих продуктов в супернатантах

Полученные результаты позволяют заключить, что нейтрофилам и их секреторным продуктам принадлежит определенная роль в регуляции микробиоценоза влагалища женщин, и, наряду с эпителиальными клетками влагалища, вагинальной слизью, микрофлорой генитального тракта и другими факторами неспецифической защиты они участвуют в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек репродуктивной системы женщины

Кроме того, на поверхности слизистых цервикального канала и влагалища бактерицидный эффект нейтрофилов может быть усилен за счет кооперации нейтрофилов и микроорганизмов, входящих в состав нормальной флоры генитального тракта (рисунок 2). Связывание компонентов микробной стенки с То11-подобными рецепторами нейтрофила может приводить к активации внутриклеточных мессенджеров с последующей секреторной дегрануляцией (Сидоренко С В , 2001; Артамонов Р Г, 2004, Маянский А.Н ,МаянскаяИ.В , 2004). В результате такого процесса из гранул высвобождаются бактерицидные вещества' микробоцид-ныеферменты, антибактериальные катионные белки, нейтральные сери-новые протеазы, металлопротеиназы, кислые гидролазы, продукты респираторного взрыва - перекись водорода, гидроксильный радикал, ато-

То11-подобные и др\ гис рецепторы

нейтрофил

дегранудяция

Активация

О

ОН Н20, галоиды серпоцидины

катепсины

тизоцим БПИ

дефенсины

лактоферрин

миелопероксидата-

Аутоцитотоксическое действие

Стафилококки

Грибы рода I ^

Candida

Е coli • aj

Бифидобактерии Лактобактерии

Н20,

НОС1-

Селективная бактерицидность

Рис 2 Кооперация нейтрофилов и лактобактерий в повышении бактерицидное™ секретов генитального тракта женщин

марный кислород, оксид азота, пероксинитрит и другие, в том числе и миелопероксидаза Возможно, этот фермент взаимодействует с Н202, которая продуцируется лактобактериями влагалища женщин, и хлоридами вагинального секрета с образованием гипохлорной кислоты (НОС1) -мощного оксиданта, способствующего избирательному киллингу микроорганизмов (рисунок 2), а кислая рН во влагалище усиливает активность миелопероксидазы

Селективная бактерицидность продуктов нейтрофилов может быть обусловлена тем, что гранулы этих клеток гетерогенны, скорость их функциональной мобилизации неодинакова (Долгушин И И , Бухарин О В , 2001) и при активации нейтрофилов через различные рецепторы, в том числе и То11-подобные, клетка секретирует неодинаковый набор антимикробных медиаторов

Таким образом, нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища, поскольку обладают селективной бакгерицидностью' они подавляют рост условно-патогенной флоры и не влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа.

Выводы

1 Функциональный ответ нейтрофилов на стимуляцию in vitro бактериями различных видов неодинаков нейтрофилы акт ивно фагоцитируют Escherichia coli (штамм М-17), Staphylococcus aureus (штамм 209), Lactobactenum и в меньшей степени - Bifidobacterium При этом фагоцитоз кишечных палочек и золотистого стафилококка сопровождается существенным, а лактобактерий и бифидобактерий - менее значительным усилением лизосомальной и НСТ-редуцирующей активности нейтрофиль-ных гранулоцитов.

2 Инкубация in vitro нейтрофилов, их секреторных продуктов с вагинальным содержимым женщин с нормальным влагалищным микробиоценозом существенно не влияет на видовой состав микрофлоры вагинальной слизи.

3 У женщин с бактериальным вагинозом инкубация вагинального секрета со взвесью нейтрофилов, продуктами их секреции существенно изменяет структуру микробиоценоза' в секрете снижается содержание гарднерелл, стафилококков, эшерихий, протея и дрожжеподобных грибов, количество лактобактерий не изменяется Инкубация in vitro вагинальной слизи с гепаринизированной кровью подавляет условно-патогенную флору и оказывает стимулирующее действие на рост лактобактерий.

4 Нейтрофилы периферической крови, инкубированные in vitro в течение 30 минут при температуре +37°С в отсутствии индукторов секреции, выделяют наружу продукты с широким спектром антимикробной активности, они подавляют рост эталонных штаммов кишечной палочки, золотистого стафилококка, лактобактерий и бифидобактерий

5 Предварительная инкубация нейтрофилов ш vitro со взвесью частиц латекса, кишечной палочки, стафилококка, лактобактерий и бифидобактерий приводит к изменению спектра бактерицидной активности сек-ретируемых нейтрофилами антимикробных продуктов. Если в качестве индуктора секреции применяется взвесь стафилококка или кишечной палочки, то секреторные продукты нейтрофилов утрачивают бактерицид-ность по отношению к этим же штаммам бактерий Индукция нейтрофилов лактобактериями также приводит к потере бактерицидности суперна-тантов по отношению к Escherichia coli (штамм М-17), Staphylococcus aureus (штамм 209). Активация нейтрофилов бифидобактериями, наоборот, сопровождается выбросом бактерицидных продуктов, подавляющих рост золотистого стафилококка и лактобактерий.

6 Нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе, поскольку обладают селективной бактерицидностькг они подавляют рост условно-патогенной флоры и не влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Андреева Ю.С Сравнительная характеристика бактерицидной функции супернатанта нейтрофилов, активированных лактобактериями, у женщин с невынашиванием беременности /ЮС Андреева, В А Тупиков, Л.Н Бугрова // Иммунология Урала: Материалы III конф. Иммунологов Урала. - Челябинск, 2003. - № 1(3). - С. 19.

2. Андреева Ю С. Изучение бактерицидной функции супернатанта нейтрофилов, активированных лактобактериями у женщин с невынашиванием беременности /ЮС Андреева, Л.Н. Бугрова // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Материалы Всероссийской науч. - пракгич. конф. - Чита, 2003. - С. 134-135.

3. Долгушин И И Участие нейтрофилов и их секреторных продуктов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин с дисбиотическими процессами в урогенитальном тракте /ИИ Долгушин, Ю С. Андреева / / Медицинская иммунология - 2003. - Т. 6, № 3-5. - С. 379-380.

4 Долгушин И И. Взаимодействие нейтрофилов и их секреторных продуктов с представителями микрофлоры влагалища женщин при дис-биотических процессах в урогенитальном тракте / И.И. Долгушин, Л.Ф Телешева, Ю С Андреева, А Ю Савочкина, М.А Свиридов, Е.В. Плеханова// Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения: Труды науч. сессии - Челябинск, 2004. - С 29-31.

5 Андреева Ю.С. Изучение in vitro влияния нейтрофилов на микрофлору влагалища женщин с дисбиотическими процессами в урогенитальном тракте /Ю С. Андреева, Л.Н Бугрова, И И Долгушин // Современные проблемы диагностики и лечения дисбакгериозов Материалы конф. - Челябинск, 2004 - С. 4-5

6 Долгушин И И Сравнительный анализ бактерицидной активности секреторных продуктов нейтрофилов, плазмы крови и цельной гепа-ринизированной крови на лактобактерии и Gardnerella vaginalis вагинальной слизи /ИИ Долгушин, Ю С Андреева, Л Н Бугрова // Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов: Материалы конф - Челябинск, 2004. - С. 27-28

Андреева Юлия Сергеевна

РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОВ В РЕГУЛЯЦИИ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА ЖЕНЩИН

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2005

Отпечатано в издательстве «Челябинская государственная медицинская

академия». Лицензия № 01906. Подписано к печати 12.05.05 г. Объем 1 п л. Формат 64x84. Гарнитура «Times New Roman суг» Бумага для офисной техники, 80 мг/м2. Тираж 100 экз.

vi о зо é

РНБ Русский фонд

2006-4 5971

В настоящее время, несмотря на широкое применение антибактериальных препаратов, инфекционные заболевания и осложнения, обусловленные микробными агентами, по-прежнему занимают доминирующее положение в патологии человека. В свою очередь, среди бактериальных инфекций большой удельный вес составляют патологические состояния, связанные с нарушением нормальной микрофлоры организма-хозяина и, в частности, с развитием вагинальных дисбактериозов у женщин.

Местная защита половой сферы женщины обусловлена ее анатомическими и физиологическими особенностями, наличием нормальной микрофлоры, гуморальных и клеточных факторов иммунитета (Бодяжина В.И., 1978; Долгушина В.Ф., 1991; Медведев Б.И., Казачкова Э.А. и др., 2001).

На сегодняшний день достаточно хорошо изучен состав нормофлоры влагалища женщин, а также его изменение при дисбиотических процессах. Подробно описаны механизмы взаимного влияния микробных ассоциантов друг на друга (Костюк О.П., Чернышова Л. И. и др., 1998; Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Воробьев А.А., Лыкова Е. А., 1999; Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2000; Кира Е.Ф., 2001; Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002). Достаточно полно раскрыты этапы взаимодействия между представителями микрофлоры и клетками вагинального эпителия (Черкасов С.В., Забирова Т.М. и др., 2001; Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др., 2001; Маянский А.Н., Маянская И.В., 2004; Holgate S.T., Lackie P.M. et al., 1999; Mills P.R., Davies R.G. et al., 1999; Godaly G., Bergsten G. et al., 2001; Rastogi D., Rather A.G. et al., 2001).

В последние годы активно исследуется роль нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза (Бережная Н.М., 1988; Зурочка А.В.,

1991; Пигаревский В.Е., 1992; Маянский А.Н., Невмятуллин A.JI. и др., 1995; Чукичев А.В., 1996; Колесников O.JL, 1998; Долгушин И.И., Зурочка А.В., 1998; Долгушин И.И., Зурочка А.В. и соавт., 1986, 1988, 1990, 1992, 2000; Долгушин И.И., 1980; Долгушин И.И., Телешева Л.Ф. и др., 2000; Goto К., Nakamura S. et al., 1984; Ishibashi Y., Yamashita T. et al., 1981, 1985, 1989; Zeman K., Tchorzewski H. et al., 1987; Lillard I. W., Boyaka P.N. et al., 1999; Yang D., Chertov O. et al., 2001).

Нейтрофилы традиционно относятся к фагоцитирующим клеткам (Пигаревский В.Е., 1982, 1992; Бережная Н.М., 1988; Бакуев М.М., 1992; Воробьев А.А., Медуницин Н.В., 1995; Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д. и др., 1996; Ройт А., Бростофф Дж. и др., 2000). Однако фагоцитоз, хотя и важный, но не единственный способ реализации гранулоцитами своих эффекторных функций.

Нейтрофилы - это секреторные клетки, способные выделять биологически активные продукты, с помощью которых они могут осуществлять внеклеточный киллинг, а также, вступая в медиаторные контакты с гуморальными системами и клетками крови, соединительной ткани, оказывать регуляторное действие (Зурочка А.В., 1991; Пигаревский В.Е., 1992; Маянский А.Н., Невмятиллин А.Л. и др., 1995; Чукичев А.В., 1996; Колесников О.Л., 1998; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Третьякова И.Е., 2003; Жогин А.В., 2003; Goto К., Nakamura S. et al., 1984; Ishibashi Y., Yamashita T. et al., 1981, 1985, 1989; Zeman K., Tchorzewski H. et al., 1987; Lillard I. W., Boyaka P.N. et al., 1999; Yang D., Chertov O. et al., 2001).

В цервикальном и вагинальном секретах нейтрофильные гранулоциты являются доминирующими клетками. Наибольшее значение в антимикробной устойчивости гениталий принадлежит нейтрофилам цервикального секрета, поскольку по количеству и функциональной активности они превосходят гранулоциты других секретов гениталий

Телешева Л.Ф., 2000; Bainton D.F., 1995). Доказано, что в верхних отделах репродуктивного тракта женщин в основном встречаются жизнеспособные и функционально активные нейтрофилы, а в цервикальном секрете процент жизнеспособности клеток гораздо ниже (Телешева Л.Ф., 2000). Можно предположить, что нейтрофилы, встречаясь с представителями нормофлоры, обильно обсеменяющей нижние отделы репродуктивного тракта женщин, активируются и секретируют бактерицидные вещества, которые селективно действуют на патогенные, условно-патогенные и непатогенные микроорганизмы. Однако четких представлений об участии нейтрофилов в формировании микробных сообществ нет.

Цель исследования

Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в регуляции микробиоценоза влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Задачи исследования

1. Оценить функциональную активность нейтрофилов периферической крови после активации различными видами микроорганизмов и латексом.

2. Изучить влияние нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалища здоровых женщин.

3. Исследовать влияние нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалища женщин с бактериальным вагинозом. и

4. Определить in vitro бактерицидный эффект супернатанта активированных и неактивированных нейтрофилов на S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Научная новизна

Впервые изучено влияние нейтрофилов, продуктов их секреции, гепаринизированной крови и лейкоцитарной взвеси на состав флоры влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Выявлено, что нейтрофильные гранулоциты и их секреторные продукты участвуют в нормализации микробиоценоза влагалища женщин с бактериальным вагинозом. При этом секреторные продукты неактивированных нейтрофилов обладают широким спектром антимикробной активности. При активации нейтрофилов эталонными штаммами Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. бактерицидные свойства их супернатантов изменяются, при этом спектр антимикробной активности определяется характером индуктора секреции.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные помогают расширить представление об участии нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек гениталий женщины. Выявлено, что нейтрофилы и продукты их секреции участвуют в селективной деконтаминации влагалищного биотопа женщин с бактериальным вагинозом. Результаты исследований открывают перспективу для проведения клинических испытаний локального использования аутологичных секреторных продуктов нейтрофилов в комплексе с основной терапией с целью оптимизации коррекции дисбиотических состояний репродуктивной системы женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным вагинозом, а также для дальнейшего более детального изучения механизмов бактерицидности продуктов нейтрофилов.

Положения, выносимые на защиту

1. Функциональный ответ нейтрофилов периферической крови на стимуляцию in vitro бактериями различных видов неодинаков: нейтрофилы активно фагоцитируют Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и в меньшей степени - Bifidobacterium spp. При этом, фагоцитоз кишечных палочек и золотистого стафилококка сопровождается существенным, а лакто- и бифидобактерий - менее значительным усилением лизосомальной и НСТ-редуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов.

2. Нейтрофильные гранулоциты периферической крови и их секреторные продукты участвуют в регуляции микробиоценоза влагалища: при нормальном микробиоценозе они существенно не влияют на его состав, при дисбиоценозе — обладают селективной бактерицидностью, подавляя рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), при этом не изменяя содержание в вагинальной слизи резидентных бактерий (лактобактерий).

3. Продукты секреции, полученные из неактивированных нейтрофилов периферической крови (супернатанты), обладают широким спектром антимикробной активности и подавляют рост Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

4. Предшествующая активация нейтрофилов взвесью бактериальных клеток приводит к изменению бактерицидных свойств медиаторов, секретируемых гранулоцитами, при этом спектр антимикробной активности определяется характером индуктора секреции.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины" (Чита, 2003); III конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2003); конференции "Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов" (Челябинск, 2004); научной сессии "Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения"; VIII всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

126 Выводы

1. Функциональный ответ нейтрофилов на стимуляцию in vitro бактериями различных видов неодинаков: нейтрофилы активно фагоцитируют Escherichia coli (штамм М-17), Staphylococcus aureus (штамм 209), Lactobacterium и в меньшей степени - Bifidobacterium. При этом, фагоцитоз кишечных палочек и золотистого стафилококка сопровождается существенным, а лактобактерий и бифидобактерий - менее значительным усилением лизосомальной и НСТ-редуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов.

2. Инкубация in vitro нейтрофилов, их секреторных продуктов с вагинальным содержимым женщин с нормальным микробиоценозом, существенно не влияет на видовой состав микрофлоры вагинальной слизи.

3. У женщин с бактериальным вагинозом инкубация вагинального секрета с взвесью нейтрофилов, продуктами их секреции существенно изменяет структуру микробиоценоза: в секрете снижается содержание гарднерелл, стафилококков, Escherichia coli, протея и дрожжеподобных грибов, количество лактобактерий и бифидобактерий не изменяется. Инкубация in vitro вагинальной слизи с гепаринизированной кровью подавляет условно-патогенную флору и оказывает стимулирующее действие на рост лактобактерий.

4. Нейтрофилы периферической крови, инкубированные in vitro в течение 30 минут при температуре +37°С в отсутствии индукторов секреции, выделяют наружу продукты с широким спектром антимикробной активности, они подавляют рост эталонных штаммов кишечной палочки, золотистого стафилококка, лактобактерий и бифидобактерий.

5. Предварительная инкубация нейтрофилов in vitro с взвесью частиц латекса, кишечной палочки, стафилококка, лактобактерий и бифидобактерий приводит к изменению спектра бактерицидной активности секретируемых нейтрофилами антимикробных продуктов. Если в качестве индуктора секреции применяется взвесь стафилококка или кишечной палочки, то секреторные продукты нейтрофилов утрачивают бактерицидность по отношению к этим же штаммам бактерий. Индукция нейтрофилов лактобактериями также приводит к потере бактерицидности супернатантов по отношению к Escherichia coli (штамм М-17), Staphylococcus aureus (штамм 209). Активация нейтрофилов бифидобактериями, наоборот, сопровождается выработкой бактерицидных продуктов, подавляющих рост золотистого стафилококка и лактобактерий.

6. Нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе, поскольку обладают селективной бактерицидностью: они подавляют рост условно-патогенной флоры и не влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа.

128

Заключение

Изучение регуляторной функции нейтрофилов является одной из наиболее актуальных и малоисследованных проблем современной иммунологии. Определено влияние нейтрофилов и их медиаторов на систему мононуклеарных фагоцитов, воспалительно-репаративные ответы тканей, эритропоэз, противоопухолевую устойчивость, нейрогуморальные механизмы регуляции, стресс-резистентность организма животных и человека (Бабаева А.Г., 1985; Власов А.В., 1991; Зурочка А. В., 1991; Третьякова И.Е., 1991, 2003; Чукичев А.В., 1996; Симбирцев А.С., 1998; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 1999; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Сформулирована концепция о важной роли нейтрофилов и их продуктов в регуляции различных звеньев гомеостаза организма (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001).

Нейтрофилы относятся к тканевым фагоцитирующим клеткам (Пигаревский В.Е., 1982, 1992; Бережная Н.М., 1988; Бакуев М.М., 1992; Воробьев А.А., Медуницин Н.В., 1995; Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д. и др., 1996; Ройт А., Бростофф Дж. и др., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). В тканях нейтрофилы осуществляют все свои эффекторные функции, участвуя в антимикробных и воспалительных реакциях. В последние годы показано, что значительная часть этих клеток покидает ткани и мигрирует на поверхность слизистых оболочек, где они и погибают (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Остается неясным, каков биологический смысл такого "марша смерти" нейтрофилов в слизистый биослой.

Не исключено, что, мигрируя на поверхность эпителия и разрушаясь в результате некробиоза или апоптоза, нейтрофилы выделяют наружу антимикробные продукты своих лизосом, которые, обладая бактерицидностью, влияют на микрофлору, заселяющую слизистые оболочки.

Ранее было показано, что в секретах репродуктивной системы женщин содержится значительное количество нейтрофилов (Телешева Л.Ф., 2000; Bainton D.F., 1995). В этой связи возникло предположение, что одной из функций цервикальных и вагинальных нейтрофилов является участие в регуляции микробиоценоза этих биотопов. Данное предположение и определило цель исследования - выяснить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в регуляции микробиоценоза влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Для решения поставленной задачи нами было проведено иммунологическое и микробиологическое обследование 103 женщин в возрасте 19-35 лет, из которых 32 женщины имели установленный диагноз -бактериальный вагиноз, а остальные были здоровыми. Исследования проводились в первой фазе менструального цикла. У всех пациенток при обследовании были исключены трихомониаз, гонорея, сифилис, ВИЧ-инфекция, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, генитальный герпес и цитомегаловирусная инфекция.

Прежде чем изучить способность нейтрофилов и их секреторных продуктов влиять на микробиоценоз влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом, нами была исследована способность бактерий, наиболее часто заселяющих влагалище, влиять на функциональный статус нейтрофилов.

Функциональная активность нейтрофилов периферической крови была изучена после активации различными видами микроорганизмов (S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp, Bifidobacterium spp.) и частицами латекса. Проведенные исследования позволили установить, что нейтрофилы способны фагоцитировать частицы латекса, условно-патогенные и непатогенные микроорганизмы, при этом поглотительная функция нейтрофилов была минимальной по отношению к бифидобактериям. Это свидетельствует о том, что фагоцитоз является универсальной функцией нейтрофилов, но бифидобактерий ("Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г. Ковров) обладают устойчивостью к захвату нейтрофильными гранулоцитами.

Способность нейтрофилов к внутриклеточному киллингу оценивалась с помощью НСТ-теста, позволяющего определить активность кислородзависимых систем бактерицидности, являющихся ведущими интралейкоцитарными микробоцидными факторами в процессе фагоцитоза. Процент клеток, восстанавливающих НСТ после активации микроорганизмами и латексом, был выше исходного уровня. Значимые отличия наблюдались при индукции нейтрофилов частицами латекса, Е. coli и S. aureus. Индексы индуцированного стафилококками и латексом НСТ-теста, выраженные в условных единицах, были достоверно выше базальной реакции, а при индукции лакто- и бифидобактериями - значимо не отличались от исходного уровня. По-видимому, кислородзависимые механизмы играют значительную роль в борьбе с Е. coli, S. aureus. Подобный эффект отмечен и в работах Белоцкого С.М., Филюковой О.Б. (1986) и Мазурова Д.В., Дамбаевой С.В. (2000). В то же время пероксидазные системы нейтрофилов, вероятно, не играют такой роли в инактивации лакто-и бифидобактерий.

Лизосомальная активность не изменялась при действии частиц полистирольного латекса, лакто- и бифидобактерий в сравнении с исходным уровнем свечения лизосом и была выше после взаимодействия нейтрофилов с Е. coli, S. aureus. Это позволяет предполагать, что в деградации Е. coli и S. aureus играют определенную роль гидролитические ферменты, заключенные в лизосомах нейтрофильных гранулоцитов.

В результате проведенных исследований нами получены данные о том, что внутриклеточные киллинговые системы нейтрофилов активируются в большей степени продуктами Е. coli (штамм М-17) и S. aureus (штамм 209), чем Lactobacterium spp. (препарат "Лактобактерии сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород) и Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г. Ковров).

Учитывая, что нейтрофилы на поверхности слизистых оболочек оказывают антимикробное действие, по-видимому, не столько за счет внутриклеточного, сколько внеклеточного киллинга, важно было оценить бактерицидные свойства их секреторных продуктов.

Для решения этой задачи прежде всего, было изучено исходное состояние влагалищной флоры, а затем определено влияние на ее состав гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси, чистой взвеси нейтрофилов и супернатантов неактивированных и активированных нейтрофилов.

Для проведения исследований в день опыта у женщины забирали 0,1 мл вагинального содержимого в пробирку с 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия и 15 мл крови из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом. Цельную гепаринизированную кровь использовали в качестве тестируемого образца в опыте № 2. Лейкоцитарную взвесь получали из гепаринизированной крови после седиментации эритроцитов и использовали в 3 опыте. Выделение чистой взвеси нейтрофилов проводили на двойном градиенте растворов фиколла-верографина. Выделенные клетки доводили до концентрации 5x106 кл/мл и использовали для опыта № 4. Для опыта № 5 использовали секреторные продукты неактивированных нейтрофилов, которые получали после инкубации клеток (концентрация 5x106 кл/мл) при температуре + 37°С в течение 30 минут без индукторов секреции. После этого клетки центрифугировали 20 мин при 3x10 об/мин, полученный супернатант фильтровали через мембранные фильтры и сразу использовали для тестирования. Секреторные продукты активированных нейтрофилов получали после инкубации клеток (концентрации 5x106 кл/мл) в тех же условиях, но в присутствии вагинального содержимого. После л центрифугирования при 3x10 об/мин, полученный супернатант пропускали через мембранные фильтры и сразу использовали в опыте № 6.

Для регистрации возможного влияния нейтрофилов, их секреторных продуктов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови на микрофлору влагалища использовали классический метод определения бактерицидной активности (Иммунол. методы . , 1981). 0,9 мл каждого тестируемого образца соединяли с 0,1 мл вагинального содержимого. Для контроля использовали 0,9 мл физиологического раствора (опыт № 1). Смесь инкубировали в течение 30 мин при температуре +37°С.

После инкубации из контрольной и опытных пробирок производили высев количественным методом на 5% кровяной, желточно-солевой агар, на тиогликолиевую среду, среду MRS и Сабуро. Через 48 часов инкубации в эксикаторе со свечой изучали рост микроорганизмов, определяли степень обсеменения вагинальной слизи, выделяли чистые культуры и проводили их идентификацию.

У здоровых женщин из влагалища в основном высевались лактобактерии, в 23 % случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях - дрожжеподобные грибы и Е. coli, что совпадало и с литературными данными (Костюк О.П., Чернышова Л. И. и др., 1998; Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Воробьев А.А., Лыкова Е.А., 1999; Анкирская А.С., Муравьева В.В., 2000; Кира Е.Ф., 2001; Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Кудрявцева Л.В., Ильина Е.Н. и др., 2003).

Содержание лактобактерии в пробе под действием нейтрофилов, их секреторных продуктов, гепаринизированной крови и лейкоцитарной взвеси существенного не менялось. Нейтрофилы значимо снижали лишь содержание коагулазонегативных стафилококков в вагинальной слизи. На дрожжеподобные грибы и E.coli все тестируемые образцы оказывали бактерицидное действие, однако значимых отличий по сравнению с контролем выявлено не было. Таким образом, супернатант неактивированных нейтрофилов и активированных нейтрофилов, лейкоцитарная взвесь и гепаринизированная кровь существенно не влияли на состав флоры влагалища здоровых женщин.

Учитывая полученные результаты, было продолжено исследование бактерицидной активности нейтрофилов периферической крови, их секреторных продуктов, а также лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови в отношении представителей влагалищной флоры женщин с бактериальным вагинозом. Данное заболевание представляло наибольший интерес, так как при бактериальном вагинозе наблюдаются значительные нарушения микробиоценоза влагалища, характеризующиеся снижением удельного веса лактобактерий и повышением уровня условно-патогенных микроорганизмов (Муравьева В.В., Анкирская А.С., 1996; Wilks М., Thin R.N. et al., 1984; Harnmann R., Kronibus A. et al., 1987). Кроме этого, одним из проявлений такого состояния является нормальное содержание лейкоцитов в вагинальной слизи (Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002) и практически полное отсутствие классической воспалительной реакции.

Установлено, что у женщин с бактериальным вагинозом из влагалища выделяется более широкий спектр микроорганизмов, чем у здоровых женщин. Наряду с лактобактериями, которые определялись в более низких титрах, из влагалища в 78% случаев высевали гарднереллы, в 30% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях -дрожжеподобные грибы, бифидобактерии, Е. coli и протей, что совпадает с данными литературы (Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Кудрявцева JI.B., Ильина Е.Н. и др., 2003).

При исследовании влияния нейтрофилов и их медиаторов на флору вагинальной слизи было отмечено снижение содержания в секрете количества стафилококков под действием секреторных продуктов нейтрофилов, лейкоцитарной взвеси и гепаринизированной крови. Инкубация с вагинальным секретом очищенной фракции нейтрофилов не оказывали значимого влияния на содержание стафилококков, вероятно потому, что у женщин с бактериальным вагинозом фагоцитарная функция нейтрофилов подавлена (Смольникова JI.A., 1999; Долгушина В.Ф., Смольникова JI.A. и др., 2001).

Нейтрофилы, супернатант неактивированных и активированных нейтрофилов, лейкоцитарная взвесь и гепаринизированная кровь значимо снижали содержание гарднерелл в вагинальной слизи. По-видимому, супернатанты активированных и неактивированных нейтрофилов содержат токсические формы кислорода, губительно действующие на анаэробную флору. Кроме того, IgG- антитела, которые в больших количествах определяются в сыворотке и вагинальной слизи женщин с бактериальным вагинозом (Смольникова JI.A., 1999; Долгушина В.Ф., Смольникова JI.A. и др., 2001), обладают опсоническими свойствами и могут стимулировать адгезию, дегрануляцию нейтрофилов и облегчать киллинг микроорганизмов (Азов Н.А., Маянский А.Н., 1985; Барсуков А.А., Годков М.А. и др., 2004).

При изучении влияния продуктов нейтрофилов на лактофлору было обнаружено незначительное бактерицидное действие фильтрата и супернатанта на эти бактерии. Вместе с тем было установлено, что добавление цельной крови к вагинальному содержимому женщин с бактериальным вагинозом, стимулирует рост лактобактерий. Это может быть связано с наличием факторов роста для лактобактерий в гепаринизированной крови. Вероятно, циклические менструальные кровотечения имеют биологический смысл, возможно, именно так ежемесячно осуществляется саморегуляция состава флоры генитального тракта.

В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что нейтрофилы и их секреторные продукты оказывают регулирующее и нормализующее влияние на состав флоры слизистых оболочек, тем самым, участвуя в селективной деконтаминации влагалищного биотопа. Бактериальный вагиноз - это эпителиальная инфекция, и, по-видимому, дефицит локальной лейкоцитарной реакции может быть одной из причин развития вагинального дисбиоза. В то же время восполнение этих клеток в секрете нормализует влагалищную флору.

В представленных опытах кровь, взвесь нейтрофилов, их медиаторы вносились в вагинальный секрет сразу после их выделения. Таким образом, оценивалась суммарная бактерицидность всех выделенных из нейтрофилов факторов: и короткоживущих (в основном это метаболиты кислорода) и долгоживущих (бактерицидные пептиды и ферменты лизосом).

Для исключения действия быстроразрушающихся метаболитов кислорода, а также для изучения зависимости спектра бактерицидной активности секреторных продуктов нейтрофилов от характера индукции секреции, был изменен дизайн исследования. Для опыта использовались супернатанты неактивированных нейтрофилов и нейтрофилов, активированных в течение 30 минут при температуре +37°С in vitro в присутствии различных индукторов секреции (частиц полистирольного латекса, S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.). Бактерицидность секреторных продуктов оценивалась через 30 дней после хранения при температуре -15°С. Спектр антимикробной активности супернатантов определялся по отношению к тем же штаммам микроорганизмов. Для определения бактерицидности применялся упрощенный фотонефелометрический метод О. В. Смирновой и Т. А. Кузьминой (Иммунологич. методы . , 1981). Для этого в пробирки наливали по 4,5мл стерильного 5% мясопептонного бульона. С целью изучения дозозависимого эффекта в опытные пробирки добавляли по 1,0 мл, 0,5 и 0,1мл секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов и нейтрофилов, активированных взвесью контрольных штаммов и частицами латекса, недостающий обьем до 1мл восполняли 0,9% раствором хлорида натрия. Для контроля использовали 1мл физиологического раствора. Затем во все пробирки вносили по одной капле 24-часовой культуры кишечной палочки (плотность взвеси 0,46-0,48, которую определяли на ФЭКе с зеленым светофильтром при длине волны 540 нм). Содержимое пробирок тщательно перемешивали и стерильной пипеткой отбирали по 2 мл для измерения на ФЭКе оптической плотности (Д). Смесь, оставшуюся в пробирках, инкубировали в термостате при температуре +37°С 3 часа. После этого вновь измеряли оптическую плотность содержимого пробирок.

Бактерицидную активность (БА) вычисляли следующим образом:

До через 3 часа - Д0 перед инкубацией

БА, % = 100--х ЮО,

Дк через 3 часа - Дк перед инкубацией где До - оптическая плотность в опыте,

Дк - оптическая плотность в контроле.

Таким образом, определяли бактерицидную активность секреторных продуктов нейтрофилов по отношению к Е. coli и S. aureus.

Для определения бактерицидной активности на лактобактерии использовали модифицированную жидкую питательную среду МРС ("НИЦФ", г. Санкт - Петербург), а для бифидобактерий использовали тиогликолиевую среду (ОАО "Биомед" им. И.И. Мечникова) и исследования проводили по той же схеме.

При действии секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов отмечено снижение содержания всех видов микроорганизмов в исследуемой пробе. При этом бактерицидность супернатанта неактивированных нейтрофилов на стафилококки была в пределах 14-46%, на эшерихии - 4590%, на лактобактерии - 49-80%, и самые высокие показатели бактерицидности были при действии на бифидобактерии - 98-105%. Повышение бактерицидных свойств секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов с увеличением дозы было отмечено только при действии супернатанта на Е. coli (штамм М-17), на другие микроорганизмы бактерицидность супернатанта существенно не менялась в зависимости от его дозы.

При изучении спектра антимикробной активности супернатантов нейтрофилов, активированных латексом, определили, что бактерицидность секреторных продуктов была ниже бактерицидного действия супернатанта неактивированных нейтрофилов (СНН), при действии на все тестируемые культуры, но достоверное снижение эффекта было отмечено только при действии на Е. coli.

Секреторные продукты нейтрофилов, активированных бифидобактериями, обладали бактерицидной активностью и превосходили бактерицидный эффект супернатанта неактивированных нейтрофилов при действии на S. aureus и Lactobacterium spp. В то же время при действии на Е. coli бактерицидность супернатанта нейтрофилов, активированных бифидобактериями (САНВ), была ниже бактерицидного эффекта СНН.

Снижение бактерицидности наблюдалось при действии супернатанта нейтрофилов, активированных стафилококком, на лактобактерии и на стафилококки; при действии на бифидобактерии и Е. coli бактерицидный потенциал сохранялся, хотя он был значительно ниже уровня бактерицидности супернатанта неактивированных нейтрофилов.

При действии секреторных продуктов нейтрофилов, активированных эшерихиями и лактобактериями, на Е. coli и S. aureus была отмечена низкая бактерицидная активность, а при влиянии на лактобактерии - этот показатель имел достоверно более высокие значения.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что интактные нейтрофилы секретируют длительно сохраняющиеся бактерицидные продукты, обладающие широким спектром антимикробного действия, влияющие на рост S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17),

Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. Аналогичным (и даже более сильным) эффектом обладают супернатанты, полученные из нейтрофилов, индуцированных взвесью бифидобактерий. Это, по-видимому, связано с описанным выше отсутствием у бифидобактерий способности активировать нейтрофилы. В то же время, предварительная инкубация нейтрофилов с взвесью других, изученных нами, индукторов секреции приводит к уменьшению или полному исчезновению у супернатантов части бактерицидной активности по отношению к некоторым видам микроорганизмов, использованных для индукции клеток. Так, преинкубация нейтрофилов со взвесью S. aureus (штамм 209) и Е. coli (штамм М-17) сопровождается потерей бактерицидных свойств супернатантов относительно этих микроорганизмов, в то время как их антимикробная активность к лакто- и бифидобактериям — сохраняется. Такая избирательная потеря бактерицидности, по-видимому, связана с тем, что антимикробные пептиды и ферменты лизосом обладают определенной специфичностью своего действия на различные группы микроорганизмов, и предварительная инкубация нейтрофилов с этими штаммами сопровождается расходованием (истощением) этих продуктов в супернатантах.

Нейтрофилы содержат различные биологически активные продукты, в том числе и высокотоксичные, которые образуются в процессе созревания клетки или синтезируются вновь после активации и накапливаются в гранулах (Borregaard N., Cowland J., 1997). Биохимический состав гранул различен. На сегодняшний день известно четыре основных типа гранул, однако с помощью градиентного центрифугирования их можно разделить на большее количество фракций, ряд которых содержит не смесь, а отдельные вещества, например миелопероксидазу, дефенсины, желатиназу и так далее (Прийма О. Б., 1997). При этом механизмы функциональной мобилизации различных секреторных органелл могут быть независимы друг от друга. На этапах выделения секреторных продуктов нейтрофил частично или полностью утрачивает свои гранулы. При дегрануляции содержимое гранул выливается в околоклеточное пространство, что и обуславливает бактерицидность супернатантов неактивированных нейтрофилов (Алексеев Н.А., 2002).

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют ему чутко и дифференцировано реагировать на малейшие изменения окружающей среды. Связывание рецепторов нейтрофила с бактериальными компонентами приводит к активации клетки. Активированный нейтрофил решает эффекторные задачи одним из двух способов: либо с помощью фагоцитоза, либо путем секреции биологически активных веществ (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Характер дегрануляции во многом определяется природой возбуждающего агента (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Воздействие различных стимулов вызывает у нейтрофила функциональные ответы, реализуемые через рецепторзависимую генерацию внутриклеточных вторичных мессенджеров. Взаимодействие лигандов с рецепторами может вызвать развитие либо определенного ответа, либо последовательно всех мобилизационных и эффекторных реакций. Нейтрофилы, по-видимому, способны в ответ на различные стимулы секретировать биологически активные продукты определенного состава. Известно, что связывание рецепторов, в частности, с хемотаксическими пептидами, вызывает хемотаксис и дегрануляцию, с С5а-компонентом комплемента - хемотаксис, дегрануляцию, генерацию супероксида, с CR1, CR3FcyRI-III - эндоцитоз, дегрануляцию, респираторный взрыв (Smolen Y.E., Boxer L.A., 1995). Важнейшей чертой секреторной дегрануляции являются неодинаковые направленность и скорость мобилизации гранул. Первичные лизосомы сливаются главным образом с мембраной фагосом, их ферменты наиболее активны при кислой рН. Мембраны вторичных и третичных гранул преимущественно сливаются с наружной цитоплазматической мембраной, то есть выделяют свое содержимое во внешнюю среду (Алексеев Н.А., 2002). Что касается скорости функциональной мобилизации, то наиболее быстро высвобождаются третичные, затем специфические, и последними подключаются азурофильные гранулы. Опыты с изучением кинетики секреции желатиназы активированными нейтрофилами свидетельствуют о том, что дегрануляция желатинсодержащих частиц опережает мобилизацию специфических и азурофильных гранул. Прилипание к пластику и стеклянным бусам сопровождается дегрануляцией специфических, но не азурофильных гранул. Есть данные о том, что азурофильные гранулы реагируют только на корпускулярные агенты (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Эти факты свидетельствуют о том, что механизмы секреции различных типов гранул обособлены друг от друга. Они позволяют вовлекать в реакции определенные продукты, необходимые для реализации конкретной функции нейтрофила, что мы и обнаружили при изучении бактерицидной активности СНН и САН. Мы думаем, что эти механизмы лежат в основе различного бактерицидного ответа нейтрофилов на разные бактериальные стимулы.

Полученные результаты позволяют заключить, что нейтрофилам и их секреторным продуктам принадлежит определенная роль в регуляции микробиоценоза влагалища женщин, и, наряду с эпителиальными клетками влагалища, вагинальной средой, микрофлорой генитального тракта и другими факторами неспецифической защиты, они участвуют в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек репродуктивной системы женщины.

Кроме того, на поверхности слизистых цервикального канала и влагалища бактерицидный эффект нейтрофилов может быть усилен за счет кооперации нейтрофилов и микроорганизмов, входящих в состав нормальной флоры генитального тракта (рисунок 1). Связывание компонентов микробной стенки с То11-подобными рецепторами нейтрофила может приводить к активации внутриклеточных мессенджеров с последующей секреторной дегрануляцией (Сидоренко С.В., 2001; Артамонов Р.Г., 2004; Маянский А.Н., Маянская И. В., 2004).

То11-подобные и другие рецепторы <нейтрофил дегрануляция

Активация

->ОН

-*н202

->Т02 галоиды катепсины

-►лизоцим -*-БПИ -►дефенсины лактоферрин миелопероксидаза

Аутоцитотоксическое

Стафилококки Грибы рода Candida Е. coli

Бифидобактерии Лактобактерии

I X • •I" s< н2о2

НОС1 действие

Селективная бактерицидность

Рисунок 1. Кооперация нейтрофилов и лактобактерий в повышении бактерицидности секретов генитального тракта женщин

В результате такого процесса из гранул высвобождаются бактерицидные вещества: микробоцидные ферменты, антибактериальные катионные белки, нейтральные сериновые протеазы, металлопротеиназы, кислые гидролазы, продукты респираторного взрыва - перекись водорода, гидроксильный радикал, галогены, атомарный кислород, оксид азота, пероксинитрит и другие, в том числе и миелопероксидаза. Возможно, этот фермент взаимодействует с Н2О2, которая продуцируется лактобактериями влагалища женщин, и хлоридами вагинального секрета с образованием гипохлорной кислоты (НОС1) - мощного оксиданта, способствующего избирательному киллингу микроорганизмов (рисунок 1), а кислая рН во влагалище усиливает активность миелопероксидазы. Работы Бакуева М.М. и Саидова М.З. (1991) подтверждают расходование и снижение активности миелопероксидазы секреторных продуктов нейтрофилов после контакта клеток с живыми культурами микроорганизмов. Селективная бактерицидность продуктов нейтрофилов может быть обусловлена тем, что гранулы этих клеток гетерогенны, скорость их функциональной мобилизации неодинакова (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001) и при активации нейтрофилов через различные рецепторы, в том числе и То11-подобные, клетка секретирует неодинаковый набор антимикробных медиаторов.

Таким образом, нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища, поскольку обладают селективной бактерицидностью: они подавляют рост условно-патогенной флоры и не влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа.