Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль клеточных и гуморальных факторов иммунитета в патогенезе экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 616.98:578.833.26

БАРКАР Наталья Дементьевна

роль клеточных

и гуморальных факторов иммунитета в патогенезе экспериментального заболевания, вызываемого вирусом ласса

14.00.36 — Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

Москва — 1990

Работа выполнена в Белорусском ордена Трудового Красного знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии ЫЗ БССР

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Михайлова А. А.

доктор медицинских наук Лукашевич И.О.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Клисенко Г. А.

доктор биологических наук .профессор Дозморов И.М.

Еедущая организация: Московский научно-исследователь-. с кий институт вакцин и сывороток им. И. И. очников а

Защита состоится "¿5" /¿/г//)/1года. в /4 часов на заседании специализированного совета Д" 074.09.01 при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, кор. 2

С диссертацией м^здо ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат разослан "_" 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А. К Колобов

'■•'■V'i -з-

■ . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

"'Актуальность исследования. Вирус Лаоса является высоко-патофнным представителем семейства Arenaviridae. Геморрагическая лихорадка, вызываемая вирусом Лзсоа, представляет собой острое инфекционное заболевание, эндемичное для стран Западной и Центральной Африки. В настоящее время в эндемичных районах ежегодно регистрируется около 300000 случаев инфицирования вирусом Лаоса, из них 6000 случаев с летальным исходом (Дроздов С. Г. , Сергиев Е П. ,1984 ). Заболевание, вызываемое вирусом Лаоса, варьирует в своих проявлениях от стертых субклинических форм до тяжелых, с выраженными геморрагическими проявлениями. С инфиц рованием вирусом Лаоса связывают до 15% всех случаев заболеваний, сопровождавшихся лихорадочным состоянием. Несмотря на ограниченное распространение вируса Лаоса , он момет представлять серьезную опасность и для неэндемичных территорий. Подтверждением этому служат сведения о заражении сотрудников вирусологических лабораторий США при работе с вирусом Лаоса, а также о завозе лихорадки Лаоса в США, Канаду, Австралию, Англию и ФРГ (Kfonath Т. Р.. 1987: MoCormick J. , 1990).

Аренавирусы обладают лимфотропностью, что. накладывает особый отпечаток на характер и формирование противовирусного иммунного ответа. Какие субпопуляции лимфоидных клеток повреадаютя аренавирусаш и какие иммунные реакции играют ведущую роль в формировании ответа на вирусный антиген -неизвестно. Иммунное реагирование при инфицировании арена-вирусами оказывает, по-видимому, существенную роль в патогенезе, поэтому выяснение взаимодействия вирусного антигена с иммунной системой хозяина имеет значение для поиска наиболее '»¡ЭДективных средств профилактики и лечения заболев-ния, вызываемого данными вирусами.

Следует подчеркнуть, что малая изученность роли иммунологических механизмов в развитии заболеваний, вызываемых аренавирусами, во многом связана ь отсутствием адекватнс экспериментальной модели для изучения таких заболеваний. Первон-чальные исследования выявили значительное сходство заболеваний, вызываемых у беспородных мышей вирусом Лаоса и блк^кородотвенным ему вирусом лимфоцитаркого у." риоменингкта (ЛХЮ. Однако в дальнейшем оказалось, что воспроизведение

эксприментального заболевания, вызываемого вирусом Ласоа. в популяции аутбредных животных значительно варьирует и воспроизводимость таких результатов невысокая (Peters С. J. st al., 1987 ). Использование дорогостоящих нечеловекообразных приматов в широкомасштабных исследованиях затруднительно. а инбредные юрские свинки (штамм 1,3), которые обладают высокой чувствительностью к вирусу Ласса. в СССР отсутствуют. К этому следует добавить, что исследования с вирусом Ласса должны производиться в условиях лабораторий, оснащенных рабочими местами с максимальной биологической защитой (Р-4).

В связи с вышесказанным чрезвычайно важным является подбор высокочувствительных к вирусу Ласса инбредных линий мышей и изучение роли иммунных мех^-'измов в патогенезе экспериментального заболевания, вызываемого данным вирусом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследований явилось изучение роли клеточного и гуморального звена иммунитета в развитии и исходе заболевания; 'вызываемого вирусом Ласса у инбредных мышей. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определить возможность использования линейных мышей для изучения экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Лаоса.

2. На чувствительных к вирусу Ласса линейных мышах изучить влияние иммуносупреесии и иммуностимуляции на развитие и исход летального заболевания.

3. Исследовать природу и закономерности формирования эф-фекторных клеток в организме инбредных мышей, чувствительных к вирусу Лаоса .

4. Изучить возможные подходы к иммунотерапии экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса у мышей.

Научная новизна результатов исоледования. Научная новизна представленной работы заключается в том, что впервые подобраны и использованы для изучения экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса, инбредные мыши, обладающие максимально высокой чувствительностью к данному вирусу. Ими оказались мыши линии СБА. Летальность мышей. СБА, инфицированных в мозг вирусом Ласса в дозе около 26 Ш50, неизменно составляет 100%.

-б-

Покаэано, что в патогенезе экспериментального заболевания клеточное звено 'иммунитета играет ведущую роль по сравнению с гуморальным иммунным ответом.

Впервые установлено, что при внутрибрютинном введении вируса Лаоса у мышей СБА развивае?ся полноценный иммунный ответ и формируется иммунологическая память, в поддержании которой участвуют эффекторные Т-лимфоциты, чувст ггельные к циклоспорину А. Летальный исход, наблюдаемый при внутримоэ-говом инфицировании животных, также связан с участием клеточного звена иммунитета.

Впервые показана возможность защиты летально инфицированных вирусом Лаоса мышей СБА трансплантацией клеток селезенки от сенсибилизированных животных, а тагак с помощью иммуносупрессии, индуцированной рентгеновским облучением или цик. офосфаном.

Научно-практическая значимость работы. Данные, получениие в работе, показывают существенную роль клеточного звена иммунитета в развитии и исходе заболевания, вызываемого вирусом Ласса у мышей СБА. Гуморальный иммунитет имеет менее существенную роль в развитии и исходе летального экспериментального заболевания. Выявлены ранее неизвестные иммунологические механизмы развития летальной вирусной инфекции и определены подходы к разработке новых способов лечения к профилактики данного заболевания.

Результаты настоящей работы используются в БелНИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ БССР при изучении антигенных и иммуногенных свойств вируса Ласса с применением олигопеп-тидов, синтезированных на основе его структурных компонентов. Акт внедрения N18801 03.1987 г.

Настоящая работа выполнена в рамках задания МЗ СССР "Изучение молекулярно-генетических свойств и механизмов репродукции патогенных аренавирусов с целью создания эффективных химиотерапевтических и медицинских средств профилактики и лечения", N гос. регистрации 81048870.

Основные подозрения, выносимые на защиту.

1 Участие иммунной системы в развитии и исходе экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса у мышеи линии СВА различно з зависимости от сяг"?оба введения вируса: при внутрибрюшиниой инокуляции вируса развивается

-б-

пол,гоценный иммунный ответ, при внутримозговом способе введения - иммунная система участвует в определении летального исхода.

2. При внутрибрюшинном введении вируса Лаоса мышам СБА благоприятный исход экспериментального заболевания.обусловлен действием вирусспецифических Т-лимфоцитов, формирующихся в селезенке животных. Гуморальное звено иммунитета играет, очевидно, менее существенную роль в патогенезе данного экспериментального заболевания.

3. Эффективными способами защиты мыией, летально инфицированных вирусом Ласса, являются трансплантация клеток селезенки от иммунизированных животных, и иммунссупрессия.

Публикация результатов исследования и апробация работы.

Основные результаты работы излечены в 5 печатных работах. Материалы диссертации были доложены и обсуждались: на заседании проблемной комиссии сошного значения "Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций, особо опасные и медленные (вирусные) <инфекции" (Минск, 1986), на симпозиуме "Мэлекулярно-биологические аспекты взаимодействия паразит-хозяин" (Ленинград, 1987), на заседании городского общества иммунологов (Минек, 1988). на секции N1 Ученого Совета Института иммунологии (Москва, 1989).

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов.

Диссертационная работа излажена на ,.. страницах машинописного текста , содержит .. рисунков и таблиц . Список литературы включает источников, из них отечественных и иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В экспериментах использовали мышей линий C3H/Sn, BaLb/c, C57BL/6, AKR, DBA/2. OBA/Lac, полученных из питомника "Рапполово" АМН СССР.

В работе использовали вирус Ласса, штамм Josi ah. получении;! от доктора G. van der Groen (Институт тропической медицины , Антверпен). Титр вируса, используемого в работе, 4-6x10° БОЕ/мл . Инфекционную активность вируса определяли методом титрования на клетках Vero под агаровым покрытием. Определение вируса в органах проводили аналогичным методом.

Предварительно готовили суспензии из соответствующих тка-яей,_ осветляли их при 5000 об/мин и из надосадотаой ттос-ти готовили серийные разведения . При проведении экспериментов на животных используемый вирус титровали тагае на мышах линии СБА для определения ДД^Вычисление ЛДдапроизво-дили по методу Reed и Mench в модификации И. И Ашмарина .

Патогенность изучаемого вируса определяли not :е внутри-мозгового, внутривенного или внутрибршинного инфицирования мышей исследуемых линий. Лоза инфицирования составляла около 25 ДЯ50 ,что равно 1000 БОЕ/мышь. Главным критерием пато-генности была гибель мышей на 6-8 сутки после инфицирования в мозг.

Для индукции иммуносупрессии у экспериментальных животных использовали химические препараты циклофосфан и циклоспорин А, а такие рентгеновское облучение. Циклофосфан применяли в диапазоне доз от 40 до 300 мг/кг массы животных. Циклоспорин А вводили в зависимости от условий опыта в диапазоне доз от 15 до 60 мг/кг массы животных. В некоторых ' случаях иммуносулрессию осуществляли с помощью рентгеновского облучения мышей в дозе 2,5 Гр или 5 Гр.

В качестве иммуностимулятора использовали препарат мие-лопид, разработанный в институте иммунологии МЗ ССОР .

Миелопид вводили подкожно в дозе 200 мкг/мышь в различное время по отношению к времени внутримозгового инфицирования мышей вирусом Лаоса.

Для оценки роли клеточного иммунитета в патогенезе заболевания, вызываемого вирусом Лаоса у мышей СВА, использовали метод адоптивного переноса клеток селезенки. В качестве доноров клеток селезёнки использовали мышей СВА, которым вкугрс'рюшинно вводили вирус Лаоса в дозе 1000 БОЕ/мышь. В определенные сроки у мышей извлекали селезенки и выделяли клетки. Жизнеспособность выделенных клеток при оценке по включению трипанового синего составляла 90-95%. Клеточную суспензию после фильтрования через эйлоновый фильтр довг дили до концентрации 100 млн/мл. Мышам-реципиектак через 2-3 w-a после внутримозгового иьфипирования вводили в хвостовую вену г^ 30 млн донорских клеток селезенки. Влияли перенесенных ллегок оценивали по рышззниг летально ив--фицировакных ¡¿шей-рецишеигов. Контрольннм кньотккм вводи-

ли -.четки селезенки от интактных мышей.

Для оценки природы иммунокомпетентных клеток в суспензии использовали специфические сыворотки к Т-и В-лимфоцитам мыши, любезно предоставленные нам профессором Краскиной Е А. (лаборатория по изучению клеточных и молекулярных основ иммунитета Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. М. Габричевского).

Для оценки гуморального иммунитета определили титры ви-русопецифических антител в'сыворотке инфицированных животных. Для определения антител использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа по общепринятой методике.

При статистической обработке экспериментальных данных вычисляли среднюю арифметическую, доверительные интервалы и проводили оценку достоверности различий с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор экспериментальной модели. Одной из задач нашего исследования было изучение роли иммунных механизмов в развитии экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Лаоса у мышей. Для её решения необходимо было подобрать высокочувствительную к данному вирусу линию инбредных мкшей. Мы тестировали несколько линий мышей с различным гаплоти-пом. В наших исследованиях по чувствительности к вирусу Лаоса при его внугримозговом введении использованные линии можно разделить на три группы : а.) высокочувствительные -новорожденные мыши линии СЗН с гаплотипом Н-2К, мыши этой же линии в возрасте 3-4 недели и мыши СБА с таким же, Н-2К, гаплотипом, в возрасте 2-6 месяцев, летальность при их внугримозговом инфицировании составляет 95 - 100%.; б) нечувствительные - мыши линии СЗН в возрасте 2-3 мес.. а также новорожденные и взрослые мыши линии ВаЦэ/с (Н-20); в) мыши со средней чувствительностью - линии С57В1/6 (Н-2В)в возрасте Я и 50 дней и мыши линии А№ (Н~2К)в возрасте 60 дней, летальность которых варьировала от 30 до 60 %. Было установлено также, что высокой чувствительностью к вирусу Лаоса обладают мыши ОВА/2 с гаплотипом Н-20.

При инфицировании з мозг у мышей чувствительных линий развиваются характерные признаки заболевания- тонические судороги, парачич задних конечностей. Гибель наступает на

-96-8 сутки после инфицирования. При этом из всех тестированных линий только у мышей линии СБА летальность неизменно составляет 100%.

Зыяснение причин различной чувствительности к вирусу-Лаоса в зависимости от галлотила и возраста инбредных мышей может быть предметом отдельного исследования. Мохио лишь полагать, что эти различия связаны с характером к силой реакций иммунной системы на вирусные антигены, а также с разным уровнем синтеза таких биологически активных веществ как интерферон - гамма, фактор некроза опухолей, интерлейкян-1, интерлейкин- 2 и др.

На основании полученных нами результатов в дальнейших экспериментах для индукции летального заболевания мышам СБА, массой 16-18 г, вводили 1000 БОБ вируса Ласса в мозг, что составля т около 25 ДН50. Введение вируса внутривенным или внутрибрюшинным путем не приводит к развитию летального заболевания. • Более того, введение в мозг мышей СБА.летальной дозы вируса Ласса через 7 суток после их внутрибрюшинного или внутривенного инфицирования также не приводит к гибели животных. Данный эффект, по-видимому, связан о формированием иммунологической памяти к вирусу Ласса. Такое критическое различие в исходе инфицирования в зависимости от способа введения вируса было использовано нами для изучения особенностей формирования иммунного ответа в организме инфицированных животных.

Влияние иммунооупрессии и иммуностимуляции на развитие экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса.

Одним из широкоиспользуемых подходов к изучению роли иммунной системы в противовирусном иммунитете является выключение или стимуляция отдельных звеньев иммунной системы при помощи иммуносупрессантов или иммуностимуляторов.

Б работе использовали иммуносупрессант широкого спектра действия - циклофосфан (ЦФ), а также рентгеновское облучение. В качестве высокоизбирательног*. иммуносупрессанта при меняли циклоспорин А (ЦС А).

"ак известно, циклофосфан представляет собой один из широко используемых иммуносупрессантов, действие которого мне. ообразно и зависит от многих факторов: д^зк вводимого антигена, количества используемого препарата и времени его

вве,гения по отношению к антигену. Чувствительными к ЦФ, в зависимости от его дозы, является В-лимфоциты и Т-супрессо-ры гиперчувствительнооти замедленного типа .

2 4 6 6 10 12

сутки после инфицирования

Рис. 1 Терапевтическое действие циклофосф&на на заболевание. вызываемое внутримозговым введением вируса Лаоса у мышей СБА.

Стрелками обозначены дни внутрибрюшнного введения Цч» в дозе 40 мг/кг (число животных в каждой группе - 20). Циклофосфан в такой дозе не обладал токсическим э#ектом на животных.

| - выживаемость мышей СВА, инфицированных в мозг и получивших ЦФ;

□- динамика кумулятивной гибели инфицированных мышей, не получавших ЦФ,

Из данных, представленных на рис.1, видно, что введение ЦФ в дозе 40 мг/кг ежедневно на протяжении первых четырех суток после внутримсзговой инокуляции летальной дозы вируса Лаоса предотвращает развитие заболевания и гибель животных.

Следует отметить, что обработка животных препаратом ЦФ

-11в лозе 50 мг/кг или 300 мг/кг за сутки до внутрямозговой инокуляции вируса Лаоса, такого влияния не оказывает.

Кроме циклофосфана, для индукции иммуносупрессии использовали рентгеновское облучение в дозе 2,5 или 5 Гр. Предварительное облучение мышей в дозе 2,5 Гр не предотвращает гибель летально инфицированных мышей СБА, однако значительный защитный эффект на животных оказывает облучс .ие в дозе 5 Гр. Влияние облучения проявляется как в удлинении инкубационного периода, так и в снижении процента гибели инфицированных животных (табл. 1 ).

Таблица 1

Влияние рентгеновского облучения на детальность мышей, инфицированных в мозг вирусом Лаоса

! УСЛОВ1..;

!обработки ! мышей I вирус !Ласса в ! мозг* 1 I

!+ 2,5 Гр**! ! +в. Лаоса !

! +5.0 Гр ! +в. Ласса !

1 -I- 5,0 Гр

летальность 1 сред, продол«. ! % ' лизни

* - вирус Лаоса вводили в дозе 1000 ВОЕ/мышь. ** - облучение жиьотных проводили за 3 часа до внутримоз-гоеого инфицирования.

С целью выяснения роли эффекторного ззена иммунной системы в патогенезе заболевания, вызываемого внутримоэговым введением вирус? Лаоса, мы исследовали влияние ЦС А на ра?-в...ке и исход летального заболевания у мышей "ВА. Известно, что ГО А. избирательно действует ка определенные субпопуля-

ции Т-лимфоцитов (Т-хелперы), не обладает миелоцитотокскч-ностью и не оказывает отрицательного воздействия на количество и пролиферативную активность стволовых клеток.

В результате проведенного нами исследования установлено, что введение ЦС А в дозах от 15 до 60 мг/кг в различное время после внутримозгового инфицирования мышей СБА вирусом Ласса не приводит к уменьшению процента гибели "чвотных.

В настоящее время доказана клеточная опос^едованность патологических изменений, приводящих к летальному исходу экспериментального заболевания, вызываемого вирусом лимфо-цитарного хориомэнингита (ЛХМ), входящим в одну серологическую группу с вирусом Ласса. Для вируса ЛХМ пслодительный эффект иммуносупрессии связывается с блокировкой или инактивацией иммунного ответа на антиг^ч вируса ЛХМ, проявляющегося прежде всего в появлении вирус-специфических цг-о-токсичеоких лимфоцитов и эффекторов гиперчувствительности замедленного типа Подавление функциональной активности этих субпопуляций, в частности с помощью ЛС 'А, предотвращает развитие в инфицированном организме иммунопатологических нарушений, приводящих к летальному исходу ( Ниее1п А. V. е1 а1.1985, Загоп М. Г. еЬ а1. ,1984 ).Наши данные о благоприятном влиянии иммуносупрессивных воздействий (рентгеновское облучение, циклофосфан) на исход заболевания мышей, инфицированных вирусом Ласса, согласуются с результатами, полученными для вируса ЛХМ (НиееШ А.V. , 1985 ).В то же время нами установлено, что имеются существенные отличия в участии иммунной системы в патогенезе заболеваний, вызываемых у мьшей этими вирусами. В частности, мы установили,что ЦС А не предотвращает развития заболевания и гибели мышей СВА, инфицированных вирусом Ласса. Очевидно, Т-хелперы, являющиеся основной мищеныо для ЦС А, не определяют летальный исход заболевания.

Таким образом, результаты опытов с использованием имму-носуг.реосантов свидетельствуют о положительном влиянии иммуносупрессии на развитие и исход экспериментального заболевания, вызываемого у мышей СВА при внутримозгозой инокуляции вируса Лаоса. Стимуляция иммунной системы при помощи миелопида не приводит к снижению летальности мышей СВА, инфицированных в мозг вирусом Ласса.

Изучение закономерностей формирования иммунных реакций при экспериментальном заболевании, вызываемом вирусом Лаоса у мышей СБА.

Для выяснения иммуншж фактор.... , в наибольшей степени отвечающих за исход заболевания при том или ином способе введения вируса в организм, мы изучали роль клеточных и гуморальных иммунных реакций в развитии и исходе экспериментального заболевания, вызываемого у мышей ОБА вирусом Лаоса.

Как.было указано вше. внутрибрюшинн&я инокуляция вируса Ласса не зызывает гибели инфицированных мышей. Локаза-т?льстза того, что при внутрибрюшинном введении вируса Лаоса у мышей идет формирование иммунного ответа, были получены нами с использованием метода адоптивного переноса клеток селезенки.

У мышей, инфицированных внутрибрюшинно (мыши-доноры), в различные сроки после введения вируса извлекали селезёнки и выделяли клетки. Далее нефракционированную суспензию клеток. освобожденную от эритроцитов, вводили внутривенно летально инфицированным сингенным реципиентам через 2-3 часа после инокуляции в мозг около 25 Щд вируса Лаоса. Для определения сроков появления эффекторных клеток проводили выделение клеток на 2, 5 или 7 сутки после инфицирования доноров. Вводимые клетки в различной степени защищают мышей-реципиентов. При этом только клетки селезёнки, выделенные на седьмые сутки после инфицирования мышей-доноров полностью предотвращают развитие заболевания и гибель мышей -реципиентов . Перенос клеток от ин актных мышей-доноров не приводит к протективному эффекту (рис. 2). Протективный эффект зависит и от дозы вводимых клеток. Для предотвращения развития летального заболевания необходимо ввести 30 млн клеток селезенки. взятых через семь суток после внутрибркшнного инфицирования милей доноров. 15 млн клеток защищают около 60% реципиентов, а 7,5 млн/мышь клеток селезенки не обладают протективным эффектом (рис.3).

Таким образом, внутрибрюшинное введение вируса Ласса мышам СБА приводит к формировании в селезенке инфицированных мышей популяции иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих защиту.зтих животных при повторном введении вируса и

обладающих протективным эффектом при переносе сингенным летально инфицированным мышам-реципиентам. Использование ци-тотоксических сывготок к Т- и В-лимфоцитам позволило показать, что протективннй эффект, • оказываемый при -адоптивном переносе клеток селезенки, обусловлен Т-лимфоцитами. Обработка суспензии вводимых клеток антисывороткой к Т клеткам

сутки после инфицирования

Рис. 2. Влияние сенсибилизированных клеток селезенки на выживаемость мышей-реципиентов , летально инфицированных гирусом Лаоса.

1 - динамика кумулятивной гибели мышей-реципиентов, которым вводили клетки селезёнки ст интактных доноров. Выживаемость мышей-реципиентов после адоптивного переноса им клеток селезёнки от мышей-доноров, инфицированных за 2 суток (2) . 5 суток (3) и 7 суток (4) дс взятия клеток. ,

-157. выживаемости

сутки после инфицирования

.Рио. 3. Зависимость протективного эффекта от дозы вводимых примированных клеток селезенки. Динимика кумулятивной гибели мышей реципиентов, которым вводили клетки селезёнки в дозе: 1 - 7.5 млн/мышь;

2-15 млн/ мышь;

3-30 млн /мышь.

полностью отменяла протективный эфЛект (табл.2). Антисыворотка к В-лимфоцитам подобным действием не обладала. Преимущественное участие Т-клеточного звена иммунитета в формировании иммунного ответа на вирус Лаоса было подтверждено и исследованием некоторых показателей гуморального иммунитета инфицированных мышей СВА. В сыворотках животных, инфицированных внутрибрюшинно или в мозг , не было отмечено достоверное повышение уровня иммуноглобулинов М или 6. Эти сыворотки не обладали такте вируснейтрастзующей активностью. Суточный супернатант, полученный в культуре клеток се-

лезёнки, взятых у животных после внутрибркшнного инфицирования. не оказывал протективного эффекта при введении летально инфицирован1" 1М реципиентам.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что к 7 суткам после внутрибрюшинного введения мышам СБА вируса Ласса у них образуются эффекторные Т-лимфоциты. Они обеспечивают выживание животных при повторном инфицировани: и обладают проте/сгивным эффектом при адоптивном переносе сингенным летально инфицированным мышам-реципиентам.

Использование ДФ или ЦС А на различных этапах получения или применения сенсибилизированных клеток селезёнки позволило выяснить некоторые особенности формирования эффектор-

Таблица 2

Влияние анти-Т и анти-В сывороток на протективные свойства примированных клеток селезёнки

! обработка клеток ! протективный эффект на !

! до переноса ! мышах-реципиентах !

!кол-во погиб, ¡выживаемость! день !

! ! кол-во инфиц. ! реципиентов ! гибели !

! ! ! в X ! !

! 0/13 ! 100,0 ! - 1

! комплемент ! 0/7 ! 100,0 ! - !

анти-Т сыворотка* ! 7/7 ! 0.0 ! 6-7 ! ! анти-В сыворотка* ! 0/7_! 100,0_? - !

* - суспензию примированных клеток селезёнки перед адоптивным переносом обрабатывали указанными антисыворотками в присутствии комплемента, В качестве источника комплемента использовали нормальную сыворотку кролика.

ной популяции, появляющейся, после внутрибрюшинной инокуляции вирусе Ласса мышам СБА.

Введение ЦФ в дозе 300 мг/кг массы за сутки до внутрибрюшинной инокуляции вируса Ласса приводит к тому, что мыши начинают погибать с характерными признаками заболевания. К 16 суткам после внутрибркгчниого инфицирования выживаемость составляет около<55%. У выживших мышей не происходит форми-

рование иммунологической памяти к вирусу Лаоса, а клетки селезёнки от таких мышей не обладают протективной активностью. Очевидно, иммуносупрессия. вызванная введением больших лоз ЦФ. приводит к теме . лнию иммунного ответа на вирус Лаоса и, в конечном итоге, к высокому проценту гибели животных. Введение меньпей дозы ЦФ, 40 мг/кг, не вызывает гибели мышей-доноров и протективная активность клеток селезёнки у таких мышей сохраняется.

ДО А менее эффективен в подавлении противовирусного иммунитета. Выживаемость мышей, обработанных НС А в дозе 50 мг/кг на 1 и 2 сутки после внутрибрюшинного введения вируса Лаоса, составила к 16 суткам после инфицирования около 707«. И хотя значительная часть мыаей погибла, у выживших мышей сохраняется способность клеток селезёнки оказывать протек-тивный эффект при адоптивном переносе.

Таким образом,* иммуносупрессия при помощи ЦФ и ДО А приводит к заметному ослаблению иммунного ответа на вирус Ласса и снижению протективного эффекта Т клеток, образующихся в селезёнке мышей, инфицированных вирусом Ласса внут-рибрюшинно.

Каким т образом эФФекторние клетки оказывают протек-тивный эффект в летально инфицированном организме мышей? Осуществляют ли они протективный эффект сами или каким то образом "активируют" иммунокомпетентные клетки в организме мышей-реципиентов? Для решения этого вопроса за сутки до введения клеток селезенки от мышей-доноров мышам-реципиентам вводили 300 иг/кг ЦФ , индуцируя таким образом стойкую иммуносупрессию. Известно, го такая доза ЦФ является цито-токсической и цигоетатической для иммунокошетеятяых клеток, однако не влияет на летальный исход заболевания, развивающегося после внутримозгового введения вируса Ласса Перенос иммуносупрессированным мышам-реципиентам 30 млн клеток селезенки от мышей-доноров приводит к полному выживании реципиентов. Введение интактных клеток селезёнки такого эффекта не оказывает. Как уже было сказано выше,-не оказывает протективного эффекта и суточный супернатант примированных клеток селезёнки. Эти результаты показывают,что протективный эффект обеспечивается именно вносимой популяцией клеток селезёнки. .

о

С целью выяснения периода времени, в течение которого введение сенсибилизированных клеток селезенки оказывает протективный эффект адоптивный перенос от мышей-доноров проводили через 3, 17, 22, 29 и Солее часов после детального инфицирования мышей-реципиентов вирусом Ласса (табл.3). Введение клеток селезёнки через 3. 17 или 22 часа одинаково эффективно предотвращало развитие летального заболевания : мышей - реципиентов. Однако введение таких клеток через 29 или 48 часов не приводило к проявлению протективного эффекта, и мыши-реципиенты погибали в контрольные сроки.

Мы установили также, что формирование популяции Т-лимфоцитов, обладающих протективным эффектом при адоптивном переносе, зависит от дозы вируса, вводимой внутрибрюшинно мышам-донорам. Из всех тестированных доз вводимого вируса Ласса (от 1,5 до 1500 Л%д). дозы вируса 150-1500 ЛД^вызывают формирование в селезёнках мышей-доноров популяции Т-лимфоцитов. обладающих протективным эффектом при адоптивном переносе.

Таблица 3

Эффективность иммунотерапии мышей СБА, летально инфицированных вирусом Ласса, в зависимости от сроков введения им примированных клеток селезёнки

! время ! кол-во выживших ! выживаемость! день !

( введения ! мышей ** ! мышей- ! гибели !

I клеток * ! кол-во инфициро- !реципиентов ! животных !

! (часы ) ! ванных мышей ! в 7. ; 1

1 3 ! 9/9 ! 100,0 ! - !

! 17 ! 9/9 1 100,0 ! - !

! 22 , ! 9/9 ! 100,0 ! - !

1 29 1 0/9 ! 0 1 6-7 !

! 48 ! 0/9 ! 0 ! 6-7 !

* -мышам Реципиентам через указанный промежуток времени вводили клетки селезенки, взятые через семь суток после в/бр инфицирования доноров.

** - отношение количества вьмивших в результате введения примированных клеток селезёнки мышей-рецншгентов к общему количеству инфицированных, мышей.

-19- "

Лозы вируса меньше 10 Щцц не вызывают формирования такой популяции.

Является ли выживание мышей-реципиентов при адоптивном переносе сенсибилизированных клеток ледствием перехода острой фазы заболевания в хроническую или это результат эффективной элиминации вируса из организма? Нами было проведено определение титра инфекционного вируса в органах летально инфициро-

Таблица 4

Влияние примированных клеток селезёнки на репликацию вируса Лаоса в органах мышей-реципиентов.

печень

! почки ! селезёнка !

после! ! ! } !

пере-! К О ! К _ 0 ! К 0! тг 0 !

носа*! } ; ; •

2 5.4+1.0 3,8±0.8 5.2±0,8 3.3±0.9 3,8+0.9 <1 4,2±0,9 4,3+0,

3 5.5±0,9 < 1 4.9±0.9 < 1 3.5+0,8 <1 4,6±0,8 < 1

4 5.Ш.0 < 1 5,5±0,5 < 1 3,9+0,7 <1 4,9±0,8 < 1

5 4,9лО,9 < 1 3,8±0.б < 1 <1 <1 4,Б±0,8 < 1

6 н. о. ** < 1 н. 0. < 1 н.0. <1 н. 0. < 1

* - мышам-реципиентам вводили примированные клетки селезенки через 3 часа после летального инфицирования вирусом Ласса;

** - определение титра инфекционного вируса в органах не проводили в связи с гибелью мышей.

К - контроль - титр инфекционного вируса в орган с мышей, которым вводили интактные клетки селезёнки ( 1с ВОЕ/мл );

О - опыт - титр инфекционного вируса в органах шеей-реципиентов, получавших примированные клетки селезёнки (]д БОЕ/мл).

- го-

ванных мышей -реципиентов в различные сроки после введения им клеток селезёнки от мышей-доноров.

Ежедневно с 1 14 сутки после проведения адоптивного переноса у мышей-реципиентов извлекали органы у проводили определение титра инфекционного вируса в тканях мозга, печени, почек и селезёнки ( табл. 4 ).В контрольной группе мышей, которым вводили клетки селезёнки от интактных М1. шей-доноров, вирус определяется уже на вторые сутки после инфицирования мыик,й и распределяется почти равномерно по всем исследованным органам. У мышей-реципиентов, получивших сенсибилизированные к вирусу Ласса клетки селезенки, репродукция вируса в исследованных органах значительно ниже. Вирус определяется только на вторые сутки после проведения адоптивного переноса, хотя и на этот срок уровень вируса был значительно ниже, чем в контрольной группе. Начиная с третьих суток после переноса клеток селезенки, вирус в исследованных органах уже не определяется. Такие же результаты были получены и при исследовании органов "леченных" мышей в более поздние сроки (до 14 суток).

На основании этих исследований нами сделан вывод о том, что в результате адоптивного переноса летально инфицированным мышам-реципиентам примированных клеток селезёнки от мы-^ей-доноров • происходит эффективная элиминация вируса Ласса из организма.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что различные линии инбредных мышей проявляют неодинаковую чувствительность к вирусу Ласса. Мыши СВА с гаплотипом Н-2К проявляют 100% чувствительность при внут-римозговой инокуляции вируса Ласса и могут быть использованы при изучении вклада иммунологических механизмов в патогенез экспериментального заболевания, вызываемого вирусом Ласса.

2. Исход заболевания при заражении мышей СВА вирусом Ласса зависит от способа инокуляции вируса. При внутримозго-вом введении вируса наблюдается гибель животных на 6-7 сутки. При внутрибрюшинном введении вируса все инфицированные животные выживают.

3. При внутрибрюшинном введении вируса Ласса в диапазоне доз 15С-1500 мьгаам.СВА в селезёнке животных формиру-

:я популяачя вирусспецифических зффекторньгх Т-лимфоцитов, обладающих протективным эффектом при адоптивном переносе ¡ингенным летально инфицированным реципиентам.

4. Введение 30 х. 10б клеток с» '¿зенки от примированных лышзй сингенным реципиентам в течение первых суток после знутримозговой инокуляции вируса Ласса предотвращает легальный исход заболевания и сопровождается эффективной элиминацией вируса из организма мышей-реципиентов.

5. При внутримозговой инокуляции вируса Ласса мышам СВА летальный исход заболевания момю предотвратить с помощью яммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном (40 мг/кг с 1 ю 4 сутки) или рентгеновским облучением (5 Гр).

6. При развитии экспериментального заболевания у мышей яаиболее существенную роль в патогенезе заболевания играют Г клеточные иммунные реакции.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. И. С. Лукашевич. С. В Орлова. Р. Ф. Марьянкова, Е Л. Баркар Патогенность вируса Ласса для лабораторных мышей // Вопр. вирусол. , 1985, N5.- 0. 595-599.

2. Е Л. Баркар Метод адоптивного переноса при изучении механизмов экспериментальной инфекции мышей вирусом Лаоса. - В сб.: Антивирусные вещества при экспериментальной терапии вирусных инфекций, Минск, 1986.- С. 1 ОС-103.

3. Н. Д. Баркар, Р. Ф. Марьянкова, А. Т. Годнева, Л. В. Григорьева, В. И. Зудин, А. С. Петкеви , И. С. Лукашевич Влияние им-муносупрессии на развитие и исход острой инфекции,вызываемой у мышей ' введением вируса Ласса//Вопр. вирусол.. 1989, N2,- С. 208-214.

4. Н. Л. Баркар, И. С. Лукашевич Вирусы Ласса и Мозамбик: перекрёстная защита в опытах на мышах и действие иммуносуп-рессантов на экспериментальную инфекцию// Вопр. вирусол.. 1989, N5,- 0.598-603. '

5. Н. Л. Баркар. И. С. Лукашевич Протективный эффект иммуно-компетентных клеток при экспериментальной инфекции, вызываемой у мышей линии СБА введением вируса Ласса// Тезисы 1-го Всесоюзного съезда иммунологов, Москва, 1989 г.