Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Роль генотипа инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis в иммунопатогенезе туберкулеза легких

На правах рукописи

Л)

Хасанова Резеда Рахматулловна

РОЛЬ ГЕНОТИПА ИНФИЦИРУЩЕГО ШТАММА

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ТУБЕРКУЛЁЗА ЛЁГКИХ

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2009

003466023

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Уразова Ольга Ивановна

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Воронкова Ольга Владимировна

Хлусов Игорь Альбертович

Фомина Татьяна Ивановна

Ведущая организация: Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Защита состоится «13» СЫ-рС/иХ 2009 г. в {О часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 'при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050, Томск, ул. Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050, Томск, пр. Ленина, 107)

Автореферат разослан ХСбуУПх^ 2009 г.

Учёный секретарь . г,

диссертационного совета Суханова Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Туберкулез занимает одну из ведущих позиций среди наиболее распространенных инфекционных заболеваний. В России ухудшение эпидемической ситуации по туберкулезу с увеличением доли тяжелых распространенных форм болезни в структуре общей заболеваемости туберкулезной инфекцией началось с середины 80-х годов прошлого века и продолжается по сей день [Тунгусо-ва О.С. и соавт., 2001; Duan L. et al., 2002; Samten В. et al., 2003; Баранов А. Л., Марь-яндышев А.О., 2008; Исакова Ж.Т. и соавт., 2008].

На сегодняшний день абсолютно доказанным является тот факт, что снижение эффективности иммунного надзора организма является одним из ключевых факторов предрасположенности к развитию туберкулезной инфекции, а качественные изменения микобактериальной популяции (появление высоковирулентных лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя) приводят к утяжелению течения специфического процесса в легких и существенно осложняют лечение [Мишин В.ГО. и соавт., 2002; Аксенова В.А. и соавт., 2009; Morris S.C. et al., 2009].

Согласно современным представлениям, ключевую роль в формировании иммунитета к туберкулезной инфекции играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-клеток [Botha Т. et al., 2003; Новицкий B.B. и соавт., 2008; Gallegos A.M. et al., 2008]. Исход взаимодействия макрофагов и микобактерий зависит от баланса антимикробной активности фагоцитирующих клеток и резистентности микобактерий к бактерицидному действию макрофагов [Хонина H.A. и соавт., 2000; Urdahl K.B. et al., 2003]. При этом особо важная роль отводится Т-лимфоцитам, среди которых CD4+ клетки активируют фагоцитарную и бактерицидную функции макрофагов, a CD8+лимфоциты способны оказывать прямое цитотоксическое действие на клетки, инфицированные Mycobacterium tuberculosis [Черных Е.Р. и соавт., 2002]. Кроме того, Т-клетки играют существенную роль в запуске и регуляции специфического гуморального иммунитета при туберкулезе, протективпая роль которого в защите от инфекции изучена мало [Harmala L.E. et al., 2002; Hickman S.P. et al., 2002].

Проблема распространения штаммов М. tuberculosis, резистентных и полирезистентных к специфическим химиопрепаратам, имеет в настоящее время огромное значение как для России, так и для всего мира По данным ВОЗ, около 50 млн. людей на Земле инфицированы мультирезистентными штаммами микобактерий туберкулеза [Марьяидышев А.О. и соавт., 2007].

Выявление источников инфекции служит основой ограничения распространения микобактерий туберкулеза. Изучение эпидемиологии туберкулеза до последнего времени было затруднено и весьма несовершенно из-за отсутствия достоверных методов маркирования штаммов микобактерий в целях изучения гетерогенности популяции, определения ареалов распространения возбудителя, расшифровки путей передачи, миграции и механизмов формирования циркулирующих в определенном регионе полирезистентных штаммов.

На протяжении последних лет в микобактериологии широко используются молекулярные технологии генотипирования и дифференцирования М. tuberculosis на уровне хромосомной ДНК [Filliol I. et al., 2002; Тунгусова О.С. и соавт., 2003; Abebe F., Bjune G., 2006; Марьяидышев А.О. и соавт., 2007; Djelouadji Z. et al., 2008]. Созда-

ние библиотек генов микобактерий, а также накопление информации по нуклеиновым кислотам, видовой специфичности белков возбудителей туберкулеза, открытие вставочных элементов в генном материале М. tuberculosis предоставляют возможность для внутривидовой дифференциации штаммов микобактерий и изучения их полиморфизма [Скотникова И.О., 2005; Abebe F., Bjune G., 2006; Mahapatra S. et a]., 2008].

Известно, что генетическая структура и физико-химические особенности микробного штамма М. tuberculosis формируют основу их вирулентности (патогснности) - основного видового признака [Kremer К. et al., 1999]. В литературе имеются данные о том, что характер специфического воспаления (фазы развития, выраженность изменений, клеточный состав очага и т.д.) во многом зависит от биологических свойств поражающего штамма М. tuberculosis. Так, например, известно, что туберкулез легких, вызванный лекарственно-резистентными микобактериями имеет ряд особенностей тканевых и клеточных реакций по сравнению с чувствительным к химиотерапии вариантом болезни [Зюзя Ю.Р. и соавт., 2004; Sharma S. et al., 2004; Ковапьчук JI.B., 2008; Фрейдлин И.С., 2008]. Клинически лекарственно-устойчивый туберкулез легких протекает намного тяжелее, а неблагоприятные исходы заболевания встречаются чаще, чем при лекарственно-чувствительном варианте. Кроме того, высказывается предположение, что появление и размножение в процессе терапии лекарственно-устойчивых микобактерий туберкулеза служит доказательством ослабления иммунологической резистентности организма, способствующего размножению высоковирулентных инфектогенов [Rad М.Е. et al., 2003; Quesniaux V. et al., 2004; Перельман М.И., 2007; Байрамов А.Л. и соавт., 2008].

В свете изложенного, представляется важным изучение роли биологических свойств инфекционного агента (таких как лекарственная устойчивость и генетический профиль) в определении характера иммунологического дисбаланса, сопровождающего туберкулезную инфекцию, что в свою очередь поможет облегчить диагностику и прогнозирование исходов заболевания, выявление групп риска по развитию прогрессирующих форм болезни, позволит проводить адекватную химиотерапию и иммуно-коррекцию.

Цель исследования. Установить роль гснотипических особенностей инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis (лекарственная чувствительность, VNTR-профиль) в модуляции иммунопатологических изменений при туберкулёзе лёгких.

Задачи исследования.

1. Оценить генетическую гетерогенность клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis (лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых), циркулирующих на территории Томской области.

2. Охарактеризовать особенности и патогенетические факторы нарушений клеточного звена иммунитета у больных с инфильтративным и диссеминированным туберкулезом легких, выделяющих микобактерии, чувствительные и с различным спектром устойчивости (моно-, поли- и мультирезистентные) к противотуберкулезным препаратам.

3. Оценить характер нарушений реактивности лимфоцитов периферической крови у больных лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулезом

легких в зависимости от варианта VNTR-профиля инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis.

Научная новизна. Впервые при помощи генетического типирования клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis установлена циркуляция штаммов семейства Beijing на территории г. Томска и Томской области. Показано, что М. tuberculosis пекинского семейства имеют высокую степень генетического родства и более высокий уровень множественной лекарственной устойчивости, чем «непекинские» штаммы возбудителя. Впервые проведено комплексное изучение CD-субпопуляционного состава и функциональных свойств лимфоцитов периферической крови при различных формах туберкулеза легких в зависимости от спектра лекарственной устойчивости и генотипического профиля инфицирующего штамма М. tuberculosis. Установлено, что течение туберкулеза легких с лекарственной мультирезистентностыо характеризуется более выраженным угнетением пролиферативной и резервной 1L-2-продуцирующей активности лимфоцитарных клеток, чем при туберкулезе легких с лекарственной монорезистентностью, при котором определяется высокий уровень ба-зальной и БЦЖ-индуцированной продукции 1L-12. Продемонстрировано, что М. tuberculosis генетического семейства Beijing вызывают реже диссеминированный и чаще инфильтративный (уникальные штаммы - лекарственно-чувствительный, кластеризующиеся - лекарственно-резистентный) туберкулёз лёгких, для которого характерны выраженный лейкоцитоз, угнетение пролиферативной активности лимфоцитов крови и базальной продукции IL-2, и напротив, высокий уровень секреции IL-12. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови (снижение количества CD3+, CD4+, повышение абсолютного числа CD16+ клеток) более значительны при туберкулёзе лёгких, индуцированном некластеризующимися Beijing-штаммами М. tuberculosis (с уникальным VNTR-профилем), тогда как для заболевания, вызванного кластеробразующими Beijing-штаммами М. tuberculosis (со 100%-й степенью гомологии VNTR-профилей) свойственно увеличение наработки IL-12.

Практическое и теоретическое значение работы. Полученные данные расширяют существующие фундаментальные знания об иммунонатогенезе туберкулезной инфекции, механизмах формирования функциональных нарушений и понуляциошго-го состава лимфоцитов периферической крови у больных с инфильтративной и дис-семинированной формами туберкулеза легких в зависимости от биологических свойств инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis. Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения туберкулеза легких, а также способов профилактики и коррекции иммунопатологических осложнений специфического процесса. Принадлежность М. tuberculosis к генетическому семейству Beijing, подтвержденная результатами генетического типирования 77 клинических изолятов, свидетельствует о необходимости детального анализа трансмиссии и эпидемиологической значимости данных штаммов на территории Томской области с целью усовершенствования профилактических мероприятий по предотвращению распространения остропрогрессирующих деструктивных форм заболевания.

Положения, выносимые на защиту:

1. На территории г. Томска и Томской области циркулирует популяция генетически неоднородных штаммов Mycobacterium tuberculosis, среди которых 19% проявляют множественную лекарственную устойчивость. Штаммы семейства Beijing в популяции составляют 27%, имеют высокую степень генетического родства (82%); уровень их множественной лекарственной устойчивости в 3 раза превышает таковой у «непекинских» штаммов.

2. Характер нарушений функциональной активности лимфоцитов крови при лекарственно-резистентном туберкулезе легких зависит от спектра лекарственной устойчивости инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis; снижение пролиферативной и резерва IL-2-продуцирующей активности лимфоцитов при туберкулёзе лёгких с множественной лекарственной устойчивостью является более выраженным, чем при монорезистентном его варианте с характерным высоким уровнем базалыюй и БЦЖ-индуцированной секреции IL-12.

3. Mycobacterium tuberculosis генетического семейства Beijing в подавляющем большинстве случаев вызывают инфильтративный лекарственно-чувствительный (уникальные штаммы) и лекарственно-устойчивый (кластеризующиеся штаммы) туберкулёз лёгких с выраженным лейкоцитозом, низким уровнем лимфопролиферации на фоне гипопродукции IL-2 и гиперпродукции IL-12. При этом T/NK-клеточный дисбаланс и продукция IFNfy у больных, инфицированных Beijing-штаммами с уникальным VNTR-профилем, более значительны, чем при туберкулёзе лёгких, вызванном Beijing-штаммами с абсолютной гомологией VNTR-профилей.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на VIII Российском съезде фтизиатров «Туберкулёз в России год 2007» (Москва, 2007), на международной Российско-Японской конференции «К 15-летнему юбилею Российско-Японского медицинского сотрудничества под эгидой Японско-Российского Фонда Медицинского Обмена (1992-2007 гг.)» (Благовещенск, 2007), межгородской конференции молодых учёных «Актуальные вопросы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2007), VIII конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007, 2008), II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007), научных семинарах кафедр патологической физиологии, фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО «СибГМУ Рос-здрава» (Томск, 2006-2009).

Работа выполнена на базе кафедр патофизиологии, фтизиатрии и пульмонологии, Центральной научно-исследовательской лаборатории и Межкафедралыюй лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска при финансовой поддержке Совета по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ РФ (НШ-2334.2008.7 «Роль генетически детерминированных реакций системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний») и Федерального агентства по науке и инновациям РФ в рамках направления «Живые системы» ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственные контракты №02.412.11.2040 «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфек-

ционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфскгогена и иммунной системы макроорганизма», №02.512.11.2112 «Молекулярно-генетические основы управления адаптационной реактивностью системы крови человека при инфекциях», №02.512.12.0013 «Разработка технологических основ персонализированной терапии и профилактики социально-значимых бактериальных и вирусных заболеваний на основе идентификации молекулярно-генетических механизмов нарушений иммунореактивности системы крови»).

Результаты исследований используются в лекционном курсе по патологической физиологии в разделе «Патофизиология клетки», «Патофизиология иммунитета», «Патофизиология системы крови», «Воспаление».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, из лих 6 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 рисунками и 34 таблицами. Библиографический указатель включает 260 источников, из них 168 отечественных и 92 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты обследования 124 пациентов (89 мужчин и 35 женщин) в возрасте 18-55 лет, страдающих распространённым деструктивным инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным и лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких (ТЛ), проходивших лечение во фтизиатрическом отделении №1 (зав. отд. - Новосельцева О.И.) Томской областной клинической туберкулезной больницы (гл. врач - канд. мед. наук Г.В. Янова). Диагноз ТЛ устанавливался на основании клинической картины заболевания, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты, рентгенологического исследования лёгких. В исследование не включались больные с другими клиническими формами туберкулезной инфекции, с тяжелыми сопутствующими заболеваниями инфекционного и неинфекционного генеза, а также лица, получающие терапию глкжокортикои-дами и иммуномодулирующими препаратами. Распределение больных ТЛ по группам представлено в табл. 1.

Группу сравнения составили 35 здоровых доноров в возрасте от 18 до 55 лет мужского и женского пола.

Таблица 1

Распределение больных туберкулезом легких по группам _

Группы обследованных лиц Абсолютное число %

Больные с лекарственно-чувствительным туберкулёзом лёгких Инфильтративным 60 49,7

Диссеминированным 14 11,6

Больные с лекарственно-устойчивым туберкулёзом лёгких Инфильтративным 37 29,8

Диссеминированным 13 8,9

Материалом для иммунологического исследования являлась периферическая кровь, стабилизированная гепарином (25 ЕД/мл), забор которой производили угром натощак из локтевой вены.

Методы исследования. Определение общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови проводили с использованием общепринятых гематологических методов. Мононуклеарные лейкоциты выделяли из крови на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3) [Меньшиков В.В., 1987]. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в счётной камере Горяева с использованием 0,5% раствора трипанового синего [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992]. Определение дифференцировочных антигенов лимфоцитов (CD-маркеров) человека проводили лимфоцитотоксическим методом с использованием наборов моноклональ-ных антител (ООО «Сорбент», г. Подольск, Московская обл.) к маркерам; CD3+ (общий маркер Т-лимфоцитов), CD4+ (маркер Т-хелперов), CD8+ (маркер цитотоксиче-ских/супрессорных Т-лимфоцитов), CD16+ (маркер натуральных киллеров), CD45RA+ (маркер наивных Т- и B-лимфоцитов). Пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови оценивали МТТ-методом, основанным на изменении цвета связывающегося с клетками красителя 3-[4,5,-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетра-золиум бромида (МТТ, тиазолил синий) из синего в желтый [Carmichael J., 1987]. Для определения уровней IL-2, IL-4, IL-12 и IFNy в супернатантах культуральных суспензий использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA). Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили комплексный белковый и липидный антигены, выделенные из Mycobacterium tuberculosis семейства Beijing1, в дозе 20 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно, рекомбинантный IL-2 («Biosource», USA) в дозе 5 нг/мл и вакцинный штамм БЦЖ в дозе 50 мкг/мл.

Параллельно с исследованием параметров иммунного статуса у больных с различными формами ТЛ проводили изучение генетического полиморфизма 77 клинических изолятов А/, tuberculosis, выделенных из мокроты соответствующего количества пациентов до назначения им специфической противотуберкулезной химиотерапии. Для видовой идентификации М. tuberculosis и определения их чувствительности к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производился посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2. Сбор и подготовку образцов биомассы М. tuberculosis осуществляли в бактериологической лаборатории Томского областного противотуберкулезного диспансера (зав. лабораторий - В.Е. Павлова). Типирование М. tuberculosis проводили в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека отдела им-мунотерапевтических препаратов ФГУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (пос. Кольцово, Новосибирская обл., зав. - д-р биол. наук С.И. Татьков). Типирование клинических изолятов М. tuberculosis осуществляли методом MIRU-VNTR, используя 12 пар праймеров для амплификации локусов микобактери-ального генома: MIRU 2, 4,10, 16,20, 23, 24,26,27, 31, 39, 40 [Cowan L.S. et al., 2002].

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., CHIA). Для оценки нормаль-

' Антигены предоставлены иммунологической лабораторией Института инфекционной биологии им. Макса Планка (г. Берлин, Германия)

ности распределения использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для попарного сравнения независимых выборок использовали нспараметрический критерий Манна-Уитни. Для всех количественных признаков в сравниваемых группах вычисляли медиану, 25%-й и 75%-й квартили. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Корреляционный анализ проводили путём вычисления г-коэффициента Спирмена. Для оценки частоты встречаемости качественных признаков использовали критерий Хи-квадрат Пирсона.

Построение дендрограммы кластеризации М. tuberculosis проводили путем оцифровки длин полученных ампликонов (элекгрофореграмм); общую дендрограмму рассчитывали с применением категориального коэффициента подобия методом UPGMA-невзвешенного попарного арифметического среднего по программе BioNumerics («Applied Math», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время ведущими факторами прогрессирования туберкулёзной инфекции принято считать постепенно нарастающий в популяции иммунодефицит, а также изменения биологических свойств возбудителя - возможность персистирова-ния в фагоцитах (повышение выживаемости в них), появление лекарственной устойчивости [Хоменко А.Г., 1999; Краснов В.А. и соавт., 2008]. Состояние факторов иммунологической защиты является решающим при инфицировании, определяет остроту течения и исход заболевания при развитии туберкулёзной инфекции. В элиминации внутриклеточных микробов, типичными представителями которых являются М. tuberculosis (МБТ), главная роль принадлежит триаде: Т-лимфоцитам, NK-клеткам и макрофагам, способным синтезировать IFNy, IL-1,1L-2, TNFa, резко усиливающие их функциональные свойства. При этом вероятность развития ТЛ определяется состоянием клеточного иммунитета, значительно повышается на фоне иммунодепрессии и тесно связана со степенью ее выраженности: качественной (функциональной) и количественной недостаточностью Т-лимфоцитов [Новицкий В.В. и соавт., 2005; 2006; 2008].

Для оценки состояния клеточного звена иммунитета у больных ТЛ определялось число отдельных субпопуляций лимфоцитарных клеток и их функциональная (пролиферативная и цитокинпродуцирующая) активность.

Как показали результаты проведенного исследования, у больных с ТЛ в острую фазу заболевания независимо от клинической формы, а также от чувствительности к химиопрепаратам инфицирующего штамма М. tuberculosis отмечалась относительная лимфоцитопения на фоне увеличения общего количества лейкоцитов по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров. Наиболее выраженные изменения были зарегистрированы у больных с диссеминированным лекарственно-чувствительным (ЛЧ) и лекарственно-устойчивым (ЛУ) ТЛ. При изучении CD-популяционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ было выявлено снижение как относительного, так и абсолютного числа CD3-, CD4- и С045КА-позитивных лимфоцитов и, напротив, увеличение количества CD8+ и CD16+ клеток во всех обследуемых группах независимо от варианта туберкулёзной инфекции и клинической формы заболевания. При этом у больных с диссеминированным

ЛУТЛ были зарегистрированы более низкие значения абсолютного содержания CD3+-, CD8+-, CD16+- и С045+-лимфоцитарных клеток относительно аналогичных параметров у пациентов с диссеминированным ЛЧТЛ и инфильтративным ЛУТЛ.

Как известно, во взрослом организме постоянство числа клеток в лимфоидных популяциях обеспечивается балансом между их образованием (за счёт лимфоцитопо-эза и пролиферации) и гибелью (как правило, по пути апоптоза). Исследованиями группы учёных Центрального НИИ туберкулёза РАМН г. Москвы установлено, что при выраженной инфильтрации в легочной ткани происходит истощение ферментных систем в лимфоцитах периферической крови, что приводит к дезинтеграции процессов дыхания и гликолиза, снижению пролиферативной активности и нарушениям количественных соотношений CD-субпопуляций лимфоидных клеток, характерных для вторичного иммунодефицита [Мишин В.Ю. и соавт., 1992, 1995; Черных Е.Р. соавт., 2002; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Garrity D. et al., 2005]. Вероятно, эти же механизмы могут обусловливать нарушения фракционного состава лимфоцитов крови, установленные в настоящей работе.

Известно, что по уровню бластгрансформации можно судить о функциональном состоянии иммуноцитов, которое напрямую определяет способность организма к оптимальной реализации специфического иммунного ответа. В работе для оценки общей реактивности лимфоцитов мы ставили перед собой задачу охарактеризовать уровень пролиферативной активности клеток in vivo (активность спонтанной бласт-трансформации), а также резерв пролиферации лимфоцитов в ответ на индукторы, в качестве которых использовали белковый и липидный антигены М. tuberculosis Bei-jing-семейства, вакцинный штамм М. bovis (БЦЖ) и рекомбинантный IL-2.

Анализ пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ позволил выявить снижение уровня спонтанной бластгрансформации клеток относительно контрольных значений вне зависимости от клинической формы и варианта туберкулёзной инфекции. Применительно к ТЛ нельзя не отметить тот факт, что снижение пролиферативного ответа может быть обусловлено перераспределением антигенреактивных клеток в поражённую специфическим процессом ткань лёгкого [Слабнов Ю.В. и соавт., 2000]. Необходимо также учитывать, что процесс бластгрансформации сопряжен с синтезом белка. Между тем, вследствие прямого и опосредованного повреждающего действия токсичных компонентов МБТ (например, корд-фактора, комплекса сульфатидов, ФГЛ и др.) на лимфоциты нарушается экспрессия мембранных рецепторов и синтез лимфокинов, что приводит к угнетению чувствительности клеток к активирующим сигналам и процессов биосинтеза белка [Новицкий В.В. и соавт., 2005, 2006, 2008; Воронкова О.В. и соавт., 2007; Перельман М.И., 2007]. Очевидно, что угнетение бластобразования служит одной из ведущих причин снижения содержания в периферической крови отдельных субпопуляций лимфоидных клеток при ТЛ.

Анализ пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ позволил установить, что стимуляция лимфоцитов in vitro добавлением в культуральную суспензию клеток белкового и липидного микобактериальных антигенов, рекомбинантного IL-2 и вакцины БЦЖ приводила к повышению показателей бластообразования у здоровых доноров и больных ТЛ относительно уровня базальной

пролиферации. Однако в целом у больных инфильтративным и диссеминированным J14TJ1 и ЛУТЛ регистрировался более низкий уровень стимулированной лимфопро-лиферации относительно соответствующих значений в контроле. При этом при дис-семинированном ЛЧТЛ уровень белок-индуцированной пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови оказался выше, а уровень липид-индуцированной лимфопролиферации, напротив, ниже, чем при инфильтративном ЛЧТЛ. Кроме этого, диссеминированный ЛУТЛ сопровождался более низкими значениями белок- и IL-2-индуцированной пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови, чем диссеминированный ЛЧТЛ.

Важнейшими индукторами роста Т-лимфоцитов, определяющими Т/В-клеточное равновесие, являются IL-2, IL-4, IL-7. В первые часы после стимуляции антигеном Thl секретируют IL-2, взаимодействие которого с высокоафинными рецепторами к данному цитокину активирует Т-лимфоциты. К тому же IL-2 является важнейшим медиатором клеточного иммунитета. Количественные изменения его продукции чреваты дизрегуляцией иммунного ответа, влекущей впоследствии тяжёлое течение и неблагоприятный исход заболевания. На различных этапах иммунного ответа спектр цитокинов изменяется в связи со сменой основных клеток-продуцентов, силы антигенного воздействия на них и со стадией патологического процесса [Сага-yannopoulos L.N., Yokoyama W.M., 2003].

Анализ цитокинсекретирующей способности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови у больных ТЛ выявил угнетение уровня спонтанной продукции IL-2 (по сравнению с параметрами у здоровых доноров) вне зависимости от клинической формы заболевания как при ЛЧТЛ, так и при ЛУТЛ. Наиболее низкие ее значения отмечались при лекарственно-устойчивом варианте туберкулёзной инфекции. Добавление в культуру клеток белкового антигена МБТ пекинского семейства и ре-комбинантного IL-2 приводило к снижению продукции эндогенного IL-2 у всех обследованных больных по сравнению с контролем. Уровень IL-2-продуцирующей активности клеток при использовании липидного микобактериального антигена у пациентов с инфильтративным ЛЧТЛ и ЛУТЛ был сопоставимым с нормой. Наряду с этим, индекс стимуляции продукции мононуклеарами IL-2 для вакцинного штамма БЦЖ оказался значительно более высоким (по отношению к контролю) у всех обследованных больных.

Зарегистрированное в острый период ТЛ угнетение спонтанной секреции IL-2, основными продуцентами которого являются активированные Т-лимфоциты-хелперы 1 типа [Вахидова Г.А. и соавт., 1991; Ешану B.C., 2004], возможно, связано со снижением числа данного типа клеток-продуцентов. Кроме того, учитывая, что цитокины обеспечивают ауто- и паракринную регуляцию функционального статуса иммуно-компетентных клеток, уменьшение продукции IL-2 могло быть опосредовано недостаточной наработкой других провоспалительных и Т-активирующих цитокинов - 1L-1 и TNFa, уровень продукции которых при ТЛ, как правило, оказывается пониженным [Кноринг В.Е. и соавт., 1999; Воронкова О.В. и соавт., 2007]. Учитывая паракринный тип регуляции межклеточных взаимодействий, логично предположить, что дефицит 1L-2 приводит к нарушению выработки других цитокинов с синергичным типом действия, в частности IFNy.

Однако необходимо заметить, что уровень базальной наработки IFNy мононук-леарами периферической крови у больных TJI, напротив, значительно превышал таковой в контроле независимо от клинической формы и варианта туберкулёзной инфекции. Оказывается, как свидетельствуют данные литературы, способностью секре-тировать IFNy кроме Thl-лимфицитов (в случае их количественной и качественной несостоятельности) обладают NK-клетки [Бурместер, Г.-Р., 2007; Morris S.C. et al., 2009]. Поскольку у всех обследованных нами больных ТЛ было обнаружено повышение числа CD16+ лимфоцитов в крови, это соответствующим образом могло отразиться и на продукции IFNy, уровень которой прямо коррелировал с содержанием CD16+ клеток (г=0,66; р<0,05).

Вместе с тем, стимуляция мононуклеаров периферической крови белковым антигеном М. tuberculosis, рекомбинантным IL-2 и вакциной БЦЖ не приводила к повышению продукции IFNy у больных с инфильтративным TJ1 и, напротив, вызывала ее увеличение при диссеминированном ЛУТЛ и ЛЧТЛ по отношению к базальному уровню секреции цитокина. Расчет индекса стимуляции для белкового и липидного микобактериальных антигенов, рекомбинантного IL-2 показал, что у пациентов с инфильтративным ЛЧТЛ и ЛУТЛ резервная способность к секреции IFNy клетками периферической крови оказалась значительно более низкой, чем в группе контроля. Обращал на себя внимание более выраженный (чем в контроле) IFNy-секреторный ответ мононуклеаров крови у всех обследуемых больных ТЛ (особенно при диссеминиро-ванной клинической форме) при добавлении в культуральную среду вакцины БЦЖ. Таким образом, резервная способность вырабатывать IFNy на действие БЦЖ у больных ТЛ оказалась повышенной, исключение составили пациенты с инфильтративным ЛЧТЛ и ЛУТЛ, у которых уровень БЦЖ-индуцированной продукции IFNy не отличался от базального.

IFNy, как показано, является одним из сильнейших специализированных индукторов макрофагапьной активации, индуцируя экспрессию более 100 различных генов. Кроме того, IFNy в совокупности с IL-12 обеспечивает дифференцировку ThO-клеток в направлении Thl-лимфоцитов, что и обусловливает развитие выраженного гранулёматозного воспаления [Макарова О.В., Михайлова Л.П., 2008]. Макрофаги потенцируют дифференцировку CD4+ Т-клеток в направлении Thl и продукцию ими IFNy с помощью индукторов: IL-12, IL-18 и др. В свою очередь IFNy усиливает наработку макрофагального IL-12, являющегося основным активатором синтеза самого IFNy клетками Thl типа. Таким образом, замыкается круг позитивной паракринной регуляции между макрофагами и лимфоцитами. Поскольку у обследованных нами больных ТЛ высокий уровень спонтанной продукции IFNy сочетался с повышенным содержанием в крови NK-клеток и низким уровнем базальной концентрации IL-12 в культуре мононуклеаров крови, можно думать, что при ТЛ имеет место дизрегуляция механизмов межклеточной кооперации между CD16+ лимфоцитами и макрофагами, что, вероятно, также может влиять на формирование Т-дефицита.

Известно, что IL-12 в ряде случаев выступает заместителем IL-2 как основного фактора лимфопролиферации [Фрейдлин И.С., Тотолян A.A., 2001]. Вероятно, зафиксированное нами угнетение бластообразования у больных ТЛ могло быть обусловлено одновременно низкой продукцией ростовых факторов - IL-2 и IL-12 либо (с

другой точки зрения) гиперсекрецией макрофагами иммунодепрессивных цитокинов (в частности IL-10) [Toossi Z. et al., 1995; Hirsch C.S. et al„ 1996, 1999; Gong J.H. et al„ 1996].

Общепризнано, что синергистом IL-10 является IL-4 - продукт Т-лимфоцитов, который, обладая противовоспалительными свойствами, выступает в качестве антагониста IFNy при воздействии на макрофаги, Т-хелперы, B-лимфоциты [O'Garra А., Murphy К., 1994]. IL-4 ингибирует IFNy-опосредованные эффекты макрофагов, угнетая транскрипцию соответствующих генов. Между тем, уровень спонтанной продукции IL-4 у всех обследованных больных TJI вне зависимости от клинической формы и варианта туберкулёзной инфекции был ниже, чем в контроле, а индекс стимуляции секреции IL-4 используемыми индукторами у большинства больных TJ1 - наоборот, выше нормы. Таким образом, при TJ1 можно констатировать наличие не только Т-дефицита, но и относительную инертность ТЬ2-клеток с сохранением резерва их функциональной активности. Известно, что альтернативные субпопуляции Th в про-тивоинфекционной защите выполняют разные функции: Thl - главные активаторы клеточного иммунного ответа, Th2 - индукторы B-лимфоцитов, а следовательно гуморального иммунного ответа. Преобладание активности гуморальных механизмов, которое предположительно связывают с нарушением иммунорегуляторной активности хелперных клонов лимфоцитов 1 и 2 типа, является одним из прогностически неблагоприятных факторов иммунопатогенеза туберкулеза [Фрейдлин И.С., Тотолян A.A., 2001; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2004; Garrity D. et al., 2005].

Проблема распространения штаммов М. tuberculosis, резистентных к специфическим химиопрепаратам, имеет в настоящее время огромное значение как для России, так и для всего мира. Немногочисленными экспериментальными исследованиями установлено, что характер специфического воспаления и иммунологическая реактивность организма во многом зависят от биологических свойств поражающего штамма М. tuberculosis [Васильева Г.И. и соавт., 2000; Сахно A.B. и соавт., 2004, 2006; Ко-вальчук Л.В., 2008; Фрейдин И.С., 2008].

Для оценки изменений параметров иммунного статуса при ЛУТЛ в зависимости от спектра лекарственной резистентности инфицирующего штамма М. tuberculosis мы провели сравнение показателей у больных, выделяющих МБТ с moho-, поли- и множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Анализ параметров количественного состава белой крови не выявил статистически значимых различий ОКЛ и субпопуляционного состава лимфоцитов у больных ЛУТЛ в зависимости от спектра лекарственной резистентности инфицирующего штамма М. tuberculosis - изменения носили однонаправленный характер. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови на базальном уровне у больных ТЛ, инфицированных МЛУ-штаммами М. tuberculosis, оказалась сниженной по отношению к норме, тогда как у пациентов, инфицированных моно- и полирезистентными МБТ, данный показатель не отличался от контрольного. Уровень БЦЖ-индуцированного бластообразования in vitro у данной группы пациентов, напротив, значимо превышал соответствующие значения в группе контроля и у больных, выделяющих моно- и полирезистентные М. tuberculosis.

Известно, что при ЛУТЛ возникает дисбаланс количественных параметров иммунного статуса, более выраженный, чем при ЛЧТЛ. Это обусловлено своеобразным иммунологическим торможением, сопряжённым с возникновением сбоя в работе иммунной системы на фоне избыточного накопления антигена [Новицкий В.В. и соавт., 2005, 2006; 2008; Воронкова О.В. и соавт., 2007]. Исследованиями некоторых авторов установлено, что у больных ТЛ, инфицированных микобактериями с высокой жизнеспособностью и нарастающим спектром лекарственной устойчивости, регистрируются более низкие показатели пролиферации лимфоцитов в ответ на туберкулин (PPD) и фитогемагглютинин (ФГА), индуцированной ФГА продукции IL-2, относительного содержания лактоферрина и активности миелопероксидазы в сыворотке крови по сравнению с соответствующими параметрами у больных, выделяющих М. tuberculosis с низкой жизнеспособностью. На наш взгляд, это свидетельствует о более выраженном токсическом действии М. tuberculosis с МЛУ на клетки организма, в том числе и иммуноциты, в отличие от возбудителя с широким спектром лекарственной чувствительности. В данном случае мы судим об анергии Т-клеток in vivo, индуцированной возбудителем с определенными биологическими свойствами. Косвенным доказательством этому может служить значительно более высокий резерв пролиферативной активности лимфоцитов крови при МЛУ ТЛ.

Анализ цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров периферической крови при ТЛ с разным спектром лекарственной устойчивости выявил снижение спонтанной секреции IL-2, IL-4, и, напротив, увеличение (более значимое при полирезистентном варианте ТЛ) продукции IFNy относительно контроля. Обращал на себя внимание высокий уровень продукции IL-12 (базальной и БЦЖ-индуцированной) в культуре мононуклеаров крови больных с монорезистентным ТЛ, который значимо превышал аналогичные значения в группе контроля и у больных с поли- и МЛУ ТЛ. Помимо этого обнаруживался резко пониженный резерв IL-2-продуцирующей способности мононуклеаров крови у больных с МЛУ туберкулёзом (при стимуляции клеток белковым и липидным антигенами, выделенными из МБТ семейства Beijing), что на фоне низкой базальной продукции цитокина может свидетельствовать об истощении функциональной активности Thl-лимфоцитов, возможно вследствие длительного их контакта с аналогичным антигеном в организме больного. Вместе с тем, индекс стимуляции продукции IL-4 in vitro для всех используемых индукторов был повышенным, что на фоне низкой базальной секреции цитокина подтверждает ранее сформулированное предположение о супрессии Т112-лимфоцитов in vivo в условиях гиперсекреции IFNy.

В основе MIRU-VNTR-типирования лежит амплификация локусов, содержащих рассеянные по геному повторяющиеся микобактериальные элементы. Исходя из того факта, что каждый из этих локусов в различающихся штаммах М. tuberculosis представлен различным числом копий повторов, родственные штаммы могут быть объединены в кластеры [Кгешег К., 1999; Норкина О.В. и соавт., 2003]. Помимо неуклонного роста показателей впервые выявленного лекарственно-устойчивого варианта ТЛ, регистрируется учащение случаев инфицированное™ штаммами, относящимися к семейству Beijing, и приобретения вторичной антибиотикорезистентности, связанной с генетическими свойствами инфектогена, позволяющими ему быстро адаптиро-

ваться к среде организма-хозяина и неблагоприятным воздействиям [Сурикова О.В. и соавт., 2005; Балабанова Я.М. и соавт., 2006].

Анализ дендрограммы кластеризации позволил нам заключить, что на территории г. Томска и Томской области циркулирует популяция генетически неоднородных штаммов М. tuberculosis, среди которых 19% проявляют множественную лекарственную устойчивость (рис. 1). Приблизительно 1/3 от всей популяции составляют штаммы семейства Beijing, которые в большинстве случаев вызывают инфильтративный, нежели диссеминированный туберкулез легких (р<0,005 по критерию Хи-квадрат). По свидетельству многих авторов, М. tuberculosis пекинского семейства чаще всего характеризуются множественной лекарственной устойчивостью. Проведенное нами сопоставление данных определения спектра лекарственной устойчивости и генотипи-ческого профиля выявили, что из 21 клинического изолята МБТ с VNTR-профилем, характерным для Beijing-семейства, только 12 оказались лекарственно-резистентными, а остальные 9 изолятов оказались чувствительными к ПТП первого ряда. Нами было установлено, что лекарственно-резистентные штаммы М. tuberculosis чаще встречаются среди клинических изолятов, принадлежащих к семейству Beijing. Так, в клинических образцах среди 77 изолятов (вся выборка) изоляты с МЛУ достоверно чаще (р<0,005 по критерию Хи-квадрат) встречались среди МБТ семейства Beijing, чем в среднем по выборке (рис. 1).

Для анализа зависимости изменений иммунного статуса у больных ТЛ от варианта генотипа инфицирующего штамма М. tuberculosis по результатам генотипирова-ния возбудителя были сформированы группы обследованных лиц: в первую вошли больные, выделяющие МБТ, по генотипическим свойствам относящиеся к пекинскому семейству, вторую составили пациенты, инфицированные М. tuberculosis «не-Beijingw-семейства.

У больных, инфицированных МБТ, относящимися к семейству Beijing, был выявлен лейкоцитоз, который характеризовался более высокими цифрами, чем у пациентов, выделяющих «iieBeijingo-штаммы МБТ. Спонтанная пролиферативная активность лимфоцитарных клеток периферической крови у данной группы больных также оказалась достоверно более высокой, чем у больных «HeBeijing-туберкулёзом». Однако добавление в культуральные суспензии микобактериальных антигенов приводило к угнетению (относительно спонтанного) уровня бласттрансформации лимфоцитов у больных, выделяющих МБТ пекинского семейства; индексы стимуляции лимфопро-лиферации для белкового и липидного индукторов соответственно были ниже, чем в группах сравнения.

По данным JI.B. Сахно и соавт. [2004], к блоку пролиферации антиген-специфичных клонов клеток и последующей их гибели при TJI может приводить избыток антигена, например, дополнительная стимуляция Т-лимфоцигов PPD, который является компонентом М. tuberculosis (как и используемые нами белковый и липид-ный антигены), а также, по данным ряда других авторов [Мишин В.Ю. и соавт., 1996, 2004; Салина Т.Ю., Худзик Л.Б., 2001; Morris S.C. et al., 2009], токсическое действие МБТ с повреждением внутриклеточных структур, угнетением факторов синтеза АТФ, ДНК, аминокислот, цитокинов и др.

VNTR

f ? SI;SJIJ¿I53Í

HZ

■ ■ ■ 9

■ щи®»

■ ■ яяя

■ ■я

■ Я

ЧШ8 ■ ■ ■ ■

К ■ шш К

ЯШ б

ЯК ■ ЯШ

■■ я

■ яя

■■ ■ ЯШ к

Я* ■ и®

ИИ я

■ ■ и як

■ ■ к: я

»■И ■ яя

■ шт т

■ ■ ш

■ и

Я ■я тш

■ я

■

■ я

■я ■ я я

1-я

■ ■ 1Я

9216 9679 1B131 4731

Рис. 1. Дендрограмма кластеризации M. tuberculosis (по результатам MIRU-VNTR-типирования 77 клинических изолятов). Синим цветом обозначены штаммы, относящиеся к Beijing-семейству, красным - штаммы с множественной лекарственной устойчивостью.

Так, у больных ТЛ в обеих обследованных нами группах отмечалось снижение (относительно контроля) базальной секреции IL-2 клетками крови, более выраженное у пациентов, выделяющих Beijing-штаммы МБТ. При этом у данной группы пациентов регистрировались высокие значения базальной выработки IL-12 и сопоставимый с нормой уровень продукции IFNy, тогда как у больных, выделяющих «HeBeijing»-штаммы МБТ, напротив, уровень продукции IL-12 оказался ниже нормы, а уровень IFNy значимо превышал таковую. Добавление в культуры лимфоцитов периферической крови больных «Beijing-туберкулёзом» рекомбинантного IL-2 не приводило к усилению лимфопролиферации относительно базального уровня (в отличие от аналогичного параметра у больных, инфицированных «neBeijingÄ-штаммами МБТ), что может служить косвенным доказательством дефицита рецепторов к IL-2 на клетках (рис. 2). Следствием недостаточной продукции IL-2 у больных, выделяющих МБТ пекинского семейства, вероятно, явился дефицит общих Т-лимфоцитов при нормальном количестве CD8+ клеток. Но, учитывая, что у больных «Beijing-туберкулёзом» было зарегистрировано повышение числа CD16+ лимфоцитов в крови и высокий уровень продукции IFNy и IL-12, можно предположить, что клетки адекватно воспринимают активирующий стимул со стороны макрофагов. При «HeBeijing-туберкулёзе» высокий уровень спонтанной секреции IFNy мог обеспечиваться также за счет повышенного содержания CD8+ клеток в крови, на что указывает наличие положительной корреляции между этими показателями (г=0,77; р<0,05).

Известно, что при воспалении макрофаги могут быть двух видов: классически и альтернативно активированными. Первые характеризуются секрецией питрооксида, провоспалительных цитокинов и генерируются в присутствии Thl-цитокинов, а альтернативно активированные, продуцирующие цитокины с противовоспалительной активностью, генерируются в присутствии цитокинов, синтезируемых Th2 (IL-4, ILIO). В процессе гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) происходит смещение баланса макрофагальных пулов в сторону классически активирующихся клеток, которые секретируют IL-12, обеспечивающий дифференцировку Thl-лимфоцитов, продуцирующих основной аутокринный ростовой фактор - IL-2. Т.к. у больных «Bei-jing-туберкулёзом» базальный уровень секреции IL-4 (как и у больных «HeBeijing-туберкулёзом») оставался в пределах нормы, а уровень продукции IL-12 (в отличие от группы сравнения) был повышенным, можно предположить классический путь активации макрофагальных клеток, который однако не сопровождается активацией Thl-лимфоцитов. Но если в случае «Beijing-туберкулёза» причиной такой недостаточности является антиген-индуцированная анергия Т-лимфоцитов, то при «neBeijing-туберкулёзе» (как показали результаты исследования) - дефицит Т-активирующих цитокинов (рис. 2).

Анализ дендрограммы кластеризации, отражающей степень генетического родства штаммов М. tuberculosis по MIRU-VNTR-профилю, продемонстрировал неоднородность штаммов Beijing, а именно наличие уникальных и кластеризующихся МБТ. При этом необходимо отметить, что штаммы МБТ с уникальным VNTR-профилем чаще вызывали инфильтративный ЛЧТЛ, а штаммы, образующие кластеры - ин-фильтративный ЛУТЛ (р<0,005 по критерию Хи-квадрат). Для анализа зависимости изменений иммунного статуса при ТЛ от спектра лекарственной устойчивости М. tu-

berculosis, принадлежности МВТ к семейству Beijing и степени их генетического родства (способности кластеризоваться) были сформированы 2 группы больных: в первую вошли 8 пациентов, инфицированных уникальными штаммами МБТ пекинского семейства, вторую группу составили 13 пациентов, выделяющих кластеризующиеся (близкородственные) штаммы М. tuberculosis семейства Beijing.

Исследование количественного состава белой крови выявило однонаправленные изменения (по сравнению с нормой) OKJI (повышение), уровня лимфоцитов (снижение) и их отдельных фракций (снижение числа CD3-, CD4-, CD45RA-позитивных клеток) в периферической крови у больных обеих обследуемых групп. Однако более значимое снижение числа CD3+ клеток (абсолютного и относительного) и CD4+лимфоцитов на 70%, 37% и 41%, 50% соответственно по сравнению с нормой оказалось в группе больных, инфицированных М. tuberculosis с уникальным VNTR-профилем. Также у этой группы больных было зарегистрировано повышение абсолютного числа CD16+ лимфоцитов.

Туберкулёз лёгких, вызванный М. tuberculosis Beijing-семейства

Высокая базальная продукция IL-12

Уровень спонтанной РБТЛ в норме

Угнетение РБТЛ при стимуляции белковым и липидным антигенами МБТ Beijing-семейства

Лимфоцитопения

Низкая базальная продукция IL-2

Угнетение функциональной активности Thl-лимфоцитов

Нет усиления РБТЛ на добавление рекомби-нантного IL-2

_J

Антиген-индуцированная анергия

Туберкулёз лёгких, вызванный М. tuberculosis "HeBeijing''-семейства

Низкая базальная продукция IL-12

Низкий уровень спонтанной РБТЛ

Усиление РБТЛ при стимуляции белковым и липидным антигенами МБТ Beijing-семейства

V

-у

Дефицит Т-активирующих цитокинов

Рис. 2. Факторы иммунопатологических изменений при туберкулезе легких в зависимости от генотипической принадлежности инфицирующего штамма М. tuberculosis (по результатам собственных исследований) (МБТ - микобактерия туберкулеза; РБТЛ - реакция властной трансформации лимфоцитов).

Кроме этого, у пациентов, выделяющих кластеризующиеся штаммы МБТ, отмечено повышение спонтанной лимфопролиферативной активности относительно аналогичного параметра в группе сравнения, что, вероятно, было связано с более вы-

соким количеством CD3+ клеток. Проведенные исследования выявили значимо более низкие индексы стимуляции бластообразования для белкового и липидного микобак-териальных антигенов при «Beijing-туберкулёзе» по сравнению с таковыми у больных, инфицированных кластеризующимися штаммами МБТ, что может свидетельствовать об истощении функциональных свойств лимфоцитарных клеток.

Анализ цитокинпродуцирующей активности мононуклеаров периферической в зависимости от степени генетического родства МБТ позволил выявить однонаправленные изменения спонтанной секреции IL-2, IL-4 (снижение) и IFNy (увеличение) относительно контрольных значений у больных TJI, инфицированных МБТ Beijing-семейства. По-видимому, высокий базальный уровень продукции IFNy за счет CD16+ клеток (на что указывалось выше) характерец преимущественно для «Beijing-туберкулёза», вызванного уникальными (не кластеризующимися) штаммами возбудителя, т.к. абсолютное число натуральных киллеров у данной группы больных оказалось более высоким. Кроме того, резервная способность синтезировать IFNy moiio-нуклеарами периферической крови у больных TJ1, выделяющих МБТ с уникальным VNTR-профилем, также оказалась более высокой, чем в группе пациентов, инфицированных близкородственными штаммами возбудителя. Установлено, что некоторые гены МБТ (например, pksl5/l) участвуют в синтезе микобактериальных фенольных гликолипидов (ФГЛ). ФГЛ МБТ, по данным литературы, считаются важными факторами вирулентности, их действие связано с угнетением Thl-опосредованного иммунного ответа хозяина [Reed М.В. et al., 2004; Лихошвай Е.Ю. и соавт., 2006]. Идентификация полноценных генов pksl 5/1 позволяет выявить штаммы с потенциально высокой вирулентностью, в том числе представителей филогенетической линии Beijing [Воронина Е.Ю. и соавт., 2004]. Возможно, эпидемиологически значимые штаммы МБТ - кластеризующиеся изоляты генотипа Beijing, имеют преимущества в распространении в популяции и в виду некоторых биологических особенностей в большей степени влияют на активность иммунной системы, угнетая не только специфические реакции антимикобактериальной защиты, но и функции макрофагов. Подтверждением данному предположению может являться факт глубокого угнетения резерва IL-12-продуцирующей активности мононуклеаров у больных, инфицированных кластеризующимися штаммами Beijing-МБТ. Установлено, что большинство белков МБТ (РЕ (пролин-глутамин) и РРЕ (пролин-пролин-глутамин)) локализовано на внешней поверхности микробной клетки и, вероятнее всего обеспечивают антигенную вариабельность, что соответствующим образом влияет на развитие иммунного ответа, в частности, путём ингибирования антигенпредставляющей и цитокинсскретирующей функции макрофагов [Banu S. et al., 2002; Бибикова М.В. и соавт., 2006].

Как показывают результаты проведенного исследования, биологические свойства возбудителя в значительной степени сказываются на особенностях реагирования иммунокомпетентных клеток крови в процессе туберкулёзного воспаления, модулируя характер специфического иммунного ответа. Следовательно, изучение антигенных свойств микобактерий различных генетических семейств, а также механизмов формирования иммунологических нарушений при туберкулезной инфекции, детерминирующих характер клинического течения и исходы заболевания, представляется весьма актуальным и своевременным.

выводы

1. Среди генетически неоднородных штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории г. Томска и Томской области, 19% проявляют множественную лекарственную устойчивость. Штаммы семейства Beijing составляют 27% от общей популяции возбудителя, имеют высокий показатель кластеризации (74%), уровень их множественной лекарственной устойчивости в 3 раза превышает таковой у «непекинских» штаммов, для которых доля кластеризующихся штаммов составляет 11%.

2. В основе дисбаланса клеточного звена иммунитета при инфильтративном и дис-семинированном туберкулезе легких лежит снижение числа CD3+, CD4+, CD45RA+ клеток и угнетение лимфопролиферативной активности вследствие гипосекреции Т-активирующих цитокинов (IL-2 и IL-12) на фоне повышения количества CD16+ лимфоцитов и продукции IFNy.

3. При лекарственно-резистентном туберкулёзе лёгких выраженность нарушений функциональной активности лимфоцитов крови зависит от спектра лекарственной устойчивости инфицирующего штамма Mycobacterium tuberculosis. При туберкулезе легких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя степень угнетения пролиферативной активности лимфоцитов и резерва продукции IL-2 выше, чем у больных с моно- и полирезистентным туберкулёзом лёгких, отличающимся высоким уровнем базалыюй и БЦЖ-индуцированной секреции IL-12.

4. Mycobacterium tuberculosis пекинского семейства в 10% случаев вызывают диссе-минированный туберкулёз лёгких и в 90% случаев - инфильтративный туберкулёз лёгких, лекарственно-чувствительный вариант которого ассоциирован с уникальным, а лекарственно-устойчивый - с кластеризующимся VNTR-профилем возбудителя. При этом при Beijing-туберкулезе лейкоцитоз, угнетение лимфопролиферации на фоне гипопродукции IL-2 и гиперпродукции IL-12 носят более выраженный характер, чем при «neBeijingÄ-инфекции.

5. У больных, инфицированных Beijing-штаммами Mycobacterium tuberculosis с уникальным VNTR-профилем, дефицит CD3+, CD4+ лимфоцитов, повышение количества CD16+ клеток и IFNy-продуцирующей активности мононуклеарных лейкоцитов крови более значительны, чем при туберкулёзе лёгких, вызванном кластеризующимися ми-кобактериальными Beijing-штаммами (со 100%-й степенью гомологии VNTR-профилей), которому свойственно увеличение наработки IL-12.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Микровязкость и липидный спектр мембраны мононуклеарных лейкоцитов крови у больных туберкулёзом лёгких [Текст] / Есимова И.Е., Новицкий В.В., Уразова О.И., Стрелис А.К., Воронкова О.В., Хасанова P.P. // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - №8. - С. 15-18.

2. Особенности поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови у • больных туберкулёзом лёгких [Текст] / Новицкий В.В., Стрелис А.К., Уразова

О.И., Воронкова О.В., Михаленко А.Н., Шевцова Н.М., Синицына В.А., Хасанова P.P., Пирогова Н.П., Рыбакова М.А. // Клиническая лабораторная диагностика. -2007. - №10. - С. 3-6.

3. Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса при лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулезе лёгких [Текст] / Уразова О.И., Воронкова О.В., Стрслис А.К., Серебрякова В.Л., Хасанова P.P., Земляная Н.А. // Туберкулёз в России, год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров.-М., 2007.-С. 114.

4. Генотипический профиль лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Томской области [Текст] / Новицкий В.В., Хасанова P.P., Наследникова И.О., Стрелис А.К., Уразова О.И., Воронкова О.В. // Туберкулез в России, год 2007: материалы VIII Российского съезда фтизиатров. - М., 2007. - С. 119.

5. Features of production TNF-a & IL-2 at tuberculosis of lung of chemotherapy [Text] / llasanova R.R., Urazova O.I., Voronkova O.V., Vasil'cva O.A., Kolosova A.E., Stam-bula Y.V. // Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance of Japan-Russia. Medical Exchange Foundation (1992-2007): book of abstract. - Blagoveshensk, 2007. - P. 58-59.

6. Influence of antituberculosis drugs on functional activity of lymphocytes [Text] / Va-sil'eva O.A., Urazova O.I., Voronkova O.V., Hasanova R.R., Melnik M.I. // Commemorating 15 years of Russia-Japan Medical Exchange under the guidance of Japan-Russia. Medical Exchange Foundation (1992-2007): book of abstract. - Blagoveshensk, 2007. -C. 107.

7. Оценка цитотоксической активности этамбутола с использованием МТТ-теста [Текст] / Васильева О.А., Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанова P.P., Мельник М.И., Стамбула Ю.В., Колосова А.Е. // Актуальные вопросы патофизиологии: межгородская конференция молодых учёных. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 24-25.

8. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов у больных туберкулёзом лёгких [Текст] / Хасанова P.P., Уразова О.И., Воронкова О.В., Васильева О.А., Стамбула Ю.В., Мельник М.И. // Актуальные вопросы патофизиологии: межгородская конференция молодых учёных. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 131-133.

9. Изменения субпопуляциониого состава лимфоцитов у больных туберкулёзом лёгких [Текст] / Хасанова P.P., Уразова О.И., Воронкова О.В., Васильева О.А., Колосова А.Е., Стамбула Ю.В., Мельник М.И. // Медицинская иммунология. - 2007. -Т.9, №2/3. - С. 252.

10. Особенности иммунотоксического действия противотуберкулёзных химиопре-паратов [Текст] / Васильева О.А., Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанова P.P. // Медицинская иммунология. -2007. - Т.9, №2/3. - С. 217-218.

11. Реактивность лимфоцитов периферической крови при туберкулёзе лёгких [Текст] / Хасанова P.P., Уразова О.И., Воронкова О.В., Стамбула Ю.В., Колосова А.Е. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: тезисы Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова. - Томск, 2007. - С. 86.

12. Влияние противотуберкулёзных химиопрепаратов на продукцию ИЛ-12 лимфоцитами периферической крови [Текст] ! Васильева О.А., Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанова P.P., Земляная Н.А., Колоколова О.В., Филинюк О.В. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здраво-

охранении: тезисы Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова. - Томск, 2007. - С. 68.

13. Дизрегуляция иммунитета при туберкулёзе лёгких [Текст] / Уразова О.И., Новицкий В.В., Воронкова О.В., Серебрякова В.А., Хасанова P.P., Васильева O.A., Фили-гаок О.В., Земляная H.A., Колоколова О.В., Наследникова И.О. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: тезисы Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова. -Томск, 2007.-С. 82.

14. Типовые реакции фагоцитов крови при туберкулёзе лёгких [Текст] / Филинюк О.В., Земляная H.A., Уразова О.И., Стрелис А.К., Воронкова О.В., Буйнова JI.H., Васильева O.A., Хасанова P.P., Серебрякова В.А. // Туберкулёз, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении: тезисы Российско-германской конференции Форума Коха-Мечникова. - Томск, 2007. - С. 84.

15. Цитокинпродуцирующая активность мононукпеарных лейкоцитов периферической крови при туберкулёзе лёгких [Текст] / Хасанова P.P., Уразова О.И., Воронкова О.В., Васильева O.A., Стамбула Ю.В., Колосова А.Е. // Науки о человеке: материалы VIII международного молодёжного конгресса молодых учёных и специалистов. - Томск, 2007. - С. 61-62.

16. Влияние противотуберкулёзных препаратов химиопрепаратов на дегидрогеназ-ную активность лимфоцитов периферической крови [Текст] / Васильева O.A., Уразова О.И., Воронкова О.В., Хасанова P.P., Мельник М.И., Стамбула Ю.В., Колосова А.Е. // Науки о человеке: материалы VIII международного молодёжного конгресса молодых учёных и специалистов. - Томск, 2007. - С. 173-174.

17. Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов у больных туберкулёзом лёгких [Текст] / Хасанова P.P., Воронкова О.В., Уразова О.И. и др. // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. - №3. - С. 31-35.

18. Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на цитохимический статус лимфоцитов in vitro [Текст] / Васильева O.A., Уразова О.И., Серебрякова В.А., Новицкий В.В., Стрелис А.К., Шевцова Н.М., Воронкова О.В., Мельник М.И., Хасанова P.P. // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. - 2008. — №3. - С. 27-30.

19. Сравнительная оценка показателей адаптивного иммунитета при лекарственно-чувствительном и лекарственно-устойчивом туберкулёзе лёгких [Текст] / Воронкова О.В., Уразова О.И., Хасанова P.P., Новицкий В.В., Серебрякова В.А., Наследникова И.О., Колосова А.Е., Будкина Т.Е., Никулина E.JL, Васильева O.A., Пирогова Н.П. // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т.9, №3. - С. 288-289.

20. Иммунопатогенез бактериальных и вирусных инфекций: роль полиморфизма генов цитокинов [Текст] / Наследникова И.О., Уразова О.И., Воронкова О.В., Новицкий В.В., Хасанова P.P., Серебрякова В.А., Будкина Т.Е., Васильева O.A., Никулина E.JI., Сухоленцева H.A., Колосова А.Е., Федорович Т.В., Чернова E.H. // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т.9, №3. - С. 294.

21. Генетическая гетерогенность возбудителей вирусного гепатита и туберкулёза Лёгких на территории Томской области [Текст] / Воронкова О.В., Наследникова И.О., Уразова О.И., Хасанова P.P., Серебрякова В.А., Никулина Е.Л., Юрьева Е.А.

// Науки о человеке: материалы IX международного молодёжного конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, 2008. - С. 56-57.

22. Зависимость продукции ИЛ-2 от варианта туберкулёза легких (лекарственно-чувствительный/лекарственно-устойчивый) [Текст] / Воронкова О.В., IIаследнико-ва И.О., Уразова О.И., Хасанова P.P., Серебрякова В.А., Стамбула Ю.В., Колосова А.Е., Федорович Т.В., Скороходова М.Г., Чернова E.H. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т.2, №2-3. - С. 245.

23. Роль аллельного полиморфизма генов цитокинов в иммунопатогенезе бактериальных и вирусных инфекций [Текст] / Наследникова И.О., Воронкова О.В., Уразова О.И., Колоколова О.В., Стамбула Ю.В., Рубанова А.И., Хасанова P.P., Серебрякова В.А., Федорович Т.В., Чернова E.H., Скороходова М.Г. // Российский иммунологический журим. - 2008. - Т.2, №2-3. - С. 256.

24. Характеристика гуморального иммунного ответа у больных туберкулёзом лёгких до и в динамике противотуберкулёзной химиотерапии [Текст] / Воронкова О.В., Новицкий В.В., Уразова О.И., Стрелис А.К., Хасанова P.P., Серебрякова В.А., Фи-линюк О.В., Земляная H.A., Перевозчикова Т.В., Наследникова И.О., Колоколова О.В., Пирогова Н.П. // Иммунология. -2008. - Т.29, №5. - С. 281-283.

25. Циркуляция на территории Томской области М. tuberculosis генетического семейства Beijing [Текст] / Татьков С.И., Воронкова О.В., Уразова О.И., Сивков АЛО., Хасанова P.P., Новицкий В.В., Стрелис А.К., Мишустиц С.П., Павлова В.Е., Наследникова И.О., Никулина Е.Л. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. - №4. - С. 13-17.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ЛУ — лекарственная устойчивость

ЛУТЛ - лекарственно-устойчивый туберкулёз лёгких

ЛЧ — лекарственная чувствительность

ЛЧТЛ - лекарственно-чувствительный туберкулёз лёгких

МБТ - микобактерия туберкулёза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ПТП - противотуберкулёзный препарат

ТЛ - туберкулёз лёгких

CD (cluster definition) - антигены кластеров дифференцировки клеток IL - интерлейкин IFN — интерферон

MIRU (mycobacterial interspersed repetitive units) - микобактериальные рассеянные повторяющиеся повторы Th - Т-хелпер

VNTR (variable number tandem repeat) - различное количество тандемных повторов

Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой фтизиатрии и пульмонологии ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», д-ру мед. наук, профессору, чл.-корр. РАМН [А.К. Стрелис^ заведующему ЦНИЛ ГОУ ВПО «СибГМУ Росздрава», д-ру мед. наук, профессору А.Н. Байкову, заведующей лабораторией молекуляр-

ной медицины д-ру мед. наук Литвиновой Л.С., главному врачу ОГУЗ «Томская областная клиническая туберкулезная больница», канд. мед. наук Г.В. Яновой, главному врачу ОГУЗ «Томский областной противотуберкулезный диспансер» С.П. Мишусти-ну, заведующей бактериологической лабораторией ОГУЗ «Томский областной противотуберкулезный диспансер» В.Е. Павловой, заведующему лабораторией разработки новых методов диагностики заболеваний человека отдела иммунотерапевтических препаратов ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребиадзора д-ру биол. наук С.И. Татькову за проявленный интерес к работе, ценные теоретические и методические рекомендации.

Подписано в печать,;/£„ о$ 0$г Усл.печ.листов ¿-¿-Печать на ризографе. О тпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № 70 Тираж/^экземпляров