Роль гиперметилирования генов в патогенезе билатеральных опухолей молочной железы

Иевлева, Аглая Геннадиевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль гиперметилирования генов в патогенезе билатеральных опухолей молочной железы

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Иевлева, Аглая Геннадиевна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль гиперметилирования генов в патогенезе билатеральных опухолей молочной железы

На правах рукописи

003483539

ИЕВЛЕВА Аглая Геннадиевна

РОЛЬ ГИПЕРМЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ БИЛАТЕРАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.14 - онкология 03.00.04 - биохимия

1 з КОЯ 2039

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003483539

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Забежпнский Марк Абрамович доктор биологических наук, профессор Комов Валим Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_»_2009 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» по адресу: 197758, Санкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская, д. 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, п. Песочный-2, ул. Ленинградская д.68) и на сайте (www.niioncologii.ru')

Автореферат разослан «_».......................2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н. Е.В. Бахидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) является самой распространенной онкологической патологией у женщин. На сегодняшний день довольно подробно изучены спектр и частота молекулярно-генетических нарушений при РМЖ. Вместе с тем, наряду с аномалиями на уровне генома, внимание современных исследователей привлекают изменения эпигенетических процессов, к которым относится метилирование ДНК. Метилирование цитозина в составе так называемых "CpG-островков" активирует деацетилирование гистонов, что, в свою очередь, приводит к изменению конфигурации хроматина и локальному подавлению транскрипции (Ng НН, Bird А, 1999). CpG-островки представляют собой короткие участки в промоторных областях генов, содержащие повышенное по сравнению с остальным геномом число CG-динуклеотидов; эти районы практически всегда не метилированы в нормальных клетках.

Для опухолей характерен дисбаланс эпигенетической регуляции: на фоне глобального гипометилирования наблюдается гиперметилирование промоторных областей множества генов. Для новообразований разных локализаций, включая РМЖ, установлены специфичные профили метилирования (Costeño JF et al., 2000).

Во многих случаях гиперметилирование является причиной инактивации супрессорных генов (Jones PA and Baylin SB, 2002; Herman JG and Baylin SB, 2003). В соответствии с классической моделью Knudson'a, функция одного из аллелей гена-супрессора может быть подавлена вследствие метилирования, а другого - за счет точковой мутации или делеции (Plass С, Soloway PD, 2002). В отличие от мутаций, необратимо изменяющих первичную структуру ДНК, присоединение метильной группы к основаниям потенциально обратимо. Этот факт лег в основу разработок терапии, направленной на восстановление нормальной картины метилирования и, соответственно, экспрессии антионкогенов (Herman JG and Baylin SB, 2003).

Гиперметилирование генов ESR1 (ER-alpha), BRCA1, CCND2, RARb2 встречается со значительной частотой при раке молочной железы.

стероидных гормонов на момент диагноза, кроме того, фракция изначально ЭР-положительных карцином перестает экспрессировать их в ходе прогрессирования. Между тем, причины нарушений экспрессии рецепторов эстрогенов пока еще во многом неясны. Некоторые исследования указывают на ассоциацию гиперметилирования промотора гена ESR1 с потерей его транскрипции (Weigel RJ, deConinck ЕС, 1993; Kim SJ et al., 2004).

Мутации в антионкогене BRCA1 обуславливают до 10-15% наследственных карцином молочной железы. В спорадических случаях, напротив, соматические мутации встречаются чрезвычайно редко. Тем не менее, такие факты, как высокая частота потерь гетерозиготности (LOH - Loss of Heterozygosity) в этом локусе и снижение экспрессии BRCA1 в «несемейных» РМЖ, свидетельствуют об участии этого гена и в развитии ненаследственных неоплазий. На сегодняшний день доказано, что гиперметилирование промотора принадлежит к числу возможных способов инактивации BRCA1 (Esteller М et al., 2000).

Еще одной частой мишенью эпигенетических нарушений является ген циклина D2 (CCND2). CCND2 вместе с другими D-циклинами отвечает за переход от S1- к G-фазе клеточного цикла путем активации циклин-зависимых киназ, фосфорилирования белка RB1 и накопления транскрипционных факторов. Кроме того, он обладает и альтернативной антипролиферативной активностью (Meyyappan М et al., 1998). Возможно, угнетение именно этой супрессорной функции при метилировании промотора CCND2 имеет значение в патогенезе РМЖ.

Доля РМЖ с гиперметилированием промотора гена рецептора ретиноевой кислоты (RARb2) составляет, по некоторым данным, до 69% (Bean GR et al., 2005). RARb2 необходим для реализации функции ретиноидов, которые участвуют в регуляции роста и дифференцировки нормальных клеток в эмбриогенезе и неопластических клеток в процессе малигнизации.

Особый интерес для молекулярно-генетических исследований представляет билатеральный рак молочной железы (БРМЖ), так как при этой форме заболевания две опухоли развиваются в пределах одного организма на фоне идентичных эндогенных и экзогенных воздействий. Кроме того, БРМЖ является самой частой формой первично-множественных опухолей у человека. Эпигенетические нарушения при БРМЖ практически не охарактеризованы. Изучение вопроса о конкордантности или дискордантности статуса метилирования описанных выше генов в двух неоплазмах от одной пациентки предоставляет исключительную возможность судить о степени

сходства патогенеза обеих опухолей и о роли эпигенетических нарушений в их развитии.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение особенностей картины метилирования генов в билатеральных опухолях молочной железы. В связи с этим поставлены следующие задачи:

1) Сравнить уровни метилирования и частоты гиперметилирования генов Е5Я1, ВЯСА1, ССК02, КАИЬ2 в билатеральных и монолатеральных опухолях молочной железы

2) Провести анализ конкордантности/дискордантности изучаемых явлений в парных образцах БРМЖ

3) Сопоставить данные о метилировании гена ЕБК1 при РМЖ с информацией об экспрессии рецепторов эстрогенов на уровне РНК и белка в тех же опухолях

4) Провести анализ корреляций между статусом метилирования генов ЕЗШ, ВЯСА1, ССЫШ, ЯАЮ)2

5) Провести анализ ассоциаций между статусом метилирования изучаемых генов и клинико-биологическими параметрами РМЖ.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые изучены профиль и частота гиперметилирования генов ЕБЮ, ВКСА1, ССИ02, ЯАЯЬ2 при БРМЖ. Также проведено сравнение частот изученных явлений между монолатеральными и билатеральными опухолями.

Практическая значимость

Полученные данные об эпигенетических нарушениях при билатеральной форме РМЖ дополняют «молекулярный портрет» БРМЖ и вносят вклад в понимание его патогенеза. В дальнейшем эта информация может быть использована при разработке новых принципов противоопухолевой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Билатеральные опухоли молочной железы не отличаются от монолатеральных по уровню метилирования и по частоте гиперметилирования генов ВКСА1, СС№2,ЯАИ)2.

2) Билатеральные опухоли молочной железы отличаются от монолатеральных по уровню метилирования промотора гена ESR1. В билатеральных карциномах значительно выше доля случаев с низким (<10%) уровнем метилирования.

3) Гиперметилирование промотора гена ESR1 является редким событием при раке молочной железы (частота составляет 4% в монолатеральных и 4% в билатеральных карциномах). Колебания уровня метилирования ниже порога гиперметилирования не ассоциированы с изменением экспрессии рецепторов эстрогенов.

4) Метилирование генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 не проявляет тенденции к повышенной конкордантности в парных билатеральных карциномах молочной железы. Данное наблюдение ставит под сомнение критическую роль эпигенетических нарушений в патогенезе БРМЖ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. H.H. Петрова (22 декабря 2008 г., Санкт-Петербург, Россия), на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2009» (17 апреля 2009 г., Санкт-Петербург, Россия).

Струю-ура н объем диссертации

Диссертация изложена на 100 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 193 публикации, в том числе 7 отечественных и 186 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемые группы

Материалом для исследования послужила ДНК, выделенная из 3 групп образцов: билатеральных опухолей молочной железы (БРМЖ), монолатеральных опухолей молочной железы (МРМЖ), а также из морфологически нормальной ткани молочной железы (N). Все пациентки, включенные в исследование, проходили лечение в НИИ онкологии им. H.H. Петрова, образцы собирались в период с 1985 по 2006 год.

Группа билатеральных карцином представлена 72 образцами от 42 пациенток. В их число вошли 32 опухоли из синхронных (сБРМЖ) и 40 опухолей из метахронных (мБРМЖ) пар. Синхронными считались случаи, в которых новообразования обеих молочных желез были диагностированы с промежутком менее 1 года. Из 40 метахронных опухолей 17 были первыми (М1), а 23 - вторыми (М2) из пар. Средний возраст женщин в подгруппах синхронных, первых и вторых метахронных неоплазм составил 56.3, 50.1 и 63.5 года, соответственно (возрастной интервал 38-85, 32-85,41-87 лет).

В группу монолатеральных карцином вошли опухоли от 71 пациентки. Средний возраст больных составил 55.4 года (возрастной интервал 32-78 лет). Контрольную группу составили 28 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы от пациенток с БРМЖ (средний возраст 57.1 года, возрастной интервал 32-85 лет).

Анализ метилирования, ввиду использования архивного парафинового материала, удалось провести не во всех случаях, информация о количестве проанализированных образцов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Количество образцов МРМЖ и БРМЖ, проанализированных при помощи пиросеквенирования (сБРМЖ - синхронный БРМЖ, мБРМЖ - метахронный БРМЖ).

МРМЖ БРМЖ N Полные пары БРМЖ Полные пары сБРМЖ Полные пары мБРМЖ

ESR1 68 52 13 17 10 7

BRCA1 57 46 14 15 6 9

CCND2 64 57 18 23 10 13

RARb2 70 69 24 29 15 14

Изучаемые группы опухолей были охарактеризованы по ряду клинико-биологических параметров. Сведения о размере опухоли и вовлеченности региональных лимфоузлов по системе TNM, иммуногистохимической экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, степени дифференцировки и гистологическом варианте новообразования взяты из историй болезни, хранящихся в архиве НИИ онкологии им. H.H. Петрова. Информация об амплификации онкогена HER2, мутациях

в гене р53 и экспрессионных подтипах карцином взята из результатов предыдущих исследований использованных коллекций опухолей (Suspitsin EN et al., 2007; Russnes HG et al., in press).

Выделение ДНК

Источником ДНК во всех исследуемых группах послужили архивные патоморФологические парафиновые блоки. Выделение ДНК проводилось по методике, рекомендованной Agilent Technologies и описанной в работе van Beers EH et al. (2006). Процедура выделения состояла из нескольких этапов: удаления парафина, обработки ферментом протеиназой К, экстракции геномной ДНК.

С целью депарафинизации в пробирку с 3-5 парафиновыми срезами толщиной 20 мкм добавляли 480 мкл PBS и 20 мкл 10% раствора Tween 20, инкубировали пробирки при 90°С в течение 10 минут, затем центрифугировали 15 минут при 10000g и помещали на лед на 2 минуты. Образовавшийся вверху пробирки слой парафина и супернатант удаляли. Депарафинизированную ткань промывали 1 мл 96% этанола. После удаления этанола добавляли 400 мкл 1М раствора тиоцианата натрия и оставляли в термошейкере на 12 часов при 37°С. Затем центрифугировали образец 20 минут при 10000g, удаляли супернатант, промывали ткань 400 мкл PBS. После удаления PBS добавляли 360 мкл лизирующего буфера ATL (Qiagen, DNeasy Blood and Tissue Kit) и 40 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл), инкубировали 12-16 часов при 55°С на термошейкере. Затем еще дважды добавляли по 40 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл) с интервалом 6-8 часов.

После полного лизиса ткани осуществляли экстракцию ДНК. Для этого к лизату добавляли 400 мкл буфера AL (Qiagen, DNeasy Blood and Tissue Kit), инкубировали 10 минут при 70°C, затем добавляли 440 мкл 96% этанола. Далее экстракцию осуществляли при помощи колонок DNeasy Mini spin columns (Qiagen) в соответствии с инструкцией к набору Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit. Ha последнем этапе ДНК элюировали 50 мкл воды. Качество выделенной ДНК контролировали путем электрофореза в 2% агарозном геле и измерения концентрации с помощью спектрофотометра Thermo Scientific NanoDrop 1000. Полученный раствор ДНК хранили при -20°С.

Выбор генов и участков генов для исследования

В настоящей работе изучался статус метилирования 4 генов: ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2. При выборе генов для тестирования учитывались следующие два критерия:

1) высокая частота гиперметнлирования при монолатералыюм РМЖ

2) вовлеченность гена в патогенез РМЖ.

Статус метилирования оценивался в промоторных зонах генов в следующих участках (считая от сайта начала транскрипции): ESR1 +94+296 (включает 19 CG-nap), BRCA1 +209+394 (включает 7 CG-nap), CCND2 -1287-1098 (включает 11 CG-nap), RARb2 +36+211 (включает 10 CG-nap). С целью выбора наиболее CG-богатых областей промоторные участки были проанализированы с помощью программы MethPrimer (Li LC and Dahiya R, 2002). Праймеры для ПЦР-амплификации подбирались с помощью этой же программы. Критериями при их подборе были максимально близкое расположение фрагмента к сайту начала транскрипции, неспособность праймеров к отжигу на немодифицированной бисульфитом натрия ДНК-матрице, а также способность амплифицировать фрагмент вне зависимости от его статуса метилирования.

Анализ метилирования ДНК

Бисульфитная обработка ДНК. Анализ метилирования проводился путем пиросеквенирования обработанной бисульфитом натрия ДНК (Kwabi-Addo В et al., 2007). Бисульфитная обработка конвертирует все неметилированные цитозины в урацил, при этом метилированные основания остаются неизмененными. Таким образом генерируется разница в нуклеотидной последовательности между метилированной и неметилированной ДНК, которая детектируется на этапе пиросеквенирования.

Бисульфитная обработка проводилась при помощи набора EpiTect Bisulfite Kit, Qiagen по протоколу, оптимизированному для образцов ДНК, полученных из архивных парафиновых срезов.

Пиросеквеннрование. Обработанную бисульфитом натрия ДНК амплифицировали в ПЦР-реакции объемом 25 мкл. Реакционная смесь содержала 1х HotStar Taq буфер, 2.0 единицы активности полимеразы Hot Star Taq (Qiagen), 1.6 мМ MgC12, 5 пмоль каждого праймера из соответствующей пары, 200 мкмоль каждого дНТФ, 2 мкл обработанной бисульфитом натрия ДНК. ПЦР-циклирование состояло из активации полимеразы в течение 10 минут при 95°С; 50 циклов, включающих шаги денатурации (95°С, 15 сек), отжига праймеров (52-60°С, 30 сек), элонгации (72°С, 30

сек); а также шага завершающего синтеза при 72°С в течение 5 минут. Обратный праймер в каждой из пар содержал биотин на 5'-конце, необходимый для последующего формирования одноцепочечной ДНК. Перед реакцией секвенирования качество ПЦР-продукта оценивалось путем электрофореза в 2% агарозном геле. Формирование одноцепочечной ДНК проводилось при помощи Pyrosequencing Workstation (Biotage, Uppsala, Sweden). Полученный в ходе ПЦР амплификат иммобилизировали на покрытых стрептавидином микрошариках streptavidin-coated Sepharose beads (GE Health Care, Uppsala, Sweden), промывали, денатурировали, после чего биотинилированную ДНК на микрошариках помещали в буфер для отжига (20 мМ Tris, 2 мМ ацетата магния, рН=7.6, V=40 мкл), содержащий 15 пмоль праймера для секвенирования.

Количественный анализ метилирования осуществлялся на приборе PSQ 96МА с использованием набора PyroGoldSQA Reagent Kit, результаты оценивались с помощью программного обеспечения Pyro Q-CpG (Biotage, Uppsala, Sweden). Универсальная обработанная бисульфитом полностью метилированная и неметилированная ДНК (EpiTect Control DNA Set; Qiagen) использовалась в качестве контроля.

Уровень метилирования каждого отдельного CG-локуса внутри каждого исследуемого фрагмента вычислялся на основании сравнения высоты пиков метилированного основания (Cm) и неметилированного основания (Cum) по следующей формуле:

Г Ст 1

Мелирование»-) = [(Ст + Сит)\ * 100

Уровень метилирования каждого гена в каждом образце вычислялся как среднее из уровней метилирования всех входящих в данную область CG-сайтов.

Для определения частоты гиперметилирования в опухолях был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена следующим образом (Lehmann U et al., 2005):

N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в норме, SD -стандартное отклонение.

Определение экспрессии мРНК ESR1

Выделение РНК. мРНК была выделена из 33 архивных патоморфологических образцов опухолевой ткани (14 билатеральных и 19 монолатеральных карцином

молочной железы). Архивные срезы депарафинизировали с помощью ксилола, регидратировали путем последовательной инкубации в 96%, 80% и 70% этаноле и лидировали на протяжении 16 часов при 60°С. Лизирующий буфер состоял из 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 мМ EDTA, 2% SDS, и 500 мкг/мл протеиназы К. Экстракция производилась кислым фенолом (pH 4,0) и хлороформом. Затем мРНК осаждали изопропанодом в присутствии 1 мкл гликогена (20 мг/мл), однократно промывали 70% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Полученный раствор РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в реакции обратной транскрипции. Для реакции обратной транскрипции использовали фермент обратную транскриптазу M-MLV (Promega) в количестве 50 единиц. Реакция проходила в объеме 20 мкл и включала, помимо M-MLV, 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл праймеров - случайных гексануютеотидов (11 ое/мл), 1 мкл смеси дНТФ (содержащей по 10 мМ каждого), 8 единиц ингибитора РНКаз и 10 мкл раствора РНК. Использовался следующий температурный режим: 20°С в течение 5 минут, 38°С в течение 30 минут, 95°С в течение 5 минут.

ПЦР в режиме реального времени. Измерение экспрессии ESR1 проводилось при помощи ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR) на оборудовании ¡Cycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules). ПЦР-реакция (суммарный объем 20 мкл) содержала 1 мкл раствора кДНК, 2.5 ед. ДНК-полимеразы "Thermostar", 1-кратный ПЦР-буфер (pH 8.3), 2.5 мМ MgCb, 200 мкМ каждого из нуклеотидтрифосфатов, 0.4 мкМ прямого и обратного праймеров гена-рефери (SDHA) или гена-мишени (ESR1), флуоресцентный краситель SYBR green I в концентрации 0,2х (исходный раствор ШОООх; Molecular Probes). Реакция начиналась с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при 95°С; далее проводилось 45 циклов амплификации (денатурация: 15 сек при 95°С; отжиг: 30 сек при 60°С; синтез: 30 сек при 72°С).

Уровень экспрессии оценивался путем вычисления соотношения относительных количеств копий кДНК гена-мишени и гена-рефери. Для получения данных значений использовался метод построения стандартных кривых (Johnson MR et al., 2000).

Статистический анализ данных

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения SPSS Version 13. Различия считались значимыми при р<0.05. Уровень метилирования промотора каждого гена в каждом образце вычислялся как среднее из метилирования всех исследуемых CG-сайтов (Ст/(Ст+Сит)) и

выражался в %. Двухсторонний непараметрический тест Манна-Уитни использовался для сравнения уровня метилирования 4 генов в разных группах. Сравнение частот гиперметилирования в МРМЖ и БРМЖ проводилось при помощи теста хи-квадрат Пирсона.

Конкордантность по статусу метилирования внутри билатеральных пар опухолей оценивалась по каждому исследованному гену в отдельности. «Конкордантной» считалась пара, в которой обе опухоли были либо гиперметшшрованы (m/m), либо не метилированы (um/um), а «дискордантной», соответственно, пара, состоящая из одной гиперметилированной карциномы и одной опухоли без указанной модификации (m/um). Обнаруженная в эксперименте реальная конкордантность сравнивалась с расчетной величиной.

Ожидаемые величины конкордантности рассчитывались, исходя из следующих посылок: если предположить, что частота события (гиперметилирования) равняется р, то вероятность случайного сочетания двух гиперметилированных опухолей в паре равняется р2. Частота противоположного события - отсутствия метилирования (q) -составляет q=l-p, а вероятность случайного сочетания двух неметилированных опухолей в паре составляет q2. Таким образом, ожидаемое число конкордантных пар (m/m+ um/um) будет равняться p2+q2, а дискордантных (m/um) - 2pq (Imyanitov EN et al., 2ООО). Экспериментальные и расчетные величины сравнивались при помощи теста хи-квадрат Пирсона.

Для оценки корреляций между метилированием четырех генов, а также между метилированием и клинико-биологическими параметрами использовался тест ранговой корреляции Спирмена.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая оценка метилирования генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 в исследуемых группах

Статус метилирования промоторных зон генов ESR1, BRCA1, CCND2, RARb2 был определен в группах билатеральных и монолатеральных опухолей молочной железы, а также в морфологически нормальных образцах ткани этого органа. На рис. 1 представлены примеры паттернов метилирования 4 изучаемых локусов в образцах опухолевой и нормальной ткани.

ESR1 BRCA1 CCND2 RARb2

CG-сайты

Рис. 1. Паттерны метилирования 4 генов в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы (N), монолатеральных (МРМЖ) и билатеральных (БРМЖ) опухолях.

При сравнении трех анализируемых групп при помощи теста Манна-Уитни выяснилось, что уровень метилирования RARb2 и BRCA1 не отличается в МРМЖ, БРМЖ и контроле (рис. 2). Интересные результаты были получены в отношении CCND2 и ESR1: метилирование обоих локусов существенно отличалось между монолатеральными и билатеральными карциномами. Уровень метилирования CCND2 оказался выше в билатеральных опухолях. При детальном сравнении МРМЖ и различных подгрупп БРМЖ обнаружилось, что максимальный вклад в различие между моно- и билатеральными неоплазмами вносят вторые опухоли из метахронных пар (М2). Мы предположили, что обнаруженные различия могут быть связаны с возрастным составом подгрупп (средний возраст в группе М2 - 61.6 лет, в МРМЖ -55.0 лет, в М1 - 46.9 лет). Действительно, анализ зависимости между уровнем

метилирования CCND2 и возрастом выявил слабую, но достоверную корреляцию между этими двумя параметрами (Rsj*arman=0.21, р=0.02) (рис. 3). Ассоциация между статусом CCND2 и возрастом была ранее отмечена в работе 1л SYet al, (2005): средний возраст значительно отличался среди случаев с гиперметилированием CCND2 (67±15 лет) и без него (59±17 лет) (р=0.03).

Уровень метилирования ESR1 был достоверно ниже в билатеральных, чем в монолатеральных карциномах (рис. 2). Наименьший уровень метилирования был выявлен в опухолях М2 (значение медианы 5.7%, диапазон 3.3-34.1%). Для групп М1, сБРМЖ и МРМЖ этот показатель составил 9.0% (диапазон 3.6-15.6%), 9.4% (диапазон 4.4-30.1%) и 12.2% (диапазон 3.2-81.0%), соответственно. Стоит отметить, что уровень изучаемой модификации в билатеральных карциномах (медиана 7.8%, диапазон 3.334.1%) был ниже, чем в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы (медиана 13.0%, диапазон 3.6-28.0%), но различия не достигли статистической достоверности ввиду небольшого размера контрольной группы (N).

При выделении образцов с самыми низкими показателями уровня метилирования (<10%) в отдельную группу, между монолатеральными и билатеральными карциномами выявляется очевидное различие. Доля случаев с «низким» метилированием (<10%) значительно выше в билатеральной группе, чем среди монолатеральных неоплазм (31/52 (60%) vs. 16/68 (24%), р=0.0001).

Интересно, что в упомянутой выше работе Li SY et al. (2005) была показана ассоциация между гиперметилированием ESR1 в опухолях и возрастом менее 60 лет. В нашем исследовании зависимость между возрастом и метилированием ESR1 не была выявлена, что не позволяет объяснить более низкий уровень метилирования в группе БРМЖ большей долей пациенток старшего возраста. Гипометилирование промоторной зоны ESR1 было отмечено в спонтанных опухолях молочной железы у крыс (Yenbutr Р et ai, 1998). В той же работе обнаружилось снижение метилирования гена ER-alpha с возрастом в нормальной молочной железе животных. В исследовании японских ученых Asada Н et al. (2008) наличие гипометилирования дистальной части промотора ESR1 было продемонстрировано в лейомиомах матки. Других упоминаний о снижении метилирования ESR1 в опухолях нам не удалось обнаружить.

Ю- |

■

т8122

МРМЖ БРМЖ N

0-0,001Ж9<*

«Н

МРМЖ СИ5МЖ М1 ™

I' (Мт' I I

3=0,Ш7 : ■■У:

мрмж сбрмж мг

Рис. 2. Сравнение уровня метилирования (вычисленного как среднее из уровней метилирования отдельных СС-локусов внутри фрагмента) ЕЗШ, ВКСА1, ССЫ02, ИАКЬ2 в исследуемых группах и подгруппах. Верхняя и нижняя границы прямоугольников на диаграммах соответствуют первому и третьему квартилям (внутрь прямоугольника попадает 50% наблюдений). Линия внутри прямоугольника соответствует медиане. Линиями сверху и снизу от прямоугольников отмечены максимальное и минимальное значения. Выбросы (значения, отличающиеся от межквартильного размаха более чем в полтора раза) отмечены кружками. Ось К -уровень метилирования, %; ось Х- анализируемые группы. МРМЖ - монолатерачьный РМЖ, БРМЖ - билатеральный РМЖ, N - образцы морфологически нормальной ткани молочной железы, сБРМЖ - синхронный БРМЖ, мБРМЖ - метахронный БРМЖ, М1 -первые опухоли из метахронных пар, М2 - вторые опухоли из метахронных пар.

зо.оон 25,0020,00% 45.00-Ш 10.006.000.00- 12.0010.005 а.оо -о се ю б.оо- 4.002.00- • * • •

................1................1.................1...............1..........Г 30 40 50 ее 70 80 Возраст 1................?................Г................1.................!.................Г 30 40 50 80 70 60 Возраст

20.00- • 25.00-

15.00- сч а г 10.00-о 5.000.00- Я Бч » 0,018 20.002 15.00 а: 5 10.005.00-о.оо- К 3<) Ыеа? " 0,1 Щ

5.............т.............т.............т.............г'".......г.............Г 30 40 50 60 70 ао 90 Возраст Т...........т...........1 Г~.......I..........™!---------Г" 30 40 50 80 70 80 Й0 Возраст

30.0060,00£ ш 40,0020.000.00- 100,00 ао.оо 5 60.00- о £ са 4й,оо-20.00 0,00 » 9 Ч „•

ЗС- Л» 60 60 ?0 60 90 Возраст 1 " 1 1 : Т Г .....Г" 30 40 60 50 60 80 Возраст

70.00 ао.оо- 50.00- О 40.00г ^ 30.0020,00- • й ип«» » О.ОЬ » * * _____, ао.оо-60.00- сч А ОС < 40,00" о. 20.00- ц в ».»♦»<-»гш-в в • , ^ * Ош * *

0,00- 0.00-

Ч........."I........~Т----------1..........1.......--------Г ' —.....Г........Г".....Т--------1---------Г.........г

зо 40 ао ей 70 га за за 40 50 во ?о оо за

Возраст Возраст

Рис. 3. Анализ зависимости уровня метилирования генов ВИСА1, ССЫВ2, ЧАНЬ2 от возраста. А, метилирование 4 генов в образцах морфологически нормальной ткани молочной железы. В, метилирование 4 генов в образцах МРМЖ (черные кружки) и БРМЖ (белые кружки). Ось У -уровень метилирования, %; ось X - возраст, годы.

Частоты гиперметилирования 4 генов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Частоты гиперметширования генов £Ж/, ВИСА1, ССЫй2, ИАИЬ2 в МРМЖ и БРМЖ (сБРМЖ - синхронный БРМЖ, мБРМЖ - метахронный БРМЖ, М1 - первые опухоли из метахронных пар, М2 - вторые опухоли из метахронных пар).

МРМЖ БРМЖ сБРМЖ мБРМЖ Ml М2

ESR1 (nopor=26,8%) 3/68(4%) 2/52(4%) 1/23(4%) 1/29(3%) 0/14(0%) 1/15(7%)

BRCA1 (nopor=11.6%) 3/57(5%) 4/46(9%) 0/17(0%) 4/29(14%) 1/14(7%) 3/15(20%)

CCND2 (nopor=16,7%) 14/64(22%) 20/57(35%) 6/24(25%) 14/33(42%) 4/14(29%) 10/19(53%)*

RARb2 (nopor=21J%) 12/70(17%) 14/69(20%) 6/32(19%) 8/37(22%) 3/15(20%) 5/22(23%)

* Различие по частоте между МРМЖ и М2 статистически достоверное (р=0.02)

Частоты гиперметилирования ESR1, BRCA1 и RARb2 достоверно не отличались во всех рассмотренных группах. Частота гиперметнлирования CCND2 в опухолях М2 значительно превышала таковую в монолатеральных неоплазмах (53% vs. 22%, р=0.02), что согласуется с данными, полученными при сравнении уровня метилирования в этих группах (рис. 2).

Полученные в данном исследовании частоты гиперметнлирования всех 4 генов в МРМЖ и БРМЖ оказались, в целом, ниже большинства опубликованных значений (ESR1: 18% (Bianco Т et ai, 2000), BRCA1: 25% (Archey WB et al., 2002), CCND2: 70% (Lee A et al., 2004), RARb2: 36% (Mehrotra J et al., 2004)). Подобные расхождения могут объясняться несколькими факторами: разными методами анализа и изучаемыми участками, разными подходами к определению порога гиперметилирования и формированию исследуемых групп. В подавляющем большинстве работ, посвященных метилированию (Parrella Р et al., 2004; Li SY et al., 2005; Mehrotra J et al., 2004), использовалась методика метил-чувствительной ПЦР, которая оценивает статус всего 1-2 CG-сайтов по принципу «метилирование есть/нет». Такой подход может привести к завышенной оценке данной модификации, так как присутствие метилцитозина даже в 1% клеток будет расценено как гиперметилирование. Другая возможная причина наблюдаемых расхождений - изучение разных участков промоторных зон. К примеру, достаточно высокая частота метилирования ESR1 (22-66%) была обнаружена при помощи бисульфитного секвенирования в районе -405-1 (Kim SJ et al., 2004; Chang HG

е! а1., 2005), а в настоящем исследовании изучался район гена +94+296. Большое значение имеет выбор порога, разграничивающего высокий и низкий уровень метилирования. В нашей работе для этого использовался достаточно строгий подход: гиперметилированными считались образцы, в которых уровень изучаемой модификации превышал среднее метилирование в норме на величину, большую, чем 2 стандартных отклонения. Наконец, на детектируемую частоту эпигенетических нарушений могут оказывать влияние особенности анализируемых групп (отбор случаев с пониженной экспрессией исследуемого гена, определенной стадией заболевания, включение клеточных линий и др,).

Анализ коикордантности/дискордантноети внутри билатеральных пар опухолей

БРМЖ представляет особый интерес для изучения фундаментальных аспектов опухолевого роста. Парные новообразования развиваются в одном организме в условиях сходного канцерогенного, эндокринного и метаболического окружения. Важным является вопрос, приводит ли воздействие аналогичных экзогенных и эндогенных факторов к одинаковому молекулярному патогенезу двух опухолей. Несколько опубликованных на эту тему исследований содержат заключения о большей степени биологической конкордантности синхронных опухолей по сравнению с метахронными неоплазмами (КоШаз У е! а1., 2004; ¡туапиоу ЕЫ а а1„ 2002; ЗизрШт ЕЫ ¿1 а1„ 2007). В данной работе был проведен анализ конкордантности БРМЖ по статусу метилирования генов ВЯСА1, СС№2, КАЯЬ2. Ни для одного из них

экспериментальные величины не превышали ожидаемые значения конкордантности (рис. 4). Аналогичные результаты были получены как для синхронных, так и для метахронных пар.

^ - конкордантные пары И - дискордантаые пары

Рис. 4. Анализ конкордантности внутри билатерачьных пар опухолей. Т -теоретическое соотношение конкордантных и дискордантных пар, Э -экспериментальное соотношение конкордантных и дискордантных пар. БРМЖ -билатеральный рак молочной железы, сБРМЖ - синхронный БРМЖ, мБРМЖ -метахронный БРМЖ.

Анализ корреляций между метилированием и внутриопухолевой

экспрессией рецепторов эстрогенов (ЭР)

Чтобы оценить влияние изучаемой модификации промоторной зоны гена ЕБЯ1 на экспрессию гормональных рецепторов в опухоли, мы сравнили уровень метилирования в неоплазмах (МРМЖ и БРМЖ), экспрессирующих (п=41) и не экспрессирующих (п=29) ЭР. При анализе ЭР- и ЭР+ групп с помощью теста Манна-Уитни различий в уровне метилирования Е8Я1 выявить не удалось (значения медианы и диапазон уровня метилирования 10.8% (3.6-29.9%) и 10.5% (3.2-34.1%) для ЭР- и ЭР+ групп, соответственно).

Детальный анализ всех 19 тестируемых СС-пар показал, что метилирование лишь одной позиции (+209) слабо ассоциировано с экспрессией ЭР на уровне белка (ЯБреагп,^ "0.31, р=0.03).

Кроме исследования ассоциаций между метилированием Е8К1 и экспрессией

ЭР на уровне белка, было дополнительно проведено измерение мРНК ЕБЯ1. При

помощи ПЦР в режиме реального времени экспрессия мРНК ESR1 была определена в 33 случаях РМЖ. Метилирование ESR1 достоверно не отличалось в случаях с высокой (п=17) и низкой (п=16) экспрессией мРНК (медиана и диапазон уровня метилирования 11.5% (5.1-26.4%) и 11.2% (4.4-16.4%), соответственно, р=0.5Э).

Таким образом, нам не удалось выявить зависимости между метилированием и экспрессией ЭР на уровне мРНК или белка. Отсутствие подобных корреляций до этого было отмечено в нескольких работах (Hon М et al., ¡999; Widschwendter М et al., 2004; Müller HM et al., 2003). Одна из вероятных причин отсутствия связи между изученной модификацией ESR1 и ЭР-статусом в данном исследовании - низкая частота гиперметилирования (гиперметилирование было обнаружено в 5 из 120 проанализированных опухолей МРМЖ и БРМЖ). Возможно, что для оказания ингибирующего эффекта на транскрипцию требуется достижение некоего порогового уровня метилирования, а колебания ниже этого уровня существенно не сказываются на экспрессии. В такой ситуации имеющихся данных (5 случаев с гиперметилированием) оказывается недостаточно для корректного анализа. К сожалению, из 5 выявленных образцов РМЖ с высоким уровнем метилирования только для 2 имелись данные по ЭР-сгатусу. Один из этих случаев был ЭР-позитивным, другой - ЭР-негативным. С другой стороны, метилирование ДНК не является единственным и достаточным условием для выключения транскрипции гена. В регуляции экспрессии ESRI задействован целый ряд транскрипционных, гормональных и ростовых факторов (Pinzone JJ et al., 2004). Альтернативный вариант контроля уровня белка - взаимодействие информационной РНК с регуляторными молекулами из класса микроРНК. К примеру, недавно была показана способность микроРНК miR-206 иигибировать экспрессию ЭР (Adams BD et al., 2007). Кроме того, в регуляции транскрипции ESR1 могут принимать участие другие районы гена и другие промоторы (Kos М et al., 2001), не рассматриваемые в настоящей работе.

Анализ корреляций между метилированием генов ESRI, BRCA1, CCND2, RARb2 при РМЖ

При анализе корреляций между метилированием разных генов была зафиксирована связь между эпигенетическим статусом ESR1 и BRCA1 (RsPcarman=0.33, р=0.001). В группе с низким уровнем метилирования ESR1 доля опухолей с гиперметилированием BRCA1 оказалась значительно меньше, чем среди РМЖ с гиперметилированием ESR1 (4/88 (5%) vs. 2/5 (40%), р=0.03). Одна из интересных особенностей гена BRCA1 заключается в том, что нарушение его функции

(наследственные мутации) приводит к развитию опухолей в эстроген-регулируемых органах - молочной железе и яичниках. Такая «органоспецифичность» гена предполагает существование взаимосвязи между BRCA1 и гормональной регуляцией при РМЖ. Некоторые аспекты взаимодействия BRCA1 и ESR1 были недавно описаны в работе Gorski JJ et al, (2009). Во-первых, эстрогенная стимуляция увеличивает экспрессию BRCA1 на уровне РНК. Во-вторых, BRCA1 угнетает способность ESR1 активировать транскрипцию генов-мишеней. Предполагается, что в норме BRCA1-опосредованная репрессия трансактивационной способности ESR1 снижает эстроген-зависимую пролиферацию в молочной железе и яичниках. В-третьих, BRCA1, помимо ингибирования функций ER-alpha, обладает способностью усиливать транскрипцию мРНК ESR1. Этот последний эффект позволяет объяснить отсутствие экспрессии ЭР в BRCAl-ассоциированных РМЖ. Таким образом, существует зависимость между ESR1 и BRCA1 на уровне РНК, а нами была обнаружена ассоциация двух генов на уровне метилирования. Сильная корреляция между метилированием ESR1 и BRCA1 была отмечена в нескольких работах (Mina S et al., 2007; Wei M et ai, 2007). Механизм данной связи не совсем понятен. Возможно, общие нарушения эпигенетической регуляции неслучайным образом приводят к одновременному «выключению» ESR1 и BRCA1 при РМЖ.

Слабая корреляция также была обнаружена между статусом метилирования генов CCND2 и RARb2 (Rspearman=0.26, р=0.005). Других корреляций между статусом метилирования четырех генов не было выявлено.

Анализ ассоциаций между метилированием и клпнико-биологнческимн характеристиками опухолей молочной железы

Анализ ассоциаций между метилированием и молекулярными и клиническими параметрами позволил выявить большую встречаемость гиперметилирования CCND2 в люминальном экспрессионном подтипе РМЖ. Гиперметилирование CCND2 было обнаружено в 11/20 (55%) люминальных и ни в одной из 8 базальных карцином (р=0.01). Люминальный вариант по сравнению с базальным отличается относительно благоприятным прогнозом. Любопытно, что при новообразованиях других локализаций (рак яичника, простаты, нейробластома) разными авторами была зафиксирована ассоциация гиперметилирования CCND2 с плохим прогнозом (Sakuma М et ai, 2007; Rosenbaum Е et al., 2005; Alaminos M et al., 2004).

Другая обнаруженная корреляция касается статуса гена BRCA1 и степени дифференцировки опухоли (Rspearm¡m=0.48, р=0.002). Уровень метилирования BRCA1

увеличивался по мере уменьшения степени дифференцировки (значения медианы и диапазон уровня метилирования составили 3.5% (2.5-7.4%), 3.9% (2.3-13.3%) и 6.5% (4.4-14.5%) в опухолях Gl, G2 и G3, соответственно). Данное наблюдение согласуется с результатами Birgisdottir Vet al. (2006) и Wei М et al. (2005).

Метилирование ESR1 слабо коррелировало с размером новообразования (Rspeamnn= -0.26, р=0.009). Корреляций между метилированием и другими клинико-биологическими параметрами выявлено не было.

ВЫВОДЫ

1) Билатеральные опухоли молочной железы не отличаются от монолатеральных по уровню метилирования и частоте гиперметилирования генов BRCA1, CCND2, RARb2 (частоты гиперметилирования этих генов в МРМЖ и БРМЖ составляют 5% и 9%, 22% и 35%, 17% и 20%, соответственно).

2) Билатеральные опухоли молочной железы отличаются от монолатеральных по уровню метилирования промотора гена ESR1. Среди билатеральных карцином значительно выше доля случаев с низким уровнем метилирования (встречаемость низкого (менее 10%) уровня метилирования при МРМЖ и БРМЖ составляет 16/68 (24%) и 31/52 (60%), соответственно, р=0.0001).

4) Метилирование четырех изученных генов не проявляет тенденции к повышенной конкордантности в парных билатеральных опухолях молочной железы. Данное наблюдение ставит под сомнение критическую роль эпигенетических нарушений в патогенезе БРМЖ.

5) Метилирование гена BRCA1 коррелирует со степенью дифференцировки опухоли: уровень метилирования возрастает с уменьшением степени дифференцировки (RSp<;annan=0.48, р=0.002).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Иевлева А.Г.. Ronneberg J.A., Tost J., Kristensen V., Borresen-Dale A.L. Анализ метилирования генов CCND2, ESR1, BRCA1, RARb2 в билатеральных опухолях молочной железы // Вопросы онкологии. - 2009. - Т. 55. - Приложение: Тезисы 5-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения -2009», Санкт-Петербург, 17 апреля 2009 г. - С. 19.

2) Соколенко А.П., Розанов М.Е., Митюшкина Н.В., Шерина Н.Ю., Иевлева А.Г.. Чекмарева Е.В., Буслов К.Г., Шилов Е.С., Того A.B., Бит-Сава Е.М., Воскресенский Д.А., Чагунава О.Л., Трофимов Д.Ю., Коваленко С.П., Devilee Р., Cornelisse С., Семиглазов В.Ф., Имянитов E.H. Наследственные мутации при ранних, семейных и билатеральных формах рака молочной железы у пациенток из России // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - №3 (27). - С. 43-49.

3) Kuligina E.S., Sokolenko А.Р., lyevleva A.G.. Buslov K.G., Togo A.V., Matsko D.E., Baelde HJ., Jordanova E.S., Cornelisse C.J., Imyanitov E.N. Molecular classification of bilateral breast carcinomas: Similarity of expression subtypes in synchronous but not metachronous tumors // Proceedings of AACR Annual Meeting, San Diego, California, 12-16 April 2008. - Abstract number 1724.

4) lyevleva A.G.. Sokolenko A.P., Rozanov M.E., Mitiushkina N.V., Sherina N.Y., Chekmariova E.V., Buslov K.G., Shilov E.S., Togo A.V., Bit-Sava E.M., Voskresenskiy D.A., Chagunava O.L., Devilee P., Cornelisse C., Semiglazov V.F., Imyanitov E.N. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia // Proceedings of AACR Annual Meeting, Los Angeles, California, 14-18 April 2007. - Abstract number 806.

5) Кулигина Е.Ш., Соколенко А.П., Иевлева А.Г.. Буслов К.Г., Того A.B., Мацко Д.Е., Cornelisse С., Имянитов Е.И. Экспрессионные профили билатеральных карцином молочной железы: конкордантность или дискордантность? // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53. - Приложение: Тезисы 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007», Санкт-Петербург, 20 апреля 2007 г.-С. 16.

6) Sokolenko А.Р., Mitiushkina N.V., Buslov K.G., Bit-Sava E.M., lyevleva A.G.. Chekmariova E.V., Kuligina E.Sh., Ulibina Y.M., Rozanov M.E., Suspitsin E.N., Matsko D.E., Chagunava O.L., Trofimov D.Yu., Devilee P., Cornelisse C„ Togo A.V., Semiglazov V.F., Imyanitov E.N. High frequency of BRCA1 5382insC mutation in Russian breast cancer patients II Eur J Cancer. - 2006. - V. 42. - P. 1380-1384.

7) Buslov K.G., lyevleva A.G.. Chekmariova E.V., Suspitsin E.N., Togo A.V., Kuligina E.Sh., Sokolenko A.P., Matsko D.E., Turkevich E.A., Lazareva Y.R., Chagunava O.L., Bit-Sava E.M., Semiglazov V.F., Devilee P., Cornelisse C., Hanson K.P., Imyanitov E.N. NBS1 657del5 mutation may contribute only to a limited fraction of breast cancer cases in Russia II Int J Cancer. - 2005. - V. 114. - P. 585-589.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю сердечную признательность научному руководителю диссертационной работы профессору Имянитову Евгению Наумовичу за мудрое руководство и ценные рекомендации. Искренне признательна сотрудникам патологоанатомической лаборатории за содействие в наборе архивного патоморфологического материала. Приношу сердечную благодарность сотрудникам отдела генетики норвежского центра Norwegian Radium Hospital (Oslo) за помощь в выполнении анализа метилирования. Приношу глубокую благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной онкологии - своим друзьям и коллегам - за помощь в выполнении работы.

Подписано в печать «29» октября 2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 4-175

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Оглавление диссертации Иевлева, Аглая Геннадиевна :: 2009 :: Санкт-Петербург

Оглавление

Список используемых сокращений и терминов

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Метилирование ДНК в норме и в опухолях

1.1.1. Распределение метилированных и неметилированных оснований в геноме

1.1.2. ДНК-метилтрансферазы

1.1.3. Механизмы репрессии транскрипции

1.1.4. Основные функции метилирования в норме

1.1.5. Нарушения метилирования в опухолях

1.2. Нарушения метилирования при раке молочной железы

1.2.1. Метилирование ЕБЮ при РМЖ

1.2.2. Метилирование ВКСА1 при РМЖ

1.2.3. Метилирование <ХЖ)2 при РМЖ

1.2.4. Метилирование ЯАЯЬ2 при РМЖ

1.3. Билатеральный рак молочной железы

1.3.1. Эпидемиологические и клинические характеристики БРМЖ

1.3.2. Изучение конкордантности/дискордантности молекулярных нарушений при БРМЖ

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Исследуемые группы

2.2. Выделение ДНК

2.3. Выбор генов для исследования

2.4. Анализ метилирования ДНК

2.4.1. Бисульфитная обработка ДНК

2.4.2. Пиросеквенирование

2.5. Определение экспрессии мРНК ЕБШ

2.5.1. Выделение РНК

2.5.2. ПЦР в режиме реального времени

2.6. Статистический анализ данных

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1. Общая оценка метилирования генов Е8Я1, ВЯСА1, ССЫЭ2, КАЯЬ в исследуемых группах

3.2. Анализ корреляций между метилированием и возрастом

3.3. Анализ конкордантности/дискордантности внутри билатеральных пар опухолей

3.4. Анализ корреляций между метилированием ЕБЮ и внутриопухолевой экспрессией рецепторов эстрогенов

3.5. Анализ корреляций между метилированием генов ЕБЮ, ВЯСА1,

ССЫ02, КАЯЬ2 при РМЖ

3.6. Анализ ассоциаций между метилированием и клинико-биологическими характеристиками опухолей молочной железы

Глава 4. Обсуждение результатов исследования

Выводы

Введение диссертации по теме "Онкология", Иевлева, Аглая Геннадиевна, автореферат

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) является самой распространенной онкологической патологией у женщин. На сегодняшний день довольно подробно изучены спектр и частота молекулярно-генетических нарушений при РМЖ. Вместе с тем, наряду с аномалиями на уровне генома, внимание современных исследователей привлекают изменения эпигенетических процессов, к которым относится метилирование ДНК. Метилирование цитозина в составе так называемых "CpG-островков" активирует деацетилирование гистонов, что, в свою очередь, приводит к изменению конфигурации хроматина и локальному подавлению транскрипции (Ng НН, Bird А, 1999). CpG-островки« представляют собой короткие участки в промоторных областях генов, содержащие повышенное по сравнению с остальным геномом число CG-динуклеотидов; эти районы практически всегда не метилированы в нормальных клетках.

Для опухолей характерен дисбаланс эпигенетической регуляции: на(фоне глобального гипометилирования наблюдается гиперметилирование промоторных областей множества генов. Для» новообразований' разных локализаций, включая РМЖ, установлены специфичные профили метилирования^ (С os te Но JF et al, 2000).

Во многих случаях гиперметилирование является причиной инактивации супрессорных генов (Jones PA and Baylin SB, 2002; Herman JG and Baylin SB, 2003). В соответствии с классической моделью Knudson'a, функция одного из аллелей гена-супрессора может быть» подавлена вследствие метилирования, а другого — за счет точковой мутации или делеции (Plass С, Soloway PD, 2002). В отличие от мутаций, необратимо изменяющих первичную структуру ДНК, присоединение метильной группы к основаниям потенциально обратимо. Этот факт лег в основу разработок терапии, направленной на восстановление нормальной картины метилирования и, соответственно, экспрессии антионкогенов (Herman JG and Baylin SB, 2003).

По данным Li S et al. (2005), ER-alpha гиперметилирован в 84% РМЖ. Определение экспрессии рецепторов эстрогенов (ЭР) в опухолевой ткани остается одним из наиболее важных параметров при определении прогноза заболевания и выборе лечебной тактики. Приблизительно треть опухолей не содержит рецепторов стероидных гормонов на момент диагноза, кроме того, фракция изначально ЭР-положительных карцином перестает экспрессировать их в ходе прогрессирования. Между тем, причины нарушений экспрессии рецепторов эстрогенов пока еще во многом неясны. Некоторые исследования указывают на ассоциацию гиперметилирования, промотора гена ESR1 с потерей его транскрипции (Weigel RJ, deConinck ЕС, 1993; Kim SJ et al., 2004).

Мутации в антионкогене BRCA1 обуславливают до 10-15% наследственных карцином молочной железы. В спорадических случаях, напротив, соматические мутации встречаются,чрезвычайно редко. Тем не менее, такие факты, как высокая^ частота потерь гетерозиготности (LOH — Loss of Heterozygosity) в этом локусе и снижение экспрессии BRCA1 в «несемейных» РМЖ, свидетельствуют об участии этого гена и в развитии ненаследственных неоплазий. На сегодняшний^ день доказано, что гиперметилирование промотора принадлежит к числу возможных способов инактивации BRCA1 (Esteller М et al., 2000).

Еще одной частой мишенью эпигенетических нарушений является ген циклина D2 (CCND2). CCND2 вместе с другими D-циклинами отвечает за переход от S1- к G-фазе клеточного цикла путем активации циклин-зависимых киназ, фосфорилирования белка RB1 ^накопления транскрипционных факторов. Кроме того, он обладает и альтернативной антипролиферативной активностью (Meyyappan М et al., 1998). Возможно, угнетение именно этой супрессорной-функции при метилировании промотора CCND2 имеет значение в патогенезе РМЖ.

Цели и задачи исследования

1) Сравнить уровни метилирования и частоты гиперметилирования генов Е8Я1, ВЯСА1, ССКБ2, КАШэ2 в билатеральных и монолатеральных опухолях молочной железы

2) Провести анализ конкордантности/дискордантности изучаемых« явлений в парных образцах БРМЖ

3) Сопоставить данные о метилировании, гена Е8Я1 при РМЖ с информацией об экспрессии рецепторов эстрогенов на уровне РНК и белка в тех-же опухолях

4) Провести анализ корреляций между статусом метилирования генов ЕБШ, ВЫСА1, ССИВ2, КАШ>2

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые изучены профиль и частота гиперметилирования генов Е8Я1, ВКСА1, ССКБ2, 11А11Ь2 при БРМЖ. Также проведено сравнение частот изученных явлений между монолатеральными и билатеральными опухолями.

Практическая значимость

Полученные данные об эпигенетических нарушениях при >билатеральной форме РМЖ дополняют «молекулярный портрет» БРМЖ и вносят вклад в понимание его патогенеза. В дальнейшем эта информация может быть использована при разработке новых принципов противоопухолевой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1)- Билатеральные опухоли молочной железы не отличаются от монолатеральных по уровню метилирования и по частоте гиперметилирования генов BRCA1, CCND2, RARb2.

2) Билатеральные опухоли молочной железы отличаются от монолатеральных по уровню метилирования промотора гена- ESR1. В билатеральных-карциномах1 значительно выше доля случаев, с низким, (<10%) уровнем метилирования.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на научной межлабораторной конференции НИИ онкологии им. H.H. Петрова (22 декабря 2008 г., Санкт-Петербург, Россия), на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения — 2009» (17 апреля 2009 г., Санкт-Петербург, Россия).

Структура и объем диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль гиперметилирования генов в патогенезе билатеральных опухолей молочной железы"

выводы

Билатеральные опухоли молочной железы не отличаются от монолатеральных по уровню метилирования и частоте гиперметилирования генов ВКСА1, ССЫБ2, ЯАКЬ2 (частоты гиперметилирования этих генов в МРМЖ и БРМЖ составляют 5% и 9%, 22% и 35%, 17% и 20%, соответственно).

Билатеральные опухоли молочной железы отличаются от монолатеральных по уровню метилирования промотора гена Е8Ю. Среди билатеральных карцином значительно выше доля случаев с низким уровнем метилирования (встречаемость низкого (менее 10%) уровня метилирования при МРМЖ и БРМЖ составляет 16/68 (24%) и 31/52 (60%), соответственно, р=0.0001).

Гиперметилирование промотора гена ЕБЮ является редким событием при раке молочной железы (частота составляет 4% в монолатеральных и 4% в билатеральных карциномах). Колебания уровня метилирования' ниже порога гиперметилирования не ассоциированы с изменением экспрессии рецепторов эстрогенов.

Метилирование четырех изученных генов не проявляет тенденции к повышенной конкордантности в парных билатеральных опухолях молочной железы. Данное наблюдение ставит под сомнение, критическую роль рассматриваемых эпигенетических нарушений в патогенезе БРМЖ.

Статус метилирования гена ЕБШ коррелирует со статусом метилирования гена ВКСА1 (КБреагшап—0.33, р=0.001). Метилирование гена ВЯСА1 коррелирует со степенью дифференцировки опухоли: уровень метилирования возрастает с уменьшением степени дифференцировки (К8реагтап=0.48, р=0.002).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Иевлева, Аглая Геннадиевна

1. Берштейн Л.М. Гормональный канцерогенез // СПб.: Наука, 2000. 2001. С.

2. Бурцева H.H., Азизов Ю.М., Иткнн Б.З., Ванюшин Б.Ф. Изменение метилирования ДНК лимфоцитов крупного рогатого скота при хроническом лимфолейкозе // Биохимия. 1977. - Т. 42. - С. 1690-1696.

3. Имянитов E.H., Хансон К.П. Эпидемиология и биология билатерального рака молочной железы // Лекции по фундаментальной и клинической онкологии / Под ред. Моисеенко В.М., Урманчеевой А.Ф., Хансона К.П. СПб.: Издательство Н-Л, 2004.-С. 51-69.

4. Моисеенко В.М., Семиглазов В.Ф:, Тюляндин С.А. Современное лекарственное лечение местно-распространенного и метастатического рака молочной железы // СПб.: Грифон, 1997. 253 С.

5. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия. 2005. - Т. 70. - С. 900-911.

6. Семиглазов В.Ф., Попова Р.Т. Диагностика билатерального рака молочной железы // Первично-множественные злокачественные опухоли / Под ред. Н.П. Напалкова, Я.В. Бохмана, В.Ф. Семиглазова. Л., 1987. - С. 7-16.

7. Ahuja N, Issa JP. Aging, methylation and cancer // Histol Histopathol. -2000.-V. 15.-P. 835-842.

8. Ahuja N, Li Q, Mohan AL, Baylin SB and Issa J-PJ. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer // Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 54895494.

9. Alaminos M, Davalos V, Cheung NK, Gerald WL, Esteller M. Clustering of gene hypermethylation associated with clinical risk groups in neuroblastoma // J Natl Cancer Inst. 2004. V. 96. - P. 1208-1219.

10. Allaman-Pillet N, DjemaT A, Bonny C, Schorderet DF. Methylation status of CpG sites and methyl-CpG binding proteins are involved in the promoter regulation of the mouse Xist gene // Gene Expr. 1998. - V. 7. - P. 61-73.

11. Archey WB, McEachern KA, Robson M, Offit K, Vaziri SA, Casey G, Borg A, Arrick BA. Increased CpG methylation of the estrogen receptor gene in BRCA1— linked estrogen receptor-negative breast cancers // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 7034-7041.

12. Asada H, Yamagata Y, Taketani T, Matsuoka A, Tamura H, Hattori N, Ohgane J, Hattori N, Shiota K, Sugino N. Potential link between estrogen^ receptor-alpha gene hypomethylation and uterine fibroid formation // Mol Hum Reprod. 2008. -V. 14.-P. 539-545.

13. Bae YK, Brown A, Garrett E, Bornman D, Fackler MJ, Sukumar S, Herman JG, Gabrielson E: Hypermethylation in histologically distinct classes of breast cancer // Clin Cancer Res. 2004. - V. 10. - P. 5998-6005.

14. Ballestar E, Esteller M. Methyl-CpG-binding proteins in cancer: blaming the DNA methylation messenger // Biochem Cell Biol. 2005. - V. 83. - P. 374-384.

15. Ballestar E, Paz MF, Valle L, Wei S, Fraga MF, Espada J, Cigudosa JC, Huang TH, Esteller M. Methyl-CpG binding proteins identify novel sites of epigenetic inactivation in human cancer // EMBO J. 2003. - V. 22. - P. 6335-6345.

16. Baylin SB, Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics // Trends Genet. 2000. - V. 16. - P. 168-174.

17. Bednarik DP. DNA methylation and retrovirus expression // EXS. 1993. -V. 64. - P. 300-329.

18. Bergman Y, Cedar H. A stepwise epigenetic process controls immunoglobulin allelic exclusion // Nat Rev Immunol. 2004. - V. 4. - P. 753-761.

19. Bird A, Tweedie S. Transcriptional noise and the evolution of gene number // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1995. - V. 349. - P. 249-253.

20. Bird A. DNA methylation patterns and'epigenetic memory // Genes Dev. — 2002.-V. 16.-P. 6-21.

21. Birgisdottir V, Stefansson OA, Bodvarsdottir SK, Hilmarsdottir H, Jonasson JG, Eyfjord JE. Epigenetic silencing and deletion of the BRCA1 gene in sporadic breast cancer // Breast Cancer Res. 2006. V. 8(4):R38.

22. Bock C, Paulsen M, Tierling S, Mikeska T, Lengauer T, Walter J. CpG Island Methylation in Human Lymphocytes Is Highly Correlated with DNA Sequence, Repeats, and Predicted DNA Structure // PLoS Genetics. 2006. - V. 2(3): e26.

23. Bonanni B, Lazzeroni M. Retinoids and breast cancer prevention // Recent Results Cancer Res. 2009. - V. 181. - P. 77-82.

24. Bovenzi V, Le NL, Cote S, Sinnett D, Momparler LF, Momparler RL. DNA methylation of retinoic acid receptor beta in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2'-deoxycytidine // Anticancer Drugs. 1999. - V. 10/ - P. 471-476.

25. Buckley MF, Sweeney KJ, Hamilton JA, Sini RL, Manning DL, Nicholson RI, deFazio A, Watts CK, Musgrove EA, Sutherland RL. Expression and amplification of cyclin genes in human breast cancer // Oncogene. 1993. - V. 8. - P. 2127-2133.

26. Chang HG, Kim SJ, Chung KW, Noh DY, Kwon Y, Lee ES, Kang HS. Tamoxifen-resistant breast cancers show less frequent methylation of the estrogen receptor beta but not the estrogen receptor alpha gene // J Mol Med. 2005. - Y. 83. -P. 132-139.

27. Chaudary MA, Millis RR, Hoskins EO^ Haider M, Bulbrook RD, Cuzick J, Hayward JL. Bilateral primary breast cancer: a prospective study of disease incidence // Br J Surg.- 1984.-V. 71.-P. 711-714.

28. Chen T, Li E. Establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mammals // Curr Top Microbiol Immunol. 2006. - V. 301. - P. 179-201.

29. Chen Y, Thompson W, Semenciw R, Mao Y. Epidemiology of contralateral breast cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1999. - V. 8. - P. 855-861.

30. Chow JC, Yen Z, Ziesche SM, Brown CJ. Silencing of the mammalian X chromosome // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. - V. 6. - P. 69-92.

31. Chu MW, Siegmund KD, Eckstam CL, Kim JY, Yang AS, Kanel GC, Tavare S, Shibata D. Lack of increases in methylation at three CpG-rich genomic loci in non-mitotic adult tissues during aging // BMC Med Genet. 2007. - Y. 8:50.

32. Clark SJ. Action at a distance: epigenetic silencing of large chromosomal regions in carcinogenesis // Hum Mo 1 Genet. — 2007. V. 16. - Spec No l:R88-95.

33. Coradini D, Oriana S, Mariani L, Miceli R, Bresciani G, Marubini E, Di Fronzo G. Is steroid receptor' profile in contralateral breast, cancer a marker of independence of the corresponding primary tumour? // Eur J Cancer. 1998. - Y. 34. -P. 825-830.

34. Cross SH, Bird AP. CpG islands and genes // Curr Opin Genet Dev. 1995. -V. 5.-P. 309-314.

35. Cui H, Onyango P, Brandenburg S, Wu Y, Hsieh CL, Feinberg AP. Loss of imprinting in colorectal cancer linked to hypomethylation of HI9 and IGF2 // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 6442-6446.

36. DiNardo DN, Butcher DT, Robinson DP, Archer TK, Rodenhiser DI. Functional analysis of CpG methylation in the BRCA1 promoter region // Oncogene. -2001. V. 20. - P. 5331-5340.

37. Dobrovic A, Simpfendorfer D. Methylation of the BRCA1 gene in sporadic breast cancer // Cancer Res. 1997. - V. 57. - P. 3347-3350.

38. Duthie SM, Nesterova TB, Formstone EJ, Keohane AM, Turner BM, Zakian SM, Brockdorff N. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from autosomal material in eis // Hum Mol Genet. — 1999. -V. 8.-P. 195-204.

39. Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Danenberg PV, Laird PW. CpG island hypermethylation in human colorectal tumors is not associated with DNA methyltransferase overexpression // Cancer Res. 1999. - V. 59. - P. 2302-2306.

40. Ehrlich M, Wang RY. 5-Methylcytosine in eukaryotic DNA // Science. -1981. V. 212. - P. 1350-1357.

41. Ehrlich M. Amount and distribution of 5-me thy Icy to sine in human DNA from different types of tissues or cells // Nucleic Acids Res. 1982. - V. 10, - P. 27092721.

42. Esteller M. Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA hypermethylome // Hum Mol Genet. 2007. - V. 16. - P. 50-59.

43. Fackler MJ, McVeigh M, Evron E, Garrett E, Mehrotra J, Polyak K, Sukumar S, Argani P. DNA methylation of RASSF1A, HIN-1, RAR-beta, Cyclin D2 and Twist in in situ and invasive lobular breast carcinoma // Int J Cancer. — 2003. V. 107. - P. 970-975.

44. Feinberg AP, Gehrke CW, Kuo KC, Ehrlich M. Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia // Cancer Res. — 1988. V. 48. - P. 1159-1161.

45. Feltus FA, Lee EK, Costello JF, Plass C, Vertino PM. DNA motifs associated with aberrant CpG island methylation // Genomics. 2006. - V. 87. - P. 572-579:

46. Fiegl H, Millinger S, Goebel G, Müller-Holzner E, Marth C, Laird PW, Widschwendter M. DNA Methylation Profiles in Cancer Cells and Tumor Stroma: Association with HER-2/neu Status in Primary Breast Cancer // Cancer Res. 2006. -V. 66.-P. 29-33.

47. Fuks F, Hurd PJ, Wolf D, Nan X, Bird AP, Kouzarides T. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation // J Biol Chem. -2003. V. 278. - P. 4035—4040.

48. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo KC, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors // Nucleic Acids Res. 1983. - V. 11. - P. 6883-6894.

49. Giacinti L, Claudio PP, Lopez M, Giordano A. Epigenetic information and estrogen receptor alpha expression in breast cancer // Oncologist. 2006. - V. 11. - P. 1-8.

50. Gopisetty G, Ramachandran K, Singal R. DNA methylation and apoptosis // Mol Immunol. 2006. - V. 43. - P. 1729-1740.

51. Hanstein B, Djahansouzi S, Dall P, Beckmann MW, Bender HG. Insights into the molecular biology of the estrogen receptor define novel therapeutic targets for breast cancer // Eur J Endocrinol. 2004. - V. 150. - P. 243-255.

52. Hartman M, Czene K, Reilly M, Adolfsson J, Bergh J, Adami HO, Dickman PW, Hall P. Incidence and prognosis of synchronous and metachronous bilateral breast cancer // J Clin Oncol. 2007. - V. 25. - P. 4210-4216.

53. Hemminki K, Granstrom C. Morphological types of breast cancer in family members and multiple primary tumours: is morphology genetically determined? // Breast Cancer Res. 2002. - V. 4(4):R7.

54. Herman JG, Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter Hypermethylation // N Engl J Med. 2003. - V. 349. - P. 2042-2054.

55. Holliday R, Pugh JE. DNA modification mechanisms and gene activity during development // Science. 1975. - V. 187. - P. 226-232.

56. Hori M, Iwasaki M, Yoshimi F, Asato Y, Itabashi M. Hypermethylation of the Estrogen Receptor Alpha Gene Is Not Related to Lack of Receptor Protein in Human Breast Cancer // Breast Cancer. 1999. - V. 6. - P. 79-86.

57. Hotchkiss RD. The quantitative separation- of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography // J Biol Chem. 1948. - V. 168. - P. 315-332.

58. Hu XG, Wong IH, Chow LW. Tumor-derived aberrant methylation in plasma of invasive ductal breast cancer patients: clinical implications // Oncol Rep. — 2003. — V. 10.-P. 1811-1815.

59. Imyanitov EN, Hanson KP. Mechanisms of breast cancer // Drug Discov Today: Dis Mech. 2004. - V. 1. - P. 235-245.

60. Issa JP, Ottaviano YL, Celano P, Hamilton. SR, Davidson NE, Baylin SB. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in, the human colon // Nat Genet. 1994. - V. 7. - P. 536-540.

61. Issa JP. CpG island methylator phenotype in cancer // Nat Rev Cancer. -2004.-V. 4.-P. 988-993.

62. Iwase H, Omoto Y, Iwata H, Toy ama T, Hara Y, Ando Y, Ito Y, Fujii Y, Kobayashi S. DNA methylation analysis at distal and proximal promoter regions of the oestrogen receptor gene in breast cancers // Br J Cancer. 1999. - V. 80. - P. 19821986.

63. Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat Genet. 2003. — V. 33. — P. 245-254.

64. Jaenisch R. DNA methylation and imprinting: why bother? // Trends Genet. — 1997.-V. 13.-P. 323-329.

65. Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code // Science 2001, V. 293. -P. 1074-1080.

66. Jerónimo C, Costa I, Martins MC, Monteiro P, Lisboa S, Palmeira C, Henrique R, Teixeira MR, Lopes C. Detection of gene promoter hypermethylation in fine needle washings from breast lesions // Clin Cancer Res. 2003. - V. 9. - P. 34133417.

67. Jobsen JJ, van der Palen J, Ong F, Meerwaldt JH. Synchronous, bilateral breast cancer: prognostic value and incidence // Breast. 2003. - V. 12. — P. 83—88.

68. Johnson MR, Wang K, Smith JB, Heslin MJ, Diasio RB. Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymerase chain reaction // Anal Biochem. 2000. - V. 278. - P. 175-184.

69. Jones PA, Baylin SB. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nat Rev Genet. 2002. - V. 3. - P. 415-428.

70. Jones PL, Veenstra GJ, Wade PA, Vermaak D, Kass SU, Landsberger N, Strouboulis J, Wolffe AP. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription // Nat Genet. 1998. - V. 19. - P. 187-191.

71. Kim GD, Ni J, Kelesoglu N, Roberts RJ, and Pradhan S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine—5) methyltransferases // EMBO J. 2002. - V. 21. - P. 4183-4195.

72. Kim JY, Siegmund KD, Tavare S, Shibata D. Age-related human small intestine methylation: evidence for stem cell niches // BMC Med. 2005. — V. 3. — P. 10-15.

73. Kim JY, Tavare S, Shibata D. Counting human somatic cell replications: Methylation mirrors endometrial stem cell divisions // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. -V. 102.-P. 17739-17744.

74. Kim SJ, Kim TW, Lee SY, Park SJ, Kim HS, Chung-KW, Lee ES, Kang HS. CpG methylation of the ERalpha and ERbeta genes in breast cancer // Int J Mol Med. -2004. V. 14. - P. 289-293.

75. Kollias J, Pinder SE, Denley HE, Ellis IO, Wencyk P, Bell JA, Elston CW, Blarney RW. Phenotypic similarities in bilateral breast cancer // Breast Cancer Res Treat. 2004. - V. 85. - P. 255-261.

76. Kontorovich T, Cohen Y, Nir U, Friedman E. Promoter methylation patterns of ATM, ATR, BRCA1, BRCA2 and P53 as putative cancer risk modifiers in Jewish BRCA1/BRCA2 mutation carriers // Breast Cancer Res Treat. 2009. - V. 116. - P. 195-200.

77. Kopelovich L, Crowell JA, Fay JF. The epigenome as a target for cancer chemoprevention // J Natl Cancer Inst. 2003. - V. 95. - P. 1747-1757.

78. Kos M, Reid G, Denger S, Gannon F. Minireview: genomic organization of the human ERalpha gene promoter region // Mol Endocrinol. 2001. - V. 15. - P. 2057-2063.

79. Kuo WH, Yen AM, Lee PH, Chen KM, Wang J, Chang KJ, Chen TH, Tsau HS. Cumulative survival in early-onset unilateral and bilateral breast cancer: an analysis of 1907 Taiwanese women // Br J Cancer. 2009. - V. 100. - P. 563-570.

80. Kwabi-Addo B, Chung W, Shen L, Ittmann M, Wheeler T, Jelinek J, Issa JP. Age-related DNA methylation changes in normal human prostate tissues // Clin Cancer Res. 2007. - V. 13. - P. 3796-3802.

81. Lapidus RG, Nass SJ and Davidson NE. The loss of estrogen and progesterone receptor gene expression in human breast cancer // J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1998. - V. 3. - P. 85-94.

82. Lee A, Kim Y, Han K, Kang CS, Jeon HM, Shim SI. Detection of tumor markers including carcinoembryonic antigen, APC, and cyclin D2 in< fine-needle aspiration fluid of breast // Arch Pathol Lab Med. 2004. - V. 128. - P. 1251-1256.

83. Lehmann U, Ahrens P, Wingen LU, Schlegelberger B, Länger F, Kreipe H. Hypermethylation of cyclin D2 and DAP kinase is associated with the lobular subtype of breast cancer // Breast Cancer Res. 2005. - V. 7(Suppl 2):P4.16.

84. Lehmann U, Länger F, Feist H, Glöckner S, Hasemeier B, Kreipe H. Quantitative assessment of promoter hypermethylation during breast cancer development // Am J Pathol. 2002. - V. 160. - P. 605-612.

85. Lewis CM, Cler LR, Bu DW, Zöchbauer-Müller S, Milchgrub S, Naftalis EZ, Leitch AM, Minna JD, Euhus DM. Promoter hypermethylation in benign breast epithelium in relation to predicted breast cancer risk // Clin Cancer Res. 2005. - V. 11. -P. 166-172.

86. Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs // Bioinformatics. -2002. V. 18.-P. 1427-1431.

87. Li S, Rong M, Iacopetta B. DNA hypermethylation in breast cancer and its association with clinicopathological features // Cancer Lett. 2006. - V. 237. - P.' 272280.

88. Li SY, Rong M, Iacopetta B. DNA hypermethylation in breast cancer and its association with clinicopathological features // Cancer Lett. — 2006. V. 237. - P. 272-280.

89. Mancini DN, Rodenhiser DI, Ainsworth PJ, O'Malley FP, Singh SM, Xing W, Archer TK. CpG methylation within the 5' regulatory region of the BRCA1 gene is tumor specific and includes a putative CREB binding site // Oncogene. 1998. - V. 16. -P. 1161-1169.

90. Matros E, Wang ZC, Lodeiro G, Mirón A, Iglehart JD, Richardson AL. BRCA1 promoter methylation in sporadic breast tumors: relationship to gene expression profiles // Breast Cancer Res Treat. 2005. - V. 91. - P. 179-186.

91. Meyyappan M, Atadja PW, Riabowol KT. Regulation of gene expression and transcription factor binding activity during cellular aging-// Biol Signals. 1996. — V. 5.-P. 130-138.

92. Meyyappan M, Wong H, Hull C, Riabowol KT. Increased expression of cyclin D2 during multiple states of growth arrest in primary and established cells // Mol Cell Biol. 1998.-V. 18.-P. 3163-3172.

93. Miremadi A, Oestergaard MZ, Pharoah PD, Caldas-.C. Cancer genetics of epigenetic genes // Hum Mol Genet. 2007. - V. 16. - Spec No 1 :R28-49.

94. Mirza S, Sharma G, Prasad CP, Parshad R, Srivastava A, Gupta SD, Raihan R. Promoter hypermethylation of TMS1, BRCA1, ERalpha and PRB in serum and tumor DNA of invasive ductal breast carcinoma patients // Life Sei. 2007. - V. 81. - P. 280-287.

95. Müller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Widschwendter M. DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker // Cancer Res. 2003. - V. 63. — P. 7641-7645.

96. Ng HH, Bird A. DNA methylation and, chromatin modification // Curr Opin Genet Dev. 1999. - V. 9. - P. 158-163.

97. Niwa Y, Oyama T, Nakajima T. BRCA1 expression status in relation to DNA methylation of the BRCA1 promoter region in sporadic breast cancers // Jpn J Cancer Res. 2000. - V. 91. - P. 519-526.

98. Noguchi S, Motomura K, Inaji H, Imaoka S, Koyama H. Differentiation of primary and secondary breast cancer with clonal analysis // Surgery. 1994. — V. 115.— P. 458-462.

99. Novak P, Jensen T, Oshiro MM; Watts GS, Kim CJ, Futscher BW. Agglomerative epigenetic aberrations are a common event in human breast cancer // Cancer Res. 2008. - V. 15. - P. 8616-8625.

100. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development // Cell. 1999. - V. 99. - P. 247-257.

101. Okano M, Xie S, Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases // Nat Genet. 1998. - Y. 19. - P. 219-220.

102. Osin P, Lu YJ, Stone J, Crook T, Houlston RS, Gasco M, Gusterson BA, Shipley J. Distinct genetic and epigenetic changes in medullary breast cancer // Int J Surg Pathol.-2003.-Y. 11.-P. 153-158.

103. Ottaviano YL, Issa JP, Pari FF, Smith HS, Baylin SB, Davidson NE. Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells // Cancer Res. 1994. - V. 54. - P. 2552-2555.

104. Pinzone JJ, Stevenson H, Strobl JS, Berg PE. Molecular and cellular determinants of estrogen receptor alpha expression // Mol Cell Biol. 2004. - V. 24. -P.4605-4612.

105. Plass C, Soloway PD. DNA methylation, imprinting and cancer // Eur J Hum Genet. 2002. - V. 10. - P. 6-16.

106. Qu GZ, Grundy PE, Narayan A, Ehrlich M. Frequent hypomethylation in Wilms tumors of pericentromeric DNA in chromosomes 1 and 16 // Cancer Genet Cytogenet. 1999. -V. 109. - P. 34-39.

107. Razin A, Riggs AD. DNA methylation and gene function // Science. — 1980.-V. 210.-P. 604-610.

108. Rhee I, Bachman KE, Park BH, Jair KW, Yen RW, Schuebel KE, Cui H, Feinberg AP, Lengauer C, Kinzler KW, Baylin SB, Vogelstein B. DNMT1 and DNMT3B cooperate to silence genes in human cancer cells // Nature. — 2002. V. 416. -P. 552-556.

109. Rhee I, Jair KW, Yen RW, Lengauer C, Herman JG, Kinzler KW, Vogelstein B, Baylin SB, Schuebel KE. CpG methylation is maintained in human cancer cells lacking DNMT1 // Nature. 2000. - V. 404. - P. 1003-1007.

110. Rice JC, Futscher BW. Transcriptional repression of BRCA1 by aberrant cytosine methylation, histone hypoacetylation and chromatin condensation of the BRCA1 promoter // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 3233-3239.

111. Rice JC, Massey-Brown KS, Futscher BW. Aberrant methylation of the BRCA1 CpG island promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA in sporadic breast cancer cells // Oncogene. 1998. - V. 17. - P. 1807-1812.

112. Rideout WM 3, Coetzee GA, Olumi AF, Jones PA. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen,in the human LDL receptor and p53 genes // Science. 1990. -V. 249.-P. 1288-1290.

113. Riggs AD, Xiong Z, Wang L, LeBon JM: Methylation dynamics, epigenetic fidelity and X chromosome structure // Novartis Found Symp. — 1998. V. 214.-P. 214-232.

114. Roll JD, Rivenbark AG, Jones WD, Coleman WB. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines // Molecular Cancer. 2007. - V. 7. - P. 15.

115. Russnes HG, Kuligina ESh, Suspitsin EN, Jordanova ES, Cornelisse CJ, Borresen-Dale AL, Imyanitov EN. Paired distribution of molecular subtypes in bilateral breast carcinomas. Article in press.

116. Russo VEA, Martienssen RA, Riggs AD. Epigenetic mechanisms of gene regulation // Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1996. — 693 p.

117. Sakuma M, Akahira J, Ito K, Niikura H, Moriya T, Okamura K, Sasano H, Yaegashi N. Promoter methylation status of the Cyclin D2 gene is associated with poor prognosis in human epithelial ovarian cancer // Cancer Sci. 2007. — V. 98. - P. 380386.

118. Sharma G, Mirza S, Prasad' CP, Srivastava A, Gupta SD, Ralhan R. Promoter hypermethylation of pl6INK4A, pl4ARF, CyclinD2 and Slit2 in serum and tumor DNA from breast cancer patients // Life Sci. 2007. - V. 80. - P. 1873-1881.

119. Shibata A, Tsai YC, Press MF, Henderson BE, Jones PA, Ross RK. Clonal analysis of bilateral breast cancer // Clin Cancer Res. 1996. - V. 2. - P. 743-748.

120. Shinozaki M, Hoon DS, Giuliano AE, Hansen NM, Wang HJ, Turner R, Taback B. Distinct hypermethylation profile of primary breast cancer is associated with sentinel lymph node metastasis // Clin Cancer Res. 2005. - V. 11. - P. 2156-2162.

121. So K, Tamura G, Honda T, Homma N, Waki T, Togawa N, Nishizuka S, Motoyama T. Multiple tumor suppressor genes are increasingly methylated with age in non-neoplastic gastric epithelia // Cancer sei. 2006. - V. 97. - P. 1155-1158.

122. Stimson KM, Vertino PM. Methylation-mediated silencing of TMS1/ASC is accompanied by histone hypoacetylation and CpG island-localized changes in chromatin architecture // J Biol Chem. 2002. - V. 277. - P. 4951-4958.

123. Sunami E, Shinozaki M, Sim MS, Nguyen SL, Vu AT, Giuliano AE, Hoon DS. Estrogen receptor and HER2/neu status affect epigenetic differences of tumor-related genes in primary breast tumors // Breast Cancer Res. 2008. - V. 10. - R46.

124. Suspitsin EN, Sokolenko AP, Togo AV, Lazareva YR, Turkevich EA, Matsko DE, Henrich KO, Borresen-Dale AL, Schwab M, Cornelisse CJ, Imyanitov EN.

125. Nonrandom distribution of oncogene amplifications in bilateral breast carcinomas: Possible role of host factors and survival bias // Int J Cancer. 2007. - V. 120. - P. 297-302.

126. Takahashi H, Watanabe K, Takahashi M, Taguchi K, Sasaki F, Todo S. The impact of bilateral breast cancer on the prognosis of breast cancer: a comparative study with unilateral breast cancer // Breast Cancer. 2005. - V. 12. - P. 196-202.

127. Turker MS. Gene silencing in mammalian cells and the spread of DNA methylation // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 5388-5393.

128. Turner BM. Cellular memory and the histone code // Cell. 2002. - V. 111.-P. 285-291.

129. Turner NC, Reis-Filho JS, Russell AM, Springall RJ, Ryder K, Steele D, Savage K, Gillett CE, Schmitt FC, Ashworth A, Tutt AN. BRCA1 dysfunction» in sporadic basal-like breast cancer // Oncogene. 2007. - V. 26. - P. 2126-2132.

130. Van" Beers EH, Joosse SA, Ligtenberg MJ, Fles R, Hogervorst FB, Verhoef S, Nederlof PM. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples // Br J Cancer. 2006. - V. 94. - P. 333-337.

131. Waki T, Tamura G, Sato M, Motoyama T. Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples // Oncogene. 2003. - V. 22. - P. 4128-4133.

132. Wei M, Xu J, Dignam J, Nanda R, Sveen L, FackenthaLJ, Grushko TA, Olopade OI. Estrogen receptor alpha, BRCA1, and FANCF promoter methylation occur in distinct subsets of sporadic breast cancers // Breast Cancer Res Treat. 2008. V. 111. -P. 113-120.

133. Weigel RJ, deConinck EC. Transcriptional control of estrogen receptor in estrogen receptor-negative breast carcinoma // Cancer Res. 1993. - Y. 53. - P. 3472— 3474.

134. Widschwendter M, Jones PA. DNA methylation and breast carcinogenesis // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 5462-5482.

135. Widschwendter M, Siegmund KD, Miiller HM, Fiegl H, Marth C, Muller-Holzner E, Jones PA, Laird PW. Association of breast cancer DNA methylation profiles with hormone receptor status and response to tamoxifen // Cancer Res. 2004. — V. 64. -P. 3807-3813.

136. Yakushiji T, Uzawa K, Shibahara T, Noma H, Tanzawa H. Overexpression of DNA methyltransferases and CDKN2A gene methylation status in squamous cell carcinoma of the oral cavity // Int J Oncol. 2003. - V. 22. - P. 1201— 1207.

137. Yang Q, Sakurai T, Kakudo K. Retinoid, retinoic acid receptor beta and breast cancer II Breast Cancer Res Treat. 2002. - V. 76. - P. 167-173.

138. Yenbutr P, Hilakivi-Clarke L, Passaniti A. Hypomethylation of an exon I estrogen receptor CpG island in spontaneous and carcinogen-induced mammary tumorigenesis in the rat // Mech Ageing Dev. 1998. - V. 106. - P. 93-102.

139. YeoW, Wong WL, Wong N, Law BK, Tse GM, Zhong S. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in tumorous and non-tumourous tissue of breast cancer // Pathology. 2005. - V. 37. - P. 125-130.

140. Yoder J A, Walsh CP, Bestor TH. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites II Trends Genet. 1997. - V. 13. - P. 335-340.

141. Zhu H, Geiman TM, Xi S, Jiang Q, Schmidtmann A, Chen T, Li E, Muegge K. Lsh is involved in de novo methylation of DNA II EMBO J. 2006. - V. 25. -P. 335-345.