Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Роль моноцитов/макрофагов в атерогенезе

На правах рукописи

? Г г од

2 7 ПИ о . Мальцева

Светлана Владимировна

РОЛЬ МОНОЦИТОВ,ШКРОФАГОВ В АТЕР0ГЕ11ЕЗЕ.

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени !ьандитата биологических наук

Санкт-Петербург 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории атеросклероза им. Н.Н.Аничков, отдела биохимии Института экспериментальной медицины РАМН.

Научный руководитель - член-корреспондент РАМН, член международной академии патологии, доктор медицинских наук, профессо{ В. А. Нагорнев.

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор

В.Ф. Пучков

доктор медицинских наук, профессо{ Э.И. Валькович

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский государственный

медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова

. Защита состоится ^ЬЛ-Н^ф^199'Х г. в /р. часов на зас< далии диссертационного совета Д.001.23.03 при Научно-исследс пательсксм институте экспериментальной медицины РАМН.

Адрес: 197376, Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НШЭМ РА) по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, 12.

Автореферат разослан '¿¿Ь" Я^9Э Р. г.

Ученый секретарь диссертационного совета клздидат-биологическкх_наук_

Е.С. Петров;

С-£'Я«1 ХАРА1СГШШ1С<Л PAEOT1J

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы происходит переоценка ключевых положений патогенеза атеросклероза. Этому способствует : 1. Установление факта, что перикисно-модифицированные яипопротевды низкой плотности (мЛПНП), образующиеся в крови и сосудисгсй стенке, в первую очередь ответственны вя

I

формирование атеросклеротических поражений артерий (D. Steinberg, 1988; А.Н. Климов, 1990; Т. Klta et al., 1990 и др.). 2. СОнарузкэние при атеросклерозе аутоантитед и особенно аутоиммунных комплексов, включающих мЛПНП в качестве антигена (D. Parums et al., 1990; А.Д. Денисенко, 1991; A.N. Klitrov, 1991; J, Salonen et al. 1992).' 3. Изучение кинетики клеток в очагах атерогенеза с анализом медиаторов воспаления (S.K. Clinton, Р. Llbby, 1992; S. Stemme, G.K. Hansson, 1694; A. Ted^ul, C. Bernard, 1994; B.A. Нагорнев, 1995; В.А. Нагорнев, Е.Г. Зота, 199В.)

, С помощью иммуногистохимических методов установлено, что в атеросклеротических поражениях основная часть пенистых клеток (ПК) имеет моноцитарно-макрофагальную природу (С. Vedeler et al., 1984; N.M. Agel et al., 1985; H. Stary, 1985). Анализ медиаторов воспаления при атерогенезе также показал, что их экспрессия в первую очередь связана с активацией макрофагов (G.K. Hansson et al., 1989; S.K. Clinton P. Libby, 1992; V.A. Nagornev et al., 1994).

Атеросклеротическая бляшка имеет много общего с развитием иммунного воспаления: образование неоантигенов (мЛИИН, десек-вестируемне антигены сосудистой стенки); очаговое скопление негранулярных лейкоцитов; очаговое разрастание соединительной

ткани. Сходство в клеточной популяции атеросклеротических бля иек и очагов иммунного воспаления при различных заболевания) лает основание рассматривать атерогенеа, как хронический воспалительный процесс, подобный реакции гиперчувствителькост! замедленного типа [ГЗТ] (S.K. Clinton, Р. Libby, 1992; В.А, Нагорнев, 1995).

Многие современные исследования, касающиеся выяснения роли моноцитов/макрофагов в атерогенезе выполнены в опытах ir vlt.ro на "чистой" культуре моноцитов/макрофагов, что не позволяет в полном объеме оценить кинетику этих клеток в сосудисто? стенке и выяснить их роль в становлении, прогрессировали f регрессии атеросклеротических поражений артерий. Комплексное цитологическое и ншуногистохимическое изучение роли моноцитов/макрофагов в атерогенезе у человека может.не только расширить представление о морфогенезе атеросклероза, но и способствовать обоснованию новых патогенетических методов лечения этого заболевания.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель» работы являлось изучение особенностей морфогенеза атеросклероза человека, связанных с клеточными реакциями, протекающими в сосудистой стенке при участии макрофагов.

Исходя из цели, определены задачи:

1. Изучить особенности адгезии и миграции моноцитов/макрофагов в интиму.

2. Исследовать особенности трансформации макрофагов в пенистые клетки и возможности их участия в удалении липидов из бляшек.

-ъ-

в интиме.

4. Провести иммуногистохимическое изучение цитокинов (ин-терлейкика-lot и -1в С IL-lot, IL-IB], фактора некроза опухоли-а [TNF-«]), продуцируемых клетками интимы в процессе развития атеросклеротических поражений артерий у человека.

г б. Выяснить роль макрофагов в развитии иммунного воспаления в стенке аорты и коронарных артерий человека при атероге-неае.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ :

В становлении и развитии атеросклеротических поражений артерий у человека, кинетику клеток интимы в значительной степени определяют моноциты/макрофаги.

В начальных стадиях атерогенеэа очаговая адгезия и миграция в интиму моноцитов происходит через неповрежденный эндотелий и связана с зонами продукции зндотелиальными клетками IL-13 на фоне отложения в суОэндотелиальном слое липопротеидов низкой плотности.

В стенке артерий в начальных и прогрессирующих стадиях атеросклероза происходит пролиферация мононуклеарных клеток. Популяция макрофагов в очагах атеросклеротических поражений артерий не однородна: часть макрофагов участвует в захвате и катаболизме липидов, трансформируясь в пенистые клетки; часть макрофагов находится в тесном контакте с лимфоцитами и участвует в продукции IL-1, TNF-a и не трансформируется в пенистые клетки. В пенистых клетках продукция медиаторов воспаления подавлена.

В атеросклеротических поражениях артерий у человека при участии негранулярных лейкоцитов (моноцитов/макрофагов и лим-

фоцигов) создаются объективные условия для развития иммунного

воспаления.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА, В настоящей работе впервые:

- показало,что адгезия ыоноцитов и лимфоцитов в первую очередь происходит »а неповрежденном эндотелии, вероятно, продуцирующим интерлейкин-жв;

- показано, что адгезия моноцитов происходит в большем количестве, чем лимфоцитов; —

- показано, что не все моноциты, фиксированные на эндотелии и мигрирующие в интиму, участвуют в продукции интерлейки-на-1;

- установлено, что в местах повреждения эндотелия наблюдается адгезия моноцитов, лимфоцитов, эхиноцитов и не постоянно тромбоцитов; преобладающей клеточной популяцией являются лимфоциты;

- показана возможность пролиферации моноцитов/макрофагов в интиме артерий при экспериментальном атеросклерозе у кроликов;

- выделены и описаны три популяции макрофагов в атероск-деротических поражениях артерий: макрофаги, трансформирующиеся в ПК; макрофаги, не трансформирующиеся в ПК и продуцирующие медиаторы воспаления; макрофаги, продуцирующие толы;о TNF-«;

- показано, что в ПК экспрессия цитокинов подавлена;

- показано, что в агеросклеротических бляшках макрофаги и лимфоцита находятся в тесном контакте и локализованы преимущественно п.зоне распада пенистых клеток.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И IP/ЖТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТУ. Комплексуй? игаяоп'.пяни«? структурно-функциональных особенностей строе-

- б -

ния атеросклеротических поражений артерий и "поведения" макрофагов в начальных и прогрессирующих стадиях атеросклероза позволило расширить представление о морфо- и патогенезе этого заболевания. Полученные данные легли в основу разработки новой концепции патогенеза атеросклероза, позволяющей рассматривать-атеросклеротическое поражение артерий как местный очаг иммунного воспаления.

Результаты даной работы могут быть использованы при разработке новых подходов к лечению атеросклероза путем направленной регуляции "поведения" макрофагов в атеросклеротических бляшках и активного их включения в регрессию липидов и продуктов распада бляшек.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на 62-ом Конгрессе Европейской атеросклеротической ассоциации (Иерусалим, 1993), на 2-ой Международной конферкнции "Спид, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1993), на 8-ом Международном липидном симпозиуме [стендовый доклад на конкурсе удостоен Диплома и первой премии] (Дрезден, 1994), на пленарном заседании Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов (Санкт-Петербург, 1994), на .Симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз", посвященном 110-летию со дня рождения академика H.H. Аничкова (Санкт-Петербург, 1995).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 работ из них 4 опубликованы за рубежом.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена

на 192 страницах машинописного текста,- содержит 63 рисунка, преимущественно в виде блоков. Список литературы включает 192 источника (31 отечественный и 161 иностранный).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основная часть работы выполнена на аутопсийном (46 случаев) и биопсийном (21 случай) материале. Экспериментальный раздел работы выполнен на 6 кроликах.

При аутопсийном отборе материала исключались случаи смерти от длительно протекающих заболеваний с токсическим или аллергическим синдромом, тяжелой сопутствующей патологией, а также случаи в которых больные получали биологически активные вещества, влияющие на иммунную систему и гормоны. Объектами исследования служили: аорта (грудной отдел) и левая коронарная артерия сердца. Материал брали в течение первых 2 часов (45-120 мин.) после смерти лиц (19 мужчин, 16 женщин), страдавших первичной сосудистой патологией, имевших клинико-морфо-логическне проявления коронарного недостаточности и погибших от острой сердечно-сосудистой недостаточности. В 11 случаях аутопсий, материал брали в первые 16 часов после смерти при той же патологии.

Биопсийный материал представлял собой сегменты отдельных артерий (брюшного отдела аорты, коронарных, сонных и подвздошных артерий). Забор осуществляли непосредственно в процессе операции.

Для исследования в каждом случае Орали макроскопически неизмененные участки артерий, липидные пятна, липидно-фиброзные и фиброзные атеросклеротические бляшки, а также осложнен--ные-яоражеияя_0щтвамураль1!ые кровоизлияния, капьциноз). В

каждом аутопсийном случае исследованию подвергали от б до ? сегментов артерий; при анализе биопсийного материала - 2-3 сегмента сосуда.

В экспериментальных исследованиях, атеросклероз у кроликов вызывали по методу академика Н.Н, Аничкова путем ежедневного введения через эонд per os Ь/. р-ра холестерина на подсолнечном масле из расчета 200 мг/кг массы тела. Забой осуществляли через 2, 3, 4 недели после начала содержания животных на атерогенном рационе.

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Подготовку материала для трансмиссионной электронной мик-роскипии осуществляли по методике, разработанной в лаборатории атеросклероза им. Н.Н. Аничкова (В.А. Нагорнев и соавт., 1982).

Для сканирующей электронной микроскопии вырезали кусочки артерий размером около 0,7-0,8 мм или несколько больше и фиксировали в' течение 3 часов в 2Z растворе глютаральдегида на 04 М какодилатиом буфере РН 7,2 при 4еС, промывали в 0,1М ка-кодилатном буфере с 0,1М сахарозой, дофиксировали в 17. OsOy, приготовленном на том же буфере, в течение 1,5 ч. После дегит-ратации в спиртах восходящей концентрации (по 20 мин.), образцы высушивали путем перехода критической точки СО в аппарате "Hitachi НСР-1", напыляли золотом ь аппарате "E1R0-1B-3" (толщина слоя напыления 30 нм). ТЭМ и СЗМ проводили в электронном микроскопе "Hitachi Н-300".

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

В работе использовали поликло'нальные антитела к мЛПНП и поли- и моноклональные антитела к человеческому IL-I« и IL-IB, а также к человеческому THF-a , полученные из лаборатории им-

мунофармакологии НИИ особочистых препаратов (С.-Петербург).*

Иммуноморфологическое исследование проводили по непрямому методу с использованием криостатных (7-8 дк) и парафиновых (5-6 мк) срезов стенок артерий. За основу техники проведения иммуногистохимической обработки тканей использовали рекомендации, изложенные в монографии "Immuno Enzyme Techniques in Cytochemistry" (1984).

РАДИОЛБТОГРАШЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

Животным 5-кратно в течении суток (по истечении срока атерогенной диеты) с интервалом в 6 часов вводили внутривенно ЗН-тимидин (удельная активность 19,8 ku/моль) из расчета по 0,3 мкки на 1 кг массы тела. Через 1 час после последней инъекции изотопа, животных умерщвляли. Из грудного отдела аорты выделяли макроскопически неизмененные сегменты и участки с начальными проявлениями атеросклероза, которые фиксировали в жидкости Карнуа, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 3-4 мкм. Ксгользовали фотоэммулюию "llford К-5" в разведении 1:2. Образцы экспонировали при 4 С в течение 2 недель и после проявления дополнительно окрашивали гематоксилином и эозином.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВКЛКНЕНИЕ МОНОЦИТОВ/МАКРОФАГОВ В НАЧАЛЬНЫЕ СТАЛЧИ АТЕРОГЕНЕЗА,

Пути и особенности миграции моноцитов в интиму.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) поверхности

*3а предоставление антител к отдельным цитокинам приношу ■глувшуе-блатодарнпг.ть прпФ _.С^А._Кетлинскому._

-з-

макроскопически неизмененных . сегментов аорты или коронарных артерий, взятых как в случаях со слабо выраженным атеросклерозом (I стадия, 1 степень ( по Г.Г. Автандилову)3, так и при прогрессировании процесса [II стадия, 2, 3 степень], показала однотипность адгезии моноцитов и состояния эндотелиального пркрова.

Независимо от степени выраженности атеросклероза, в местах пограничных с липидными пятнами или атеросклеротическими бляшками эндотелиальные клетки находились в функционально активном состоянии (множественные микровилли на поверхности эндотелия), составляя единый монослой без признаков деструкции.

Независимо от типа сосуда (аорта или коронарные артерии) или зоны исследованных сегментов артерий (проксимальный или дистальный отдел, у места отхождения боковых ветвей или на значительном отдалении), картина адгезии негранулярных лейкоцитов была однотипной - очаговая фиксация нескольких клеток, на неповрежденном эндотелии. Обычно в этих же местах наблюдали "выпадение" из тока крови эритроцитов, нередко "приклеенных" к поверхности моноцитов, тогда как адгезия тромбоцитов отсутствовала.

Параллельно проведенный- иммуногистохимический анализ ци-токинов показал, . что в макроскопически неизмененных сегментах артерий, граничащих с липидными пятнами или атеросклеротичес-кими бляшками, наблюдается очаговая продукция эндотедиальными клетками 1Ь-1В. В то же время в эндотелии не выявляли положительной окраски при обработке срезов антителами к 1Ь-Ю и ТОГ- а. '

В зонах лилидных пятен или в местах перехода липидных пя- .

тен в втеросклеротические бляшки, наряду с адгезией, наблюдали миграцию негранулярных лейкоцитов в сосудистую стенку. Две-три макрофагальные клетки стремятся проникнуть в сосудистую стенку черев один межклеточный-контакт, что вызывает повреждение пето,: эндотелия. В процессе миграции между моноцитами/макросами образуются мепклеточные мостики, что ушивает, по-видимому. на возможность обмена какой-то информацией »еяду клетками

или взаимную активацию.

Судьба моиоюпоа/аакрофагой в втиме аркфгЛ. Комплексное использование ТШ и ишуногистохимии позвапи-ло впервые описать в интиме артерий человека при атерогеиеэе

несколько типов макрофагов.

Первый тт. Большая часть популяции макрофагов моноцитар-

„ого происхождения в липидннх пятнах трансформируется в ПК. В

монодатах/макрофагах, содер» только единичные лшидные вакуоли. не наблюдали признаков разрушения органе«. Состояние цитоплазматических структур указывало на интенсивную метаболическую активность клеток: гипертрофия аппарата Гольджи. расширение цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума с неравномерна распределением микросом на мембране и образование большого числа вторичных лиэосом.

В макрофагах содержащих большое количество липидных вакуолей отмечали существенные изменения в митохондриях: исчезновение крист. просветление или, напротив . гомогенизацию матрица. По мере накопления липидов в клетках, лизосомы сливались с липидными вакуолями, образуя крупные Фаголиэосомы.

Прогр1

-и -

месте разрушающихся фаголизосом образуются остаточные тельца и миэлиноподобные структуры.

Еэюрой тп. Не все макрофаги трансформируются в ПК. Часть макрофагов . контактирующих с ПК, или находящихся в окружении последних в глубине дилидных ият^н, не содержит в цитоплазме липидные вакуоли.

Иммуногистохимический анализ цитокинов показан, что в су-бэндотелиальном слое моноциты/макрофаги, не трансформирующиеся в ПК, интенсивно продуцируют 1Ь-1в. В макрофагах, локализованных а глубине липидных пятен, продукция 11,-10 была не столь отчетливо выражена. Макрофаги , трансформирующиеся в ПК, либо продуцировали II--Iз в небольвом количестве, либо не синтезировали совсем. Подобнгя закономерность была отмечена и в отношении с той лишь разницей, что количество И- 1а в активированных клетках выявляли в меньшем объеме, чем 11-18.

Наиболее интенсивное окрашивание антителами к ТИР-« было выявлено в макрофагах, находящихся в глубине липидных пятен. Причем ТИР-а выявляли также преимущественно В клетках, не трансформирующихся в ПК.

ГреэдЗ шй. Среди макрофагов, локализованных в липидных пятнах , а .главным образом, в глубине интимы среди ПК и продуктов распада ГМК и ПК, можно было выделить клетки интенсивно продуцирующие ТМР-а при отсутствии экспрессии 11-1В. Мч отнесли эти клетки к цитотоксическому типу макрофагов.

Пролиферация Ионоцитов/ма*ро|агов в интиме артерий при экспериментальное атеросклерозе у кроликов.

Ггготоавторадиографическое исследование аорты кроликов с

- лг -

использованием ЗН-ткмкдика показало, что включение ЗН-тимидина в моноциты возможно уже на стадии фиксации клеток на эндотели-аяьной поверхности, при отсутствии липидных отложений в интиме. Через 2 недели экспериментальной гиперхолестеренемии, макрофаги. фиксированные в субэндотелиальном слое интенсивно включают ЗН-тимидин в ядра. Через 2-3 недели опыта формируются локусы пролиферации макрофагов, состоящие из группы клеток, включающих ЗН-тимидин в ядра.

ВКШЕНИЕ МОНОЦИТОВ/МАКРОФАГОВ В ПРОГРЕССИРУЮЩИЕ СТАЛИН АТЕРОГЕНЕЗА.

Пути и особенности миграции моноцитов в ютшу.

Особенно интенсивную фиксацию моноцитов наблюдали на границе неповрежденного и разрушенного эндотелия. В этих вонах скопление моноцитов носило очаговый характер, так же как и В начальных стадиях атерогенеза. Отмечали не только адгезию , но и миграцию моноцитов в зону бляшек. В этих же местах происходит адгезия лимфоцитов, причем данный процесс в бляшках более выражен, чем в липидных пятнах.

Наиболее интенсивную фиксацию моноцитов наблюдали в местах разрушенного зндотелиальяого покрова с обнажением соедино-тельнотканного матрикса и отложением в этих гонах фибринопо-добных масс. В таких случаях адгезия моноцитов носила как очаговый характер, так и более диффузный, с равномерным распределением клеток по всей поверхности обнаженных коллагеновых структур.

Не менее важная особенность адгезии моноцитов, выявленная

1ГТ10М0ЩШ—СШ—-—cнк^^^xмшцтaкг_JS_жiШШ^Итaми или совместная

локализация, включая и лимфоциты, в одних и тех же гонах.

функциональная морфология моиоцитов/марофагов в атэросклеротических бляшках.

Большая часть мононуклеарных клеток трансформируется в ПК. В сформированных ПК вся цитоплазма заполнена липидными вакуолями и остаточными тельцами при полном отсутствии каких-либо органелл. В бляшках, выступающих в просвет, за счет растяжения и истончения эндотелия происходит его разрушение. В таких случаях на пенистых клетках наблюдали адгезию моноцитов и лимфоцитов.

При исследовании бляшки с помощью ТЭМ, можно было наблюдать . попытки фагоцитоза макрофагами кристаллов холестерина, образующихся в зоне распада ПК. Причем .макрофаги , фагоцитирующие кристаллы холестерина, качественно отличаются от ПК - в них отсутствуют липидные вакуоли.

Другой не менее важной особенностью "поведения" макрофагов в атеросклерогических бляшках является то, что клетки нагруженные липидами могут мигрировать из бляшек и выходить в просвет сосуда. О прижизненности данного явления ,т.е. что это не артефакт, можно судить по эритроцитам, локализованным в виде шапочек на поверхности таких ПК.

Взаимоотношения лейкоцитов (моноцитов/макрофагов и лимфоцитов) в атеросклерогических бляшках.

При атерогенеэе происходит не только очаговая фиксация моноцитов и лимфоцитов в одних и тех же зонах бляшек, но и их совместная миграция в глубину бляшек. Контакт межде моноцита-

ыи/макрофагами и лимфоцитами сохраняется и в атеросклеротических бляшках. Мы•наблюдали появление лимфоцитов среди скоплений ПК и их тесную связь с последними. Пенистые клетки образуют вытянутые отростки, которые частично охватывают лимфоциты. При этом мы не наблюдали каких-либо дистрофических изменений в цитоплазме лимфоцитов.

Особенности прздуящщ цнтшошоа иокснукдеарникн клезншш з ш«ро€Юшроуйческнх Сляшах.

В выраженных атеросклеротических бляшках с повреждением или разрушением эндотелия обнаруживали мононуклеарные клетки, вероятно, макрофаги, в которых осуществлялась продукция IL-le с локализацией преимущественно я веде мембранной формы. В таких бляшках а мононуклеаркых клетках клетках, по-шудаолу, также происходит интенсивная продукция TNF-«.

Фактор некроза опухоли-а обнаруживали также и экстрацеллю-лярно в глубине бляшек в 8оне разрушения ПК. В то время как сохранившиеся мононуклеарные клетки давали положительную окраску Ha IL-15. В разрушенных ПК, локализованных в глубине атеромы, выявляли положительную окраску на TNF-ct.

ОБОШДЕНЙЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Как Известно из литературы, IL-10 ведет себя как интегра-тивный мембранный'белок. Уровень IL-I mRNA значительно возрастает в аонзх атеросклеротических поражений по сравнению с нормальной тканью сосудистой стенки (A.M. Wang et al., 1989; R. Ross et al., 1990). Перекисно-модифицированные липопротеиды ниэ!шй плотностаг (мЛПНП),—но-не-натишше,-вызывзют_6~10 крат^

-

кое увеличение IL-IB в человеческих макрофагах, происходящих ив моноцитов (G. Ku et al., 1992 ). Возможно, что мЛПНП ведут себя также и в отношении эндотелиальных клеток. На этой основе выдвинута цитогсиновая гипотеза атерогенеза (6. Ku et al.,

1992). Согласно этой гипотезе, ЛПНП, проникающие в интиму, подвергаются первой незначительной модификации (ммЛПНП) под воздействием эндотелиальных клеток; ммЛПНП в артериальной стенке под влиянием свободных радикалов (О**, ОН'), индуцируемых проникшими макрофагами (G. Chandrl, I.A. Clark, 1989), подвергаются дальнейшей модификации с образованием мЛПНП; мЛПНП индуцируют эндотелий к экспрессии IL-I0, который в свою очередь осуществляет аутокринную регуляцию экспрессии хемоатт-рактантов, что приводит к адгезии с этих зонах моноцитог и лимфоцитов.

Активная продукция IL-I3 в эндотелиальных клетках, вероятно, под влиянием мЛПНП может вызвать не только экспрессию адгезивных молекул, но и стимулировать пролиферацию клеток эндотелия. Нарушение плотных мекэндотелиаглных контактов во время деления клеток способствует проникновению моноцитов в интиму (В.А. Нагорнев, Т.Г. Бабушкина, 1987; If A. Lehr et al.,

1993).

Питокины и хемоаттрактанты, продуцируемые активированными эндотелиальными клетками, по-видимому, и являются тем основным условием, которое обеспечивает очаговую адгезию и миграцию в интиму моноцитов.

Моноциты/макрофаги проникают в интиму в зону отложения липидов и большей частью трансформируются в ПК. Появление первых липидных 'вакуолей в цитоплазме клеток (как показано в мно-

гочисленной литературе - скевенджер-захват [J.L. Goldstein, M.S. Brown, 19783) сопровождается повышением метаболической активности клеток. В клетках возрастает синтез вторичных лиэо-сом. Слияние лизосом с липкдными вакуолями приводит к образованию фаголизоссм. Однако при этом полного катаболизма липидов (мЛПНП) в фагодизосомах не происходит.

.Часть макрофагов в субэндотелиальном плое включается в деление. Макрофаги высокодетерминированные клетки и чтобы выв-' ' вать их пролиферацию нужны какие-то особые условия или факторы. М IS? относится к факторам дифференцировки и пролиферации макрофагов, поддерживая их функциональную жизнеспособность в атероматозном ядре (А.. Tedgui, С. Bernard, 1994). Е. Fllonzi et al. (1993) показали, что ГМК, стимулированные IL-Iß, TNF-a, INF-r, увеличивают экспрессию M-CSF и GM-CSF в атеросклероти-ческих бляшках и таким образом В1Ш)чаются в воспалительные рз-акции. Не только ГМК, но и эндотелиальные клетки продуцируют М-CSF.

При атерогенезе у человека в атеросклеротических поражениях аорты и коронарных артерий выделен новыйчфенотип макрофа-• гов - секреторный. Макрофаги секреторного типа были обнаружены в поверхностных и глубоких отделах атеросклеротических бляшек, они не трансформировались в ПК, хотя и находились в тесном контакте с последними. Как показано в многочисленных исследованиях, макрофаги'имеют набор рецепторов ко всем видам мЛПНП (M.S. Brown, J.L. Goldstein, 1983; R.W. Mahley, 1983; A.H. . Климов, 1985 и др.). Вряд ли возможна, чтобы эти рецепторы не работали в прбцессе миграции моноцитов/макрофагов в интиму в зону отложения или образования-мЛПНП.______С _другой_стороны, клет-

-я

ки, цитоплазма которых заполнена липидными вакуолями, не способны секретировать какие-либо цитокины поскольку в них разрушены практически все цитоплаэматические структуры, участвующие в пластических реакциях. По-видимому источником этой популяции макрофагов являются клетки, пролиферирующие в субэндотелиаль-ном слое и находящиеся в контакте с Т-лимфоцитами. Мы полагаем, что в таких макрофагах под воздействием IL-2 и INF-г, в первую очередь происходит экспрессия генов , связанных с продукцией цитокинов.

В прогрессирующих стадиях атерогенеза над атеросклероти--ческкми бляшками различной степени выраженности постоянно происходит совместная очаговая адгезия моноцитов и лимфоцитов, причем нередко количество фиксированных лимфоцитов преобладает. Эти закономерности сохраняются и в глубине бляшек. Лимфоциты находятся в постоянном контакте с моноцитами/макрофагами, а также контактируют с пенистыми клетками. Причем, по-видимому, этот процесс носит активный характер, т.к. пенистые клетки образуют вытянутые отростки, частично охватывающие лимфоциты.

Регуляторный потенциал лимфоцитов в сосудистой стенке рассматривается как важное звено атерогенеза. . Высказывается предположение, что при их участии в атеросклеротических поражениях развивается хронический процесс, характерный для реакций гиперчуствительности замедленного типа [ГЗТ1 (S.K. Clinton, Р. Llbby, 1992; В.А. Нагорнев, 1993).

Пусковым механизмом этих сложных реакций являются мЖШП. Например, показало, что перекисна-модифицированные ЛПНП увеличивают синтез ДНК, экспрессию HLA-DR и IL-2 в Т-клетках (J. Frostegard et al., 1992). При этом авторы считают, что стиму-

лирующий эффект мЛПНП на Т-клетки не прямой, а опосредован черев моноциты, которые под влиянием ЛПНП реализуют IL-1B,' воздействующий на лимфоциты.

Продукция макрофагами, контактирующими с лимфоцитами, IL-1 и TNF-« указывает на включение клеток в воспалительные реакции с широким спектром действия.

При анализе патогенетической роли макрофагов, следует подчеркнуть еще одну важную особенность атерогенева, имеющую отношение к регрессии лилвдных пятен и бляшек. Макрофаги, нагруженные липидами, но еще сохранившие цитоплаэматические структуры могут мигрировать из бляшек в просвет сосуда и таким образом принимать участие в удалении липидов из бляшек. По данным СЭМ на пенистых клетках, "выходящих" из бляшек, также наблюдается адгезия моноцитов и лимфоцитов, вероятно 'направленная на их разрушение.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что роль моноцитов/макрофагов в атерогенезе намного сложнее, чем казалось еще недавно. Они не только участвуют в скевенджер-захвате 'мЛПНП, трансформируясь в ПК, но и могут очищать бляшку от липидов и активно включаться в реакции иммунного воспаления, придавая процессу хроническое течение

ВЫВОДЫ

1. Комплексное использование сканирующей электронной микроскопии и иммуногистохимии с применением поли- и моноклональг ных.антител против .отдельных провоспалительных цитокинов пока-

зало, что в начальных"стадиях~атерогенеза-человека-очаговая _

адгезия моноцитов происходит на неповрежденном эндотелии интенсивно продуцирующем интерлейкин-10.

2. Комплексное использование трансмиссионной электронной микроскопии и иммуногистохимии с применением поли- и монокло-нальных антител против отдельных медиаторов воспаления, позволило описать в интиме артерий человека при атерогенезе несколько типов (фенотипов) макрофагов: 1) макрофаги, трансформирующиеся в пенистые клетки; 2) макрофаги, не трансформирующиеся в пенистые клетки и включающиеся в реакции иммунного воспаления; 3) цитотоксические макрофаги.

3. Гисторадиоавтография показала, что в начальных стадиях экспериментальной гиперхолестеринемии в проксимальном и грудном отделах аорты кроликов формируются очаги пролиферации макрофагов. На основании полученных данных высказана гипотеза, что преимущественно макрофаги, пролиферирующие в интиме, включаются в реакции иммунного воспаления и не трансформируются в пенистые клетки.

4. Накопление липидов в фаголизосомах макрофагов, трансформирующихся в пенистые клетки, приводит к распаду клеток, что может рассматриваться как основа образования неоантигенов.

5. В начальных и прогрессирующих стадиях атерогенеза макрофаги, не трансформирующиеся в пенистые клетки, находятся в контакте с лимфоцитами и интенсивно продуцируют интерлей-кин-1в. Фактор некроза опухоли-а и в меньшем количестве интер-лейкин-1а. Макрофаги , трансформирующиеся в пенистые (слетки, не продуцируют интерлейкин-1.

6. В этеросклеротических поражениях артерий распад пенистых и глапкомншечных клеток, лизис и фрагментация коллагеновых

и эластических волокон наблюдаются вокруг макрофагов, продуцирующих фактор некроза опухоли-ct.

7. Результаты изучения вклада макрофагов в становление и развитие атеросклеротических поражений показали, что их роль в этом процессе не однозначна. Реакция клеток, проникающих в сосудистую стенку через неповрежденный или поврежденный эндотелий, направлена не только на захват и катаболизм липидов, но и связана с продукцией цитокинов и включением в процесс иммунного воспаления.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Nagornev Y.A., Ketllnsky S.A., Plgarevsky P.V., Malt-sevaS.V., Prokoplev A.A. Is the arterial wall the region of immune inflamatlon under atherosclerosis.//62-nd EAS Congr.: Ierussalem, 1993.' - P. 135.

2. Нагорнев В.A., Пигаревский П.В., Мальцева C.B., Про-копьев A.A. Роль интерлейкинов в патогенезе атеросклероза.// 2-я Международная конференция "Спид, рак и ретровирусы человека" - Санкт-Петербург; 1993. - С. 20..

3. Нагорнев В.А., Мальцева C.B. Клеточно-молекулярные аспекты экспериментального атеросклероза у кроликов. Особенности развития начальных чтеросклеротических поражений артерий.// Арх. Патол. - 1993. - N г.- С. 64-69.

4. Nagornev V., Denisenko A., Ketllnsky S., Maltseva S., Prokoplev A. Cytokines at the early stage of atherogenesis of coronary arteries.//8-th International Dresden Symp. on Lipop-roteirTa^^—P.-45.--

5. Nagornev V., Denlsenko A., Ketllnsky S., Maltseva S., Prokoplev A. Cytokines at the early stage of atherogeriesls of coronary arteries.//Advances in Lipoprotein and Atherosclerosis Research, Diagnostics and Treatment. - Jena.: Gustav Fisr her Verlag. - 1995, - P. 209-213.

6. Nagornev V.A., Maltseva S.V. The phenotype of macrophages wich are not transformed into foam cells in atherogerie-sls.//Atherosclerosis. - 1996. - Vol. 121. - P. 245-251.

Tun BtfMjjf; 3/; ( Jü r«f 1Q0. tiJtn JC-