Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Роль геропротекторных пептидов пинеальной железы и мелатонина в коррекции нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции

На правах рукописи

МИЛЮТИНА Юлия Павловна

РОЛЬ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И МЕЛАТОНИНА В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ

14.01.30 - геронтология и гериатрия 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ШП 20:0

Санкт-Петербург - 2010

004602327

Работа выполнена в лаборатории биохимии Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и в лаборатории перинатальной биохимии Учреждения Российской академии медицинских наук «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга» СЗО РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Арутюнян Александр Вартанович

доктор биологических наук, доцент Козина Людмила Семеновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Попович Ирина Григорьевна

доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук «Институт физиологии им. акад. И.П. Павлова» РАН

Защита состоится «_»_2010 г. в_часов на

заседании диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

Козина JI.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вследствие увеличения средней продолжительности жизни человека женский организм в течение более 20-25 лет пребывает в условиях возрастного изменения гормонального гомеостаза, обусловленного прекращением циклических процессов в репродуктивной системе. В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на изучение механизмов регуляции репродуктивной функции, ее возрастных изменений, с целью разработки мер для контроля и возможного продления репродуктивного периода. Исследования, проведенные в последние десятилетия, направлены на раскрытие сложных механизмов развития нормального функционирования и угасания репродуктивной системы. Отмечено, что изменения в механизмах центральной регуляции репродуктивной функции самок крыс, наблюдаемые в процессе старения, сходны с нарушениями, вызванными воздействием некоторых соединений, которые обладают нейротоксическим действием (ароматические углеводороды, ацетат свинца, диоксан и др.) [Арутюнян A.B., 1997J. Аналогичным образом действует используемый в данном исследовании 1,2-диметилгидразин, что позволяет рассматривать его использование ш vivo как модель преждевременного старения репродуктивной системы женского организма. Несмотря на то, что она является одной из наиболее чувствительных систем организма к изменению окружающей среды, отмечается неспецифический характер ее реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции под действием неблагоприятных факторов, независимо от их природы [Арутюнян A.B., 2003; Arutjunyan et al., 2003].

Процессу овуляции, с которого начинается отсчет каждого репродуктивного цикла, предшествует ряд гормональных изменений в организме, среди которых важнейшим является резкое повышение в крови уровня гонадотропных гормонов гипофиза, вызванное гиперсекрецией гонадолиберина. Для осуществления преовуляторного пика секреции гонадолиберина необходимо взаимодействие двух сигналов - гормонального, заключающегося в повышении уровня в крови синтезируемых яичниками половых стероидов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного сигнала, ежедневно поступающего из супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса к нейрональным структурам, ответственным за синтез (МПО) и секрецию (СВ-Арк) этого нейрогормона [Palm I.F., 1999, 2001]. Оба эти сигнала передаются к гонадолиберинэргическим нейронам опосредовано через нейромедиаторные системы.

Несмотря на то что роль циркадианного осциллятора СХЯ гипоталамуса в протекании эстрального цикла в настоящее время не вызывает сомнений, многие вопросы, связанные с молекулярной организацией этого процесса у животных с сезонным и несезонным размножением, а также у человека, остаются невыясненными. Имеются данные о роли катехоламинергических и

пептидергических систем в нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции [Chappell P.E., 2005]. Однако по-прежнему мало изученными остаются вопросы, связанные с изменением содержания нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина. Недостаточно изучена роль пинеальной железы и продуцируемого ею мелатонина в регуляции репродуктивных циклов и их возрастных нарушениях.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение роли биогенных аминов в изменении процессов гипоталамической регуляции репродуктивной функции с возрастом, а также в модели преждевременного старения репродуктивной системы, и возможности коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать суточную динамику и общее содержание биогенных аминов в гипоталамических структурах, осуществляющих регуляцию репродуктивной функции (медиальная преоптическая область и срединное возвышение с аркуатными ядрами) на разных стадиях астрального цикла у крыс.

2. Изучить возрастные изменения содержания и суточной динамики катехоламинов (норадреналина и дофамина) в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез (медиальная преоптическая область) и секрецию (срединное возвышение с аркуатными ядрами) гонадолиберина.

3. Изучить влияние геропротекторных препаратов пинеальной железы (эпиталамина и эпиталона) и мелатонина на суточную динамику и общее содержание исследуемых катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса в экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной системы (введение 1,2-диметилгидразина).

4. Исследовать воздействие пептидных биорегуляторов пинеальной железы эпиталона и эпиталамина на клеточный рост при культивировании фрагментов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых крыс.

Научная новизна

Впервые особое внимание было уделено регистрации времени изменения содержания биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, что имеет важное значение для формирования преовуляторного пика гонадолиберина, обусловливающего нормальное течение репродуктивных циклов. Показано, что значительное снижение уровня норадреналина в медиальной преоптической области и повышение уровня дофамина в

срединном возвышении с аркуатными ядрами происходит на стадии проэструса в узком временном интервале между 9:30 и 11 ч циркадианного времени.

Впервые проведена оценка зависимости изменений в уровне различных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина (ГнРГ) от овариального и циркадианного сигналов, оказывающих специфическое действие на моноаминергические системы гипоталамуса. Установлено, что обнаруженная суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами не зависит от уровня половых стероидов в крови. Выявлено, что содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатньми ядрами и дофамина в медиальной преоптической области подчиняется зависимости иного рода и определяется стадией астрального цикла экспериментальных животных. Отмечено сохранение нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области в условиях постоянной темноты, что доказывает ее зависимость от работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

Получены новые данные о роли катехоламинов в процессах возрастного изменения и выключения циклических процессов в репродуктивной системе самок крыс. Впервые показано, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются изменением нормальной суточной динамики содержания катехоламинов - норадреналина и дофамина, в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, связанным с предполагаемым нарушением работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

Впервые обнаружен протекторный эффект эпиталамина на суточную динамику содержания норадреналина в медиальной преоптической области и эпиталона на суточный ритм содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами, нарушенные при воздействии 1,2-диметилгидразина. Показано, что введение мелатонина на фоне нарушения в гипоталамусе ритма содержания катехоламинов, регулирующих синтез и секрецию гонадолиберина, приводит к нормализации их суточной динамики. Установлено также, что исследованные пептидные препараты пинеальной железы стимулируют при органотипическом культивировании развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых самок крыс.

Практическая значимость

Экспериментальное исследование роли катехоламинов в процессах центральной регуляции репродуктивной функции и изучение молекулярной организации этого процесса, способствует пониманию сложных механизмов выключения репродуктивной функции в процессе старения женского организма и ее нарушений при действии неблагоприятных факторов окружающей среды.

Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы при нарушении астрального цикла под влиянием 1,2-диметилгидразина (модель преждевременного старения репродуктивной системы) являются перспективными в практическом отношении с точки зрения использования этих соединений для коррекции нарушений в гипоталамической регуляции репродуктивной функции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Суточные ритмы содержания катехоламинов формируют нейромедиаторный фон, необходимый для реализации пика секреции гонадолиберина.

2. Начальные этапы возрастного угасания репродуктивной функции сопровождаются нарушением нормальной суточной динамики катехоламинов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, связанным с предполагаемым изменением работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

3. Мелатонин, эпиталамин и эпиталон способствуют сохранению и (или) восстановлению нормальной суточной динамики катехоламинов в гипоталамических структурах, ответственных за регуляцию репродукции, нарушенной в экспериментальной модели старения репродуктивной системы, вызванного введением 1,2-диметилгидразина.

4. Пептидные препараты пинеальной железы стимулируют развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых крыс in vitro.

Апробация и реализация диссертации

Материалы исследования доложены и обсуждены на совместном заседании лаборатории перинатальной биохимии и отдела эндокринологии НИИ акушерства и гинекологии СЗО РАМН. Результаты исследования были представлены на 4-м Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Киев, Украина, 2005), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), VI Европейском конгрессе международной ассоциации геронтологов и гериатров (Санкт-Петербург, 2007), VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2008), Конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), V Всероссийской Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 3 статьи в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ), 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, главы описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 138 страницах, содержит 4 таблицы и иллюстрирован 36 рисунками. Указатель литературы содержит 205 источников, из которых отечественных -51, зарубежных - 154.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика исследуемого материала

Исследования проводились в экспериментах in vivo и in vitro

Эксперименты in vivo были выполнены на 452 половозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались в виварии с искусственной вентиляцией и контролируемым световым режимом (12 часов - день, 12 часов - ночь) или в условиях полной темноты (24 часа - ночь), получали стандартный корм и воду.

Исследования in vitro проведены на 300 эксплантатах МПО гипоталамуса 3-месячных (молодых) и 24-месячных (старых) самок крыс линии Wistar. Исследуемые препараты - эпиталон и эпиталамин -добавлялись в культуральную среду в концентрациях 2 нг/мл и 100 нг/мл, соответственно.

Общая схема экспериментов

Изучение суточной динамики содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина. Эксперимент был выполнен на 60 половозрелых самках крыс линии Wistar, с массой тела 170-200 г с четырехдневным эстральным циклом. Животные содержались при стандартном световом режиме (12 часов : 12 часов). Декапитацию животных проводили в стадии проэструса в 10, 12, 14, 16, 18 часов и 21 час ЦВ (циркадианное время отсчитывается от начала дневной фазы экспериментальных суток).

Стадии эстрального цикла в этом и последующих экспериментах определяли по влагалищным мазкам. Правильность отбора подтверждали post mortem, измеряя массу яичников и оценивая состояние матки. Также в сыворотке крови определяли уровень половых стероидов (эстрадиола и прогестерона) с использованием радиоиммунного метода.

Из мозга декапитированных животных под лупой выделяли МПО, СВ-Арк, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70°С до начала анализа.

Изменение содержания катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатньши ядрами гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстралыюго цикла. Исследования выполняли на 40 половозрелых крысах-самках линии Wistar с массой тела 200 - 250 г. Эксперимент включал в себя две группы животных. Первую группу составляли 20 нормально циклирующих крыс с четырехдневным эстральным циклом, находившихся в стадии проэструса. Во вторую группу входили оставшиеся 20 нормально циклирующих крыс, находившихся в стадии диэструса. Декапитацию животных производили в 5 часов, 9:30 часов и 11 часов ЦВ, что соответствует 12:00, 16:30 и 18:00 часам астрономического времени. Из мозга животных выделяли МПО и СВ-Арк.

Изучение суточной динамики содержания катехоламинов в условиях постоянной темноты. Эксперимент был выполнен на 40 крысах линии Wistar. Животные содержались в условиях постоянной темноты, забой проводили в 5, 11, 18 и 23 часа ЦВ.

Изучение возрастных изменений суточной динамики и общего содержания катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса. Эксперимент был выполнен на 72 крысах линии Wistar. В данном исследовании самки были разделены на 4 группы. Первую группу составили животные в возрасте 1,5 месяцев. Данный возраст характеризуется открытием влагалища и формированием эстральных циклов. Вторая группа животных состояла из половозрелых, регулярно циклирующих самок 7-8 месяцев. В третьей группе животных находились самки в возрасте 13-14 месяцев, период, при котором еще встречаются отдельные эстральные циклы, но наблюдается удлинение стадий диэструса и/или эструса. Четвертую группу составили самки в возрасте 24 месяцев и старше, когда половая цикличность полностью прекращается, и животные находятся в состоянии персистирутощего диэструса.

Изучение влияния мелатонина, эпиталамина и эпиталона на суточную динамику и общее содержание катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса в экспериментальной модели преяадевременного старения репродуктивной системы (введение 1,2-диметилгидразина)

Исследование проводили на 240 половозрелых крысах-самках линии Wistar с массой тела 200-250 г. Была выбрана следующая схема эксперимента, по которой животные были разделены на 6 групп:

1. Контрольная группа, животные, которым вводили физиологический раствор в течение 4 дней.

2. Животные, которым однократно вводили 1,2'-диметилгидразин гидрохлорид (Sigma).

3. Группа животных, которые получали инъекции мелатонина (Sigma), в течение четырех дней (один эстральный цикл, начиная со стадии проэструса).

4. Животные, которым на фоне 4-дневного введения мелатонина была сделана инъекция 1,2'-диметилгидразина гидрохлорида (ДМГ).

5. Группа животных, которым на фоне 4-дневного введения эпиталамина (полипептидный препарат эпифиза), была сделана инъекция ДМГ.

6. Животные, которым на фоне 4-дневного введения эпиталона (Ala-Glu-Asp-Gly) была сделана инъекция ДМГ

ДМГ, растворенный ex tempore в 0,9% растворе натрия хлорида, вводили в дозе 19,2 мг/кг массы (в расчете на основание), утром, накануне дня проэструса в 3 часа ЦВ. Мелатонин вводили вечером в 10 часов ЦВ в концентрации 1 мг/кг массы. Эпиталон и эпиталамин вводили в дневное время в концентрациях 2 мкг/кг массы и 1 мг/кг массы соответственно. Все препараты вводили внутрибрюшинно, в объеме 250 мкл. Декапитацию животных производили в 5,9:30 и 11 ч. ЦВ на стадии проэструса.

Определение катехоламинов в структурах мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,25 мл 0,1 М хлорной кислоты, содержащей 0,05% метабисульфита калия, центрифугировали (10000 g, 15 мин., +4 °С), супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическому анализу в тот же день.

Количественный анализ норадреналина (НА) и дофамина (ДА) в исследуемых областях гипоталамуса проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием [Арутюнян A.B., 1998]. Хроматографическое разделение катехоламинов осуществляли на колонке Reprosil 80 ODS-2 (100x4 мм, 3 мкм, Dr. Maisch GmbH, Германия). Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США) при потенциале +0,65 В. Подвижная фаза содержала 6 мМ цитратного буфера, 2 мМ этилендиаминтетраацетата натрия, 1,1 мМ октилсульфоната натрия и 7% ацетонитрила (v/v). Расход элюента -0,75 мл/мин. Содержание определяемых веществ рассчитывали в нанограммах на миллиграмм белка, который определяли по методу Vera [Vera J.C., 1988].

Изучение влияния пептидных препаратов пииеальной железы на органотипические культуры клеток медиальной преоптической области

гипоталамуса крыс

Отпрепарированную ткань медиальной преоптической области разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки. В среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (100ед/мл).

Исследуемые препараты - эпиталон и эпиталамин - добавлял в культуральную среду в концентрациях 2 нг/мл и 100 нг/мл, соответствен»! В качестве пептида сравнения был выбран вилон (Lys-Glu), который вводил в дозе 2 нг/мл. Чашки Петри с экспериментальными эксплантатами помещал в термостат при температуре 37° С и через 3 суток просматривали под фазов( контрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), которы рассчитывали в условных единицах как отношение площади всего эксплантат (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зон эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадк для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчет ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Для каждог исследуемого вещества анализировали 20-25 экспериментальны и 20-23 контрольных эксплантатов.

При иммуногистохимическом исследовании эксплантатов определял в периферической зоне роста на 3-й сутки экспрессию проапоптозного бел» р53. Иммуногистохимическое исследование проводили с использование моноклональных мышиных антител к проапоптозному белку р5 (1:75, Novocastra) и к фактору пролиферации PCNA (1:200, Novocastra В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащи биотинилированные анти-мышиные и анти-кроличьи иммуноглобулины.

Статистическая обработка результатов исследования

Обработку полученных данных проводили с использованием статистического пакета программ «STATISTICА 5.0». Для сравнения уровня катехоламинов в разных временных точках, а также для установления достоверных различий в содержании моноаминов между разными возрастными группами животных, применяли t-критерий Стыодентг сравнения средних значений для независимых выборок, с учетами дисперсий. Достоверность суточных ритмов оценивали при помощи однофакторногс дисперсионного анализа, влияние времени суток и стадии эстрального цикле на уровень исследуемых показателей - при помощи двухфакторного (время стадия цикла) дисперсионного анализа, с использованием модуля ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Суточная динамика содержания катехоламинов в структурам гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолибериш

Исследуя структуры гипоталамуса, осуществляющие синтез и секрецик ГнРГ, с интервалом в два часа, было обнаружено, что в проэструсе происходит достоверное снижение уровня НА в МПО в узком временное интервале от 9 к 11 ч ЦВ (17,48±1,63,12,48±1,36 нг/мг белка, соответственно" (рис. 1), тогда как изменение уровня ДА в этой гипоталамической структуре носит характер тенденции (рис. 2). В СВ-Арк уровень НА остаетс? постоянным (рис. 3), а содержание ДА, достоверно повышается в том же временном интервале, что и НА в МПО с 2,53+0,35 нг/мг белка в 9 ч. ЦВ дс 4,63±0,72 нг/мг белка - в 11 ч. ЦВ (рис. 4).

1 3 5 7 9 11 13 15 циркадианное время

Рис. 1. Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс в проэструсе.

* - р<0,05 отличие содержания норадреналина в 11 часов ЦВ от 9 часов ЦВ.

Рис. 3. Суточная динамика содержания норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в проэструсе.

1 3 5 7 9 11 13 15 циркадианное время

Рис. 2. Суточная динамика содержания дофамина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс в проэструсе.

Рис. 4. Суточная динамика содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в проэструсе.

* - р<0,05 отличие содержания дофамина в 11 часов ЦВ от 9 часов ЦВ.

Обнаруженные нами резкое снижение НА в МПО и достоверный подъем ДА в СВ-Арк совпадают по времени с завершением преовуляторного выброса ГнРГ, кроме того, в эти же часы происходит подъем уровня прогестерона, опиоидных пептидов, а также снижение содержания вазопрессина. Известно, что увеличение секреции прогестерона на стадии проэструса на фоне повышенного уровня эстрадиола происходит за несколько минут до преовуляторного пика секреции лютеинизирующего гормона. [Fink G., 1991], что характеризует механизм положительной обратной связи овариального сигнала активации гипоталамо-гилофизарного звена регуляции репродуктивной функции. Вазопрессин же является одним из основных нейромедиаторов, участвующих в передаче циркадианного сигнала запуска процесса гиперсекреции ГнРГ от СХЯ к МПО гипоталамуса [Palmet al., 1999; 2001].

На основании полученных результатов представляло интерес выяснить природу обнаруженных суточных изменений катехоламинов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса: установить, зависят ли они от работы центрального циркадианного осциллятора, расположенного у млекопитающих в СХЯ гипоталамуса, или же эти ритмы обусловлены лишь циклом свет-темнота и изменением уровня освещенности.

Необходимо также учитывать, что значительная роль в формировании проэстрального пика секреции ГнРГ отводится влиянию на активность моноаминергических нейронов повышенного уровня в крови половых гормонов в день проэструса. Поэтому в следующей серии экспериментов нами была изучена зависимость изменений содержания исследуемых нейромедиаторов от стадии астрального цикла и уровня половых стероидов в крови, для чего были выбраны три временные точки, которые достаточно хорошо отражают основные изменения в стероидном фоне и формирование пика секреции ГнРГ в стадию проэструса.

Содержание катехоламинов в медиальной преоптической области, срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстрального цикла. В результате последующих исследований, было установлено, что суточная динамика НА в МПО в диэструсе (стадия эстрального цикла, когда уровень эстрадиола и прогестерона в крови остается относительно стабильным), сходна с его ритмами в проэструсе (рис. 5). Содержание нейромедиатора в исследуемой области гипоталамуса составило в проэструсе: 10,98+0,63 нг/мг белка. 9,68±0,79 нг/мг белка и 5,85+0,41 нг/мг белка, в диэструсе: 10,10±2,34 нг/мг белка, 10,96±0,40 нг/мг белка и 7,72±0,53 нг/мг белка для трех временных точек циркадианного времени, соответственно. Отмечено, что на обеш стадиях эстрального цикла содержание ДА в СВ-Арк также имеет выраженную суточную динамику с повышением его уровня в вечерние часы (рис. 6). Уровень ДА составил в проэструсе: 7,03±1,29 нг/мг белка (5 ч. ЦВ). 9,44±2,01 нг/мг белка (9,5 ч. ЦВ) и 10,88±0,98 нг/мг белка (11 ч. ЦВ); в диэструсе: 6,85±0,84 нг/мг белка (5 ч. ЦВ), 6,41±1,03 нг/мг белка (9,5 ч. ЦВ]

и 13,17±1,78 нг/мг белка (11 ч. ЦВ). Даухфакторпый дисперсионный анализ показал отсутствие зависимости содержания НА в МПО и ДА в СВ-Арк от стадии астрального цикла и, следовательно, независимо от уровня половых стероидов содержание этих нейромедиаторов подвержено постоянным ежедневным изменениям с характерным снижением НА в МПО в узком временном интервале от 9,5 к 11 часам ЦВ и повышением ДА в СВ-Арк к 11часам ЦВ.

Прозструс —И—Дизструс [

Проэструс —а—Диэструс {

Рис. 5. Изменение содержания норадреналина в медиальной

преоптической области гипоталамуса самок крыс в различные стадии астрального цикла.

* - р<0,001 отличие содержания норадреналина в проэструсе и диэструсе в 11 часов ЦВ от соответствующих уровней норадреналина в 9,5 часов ЦВ.

Рис. 6. Изменение содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в различные стадии эстрального цикла * - р<0,01 отличие содержания дофамина в проэструсе и диэструсе в 11 часов ЦВ от соответствующих уровней дофамина в 5 ч. ЦВ.

** - р<0,001 отличие содержания дофамина в 9,5 часов ЦВ от 11 часов ЦВ в диэструсе.

В СВ-Арк также отмечены изменения в содержании НА, однако отличного от МПО характера. Так, не было обнаружено суточных ритмов содержания НА в этой структуре (рис. 7). На обоих стадиях эстрального цикла фиксировался практически постоянный уровень нейромедиатора на протяжении всего дня. Однако на стадии проэструса общий уровень НА в СВ-Арк составил 8,19+0,64 нг/мг белка, что достоверно выше уровня нейромедиатора в стадии диэструса (6,01±0,50 нг/мг белка) (р<0,05) (рис 8). Содержание ДА в МПО, в отличие от его изменений в СВ-Арк, не претерпевает достоверных суточных изменений. Отмечена лишь тенденция к снижению его уровня от 5 к 11 часам ЦВ в диэструсе и повышение в 9,5 часов ЦВ - в проэструсе (рис. 9).

Рис. 7. Суточная динамика содержания норадреяалина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в различные стадии эстрального цикла.

Рис. 8. Содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на разных стадиях эстрального цикла. * - р<0,05 отличие содержания норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами в проэструсе от диэструса.

Рис. 9. Суточная динамика содержания дофамина в медиальной преолтической области

гипоталамуса самок крыс в различные стадии эстрального цикла.

Рис. 10. Содержание дофамина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс на разных стадиях эстрального цикла.

* - р<0,05 отличие содержания дофамина в медиальной преоптической области в проэструсе от диэструса.

Однако содержание ДА в МПО подчинялось зависимости иного рода и определялось стадией астрального цикла экспериментальных животных. Общий уровень нейромедиатора в стадии проэструса был равен 3,27±0,50 нг/мг белка, что достоверно ниже (р<0,05) его уровня в стадии диэструса, с содержанием 5,35± 0,81 нг/мг белка (рис. 10).

Таким образом, можно предположить, что изменение содержания НА в СВ-Арк и ДА в МПО, зависящее от фона половых стероидов, связано с реализацией овариального сигнала процесса формирования преовуляторного пика ГнРГ.

Вместе с тем, повышение уровня половых стероидов само по себе не может вызывать преовуляторный пик ГнРГ в день проэструса, и непосредственным триггером процесса гиперсекреции является сигнал нейрональной природы, ежедневно поступающий от СХЯ гипоталамуса.

Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса в условиях постоянной темноты

Эксперимент был проведен с целью выяснения, в какой мере обнаруженные суточные ритм ы биогенных аминов, участвующие в регуляции репродуктивных функций самок крыс и сохраняющиеся при изменяющемся фоне половых стероидов в крови, зависят от работы циркадианного осциллятора, СХЯ, а какие изменения обусловлены уровнем освещенности. Основным фактом, подтверждающим истинную циркадианную природу ритма, является его сохранность в условиях постоянной темноты [Ашофф, 1984]. Были получены данные о том, что наблюдаемая у с шок крыс суточная динамика содержания НА в МПО сохраняется в условиях постоянной темноты (табл. 1), следовательно, она носит истинный циркадианный характер и контролируется работой циркадианного осциллятора, расположенного в СХЯ гипоталамуса.

Таблица 1

Суточные изменения содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в условиях постоянной темноты

Показатель Время определения (ч ЦВ)

5 И 18 23

НА в МПО 27,62±1,47 23,08±1,35* 21,28±1,78* 28,09±1,64

ДА в СВ-Арк 17,00±2,83 15,15±2,54 13,01±2,07 16,58±3,19

* - отличие содержания норадреналина в медиальнои преоптическои области в 11 и 18 часов ЦВ от его содержания в 5 часов ЦВ, р<0,05.

Между тем, суточный ритм ДА в СВ-Арк в условиях постоянной темноты исчезает, что позволяет сделать вывод о том, что отмеченное нами суточное изменение содержания данного нейромедиатора в этой структуре при стандартном световом режиме зависит от уровня освещенности и не связано с эндогенными ритмами в СХЯ. В этой связи следует отметить, что рядом авторов были обнаружены афферентные проекции, которые связывают срединное возвышение с сетчаткой глаза, скорее всего посредством мультисинаптического пути [Saeb-Parsy К., 2000].

Возрастные изменения содержания катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса

Известно, что возрастные изменения преовуляторного пика секреции гонадолиберина и гонадотропинов связаны со снижением активности нейромедиаторных систем, контролирующих эти процессы, в частности, ослаблением сигнала, поступающего от СХЯ [Harney J.P. et al., 1996; Wise P.M. et al, 1997]. Нами было установлено, что с возрастом, к 24 месяцам, когда половая цикличность полностью прекращается и животные находятся в состоянии персистирующего диэструса, содержание НА в МПО значительно снижается и становится достоверно ниже, чем у молодых животных (рис. 11). Содержание этого нейромедиатора составило 22,7510,46 нг/мг белка у 1,5 месячных животных и 20,25± нг/мг белка - у 24 месячных.

Рис. 11. Возрастное изменение общего содержания норадреналина в медиальной

преоптической области гипоталамуса. * - р<0,01 достоверное отличие содержания норадреналина в медиальной преоптической области 24-месячных от 1,5-месячных самок крыс.

В последующих экспериментах было установлено, что у 13-14-месячных животных, у которых еще встречались отдельные эстральные циклы, но наблюдалось удлинение стадий диэструса и/или эструса, происходит

нарушение нормальной суточной динамики НА в МПО, характерной для 7-8-месячных самок (нормально циклируюгцие) с повышением к 9,5 часам ЦВ и достоверным снижением к 11 часам ЦВ (рис. 12). Так, содержание НА в МПО у 13-14-месячных животных в исследованные три временные точки составило: 23,26±0,77 нг/мг белка в 5 часов ЦВ, 21,56±1,78 нг/мг белка в 9,5 часов ЦВ и 21,31±1,59 нг/мг белка в 11 часов ЦВ. Однако отмечено, что, несмотря на исчезновение суточного ритма нейромедиатора в этой структуре, его общее значение не имеет достоверных отличий при сравнении с молодыми животными (рис. 13). Известно, что именно в этом возрасте начинают происходить изменения в астральном цикле и секреции JIT, наблюдается задержка в начале его преовуляторного подъема с достоверным снижением амплитуды [Mohankumar P.S., 1994, Wise P.M., 1982, 2002].

Анализ данных по содержанию ДА в СВ-Арк показал, что суточный ритм с повышением уровня нейромедиатора к вечеру, характерный для 7-8 месячных животных, у 13-14 месячных самок отсутствует (рис. 14). Содержание нейромедиатора в этой структуре гипоталамуса в 5, 9,5 и 11 часов ЦВ составило: 4,41±0,37 нг/мг белка, 4,43±0,50 нг/мг белка и 3,90±0,42 нг/мг белка соответственно. Кроме того, в этом возрасте происходит также снижение его общего содержания, 7,31±0,56 нг/мг белка - у 7-8 месячных и 4,28±0,25 - у 13-14 месячных животных (рис. 15).

На основании полученных нами данных, а также, анализируя результаты исследований других авторов, можно предположить, что с возрастом у самок крыс начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются постепенным исчезновением характерной суточной динамики НА в МПО гипоталамуса на стадии проэструса, но еще при сохранении нормального общего уровня этого нейромедиатора, что, вероятно, связано с нарушениями работы циркадианных центров в СХЯ гипоталамуса. Лишь позднее происходит возрастное изменение порога чувствительности гипоталамуса к половым стероидам, ведущее затем к еще более выраженным изменениям в норадренергической системе, участвующей в регуляции пика ГнРГ: значительному снижению содержания НА, прекращению нормальной реализации репродуктивной функции и, как следствие, ановуляции и персистирующему диэструсу.

Исходя из того, что снижение общего содержания моноаминов в СВ-Арк происходит еще при сохранении нормального общего уровня нейромедиаторов в МПО, можно предположить, что с возрастом нарушения процессов, связанных с секрецией ГнРГ, предшествуют снижению его синтеза. Предположение о том, что на начальных этапах старения происходит снижение секреции ГнРГ, а по мере дальнейших возрастных изменений уменьшается и его синтез, высказано также другими исследователями. Ими отмечалось, что у старых животных с нерегулярным циклом содержание ГнРГ в гипоталамусе в 2,5 раза больше, чем у молодых самок, а уровень ЛГ в крови значительно снижается [Бабичев В.Н., 1981].

Рис. 12. Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс различного возраста.

Рис. 14. Суточная динамика содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс различного возраста.

Рис. 13. Общее содержание норадреналина в медиальной преоптической области

гипоталамуса самок крыс различных возрастных групп.

Рис. 15. Общее содержание дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс различных возрастных групп. * - р<0,01 достоверное отличие содержания дофамина в

срединном возвышении с аркуатными ядрами 13-14 месячных от 7-8 месячных самок крыс.

Влияние пептидных препаратов пинеальной железы и мелатонина на содержание и суточные ритмы катехоламинов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс в экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной системы

Несмотря на то, что репродуктивная система является одной из наиболее чувствительных систем организма к изменению окружающей среды [Айламазян Э.К., 1997], отмечается неспецифический характер ее реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции под действием неблагоприятных факторов, независимо от их природы. Так как изменения в центральных механизмах регуляции в процессе старения сходны с нарушениями в репродуктивной системе, вызванными действием ряда ксенобиотиков, мы в нашем исследовании использовали модель, в которой животным вводили нейротоксический ксенобиотик 1,2'-диметилгидразин. Установлено, что однократное введение ДМГ приводило к нарушению нормальных суточных ритмов НА в МПО и ДА в СВ-Арк и их уровень сохранялся практически постоянным во всех трех временных точках (рис 16, 17). Рассматривая зависимость суточной динамики и общего содержания биогенных аминов, участвующих в процессах синтеза и секреции ГнРГ, от различных факторов, таких как фон половых стероидов в крови, работа циркадианного осциллятора, уровень освещенности, необходимо отметить, что значительная роль в гипоталамо-гипофизарной регуляции репродуктивной функции отводится гормону пинеальной железы мелатонину.

В связи с этим интересным представляется изучение влияния экзогенно введенного мелатонина, а также соединений, способных стимулировать синтез и/или синхронизировать секрецию эндогенного мелатонина при предполагаемом снижении функциональной активности пинеальной железы, что наблюдается, например, с возрастом или при воздействии некоторых ксенобиотиков. Установлено, что при введении ДМГ на фоне инъекций гормона пинеальной железы мелатонина нормальная суточная динамика НА в МПО сохранялась, при этом наблюдается снижение уровня этого нейромедиатора от 9:30 к 11 часам ЦВ (р<0,05), характерное для соответствующих контрольных животных (животные, которым вводился только мелатонин), подобный же положительный эффект наблюдался при сочетанном введении ДМГ и эпиталамина, который в МПО оказался более эффективным, по сравнению с эпиталоном (рис 16). При сочетанном введении ДМГ и мелатонина обнаружена нормальная суточная динамика ДА в СВ-Арк, сходная с его ритмом, отмеченном в группе животных, которые получали только инъекции мелатонина. В СВ-Арк достаточно эффективным оказался эпиталон, который предотвращал нарушение суточной динамики ДА, вызванное воздействием ксенобиотика, сохраняя низкий уровень этого моноамина в 5 ч ЦВ, с достоверным повышением его к 11 часам ЦВ (рис. 17).

Рис. 16. Изменение содержания норадреналина в медиальной преоптической области под действием однократного введения 1,2'-диметилгидразина на фоне введения физ. раствора, мелатонина, эпиталамина и эпиталона. * - р<0,05, величины, достоверно отличающиеся от уровня норадреналина в соответствующих группах в 9,5 часов циркадианного времени.

25 20 + 1 15 10 5 0

физ. раствор физ. раствор + мелатонин ДМГ

эпиталон ДМГ

□ 5 часов ЦВ

О 9,5 часов ЦВ

□ 11 часов ЦВ

Рис. 17. Изменение содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами под действием однократного введения 1,2'-диметилгидразина на фоне введения физ. раствора, мелатонина, эпиталамина и эпиталона.

* - р<0,01, ** - р<0,05 *** - р<0,001 величины, достоверно отличающиеся от уровня дофамина в соответствующих группах в 5 часов циркадианного времени.

Мелагонин, эпиталамин и эпиталон вероятнее всего вызывают усиление реакции катехоламиергических систем на введение ДМГ путем компенсаторного повышения содержания нейромедиаторов в МПО, возможно обусловленное снижением активности МАО под действием ксенобиотика. Сильно же выраженная активация моноаминергических систем в МПО при инъекции ДМГ на фоне эпиталамина, а также то, что он при введении ксенобиотика восстанавливает нормальную суточную динамику НА в этой структуре гипоталамуса, свидетельствует о том, что данный полипептид оказывает влияние преимущественно на процессы, связанные с синтезом ГнРГ. Тогда как эпиталон, вызывая активацию нейромедиаторных систем на уровне СВ-Арк, действует преимущественно на процесс секреции ГнРГ.

Влияние пептидных препаратов пинеальной железы на органотипические культуры клеток медиальной преоптической области гипоталамуса крыс

В следующей серии экспериментов было исследовано непосредственное влияние пептидных препаратов пинеальной железы на нейрональные структуры, участвующие в синтезе ГнРГ. При культивировании фрагментов МПО как 3-х месячных, так и 24-месячных крыс наблюдалась стимуляция развития эксплантатов под влиянием эпиталамина и эпиталона. Синтетический пептид вилон, используемый как препарат сравнения, влияния на развитие эксплантатов МПО молодых и старых крыс не оказывал, и индекс площади (ИП) оставался на уровне контрольных значений (рис. 18).

Рис. 18 Влияние эпиталамина, эпиталона и вилона на развитие в культуре медиальной преоптической области молодых и старых крыс.

Рис. 19 Влияние эпиталона на индекс площади и площадь экспрессии р53 в культуре медиальной преоптической области.

При иммуногистохимическом исследовании было выявлено, что при действии эффективных концентраций эпиталона, стимулирующих ИП зоны роста эксплантатов МПО у зрелых крыс, наблюдалось достоверное снижение площади экспрессии проапоптозного белка р53 на 27+6% (р<0,05) по сравнению с контролем. Таким образом, согласно полученным результатам,

эпиталон стимулирует пролиферативные процессы в МПО за счет ингибироваиия клеточных процессов апоптоза (рис. 19).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что как комплексный полипептид эпиталамин, так и синтетический пептид эпиталон обладают выраженной тканеспецифичностью по отношению к культивируемой МПО гипоталамуса как у молодых, так и у старых животных. При этом интересно отметить, что действие пептидных препаратов пинеальной железы, особенно эпиталамина, является более выраженным у молодых крыс. У старых животных стимулирующее влияние эпиталамина и эпиталона на рост ИП эксплантантов ослабевает. Можно предположить, что это связано с угасанием репродуктивной функции при старении и меньшей подверженности гипоталамуса регуляторному влиянию пинеальной железы.

ВЫВОДЫ

1. В медиальной преоптической области наблюдается суточный ритм содержания норадреналина с выраженным снижением в узком временном интервале с 9,5 до 11 часов ЦВ. Суточный ритм содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами характеризуется повышением его содержания с 5 к 11 часам ЦВ. Содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области находится в зависимости от стадии эстрального цикла, определяемой уровнем половых стероидов.

2. Начальные этапы угасания с возрастом репродуктивной функции самок крыс сопровождаются постепенным исчезновением нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса на фоне сохранения его общего уровня, снижение которого отмечается позднее к 22-24 мес. Снижение среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами происходит уже в 13-14 мес. одновременно с нарушением его суточного ритма.

3. В экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной системы, вызванного введением 1,2-диметилгидразина накануне дня проэструса, наблюдались сходные с возрастными изменения нормальных суточных ритмов содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами. При этом не изменялся уровень норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области.

4. При использовании геропротекторных препаратов пинеальной железы для коррекции нарушенных суточных ритмов моноаминов эпиталамин, восстанавливая нормальную суточную динамику норадреналина, оказался более эффективным на уровне медиальной преоптической области, а эпиталон оказывал действие в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сохраняя суточный ритм содержания дофамина. Мелатонин восстанавливает нормальную суточную динамику содержания исследованных катехоламинов в обеих рассматриваемых гипоталамических структурах.

5. Пептидные препараты пинеальной железы эпиталон и эпиталамин стимулируют при органотипическом культивировании развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых самок крыс. Эпиталон стимулирует пролиферативные процессы в медиальной преоптической области и ингибирует экспрессию проапоптозного белка р53.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы (эпиталамин и эпиталон) при нарушении репродуктивных циклов создают предпосылки их использования для коррекции возрастных изменений репродуктивной функции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Активность моноаминоксидазы в медиальной преоптической области и срединном возвышении самок крыс разных возрастных групп/

A.B. Разыграев, A.B. Арутюнян, М.Г. Степанов, Ю.П. Милютина, Т.А. Мазур // Нейрохимия. - 2008. - Т. 25, №3. - С 222-226.

2. Влияние пептидных препаратов эпифиза на пролиферативные процессы в органотилической культуре преоптической области гипоталамуса/ Ю.П. Милютина, Л.С. Козина, A.B. Арутюнян, Н.И. Чалисова,

B.В. Лесняк // Успехи геронтологии,- 2007. - Т. 20. - № 4. С. 61- 63.

3. О взаимосвязи циркадианных и овариальных циклов в гипоталамической регуляции репродукции (экспериментальное исследование)/ A.B. Кореневский, Ю.П. Милютина, М.Г. Степанов, Г.О. Керкешко, A.B. Арутюнян // Журнал акушерства и женских болезней, 2007. - Т. 56, Вып. 4.-С. 24-30.

Статьи

4. Арутюнян A.B. Хронобиология регуляции репродуктивной функции при старении/А.В. Арутюнян, JT.C. Козина, Ю.П. Милютина// Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях: Матер, всероссийской научной конференции, 8-19 августа 2006 г., Сочи-Адлер. - 2006. - С.276-281.

5. On the interrelationship between circadian and ovarian cycles in hypothalamic regulation of reproduction (experimental study)/A.V. Korenevsky, Yu. P. Milyutina, M.G. Stepanov, G.O. Kerkeshko, A.V. Arutjunyan // J Environ Neurosci Biomed, 2008. - V. 2, № 1. - P. 220-229.

Тезисы докладов

6. Антиоксидантные свойства геропротекторных пептидов эпифиза/А.В. Арутюнян, Л.С. Козина, Т.В. Харитонова, Ю.П. Милютина//4-й Национальный конгресс геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия», Киев.- 2005. -Т. 14. - С. 71-72.

7. Антиоксидантные свойства эпиталона и его структурных аналогов/ Л.С. Козина, A.B. Арутюнян, В.М. Прокопенко, Т.И. Опарина, Ю.П. Милютина // Биоантиоксидант: VII Международная конф., 25-26 октября 2006 г. М.: Изд-во Российского университета дружбы народов, 2006. -С. 154-155.

8. Влияние 1,2-диметилгидразина и биологически активных соединений эпифиза на активность моноаминооксидазы в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс/ A.B. Разыграев, Ю.П. Милютина, М.Г. Степанов, A.B. Кореневский, В.М. Прокопенко, А.В .Арутюнян// Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение 2, часть I). - 2008. - №3 (23). - С. 91-92.

9. Защитная роль мелатонина и пептидных препаратов эпифиза при воздействии экотоксикантов на репродуктивную функцию/ A.B. Арутюнян, Ю.П. Милютина, A.B. Кореневский, М.Г. Степанов, Л.С. Козина, В.Х Хавинсон// Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение 2, часть I). - 2008. - №3 (23). - С. 65.

Ю.Коррекция нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс с помощью мелатонина и пептидных препаратов эпифиза/А.В. Арутюнян, Ю.П. Милютина, A.B. Разыграев, М.Г. Степанов, A.B. Кореневский //Матер. VIII международ, симп. «Биологические механизмы старения», Харьков. - 2008. С. 65-66.

11.Милютина Ю. П. Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции самок крыс в процессе старения/Ю. П. Милютина, А. В. Арутюнян //V Всерос. научно-практич. конф. «Общество, государство и медицина для пожилых», 2008. - С.48.

12.The role of melatonin and peptide preparation from the pineal gland in preventing disturbances of the hypothalamic regulation of reproduction in female rats/Yu. P. Milyutina, A.V. Korenevsky, M.G. Stepanov, A.V. Arutjunyan//Advances in Gerontology, 2007. - V. 20, № 3. - P. 56.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ГнРГ - гонадотропин-рилизинг-гормон (гонадолиберин)

ДА - дофамин

ДМГ - 1,2'-диметилгидразин

ИП - индекс площади

ЛГ - лютеинизирующий гормон

МПО - медиальная преоптическая область

НА - норадреналин

СВ-Арк - срединное возвышение с аркуатными ядрами

СХЛ - супрахиазматические ядра

МИЛЮТИНА Юлия Павловна РОЛЬ ГЕРОПРОТЕКТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ПИНЕАЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И МЕЛАТОНИНА В КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ// Автореф. дис. канд. биол. наук: 14.01.30; 03.01.04 - СПб., 2010. -25 с.

Подписано в печать 22.03.2010. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ Ц-&. Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Актуальность проблемы. Вследствие увеличения средней продолжительности жизни человека женский организм в течение более 20-25 лет пребывает в условиях возрастного изменения гормонального гомеостаза, обусловленного прекращением циклических процессов в репродуктивной системе. В связи с этим актуальными являются исследования, направленные на изучение механизмов регуляции репродуктивной функции, ее возрастных изменений, с целью разработки мер для контроля и возможного продления репродуктивного периода. Исследования, проведенные в последние десятилетия, направлены на раскрытие сложных механизмов развития нормального функционирования и угасания репродуктивной системы. Отмечено, что изменения в механизмах центральной регуляции репродуктивной функции самок крыс, наблюдаемые в процессе старения, сходны с нарушениями, вызванными воздействием некоторых соединений, которые обладают нейротоксическим действием (ароматические углеводороды, ацетат свинца, диоксан и др.) [Арутюнян А.В. и соавт., 1997]. Аналогичным образом действует используемый в данном исследовании 1,2-ди метил гидразин, что позволяет рассматривать его использование in vivo как модель преждевременного старения репродуктивной системы женского организма. Несмотря на то, что она является одной из наиболее чувствительных систем организма к изменению окружающей среды, отмечается неспецифический характер ее реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции под действием неблагоприятных факторов, независимо от их природы [Arutjunyan et al., 2001; Арутюнян А.В. и соавт., 2003].

Процессу овуляции, с которого начинается отсчет каждого репродуктивного цикла, предшествует ряд гормональных изменений в организме, среди которых важнейшим является резкое повышение в крови уровня гонадотропных гормонов гипофиза, вызванное гиперсекрецией гонадолиберина. Для осуществления преовуляторного пика секреции гонадолиберина необходимо взаимодействие двух сигналов — гормонального, заключающегося в повышении уровня в крови синтезируемых яичниками половых стероидов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного сигнала, ежедневно поступающего из супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса к нейрональным структурам, ответственным за синтез (медиальная преоптическая область) и секрецию (срединное возвышение с аркуатными ядрами) этого нейрогормона [Palm I.F. et al., 1999; 2001]. Оба эти сигнала передаются к гонадолиберинэргическим нейронам опосредовано через нейромедиаторные системы.

Несмотря на то что роль циркадианного осциллятора СХЯ гипоталамуса в протекании эстрального цикла в настоящее время не вызывает сомнений, многие вопросы, связанные с молекулярной организацией этого процесса у животных с сезонным и несезонным размножением, а также у человека, остаются невыясненными. Имеются данные о роли катехоламинергических и пептидергических систем в нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции [Chappell Р.Е., 2005]. Однако по-прежнему мало изученными остаются вопросы, связанные с изменением содержания нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина. Недостаточно изучена роль пинеальной железы и продуцируемого ею мелатонина в регуляции репродуктивных циклов и их возрастных нарушениях.

Цели и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение роли биогенных аминов в изменении процессов гипоталамической регуляции репродуктивной функции с возрастом, а также в модели преждевременного старения репродуктивной системы, и возможности коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать суточную динамику и общее содержание биогенных аминов в гипоталамических структурах, осуществляющих регуляцию репродуктивной функции (медиальная преоптическая область и срединное возвышение с аркуатными ядрами) на разных стадиях астрального цикла у крыс.

2. Изучить возрастные изменения содержания и суточной динамики катехоламинов (норадреналина и дофамина) в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез (медиальная преоптическая область) и секрецию (срединное возвышение с аркуатными ядрами) гонадолиберина.

3. Изучить влияние геропротекторных препаратов пинеальной железы (эпиталамина и эпиталона) и мелатонина на суточную динамику и общее содержание исследуемых биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса в экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной системы (введение 1,2-диметилгидразина).

4. Исследовать воздействие пептидных биорегуляторов пинеальной железы эпиталона и эпиталамина на клеточный рост при культивировании фрагментов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых крыс.

Научная новизна работы

Впервые особое внимание было уделено регистрации времени изменения содержания биогенных аминов в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, что имеет важное значение для формирования преовуляторного пика гонадолиберина, обусловливающего нормальное течение репродуктивных циклов. Показано, что значительное снижение уровня норадреналина в медиальной преоптической области и повышение уровня дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами происходит на стадии проэструса в узком временном интервале между 9:30 и 11 ч циркадианного времени.

Впервые проведена оценка зависимости изменений в уровне различных нейромедиаторов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина (ГнРГ) от овариального и циркадианного сигналов, оказывающих специфическое действие на моноаминергические системы гипоталамуса. Установлено, что обнаруженная суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами не зависит от уровня половых стероидов в крови. Выявлено, что содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области подчиняется зависимости иного рода и определяется стадией астрального цикла экспериментальных животных. Отмечено сохранение нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области в условиях постоянной темноты, что доказывает ее зависимость от работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

Получены новые данные о роли катехоламинов в процессах возрастного изменения и выключения циклических процессов в репродуктивной системе самок крыс. Впервые показано, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются изменением нормальной суточной динамики содержания катехоламинов — норадреналина и дофамина, в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, связанным с предполагаемым нарушением работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

Впервые обнаружен протекторный эффект эпиталамина на суточную динамику содержания норадреналина в медиальной преоптической области и эпиталона на суточный ритм содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами, нарушенные при воздействии 1,2-диметилгидразина. Показано, что введение мелатонина на фоне нарушения в гипоталамусе ритма содержания катехоламинов, регулирующих синтез и секрецию гонадолиберина, приводит к нормализации их суточной динамики. Установлено также, что исследованные пептидные препараты пинеальной железы стимулируют при органотипическом культивировании развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых самок крыс.

Практическая значимость работы

Экспериментальное исследование роли катехоламинов в процессах центральной регуляции репродуктивной функции и изучение молекулярной организации этого процесса, способствует пониманию сложных механизмов выключения репродуктивной функции в процессе старения женского организма и ее нарушений при действии неблагоприятных факторов окружающей среды.

Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы при нарушении эстрального цикла под влиянием 1,2-диметилгидразина (модель преждевременного старения репродуктивной системы) являются перспективными в практическом отношении с точки зрения использования этих соединений для коррекции нарушений в гипоталамической регуляции репродуктивной функции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Суточные ритмы содержания катехоламинов формируют нейромедиаторный фон, необходимый для реализации пика секреции гонадолиберина.

2. Начальные этапы возрастного угасания репродуктивной функции сопровождаются нарушением нормальной суточной динамики катехоламинов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, связанным с предполагаемым изменением работы циркадианного осциллятора в супрахиазматических ядрах гипоталамуса.

3. Мелатонин, эпиталамин и эпиталон способствуют сохранению и (или) восстановлению нормальной суточной динамики катехоламинов в гипоталамических структурах, ответственных за регуляцию репродукции, нарушенной в экспериментальной модели старения репродуктивной системы, вызванного введением 1,2-диметилгидразина.

4. Пептидные препараты пинеальной железы стимулируют развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых крыс in vitro.

Апробация и реализация результатов диссертационной работы

Материалы исследования доложены и обсуждены на совместном заседании лаборатории перинатальной биохимии и отдела эндокринологии НИИ акушерства и гинекологии СЗО РАМН. Результаты исследования были представлены на 4-м Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины «Проблемы старения и долголетия» (Киев, Украина, 2005), Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических целях» (Сочи-Адлер, 2006), VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), VI Европейском конгрессе международной ассоциации геронтологов и гериатров (Санкт-Петербург, 2007), VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2008), Конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), V Всероссийской Научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 5 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 3 статьи в журналах, включенных в перечень ВАК Минобрнауки РФ), 8 тезисов докладов.

Связь с научно-исследовательской работой института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, главы описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 138 страницах, содержит 5 таблиц и иллюстрирован 36 рисунками. Указатель литературы содержит 238 источников, из которых отечественных - 56, зарубежных - 182.

ВЫВОДЫ

1. В медиальной преоптической области наблюдается суточный ритм содержания норадреналина с выраженным снижением в узком временном интервале с 9,5 до 11 часов ЦВ. Суточный ритм содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами характеризуется повышением его содержания с 5 к 11 часам ЦВ. Содержание норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области находится в зависимости от стадии эстрального цикла, определяемой уровнем половых стероидов.

2. Начальные этапы угасания с возрастом репродуктивной функции самок крыс сопровождаются постепенным исчезновением нормальной суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса на фоне сохранения его общего уровня, снижение которого отмечается позднее к 22-24 мес. Снижение среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами происходит уже в 13-14 мес. одновременно с нарушением его суточного ритма.

3. В экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной системы, вызванного введением 1,2-диметилгидразина накануне дня проэструса, наблюдались сходные с возрастными изменения нормальных суточных ритмов содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами. При этом не изменялся уровень норадреналина в срединном возвышении с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области.

4. При использовании геропротекторных препаратов пинеальной железы для коррекции нарушенных суточных ритмов моноаминов эпиталамин, восстанавливая нормальную суточную динамику норадреналина, оказался более эффективным на уровне медиальной преоптической области, а эпиталон оказывал действие в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сохраняя суточный ритм содержания дофамина. Мелатонин восстанавливает нормальную суточную динамику содержания исследованных катехоламинов в обеих рассматриваемых гипоталамических структурах.

5. Пептидные препараты пинеальной железы эпиталон и эпиталамин стимулируют при органотипическом культивировании развитие эксплантатов медиальной преоптической области гипоталамуса молодых и старых самок крыс. Эпиталон стимулирует пролиферативные процессы в медиальной преоптической области и ингибирует экспрессию проапоптозного белка р53.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы (эпиталамин и эпиталон) при нарушении репродуктивных циклов создают предпосылки их использования для коррекции возрастных изменений репродуктивной функции.